CN102177176A

CN102177176A - 氧化剂耐受性载脂蛋白a-1及模拟肽

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Inventors: J·D·史密斯; S·L·哈泽恩
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Filing date: 2008-10-23
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Abstract

一种包含耐受氧化的ApoA1模拟物或其片段的纯化多肽。

Description

氧化剂耐受性载脂蛋白A-1及模拟肽

相关申请

本申请要求2007年10月23日提出的美国临时申请号60/981,887的优先权，其主题通过引用纳入本文。

发明背景

循环胆固醇由血浆脂蛋白携带。脂蛋白是在血液中转运脂类的脂质和蛋白颗粒。低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)是主要的胆固醇转运载体。据信，LDL在体内负责将胆固醇从肝脏运送到肝外组织。

术语“逆向胆固醇转运”(RCT)描述了胆固醇从肝外组织转运到进行分解代谢和清除的肝脏。据信，血浆HDL颗粒在逆向转运过程中发挥主要作用，用作组织胆固醇的清除剂。RCT主要由三个步骤组成：(a)胆固醇流出，即初步将胆固醇从多种外周细胞库中除去；(b)在卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)的作用下发生胆固醇酯化，防止流出的胆固醇重新进入细胞；以及(c)将HDL胆固醇酯摄取/运送到肝脏细胞。

HDL和作为主要HDL蛋白的载脂蛋白A-1(ApoA1)的水平高早已与心血管疾病风险降低相关。ApoA1是一级氨基酸序列已知，包含243个氨基酸残基的单链多肽(Brewer等，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：623-630)。ApoA1通过介导胆固醇从细胞中流出而在逆向胆固醇转运中担任细胞胆固醇受体。

每个HDL颗粒都包含至少一个拷贝(通常是两到四个拷贝)的ApoA1。ApoA1在人体中以267个残基的前载脂蛋白原形式由肝脏和小肠合成，其以蛋白原形式分泌后迅速被钙依赖性蛋白酶切割，从而产生243个氨基酸残基的成熟多肽并分泌入血浆。据推断，ApoA1含有八个串联重复22单体序列和两个11单体序列，其中大多数都具有形成A类两亲性螺旋结构的潜能(Segrest等(1974)FEBS Lett.38::247-253)。A类两亲性螺旋的特征包括存在于极性-非极性界面处的带正电荷残基和存在于极性面处的带负电荷残基(Segrest等(1974)FEBS Lett.38：247-253；Segrest等(1990)Proteins：Structure，Function，and Genetics 8：103-117)。

ApoA1可以与脂类形成三类稳定复合物：称为前β1-HDL的小分子贫脂复合物；称为前β2-HDL的包含极性脂(磷脂和胆固醇)的扁平盘状颗粒；以及称为球状或成熟HDL(HDL₃和HDL₂)的同时包含极性和非极性脂质的球状颗粒。大多数循环的HDL都同时包含ApoA1和ApoAII(第二主要HDL蛋白)，称为HDL的A1/AII-HDL组分。但是只包含ApoA1的HDL组分(本文称为A1-HDL组分)似乎在RCT中更有效。一些流行病学研究支持A1-HDL组分具有抗动脉粥样硬化作用的假设(Parra等，1992，Arterioscler.Thromb.12：701-707；Decossin等，1997，Eur.J.Clin.Invest.27：299-307)。

有充分证据表明，血清胆固醇升高与冠心病相关。例如，动脉粥样硬化是一种慢性进行性疾病，特征为在动脉壁内的胆固醇累积。在动脉粥样硬化病变处沉积的脂质主要来源于血浆LDL的观点也得到了有力证据的支持；所以LDL通常视作“有害胆固醇”。与此相反，HDL的血清水平则与冠心病逆相关，因此视作负风险因素。据推测，高水平的血清HDL不仅对冠心病具有防护作用，实际上还可诱导动脉粥样硬化斑块的消退(例如，Badimon等，1992，Circulation 86(增刊III)：86-94)。所以，HDL通常视作“有益胆固醇”。

发明概述

本发明涉及能促进胆固醇流出荷脂细胞的新型ApoA1模拟物。所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列与包含至少一个色氨酸并能促进胆固醇流出荷脂细胞的天然ApoA1或ApoA1的在前模拟物的至少一部分氨基酸序列基本上相似。与天然ApoA1或ApoA1的在前模拟物不同，所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少有一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。新型ApoA1模拟物可包含，例如含有色氨酸的ApoA1片段、天然ApoA1、ApoA1融合蛋白、ApoA1嵌合蛋白、截短的ApoA1蛋白或ApoA1多肽的在前模拟物的氨基酸序列，其中所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

本发明还涉及治疗心血管疾病的方法，该方法给予对象包含能促进胆固醇流出荷脂细胞的新型ApoA1模拟物的药物制剂。所述新型ApoA1模拟物包含含有至少一个色氨酸并能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1或ApoA1的在前模拟物的至少一部分氨基酸序列。上述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少有一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。新型ApoA1模拟物可以包含，例如含有色氨酸的ApoA1片段、天然ApoA1、ApoA1融合蛋白、ApoA1嵌合蛋白、截短的ApoA1蛋白或ApoA1的多肽模拟物的氨基酸序列，其中所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

本发明还涉及促进胆固醇流出荷脂细胞的方法。所述方法包括给予荷脂细胞生物学有效量的纯化多肽。所述多肽可包含含有SEQ ID NO：1所示胆固醇流出受体部分的氨基酸序列，其中X选自由色氨酸或苯丙氨酸组成的群组，且至少一个X是苯丙氨酸。

本发明还涉及减轻对象炎症的一种或多种症状的方法。所述方法包括给予治疗对象能促进胆固醇流出荷脂细胞的新型ApoA1模拟物。所述新型ApoA1模拟物包含含有至少一个色氨酸并能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1或ApoA1的在前模拟物的至少一部分氨基酸序列。所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少有一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。新型ApoA1模拟物可以包含，例如含有色氨酸的ApoA1片段、天然ApoA1、ApoA1融合蛋白、ApoA1嵌合蛋白、截短的ApoA1蛋白或ApoA1多肽的模拟物的氨基酸序列，其中所述新型ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

本发明的另一个方面涉及减轻包含至少一个色氨酸残基的ApoA1、其片段或其模拟物的胆固醇流出受体功能的MPO氧化丧失的方法。所述方法包括用氧化剂耐受性氨基酸取代ApoA1、其片段或ApoA1模拟物的至少一个色氨酸残基。

附图简述

本发明的上述和其它特征及优点在本发明所属领域的技术人员经过参阅下列附图说明后是显而易见的，其中：

图1(A-F)显示分离自人动脉粥样化组织的ApoA1蛋白修饰的串联质谱。在对人粥样斑的免疫亲和纯化ApoA1进行胰蛋白酶直接或胶内酶解后，可以获得碰撞诱导解离光谱。在LC串联质谱实验中检测双电荷离子，并断裂成碎片。A.肽D1-R10(SEQ ID NO：70)，在第8个残基处包含单羟基色氨酸。B.肽L46-K59(SEQ ID NO：71)，在第50个残基处包含单羟基色氨酸。C.肽E62-K77，在第72个残基处包含单羟基色氨酸(SEQ ID NO：72)。D.肽W108-R116(SEQ ID NO：73)，在第108个残基处包含单羟基色氨酸，在第112个残基处包含甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)。E.肽与D中相同，但是在第108个残基处的色氨酸变为双羟基色氨酸(SEQ ID NO：74)。F.肽L41-R49(SEQ ID NO：75)，在第48个残基处包含甲硫氨酸亚砜。

图2显示分离自人血浆和动脉粥样化组织的ApoA1上的赖氨酸修饰。ApoA1分别从六个健康对象的血浆和六个动脉粥样化样品中通过免疫亲和层析分离。赖氨酸修饰终产物——2-氨基己二酸的水平在酸水解后通过质谱分析定量测定，并按照ApoA1赖氨酸含量标准化。数据显示各样本的双重测定的平均值(双尾t检验p＝0.005)。

图3显示还原性甲基化对赖氨酸残基的保护无法使其免受完整MPO/H₂O₂/Cl^-系统的失活作用。采用不同H₂O₂∶ApoA1摩尔比，通过MPO对ApoA1(实心圆，实线)和还原性甲基化的ApoA1(空心圆，虚线)进行修饰。然后以5μg/ml与经0.3mM 8Br-cAMP处理以诱导ABCA1的胆固醇标记的RAW264.7细胞温育4小时来测定这些蛋白质的ABCA1依赖性细胞胆固醇受体活性。数据是三重测定的±S.D.平均值，没有条杠时，S.D.落在符号内。

图4的图(A)和图(B)显示，缬氨酸取代为甲硫氨酸的ApoA1对MPO介导功能丧失的易感性增加。A.对重组人ApoA1(rh-ApoA1)、rh-ApoA1 3MV(内部3个甲硫氨酸被取代为缬氨酸)以及经甲酸处理去除重组蛋白中起始甲硫氨酸和6His-tag的rh-ApoA1 3MV(rh-ApoA1 3MV F.A.)进行H₂O₂∶ApoA1摩尔比为15∶1的高剂量MPO修饰。细胞胆固醇流出活性的测定如图1所述。数据是双重测定的平均值±S.D.。B.采用不同H₂O₂∶ApoA1摩尔比，通过MPO对rh-ApoA1(实心圆，实线)和rh-ApoA1 3MV(空心圆，虚线)进行修饰。然后根据图3所述方法测定这些蛋白质的ABCA1依赖性细胞胆固醇受体活性。数据是三重测定的平均值±S.D.。^*，通过双尾t检验，以相同H₂O₂∶ApoA1摩尔比与rh-ApoA1 3MV比较，p＜0.01。

图5(A-B)显示色氨酸取代为苯丙氨酸或亮氨酸对rh-ApoA1功能的影响，以及苯丙氨酸取代对MPO的失活作用的耐受性。A.如图3所述测定不同浓度的rh-ApoA1(实心圆，实线)、rh-ApoA1 4WF(4个色氨酸换为苯丙氨酸，空心圆，虚线)以及rh-ApoA1 4WL(4个色氨酸换为亮氨酸，空心方块，点线)的细胞胆固醇受体活性。4WF变体很大程度保留了该活性，而4WL变体丧失该活性。数据是三重测定的平均值±S.D.。B.采用不同H₂O₂∶ApoA1摩尔比，通过MPO对rh-ApoA1(实心圆，实线)和rh-ApoA1 4WF(空心圆，虚线)进行修饰。然后如图3所述测定这些蛋白质的ABCA1依赖性细胞胆固醇受体活性。数据是三重测定的平均值±S.D.。^*，p＜0.05；和^**，p＜0.0001，通过双尾t检验，以相同H₂O₂∶ApoA1摩尔比与rh-ApoA1比较。

图6显示色氨酸取代为苯丙氨酸的ApoA1对于HOCl介导的功能丧失具有耐受性。以不同HOCl∶ApoA1摩尔比对rh-ApoA1(实心圆，实线)和rh-ApoA1 4WF(空心圆，虚线)进行修饰。然后如图3所述测定这些蛋白质的ABCA1依赖性细胞胆固醇受体活性。数据是三重测定的平均值±S.D.。^**，p＜0.0001，通过双尾t检验，以相同HOCl∶ApoA1摩尔比与rh-ApoA1比较。

图7(A-B)显示rh-ApoA1 4WF与脂质以及rh-ApoA1结合，其脂质结合活性对MPO介导的氧化具有耐受性。A.制备二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)乳液(125μg)，在不添加(实粗线)或添加25μg的rh-ApoA1(实细线)或rh-ApoA1 4WF(点线)的条件下进行温育。24℃，随时间读取325nm的吸光度(每种条件下n＝3，平均值±S.D.)，通过浊度丧失来监测脂质结合和增溶。与野生型rh-ApoA1相比，4WF变体产生了相似的DMPC清澈度。B.采用不同H₂O₂∶ApoA1摩尔比，通过MPO对rh-ApoA1(实心圆，实线)和rh-ApoA14WF(空心圆，虚线)进行修饰。然后通过阻止磷脂酶C依赖性LDL聚集来测定这些蛋白质的脂质结合活性。数据根据无H₂O₂时处理的rh-ApoA1的脂质结合活性作标准化。数据是三重测定的平均值±S.D.。^*，p＜0.05；和^**，p＜0.001，通过双尾t检验，以相同H2O2∶ApoA1摩尔比与rh-ApoA1 4WF比较。数据表明，在降低野生型rh-ApoA1的脂质结合活性的MPO修饰剂量下，rh-ApoA1 4WF并未丧失其脂质结合活性。

图8所示的免疫印迹显示色氨酸取代为苯丙氨酸的ApoA1对MPO产生的交联作用仍然易感。采用下列H₂O₂∶ApoA1摩尔比对rh-ApoA1和rh-ApoA14WF进行MPO修饰：0、1、2、3、5和12.5(从左至右)。通过蛋白质印迹法定量测定ApoA1交联。分子量标准的迁移显示在左侧。

图9所示梯度凝胶显示无脂质rh-ApoA1的迁移。A.采用棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和野生型或4WF rh-ApoA1(POPC∶ApoA1摩尔比为100∶1)，通过胆酸盐透析制备rHDL，将其在4-20％的非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行电泳。第1泳道，分子大小标准，直径列于左侧；第2泳道，10μg野生型rh-ApoA1 rHDL；第3泳道，10μg的4WF rh-ApoA1 rHDL。两种ApoA1变体在非变性梯度凝胶上均产生了约9.8、12和17nm的圆盘。无脂质rh-ApoA1的迁移由箭头显示在右侧。

图10显示在有(实心柱)或没有(空心柱)0.3mM 8Br-cAMP预处理产生的ABCA1诱导作用存在下，由[³H]胆固醇标记的RAW264.7细胞得到的rHDL制品(4小时温育)的胆固醇流出活性。rh-ApoA1(10μg/ml)产生了ABCA1依赖性胆固醇受体活性；但是野生型(WT)和4WF ApoA1 rHDL制品(10μg/mlApoA1)均只产生ABCA1依赖性胆固醇受体活性。条柱显示平均值±S.D.(n＝3)。

图11显示含色氨酸取代的合成肽的ABCA1依赖性胆固醇受体活性。合成的亲本肽p18(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH₂)(SEQ ID NO：76)包含或缺乏用色氨酸残基(W)取代苯丙氨酸(p18WF)或亮氨酸(p18WL)。通过与经0.3mM 8Br-cAMP预处理以诱导ABCA1的[³H]胆固醇标记的RAW264.7细胞进行4小时温育来测定所述三种肽的胆固醇受体活性。肽浓度以μg/ml为单位显示在柱状图标签上。条柱显示平均值±S.D.(n＝3)。

发明详述

本发明涉及给予对象时能耐受氧化并能增强胆固醇流出荷脂细胞的载脂蛋白A-1(ApoA1)多肽模拟物。在说明书和权利要求书中使用的“对氧化的耐受性”或“氧化剂耐受性”是指ApoA1模拟多肽至少部分耐受损伤或降低ApoA1多肽的胆固醇接受和脂质结合活性的氧化作用。所述氧化作用可能与一些作用有关或由其导致，例如，各氧化途径的氧化作用，包括以下至少一种：髓过氧化酶(MPO)、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物(reactive chlorinating species)、MPO/H₂O₂/Cl^-系统、HOCl/OCl^-、MPO产生的活性氮(reactive nitrogen species)、MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统、二氧化氮、过氧亚硝酸根(peroxynitrite)(ONOO^-)、亚硝基过氧碳酸根(peroxycarboxynitrite)(ONOOCO₂ ^-)以及ONOO^-在有CO₂(或缓冲液中有HCO₃ ^-)存在下起作用时形成的产物。

据发现，ApoA1蛋白的色氨酸残基很容易被氧化，例如，在髓过氧化酶(MPO)、次氯酸或其它潜在的氧化剂的作用下。ApoA1色氨酸残基的氧化会导致其丧失胆固醇接受和脂质结合活性。此外，MPO介导的天然ApoA1的氧化作用可能使得作为逆向胆固醇转运一部分的细胞胆固醇的接受作用失活。

本发明的ApoA1氧化剂耐受性模拟物(或氧化耐受性模拟物)的氨基酸序列与包含至少一个色氨酸并且至少一个色氨酸残基被氧化剂耐受性残基，例如氧化剂耐受性肽残基取代但ApoA1脂质结合和流出活性保留的ApoA1、ApoA1片段或已知的ApoA1模拟物的氨基酸序列大体相似。在一个实施例中，所述氧化剂耐受性残基可包括芳香肽残基，例如苯丙氨酸。

在说明书和权利要求书中使用的“ApoA1的模拟物”、“ApoA1的在前模拟物”或“已知的ApoA1模拟物”指可在任何参考文献鉴定或衍生自其中的具有ApoA1特性的ApoA1模拟物。这包括在美国和外国专利及出版物中鉴定的ApoA1模拟物。术语“ApoA1的模拟物”、“ApoA1的在前模拟物”或“已知的ApoA1模拟物”与说明书和权利要求书中的术语“ApoA1模拟物”、“新型ApoA1模拟物”或“新ApoA1模拟物”不同，后者包括对氧化耐受或氧化剂耐受性的本发明ApoA1模拟物。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在此可交换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语既适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，也适用于天然氨基酸聚合物。此处使用的“芳香氨基酸”指在支链上含有至少一个芳环或杂芳环的疏水氨基酸。所述芳环或杂芳环可包含一个或多个取代基，例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH₂、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH₂、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中各R独立为(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基或取代的6-26元烷杂芳基。遗传编码的芳香氨基酸包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一特定实例中，本发明中的氧化耐受性氨基酸可以是苯丙氨酸。

氧化耐受性ApoA1模拟物在促进胆固醇流出荷脂细胞方面是优秀的，可以用作治疗、减轻和/或预防冠状动脉血管疾病的疗法(例如心血管疾病)，包括可以同时减少已有斑块和抑制新斑块形成、动脉粥样硬化、血管炎症、伤口愈合及高脂血症的治疗剂。故本发明包括通过给予对象治疗有效量的ApoA1模拟物来治疗、预防和/或减轻治疗对象的冠状动脉血管疾病、血管炎症、伤口愈合和/或高脂血症的方法。

在本发明的一方面，ApoA1模拟物可以包括一种多肽，该多肽具有的氨基酸序列包含至少一个色氨酸和天然ApoA1的胆固醇流出受体部分。在一个实施例中，ApoA1模拟物可以具有下列氨基酸序列：

DEPPQSQXDR VKDLATVYVD VLKDSGRDYV SQFEGSALGKQLNLKLLDNX DSVTSTFSKL REQLGPVTQE FXDNLEKETEGLRQEMSK DL EEVKAKVQPY LDDFQKKXQE EMELYRQKVEPLRAELQEGA RQKLHELQEK LSPLGEEMRD RARAHVDALRTHLAPYSDEL RQRL

除了包括色氨酸取代的野生型或天然形式ApoA1外，ApoA1模拟物还可以包括本领域已知的色氨酸取代的ApoA1天然变体。例如，Weisgraber等证明在称为ApoA1-Milano的突变型ApoA1中，可以将半胱氨酸取代第173位的精氨酸(Weisgraber等(1983)J.Biol.Chem.258：2508-2513)。所以，基于ApoA1-Milano的ApoA1模拟物可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FXQQDEPPQS PXDRVKDLATVYVDVLKDSG RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNXDSVTSTFSKLREQLGP VTQEFXDNLE KETEGLRQEM SKDLEEVKAKVQPYLDDFQK KXQEEMELYR QKVEPLRAEL QEGARQKLHELQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALCTHLAPY SDELRQRLAARLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQGLLPVLESFK VSFLSALEEY TKKLNTQ(SEQ ID NO：2)，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性残基(例如苯丙氨酸)，且至少一个X取代氧化剂耐受性残基。

本发明ApoA1模拟物的另一个实例是基于已知的人ApoA1肽的全长模拟物，在成熟ApoA1的第151位具有半胱氨酸(对应于SEQ ID NO：3序列中的第175位)。该实例的ApoA1模拟物可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FXQQDEPPQS PXDRVKDLATVYVDVLKDSG RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNXDSVTSTFSKLREQLGP VTQEFXDNLE KETEGLRQEM SKDLEEVKAKVQPYLDDFQK KXQEEMELYR QKVEPLRAEL QEGARQKLHELQEKLCPLGE EMRDRARAHV DALCTHLAPY SDELRQRLAARLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQGLLPVLESFK VSFLSALEEY TKKLNTQ(SEQ ID NO：3)；其中X是色氨酸或氧化剂耐受性残基(例如苯丙氨酸)，且至少一个X取代氧化剂耐受性残基(例如苯丙氨酸)。

相应地，本发明所涵盖的ApoA1多肽模拟物可包括各种ApoA1形式和变体的修饰多肽，包括例如，载脂蛋白A-1(Brewer等，(1978))、载脂蛋白A-1Milano(Weisgraber(1983))、载脂蛋白A-1Marburg(Utermann等，(1982)J.Biol.Chem.257：501-507)、载脂蛋白A-1 Paris(Bielicki和Oda(2002)Biochemistry 41，2089-2096)、载脂蛋白原A-1或本领域已知的合成或天然的其它ApoA1突变体形式。

或者，本发明的ApoA1模拟物也可包括高度模仿人或小鼠ApoA1肽的A类两亲性螺旋的两亲性螺旋肽(即ApoA1的模拟物)，其中X表示的残基可包括色氨酸残基或氧化剂耐受性氨基酸残基，且至少一个X是氧化剂耐受性残基。术语“两亲性螺旋肽”指包含至少一个两亲性螺旋(两亲性螺旋结构域)的肽。本发明中的某些两亲性螺旋肽可包含两个或更多(例如3、4、5个等)两亲性螺旋。

术语“A类两亲性螺旋”指一种蛋白质结构，其形成隔开极性和非极性面的α螺旋，其中带正电荷的残基位于极性-非极性界面处，而带负电荷的残基则位于极性面的中心(见例如，Segrest等(1990)Proteins：Structure，Function，and Genetics 8：103-117)。特别优选的肽可以与编码人或小鼠ApoA1的A类两亲性螺旋的外显子编码的多肽有大于50％的氨基酸序列相同性。所述肽可以与药理学可接受的赋形剂(例如适合口服给予哺乳动物的赋形剂)混合。

在某些实施方案中，ApoA1模拟物是ApoA1的片段或模拟物，其能促进胆固醇流出并包含下列氨基酸序列中的一个或多个：

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO：4)，

D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F-(SEQ ID NO：5)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：6)，

D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：7)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：8)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：9)，

D-X-F-K-A-F-Y-D-K-F-F-E K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：10)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：11)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：12)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO：13)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：14)，

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：15)，

E-X-L-K-L-F-Y-E-K-V-L-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：16)，

E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：17)，

E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO：18)，

E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO：19)，

E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-L-K-E-F-F-(SEQ ID NO：20)，

E-X-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：21)，

E-X-L K-A-F-Y-D-K-V-F-E-K-F-K-E-F-F-(SEQ ID NO：22)，

D-X-L-K-A-L-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-L-(SEQ ID NO：23)，

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D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P-D-X-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F(SEQ ID NO：67)，

D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-V-Y-D-K-V-F-K-L-K-E-F-F(SEQ ID NO：68)，和

D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F-P-D-X-L-K-A-F-Y-D-K-F-A-E-K-F-K-E-F-F(SEQ ID NO：69)；

其中X是色氨酸或氧化剂耐受性残基(例如苯丙氨酸)，且各序列中至少有一个X取代氧化剂耐受性残基。

上述引用序列(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：69)描述于Fogelman等的美国专利号7,144,862B2(以下称‘862专利)，其通过引用全文纳入本文。‘862专利涉及用于减轻动脉粥样硬化的一种或多种症状的肽。‘862专利所述的肽在本文标记为X的各残基处包含色氨酸残基。‘862专利的合成肽设计成模拟A类两亲性螺旋基序(Segrest等(1990)Proteins：Structure，Function andGenetics 8：103-117))，能与磷脂结合并表现出与人ApoA1相似的许多生物学特性。

还应注意，该ApoA1模拟肽清单不是全部。上述序列的截短形式、上述序列的多聚体组合(例如，从二聚体到三聚体、四聚体、五聚体、八聚体或十聚体)、上述序列的保守性取代和/或包含氨基酸类似物的上述序列，根据其中的提示也涵盖在内。

应该理解，一般将ApoA1用作起点，可以产生出ApoA1模拟多肽的生物功能等同物，甚至改进。可以对该蛋白质的结构进行修饰和改变，且仍然获得具有相似或所需特征的分子。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以取代其它氨基酸，同时并不造成胆固醇流出受体活性显著丧失。

同样应该被涵盖的是，本领域技术人员可以通过取代、缺失或插入至少一个氨基酸来进一步修饰本发明的ApoA1氨基酸序列，这些进一步的修饰产生氧化剂耐受性ApoA1多肽的生物学功能等同物。这些取代不严重抑制修饰的ApoA1促进胆固醇流出荷脂细胞的能力。本文所用的“实质性抑制”或“抑制”包括修饰的ApoA1多肽促进胆固醇流出荷脂细胞的能力中任何可测的可重复降低。

技术人员还熟知，“生物学功能等同”蛋白质或多肽的定义中固有的概念是，分子所限定一部分内可以做出的改变数目有限，且仍然可以获得具有可接受水平的等同生物学活性的分子。所以本文将生物学功能等同蛋白质和肽定义为某些，而非多数或全部的氨基酸可被取代的蛋白质和肽。当然，根据本发明不难制备和使用多种具有不同取代的不同蛋白质/肽。

氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。对氨基酸侧链取代基大小、形状和类型的分析显示，精氨酸、赖氨酸和组氨酸均为带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸均具有相似大小。所以，考虑到这些因素，本文将精氨酸、赖氨酸和组氨酸，及丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸定义为生物学功能等同物。

按照Alton等的公开申请(WO83/04053)中的方法，不难设计并制备编码微生物表达多肽的基因，所述多肽的初级构象在一个或多个残基的相同性或位置方面与本文定义那些的不同(例如，取代、末端和中间的插入和缺失)。或者，通过熟知的定点诱变技术不难对cDNA和基因组基因的修饰，再将其用于生成ApoA1的类似物和衍生物。这样的产物与修饰的氧化剂耐受性ApoA1具有至少一项共同的生物学特性，而其它方面可以不同。

根据本发明的另一方面，ApoA1模拟多肽可以是全长人ApoA1肽的片段。本发明的ApoA1片段是上述ApoA1多肽在至少一个方面，包括但不限于促进胆固醇流出和减轻炎症状态的一种或多种症状的生物学功能等同物。ApoA1片段可由约5到50个氨基酸组成，包括至少一个色氨酸残基，其中色氨酸残基被氧化剂耐受性氨基酸取代。

应该理解，与ApoA1模拟多肽相似，可以对ApoA1片段的结构和氨基酸序列作出修饰和改变，且仍然获得具有相似或所需功能特征的分子。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可取代其它氨基酸，同时胆固醇流出促进作用不显著丧失。

本发明的ApoA1模拟多肽还可以包含与多肽氨基末端和/或羧基末端偶联的保护基团。术语“保护基团”指与氨基酸中的功能基团(例如，侧链、α氨基、α羧基等)连接时会阻断或掩盖该功能基团特性的化学基团。氨基末端保护基团的例子包括但不限于乙酰基或氨基。在这样的实施方案中，本文所述多肽N末端和/或C末端的前一到四个氨基酸残基可被已知赋予α螺旋二级结构区域稳定性的一个或多个氨基酸残基或一个或多个肽段(“末端帽”或“保护基团”残基或区段)取代。这样的末端帽残基和区段为本领域所熟知(见例如，Richardson和Richardson，1988，Science 240：1648-1652；Harper等，1993，Biochemistry 32(30)：7605-7609；Dasgupta和Bell，1993，Int.J.Peptide Protein Res.41：499-511；Seale等，1994，Protein Science3：1741-1745；Doig等，1994，Biochemistry 33：3396-3403；Zhou等，1994，Proteins 18：1-7；Doig和Baldwin，1995，Protein Science 4：1325-1336；Odaert等，1995，Biochemistry 34：12820-12829；Petrukhov等，1996，Biochemistry35：387-397；Doig等，1997，Protein Science 6：147-155)。或者，本文所述多肽的前一到四个N末端和/或C末端氨基酸残基可以被模拟末端帽残基或区段的结构和/或特性的拟肽部分所替换。末端帽模拟物的例子为本领域所熟知，描述于例如，Richardson和Richardson，1988，Science 240：1648-1652；Harper等，1993，Biochemistry 32(30)：7605-7609；Dasgupta和Bell，1993，Int.J.Peptide Protein Res.41：499-511；Seale等，1994，Protein Science3：1741-1745；Doig等，1994，Biochemistry 33：3396-3403；Zhou等，1994，Proteins 18：1-7；Doig和Baldwin，1995，Protein Science 4：1325-1336；Odaert等，1995，Biochemistry 34：12820-12829；Petrukhov等，1996，Biochemistry35：387-397；Doig等，1997，Protein Science 6：147-155。

本发明的ApoA1模拟多肽可纯化和分离。术语“纯化和分离的”在本文指基本上除去了不需要的物质，从而使该被修饰的ApoA1模拟物的多肽或其片段可用于促进胆固醇流出荷脂细胞。例如，可以获得基本上除去其它人蛋白或致病物因子的修饰重组人ApoA1模拟多肽。这些多肽的特征还在于是哺乳动物细胞的产物、化学合成方法的产物、或通过基因组或cDNA克隆或基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主表达(例如，通过细菌、酵母菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞培养)的产物。产物在典型的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或原核(例如大肠杆菌(E.coli))宿主细胞中的表达与任何哺乳动物蛋白质无关联。产物在脊椎动物(例如非人哺乳动物(例如，COS或CHO)和禽类)细胞中的表达与任何人蛋白质无关联。本发明的多肽依赖于所用的宿主和其它因素，可以被哺乳动物或其它真核糖类糖基化，也可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括起始甲硫氨酸残基(相对多肽第一氨基酸残基位于第-1位)。

本发明的多肽可通过本领域已知技术进行纯化，例如反相高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析等。纯化特定肽采用的实际条件部分依赖于合成策略和因素，例如静电荷、疏水性、亲水性等，对于本领域技术人员是显而易见的。多聚分支肽可以通过诸如离子交换层析或分子排阻层析等方法纯化。

对于亲和层析纯化，可以采用与所述肽特异性结合的任何抗体。对于抗体生产，各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等可通过注射肽进行免疫。所述肽可以通过侧链功能基团或与侧链功能基团连接的接头与合适的运载体相连，例如BSA。可用各种佐剂增强免疫应答，依赖于宿主种类，包括但不限于弗氏(完全及不完全)佐剂，诸如氢氧化铝的矿物凝胶，诸如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇类、聚阴离子、肽类、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚的表面活性物质，以及诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的可能有用的人佐剂。

可以采用通过连续细胞系培养提供抗体分子生产的任何技术制备肽的单克隆抗体。这些包括但不限于杂交瘤技术，其最初由Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495-497，或Kaprowski，美国专利号4,376,110所描述，通过引用纳入本文；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today4：72；Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030)；以及EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。此外，可采用通过将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同具有适当生物学活性的人抗体分子的基因一起剪接而为生产“嵌合抗体”开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454，Boss，美国专利号4,816,397；Cabilly，美国专利号4,816,567；通过引用纳入本文)。或者可以制备“人源化”抗体(见例如，Queen，美国专利号5,585,089，通过引用纳入本文)。或者可以采用单链抗体生产所描述的技术(美国专利号4,946,778)来生产肽特异性单链抗体。

包含特异性结合位点缺失的抗体片段可以由已知技术生成。例如，这样的片段包括但不限于胃蛋白酶消化抗体分子得到的F(ab′)₂片段和还原F(ab′)₂片段二硫键得到的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)，从而能快速而方便地鉴定对感兴趣肽具有所需特异性的单克隆Fab片段。

对所需肽具有特异性的抗体或抗体片段可以连接到，例如琼脂糖，抗体-琼脂糖复合物可用于免疫层析以纯化本发明的肽。见Scopes，1984，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag New York，Inc.，NY，Livingstone，1974，Methods In Enzymology：ImmunoaffinityChromatography of Proteins 34：723-731。

本发明还涵盖了包含多组氨酸标签的ApoA1模拟多肽。多组氨酸标签是蛋白质中由至少6个组氨酸(His)残基组成的一种氨基酸基序，经常位于蛋白质的N或C末端。也称为六组氨酸标签、6xHis-tag，商标名为

(EMD生物科学公司(EMD Biosciences))。多组氨酸标签可用于在大肠杆菌或其它原核表达系统中表达的多组氨酸标记重组蛋白的亲和纯化。通过离心收获细菌细胞，可采用物理方法、表面活性剂或酶，例如溶菌酶裂解得到的细胞沉淀物。粗裂解液在该阶段包含混在其它细菌蛋白质中的重组蛋白，与诸如NTA琼脂糖、HisPur树脂或Talon树脂等亲和介质一起温育。这些亲和介质包含结合的金属离子镍或钴，多组氨酸标签以微摩尔级的亲和力与之结合。接着用磷酸盐缓冲液洗涤树脂，除去没有与钴或镍离子特异性相互作用的蛋白质。可以添加20mM咪唑来提高洗涤效率，然后通常用150-300mM咪唑洗脱蛋白质，但是也使用更高的浓度。蛋白质的纯度和含量可以通过SDS-PAGE和蛋白质印迹评价。

当重组蛋白是在原核宿主生物中表达时，使用多组氨酸标签的亲和纯化通常可以获得较纯的蛋白质。在特定的情况下或为了达到特定的目的，例如纯化蛋白复合物以研究被修饰的ApoA1多肽相互作用，从诸如酵母、昆虫细胞或其它真核生物等更高级生物中进行纯化可能要求使用两个标签的串联亲和纯化以产生更高纯度。或者，使用固定钴离子而不是镍离子的一步纯化方法一般可以实质性提升纯度，且洗脱组氨酸标签标记的蛋白质所需的咪唑浓度也更低。

本发明的另一个方面涉及编码前述的修饰ApoA1模拟多肽的核酸。本发明的核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。在DNA中，ApoA1互补DNA(cDNA)(例如，Breslow等(1982)Proc.Nat.Acad.Sci.79：6861-6865，分离并鉴定了人ApoA1的cDNA克隆)、基因组DNA(gDNA)、杂交序列、合成或半合成序列均可使用。此外，核酸还可以经过化学修饰，例如，为达到增加其对核酸酶的抗性、其细胞穿透或细胞寻靶、其治疗效果等。这些核酸可以来自人、动物、植物、细菌、病毒、合成等。这些核酸可以通过本领域技术人员已知的任何技术获得，特别是通过筛选文库、化学合成或包括对筛选文库获得的序列进行化学或酶修饰的混合方法。

本发明的另一个方面涉及可用于促进包含至少一部分ApoA1模拟物的多肽或蛋白质在原核或真核宿主细胞中表达的核酸序列。对于本发明的重组ApoA1模拟物的生产，所述核酸可以整合入可以是自主复制或整合载体的病毒或质粒载体中。接着该载体用来转染或感染所选细胞群体。然后将收获的转染或感染的细胞在允许所述核酸表达的条件下培养，分离本发明的重组ApoA1模拟物。可用来通过重组方法生产本发明变体的细胞宿主是真核或原核宿主。真核宿主的例子包括动物细胞、酵母或真菌。特别对于酵母，可以使用酿酒酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、许旺酵母属(Schwanniomyces)或汉森酵母属(Hansenula)。对于动物细胞，可以使用COS、CHO、CI27、NIH-3T3等。在真菌中，可以使用曲霉菌(Aspergillus ssp.)或木霉菌(Trichoderma ssp)。对于原核宿主，例如，可以使用下列细菌：大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)或链霉菌(Streptomyces)。然后可将如此分离的变体以治疗作用为目的进行包装。

所以，根据本发明的另一个实施方案，提供的核酸编码一种多肽，该多肽具有能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物或其片段的修饰的氨基酸序列。所述氨基酸序列通过用氨基酸序列中至少一个色氨酸取代氧化剂耐受性氨基酸得到修饰。

如果所述肽完全由基因编码的氨基酸组成，或其一部分由此组成，所述多肽或相关部分也可以采用常规重组基因工程技术合成。对于重组生产，编码所述肽的多核苷酸序列被插入适当的表达载体，即包含所插入编码序列转录和翻译的必要元件的载体，或在RNA病毒载体的情况下，包含复制和翻译的必要元件。接着表达载体转染入合适的靶细胞，表达肽。然后依据所用的表达系统，通过本领域已有的方法分离表达的肽。重组蛋白和肽的生产方法为本领域所熟知(见例如，Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，冷泉港实验室，纽约；以及Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学方案)，格林出版伙伴和威利科学出版社(Greene Publishing Associates andWiley Interscience)，纽约，各自通过引用全文纳入本文)。

为提高生产效率，可将多核苷酸设计为编码由酶切位点分隔的多个肽单元——均聚物(重复的肽单元)或杂聚物(串联在一起的不同肽)均可以照此设计。可以切割获得的多肽(例如用适当的酶处理)来回收肽单元。这样可以提高单个启动子驱动的肽的产量。在一个实例中，可以设计多顺反子多核苷酸以转录出编码多个肽(即均聚物或杂聚物)的单个mRNA，各编码区域操作性连接于帽不依赖型翻译控制序列，例如内核糖体插入位点(IRES)。当用于适当的病毒表达系统时，mRNA编码各肽的翻译均受转录物内部的指导，例如通过IRES。因此，多顺反子构建物指导单个大多顺反子mRNA的转录，进而指导多个个体蛋白质的翻译。这种方式消除了多聚蛋白的产生和酶加工，可以显著提高单个启动子驱动的肽的产量。

可利用各种宿主表达载体系统来表达本文所述的肽。这些包括但不限于微生物，例如包含适当编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的细菌；包含适当编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；包含适当编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；包含适当编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染的或包含适当编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。

表达系统的表达元件的强度和特异性各有不同。依赖于所用宿主/载体系统，多个转录和翻译元件中的任何元件，包括组成型和诱导型启动子，都可用于表达载体。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用诸如杆状病毒多角体启动子等启动子；当在植物细胞系统中进行克隆时，可以使用来自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或来自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中进行克隆时，可以使用哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白)或哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)；当生成包含多拷贝表达产物的细胞系时，可以配合选择标记使用基于SV40-、BPV-和EBV-的载体。

本发明的寡核苷酸可以是DNA、RNA或其嵌合混合物、衍生物或修饰形式，可以是单链或双链的。这样的寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上进行修饰，来达到例如增强分子稳定性和杂交等。本发明的寡核苷酸还可包括其它基团，例如肽(例如，以在体内对宿主细胞受体进行定位)、促进跨细胞膜转运的试剂(见例如，Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：648-652；PCT公开号WO 88/09810，公开日1988年12月15日)、杂交触发的切割剂(见例如，Krol等(1988)BioTechniques 6：958-976)或嵌入剂(见例如，Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)。为此目的，所述寡核苷酸可以与另一个分子偶联，例如，肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、杂交触发的切割剂等。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用若干基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，编码序列可连接到腺病毒转录/翻译调控复合物，例如，晚期启动子和三联先导序列。然后可通过体外或体内重组将该嵌合体插入腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)会产生可存活并能在感染宿主中表达肽的重组病毒(例如，见Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：3655-3659)。或者，可以使用痘苗7.5K启动子(见例如，Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：7415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49：857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79：4927-4931)。

产生本发明多肽的其它表达系统是本领域技术人员显而易见的。根据本发明的另一个方面，的编码修饰ApoA1多肽的本文所述DNA序列对于提供关于迄今未知的哺乳动物蛋白质的氨基酸序列是非常有价值的。换言之，本发明提供的DNA序列可用于产生新的和有用的病毒和环状质粒DNA载体、新的和有用的转化和转染的原核和真核宿主细胞(包括培养的细菌和酵母细胞及哺乳动物细胞)以及培养生长能表达修饰的氧化剂耐受性ApoA1多肽及其相关产物的宿主细胞的新的和有用的方法。

或者，可以不使用载体来促进在宿主中相对稳定地存在。例如，同源重组可促进与宿主基因组的整合。可以将核酸置于药学可接受的运载体中来促进细胞摄取，例如脂质溶液运载体(例如荷电脂质)、脂质体或多肽运载体(例如多赖氨酸)。一篇关于基因治疗的综述是Verma，Scientific American，1990年11月，68-84页，通过引用纳入本文)。

可以首先将所需核酸置于细胞中，并将所述细胞给予患者(例如移植组织)，或可以直接将所需核酸给予患者以供体内摄取。可以利用影响所述细胞生长或增殖的一个或多个因子培养待转移到接受者的细胞，例如SCF。

本发明还可利用编码修饰的氧化剂耐受性ApoA1模拟物偶联，例如融合蛋白的核酸分子。这样的核酸可通过制备引入合适宿主时表达ApoA1模拟物融合蛋白的构建物(例如表达载体)而获得。例如，看如下所示制备这样的构建物：将编码能促进胆固醇流出荷脂细胞的修饰的氧化剂耐受性ApoA1模拟蛋白的第一多核苷酸与编码另一蛋白质的第二多核苷酸框内融合，从而构建体在合适表达系统中的表达产生了融合蛋白。

采用分子生物学技术不难制备ApoA1模拟融合蛋白。利用本文公开的和本领域已知的治疗试剂可设计和制备任何融合蛋白。融合蛋白技术不难适用于制备其中的两部分通过选择性可切割肽序列连接的融合蛋白。使用重组DNA技术来达到这样的目的如今是本领域技术人员的标准做法。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术以及体内重组/遗传重组。此外，DNA和RNA的合成可以利用自动合成器来完成。

制备这样的融合蛋白一般需要制备第一第二两个DNA编码区域，并在框内架功能性连接两个区域，从而制备编码所需融合蛋白的单个编码区。一般认为，构建体哪个部分制备为N末端区域或C末端区域并不是特别相关。

本发明还涉及药物组合物和/或制剂及这种组合物在治疗高脂血症、高胆固醇血症、冠心病及动脉粥样硬化方面的应用。本发明的药物组合物可以包括作为活性成分的ApoA1模拟多肽或其片段以及适于给药和体内递送的药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物一般包含有效量的修饰ApoA1多肽或其片段，溶解或分散于药学上可接受的运载体或水性介质中。也考虑了联合疗法，同一类型的基本药物组合物可以用于单剂和复合药剂。

短语“药学或药理学上可接受”是指视需要给予动物或人时，不产生有害、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。兽医学用途同样包括在本发明内，且“药学上可接受”制剂包括临床和兽医应用的制剂。

本文使用的“药学上可接受的运载体”包括任一和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂等。这些介质和试剂在药物活性物质方面的应用为本领域所熟知。除了任一常规介质或试剂与所述活性成分无法相容外，包括其在治疗组合物中的应用。就对人给药来说，制剂应该满足FDA生物制品办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度的标准。补充活性成分也可掺入组合物。

运载体的例子包括溶剂和分散介质包含诸如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其混合物以及植物油。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖类或氯化钠。可以通过以下方法保持适当的流动性，例如使用诸如卵磷脂的包衣、在分散的情况下保持所需的颗粒大小和/或使用表面活性剂。

本发明包括通过各种途径给予所述药物组合物。包含本发明ApoA1模拟多肽或其片段的药物组合物可以通过保证循环中生物利用度的任何途径给予。这些途径可以包括但不限于口服、鼻腔给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮给药、吸入给药以及肌肉内注射。

可注射制品包括水性或油性载体配制的活性成分的无菌悬浮液、溶液或乳液。所述组合物还可包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射用制剂可以是单位剂形，例如，存在于安瓿或多剂量容器，可包含添加的防腐剂。

或者，可注射制剂可以是粉末形式以便在使用前与载体进行重建，载体包括但不限于无菌无热原水、缓冲液、葡萄糖溶液等。为此目的，可以冻干本发明的ApoA1模拟多肽，或可以制备共同冻干的肽-脂质复合物。储存的制剂可以是单位剂形，在体内使用前进行重建。

就延长递送来说，可以将活性成分制备为长效制剂，以便通过植入给药，例如，皮下、皮内或肌肉内注射。所以例如，活性成分可以用多聚体或疏水材料(例如，作为可接受油配制的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物，例如，作为修饰的ApoA1多肽或其片段的微溶性盐形式。

或者，可以使用制成吸附盘或粘贴片形式的透皮给药系统，其对经皮吸收的活性成分具有缓释作用。为此目的，可以使用渗透促进剂来促进活性成分的透皮渗透。将本发明的修饰的ApoA1多肽或其片段或肽-脂质复合物掺入用于缺血性心脏病和高胆固醇血症患者的硝酸甘油贴片内，可以达到极佳效果。

就口服来说，可以利用药学上可接受的赋形剂将所述药物组合物通过常规方法制备为诸如片剂或胶囊的形式，所述赋形剂是例如，结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧甲基淀粉钠)或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。可以采用本领域所熟知的方法为片剂包衣。口服给予的液体制剂可以制备为诸如溶液、糖浆或悬液等形式，或可以是干燥产物形式以便在使用前用水或其它合适的载体构建。这样的液态制剂可利用药学上可接受的添加剂，通过常规方法制备，所述添加剂是例如，悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用油脂)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性载体(例如，杏仁油、油质酯类、乙醇或分馏植物油)以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制品还可视需要包含缓冲盐、调味剂、着色剂或甜味剂。看适当配制口服给予的制品以控释活性化合物。

就口腔含化给药来说，所述组合物可以通过常规方式制备为片剂或锭剂形式。就直肠和阴道给药途径来说，活性成分可以制备为溶液(用于贮留灌肠剂)、栓剂或软膏。

就吸入给药来说，可以利用推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它气体，从加压包或喷雾器方便地递送气溶胶喷雾形式的活性成分。就加压气溶胶来说，剂量单位可以通过提供计量阀门来确定，从而递送计量用量。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制为包含化合物和合适粉基，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中，所述装置可包含一个或多个含活性成分的单位剂形。例如，所述包装可以包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分配器装置可以附带给药说明。

“单位剂量”制剂是指包含适应具体定时给药的给药成分的剂量或亚剂量的那些制剂。例如，例示性“单位剂量”制剂是指包含日剂量或单位、日亚剂量、或周剂量或周单位、或周亚剂量等的那些制剂。

在常规的储存和使用条件下，所有这些制剂均应包含防腐剂以防止微生物的生长。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等阻止微生物的作用。可通过使用延缓吸收的试剂组合物，例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。

在进行配制之前或当时，修饰的ApoA1多肽或其片段应经广泛透析以除去不需要的小分子量分子，和/或经冻干以在适当的情况下更易配制到所需载体内。将适当溶剂中的所需量的活性剂与以上列举的各种其它成分(视需要)相掺混，再经过滤除来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种灭菌的活性成分掺入包含基本分散介质和以上列举的所需其它成分的无菌载体制备分散液。

就制备无菌可注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，从而产生活性成分的粉末，外加来自其之前无菌过滤溶液的任何附加所需成分。

可利用药物的“缓释”胶囊或“持续释放”组合物或制剂，它们通常是适用的。缓释制剂一般设计为能在一段延长的时间内提供恒定药物水平，可以用于递送本发明的ApoA1模拟多肽或其片段。

在某些实施方案中，脂质体和/或纳米颗粒还可与ApoA1模拟多肽或其片段一起使用。脂质体的制备和使用一般为本领域技术人员所知，并总结如下。脂质体由磷脂形成，磷脂分散于水性介质中，并自发形成多层的同心双层囊泡(也被称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径一般为25nm-4μm。对MLV进行超声处理会形成小的单层囊泡(SUV)，其直径为

其中心处含水性溶液。还可通过与磷脂脂质体的自发反应或胆酸盐透析步骤将ApoA1模拟多肽或其片段制备成直径为8-20mn的磷脂盘。

纳米胶囊一般可以稳定而可重复地夹带化合物。为了避免胞内多聚体超负荷引起的副作用，这些超微粒(约0.1μm大小)的设计应采用体内可降解的聚合物。本发明考虑使用满足这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒，这些颗粒不能制备。

另外的药理学活性剂可以随诸如本发明多肽等主要活性剂一起递送。治疗可以包括但不限于所涉及药物的同时或顺次给药。在一个实施方案中，这些试剂包括但不限于降低动脉粥样硬化和/或其并发症风险的试剂。这些试剂包括但不限于β阻滞剂、β阻滞剂与噻嗪类利尿剂联合用药、抑制素、阿司匹林、ACE抑制剂、ACE受体抑制剂(ARB)等。

β阻滞剂的例子包括但不限于心选择性β阻滞剂(选择性β1阻滞剂)，例如，醋丁洛尔(Sectral)、阿替洛尔(Tenormin)、倍他洛尔(Kerlone)、比索洛尔(Zebeta)、美托洛尔(Lopressor)等。非选择性阻滞剂(对β1和β2同等阻断)的例子包括但不限于卡替洛尔(Cartrol)、纳多洛尔(Corgard)、喷布洛尔(Levatol)、吲哚洛尔(Visken)、普萘洛尔(Inderal)、噻吗洛尔(Blockadren)、拉贝洛尔(Normodyne，Trandate)等。

β阻滞剂与噻嗪类利尿剂组合的例子包括但不限于美托洛尔HCT、ZIAC、阿替洛尔、纳多洛尔和苄氟噻嗪片剂(Corzide)、提莫莱德(Timolide)、普萘洛尔LA 40/25、盐酸萘心安一氢氯噻嗪制剂(Inderide)、诺莫载德(Normozide)等。

抑制素的例子包括但不限于普伐他丁(普拉瓦科公司(Pravachol)/布里斯托-美时施贵宝(Bristol-Myers Squibb))、辛伐他汀(佐科公司(Zocor)/默克公司(Merck))、洛伐他汀(默瓦克公司(Mevacor)/默克公司)、立普妥(辉瑞制药(Pfizer))等。

ACE抑制剂的例子包括但不限于卡托普利(例如施贵宝公司的开博通(Capoten))、贝那普利(例如诺华公司的洛汀新(Lotensin))、恩纳普利(例如默克公司的瓦索泰克(Vasotec))、福辛普利(例如布里斯托-美时的蒙诺(Monopril))、赖诺普利(例如默克公司的普宁维(Prinivil)或A&Z公司(Astra-Zeneca)的捷赐瑞(Zestril))、喹那普利(例如P&D公司(Parke-Davis)的阿奎普利(Accupril))、雷米普利(例如H-M-R皇家制药公司(Hoechst MarionRoussel，King Pharmaceuticals)的阿泰克(Altace))、咪达普利、培哚普利(例如R-P-R公司(Rhone-Polenc Rorer)的阿瑟昂(Aceon))、群多普利(例如科诺制药公司(Knoll Pharmaceutical)的玛维克(Mavik))等。合适的ARB(ACE受体阻滞剂)包括但不限于氯沙坦(例如默克公司的科素亚(Cozaar))、依贝沙坦(例如赛诺菲公司(Sanofi)的阿瓦普罗(Avapro))、坎地沙坦(例如阿斯塔默克公司(Astra Merck)的阿特坎得(Atacand))、缬沙坦(例如诺华公司的代文(Diovan))等。

本发明的另一个方面涉及治疗心血管疾病的方法。此处使用的“心血管疾病”是指涉及心脏或血管(动脉和静脉)的疾病。“心血管疾病”还指影响心血管系统的任何疾病，可用来指与动脉粥样硬化相关的疾病(动脉疾病)。心血管疾病可以包括但不限于动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、脑血管病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、瓣膜病、冠心病、扩张性心肌病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心脏病发作、血管狭窄和静脉血栓栓塞。

此处使用的“动脉硬化”是指大动脉发生的任何硬化(及弹性丧失)(在希腊语中，“Arterio”意为动脉，“sclerosis”意为硬化)，小动脉硬化则是主要影响小动脉的动脉粥样硬化。此处使用的“动脉粥样硬化”是指特定由粥样斑块引起的动脉硬化。所以，动脉粥样硬化是动脉硬化的一种形式。动脉粥样硬化是动脉壁中发生的一种慢性炎症反应，主要是由脂蛋白(携带胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白)沉积引起。其通常称为动脉的“硬化”或“积垢”。由动脉内多个斑块的形成所引起。

此处所述的方法包括给予对象治疗有效或生物有效量的药物组合物，其包含能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物或其片段。所述ApoA1模拟物或其片段的氨基酸序列可如上所述进行修饰，将至少一个色氨酸取代为氧化剂耐受性氨基酸。

“生物有效量”或“治疗有效量”对每个前述的治疗方法来说指产生抗炎症效果、促进细胞胆固醇流出或减轻心血管疾病症状的至少一种修饰ApoA1多肽或其片段的有效用量。

此处使用的“给药”指提供或递送包含至少一种ApoA1模拟多肽或其片段的组合物，提供的用量和时间长度组以产生抗炎症效果、促进细胞胆固醇流出或减轻心血管疾病症状。一般优选蛋白质疗法的被动给药方式，部分是因为其方便且可重复。

由于本发明的多肽具有氧化耐受特性，此处所述的ApoA1模拟多肽和其片段还可用于促进从细胞到肝脏的胆固醇流出的方法。所述方法包括给予细胞生物学有效量的纯化多肽的步骤，所述多肽的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

本发明还涉及减轻对象炎症状态一种或多种症状的方法。术语“减轻”用于“减轻炎症状态一种或多种症状”时指减少、阻碍或消除炎症状态和/或相关病理状态特征性的一个或多个症状。这样的减少包括但不限于减少炎症蛋白的生物合成、减少血浆胆固醇等。所述方法包括给予对象包含ApoA1模拟物或其片段的药物组合物的步骤。对慢性和急性炎症反应的治疗均涵盖在本发明内。

本发明还有另一方面涉及促进伤口愈合和/或治疗或减轻内皮损伤的方法，例如在血管损伤(例如球囊血管成形术)之后会发生的动脉内皮细胞损伤。所述方法可以包括给予对象包含ApoA1模拟物或其片段的药物组合物的步骤。所述ApoA1模拟物或其片段的给药量足以促进内皮细胞迁移和治疗内皮细胞损伤。

本发明的治疗方法和应用还可扩展到提供编码至少一种包含ApoA1模拟多肽或其片段的治疗剂的核酸，采用的方式可以有效引起其在靶症状、靶状态或靶疾病附近表达。任何基因治疗技术均可以采用，例如，裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括离体操作患者细胞等。

应该理解，即使处于ApoA1多肽或其片段的剂量或联合疗法倾向于所需治疗范围低端的情况下，该治疗方法在特定疾病或患者的背景下仍然可能产生与其它所有已知治疗方法同等有效的作用，甚至更加有效。对于临床医生来说不幸的是，某些疾病和病症无法在中长期内有效治疗，但这并不会否定本治疗方法的实用性，特别是该治疗方法与其它一般建议的方案至少同等有效。

本发明治疗方法的目的主要在于产生显著的抗炎作用或胆固醇流出促进作用，同时将剂量仍然保持在与不可接受的毒性相关的水平之下。除改变本身剂量之外，还可改进给药方法以优化治疗策略。

本发明的活性剂还可用于很多情况。例如，据发现，心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、中风等)经常伴随或跟随急性期炎性反应的发作，例如，与复发性炎性疾病相关的反应、病毒感染(例如流感)、细菌感染、真菌感染、器官移植、受伤或其它外伤等。

所以，在某些实施方案中，本发明包括将本文所述的一种或多种活性剂给予具有患急性炎性反应风险或已有急性炎性反应和/或具有患动脉粥样硬化和/或相关病理状态(例如中风)症状风险或已有动脉粥样硬化和/或相关病理状态症状的对象。

所以，例如，可以在流感季节保护性地给予患冠心病或有患病风险的人本发明的一种或多种药物组合物。可用本文所述的一种或多种活性剂治疗发生复发炎性病症(例如，类风湿性关节炎、多种自身免疫性疾病等)的人(或动物)对象，以缓和或防止动脉粥样硬化或中风的发生。可用本发明多肽治疗受外伤(例如，急性损伤、组织移植等)的人(或动物)对象，以缓解动脉粥样硬化或中风的发生。在另一个特定实施例中，可在心肌梗死后通过静脉内注射治疗对象，减小斑块大小并稳定斑块以防破裂和糜烂。

纳入下列实施例以演示本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应理解，下列实施例中公开的技术代表发明者开发的在本发明实施过程中发挥作用的技术，所以可以认为其构成实施发明的优选方式。但是根据本说明书内容，本领域的技术人员应理解，可以对公开的特定实施方案作很多改动，且仍然可以获得同样或相似的结果而并不背离本发明的构思和范围。

实施例

在下列实施例中，我们设法确定修饰ApoA1中的MPO敏感残基，赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸所产生的效应。发现将四个ApoA1色氨酸残基替换为亮氨酸后会导致功能丧失，而将色氨酸替换为苯丙氨酸则不仅保留ApoA1的功能，还可以使其耐受获得MPO的氧化失活作用。

方法

质谱法

通过前述的免疫亲和层析法分离人粥样斑衍生的ApoA1。在甘氨酸缓冲液(pH2.5)中洗脱ApoA1，然后直接进行胰蛋白酶酶解，或先经SDS-PAGE分离，再进行胰蛋白酶胶内酶解。如前所述，进行质谱测定，并获得碰撞诱导解离(CID)光谱。如前所述，在酸水解后，利用重同位素内标，采用由免疫亲和层析分离的人粥样斑或健康志愿者血浆的ApoA1的双重测定分析氯酪氨酸和2-氨基己二酸。

定点诱变和重组ApoA1生产

利用斯特拉塔基因公司的快变诱变试剂盒(QuickChange MutagenesisKit，Stratagene)对色氨酸(8、50、72、108)和甲硫氨酸(86、112、148)残基进行点突变，通过DNA测序确认。将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE-3)pLysS lnJ菌株，如前所述进行ApoA1的表达和纯化。以PBS或MPO反应缓冲液(60mmol/L磷酸钠，100mmol/L氯化钠，100μmol/L二乙烯三胺五乙酸，pH7.0)对rh-ApoA1进行广泛透析，以除去微量的咪唑，经SDS-PAGE分析，发现纯度＞95％。由于色氨酸和甲硫氨酸取代改变了蛋白质的OD₂₈₀值和对BCA或Lowry蛋白质检测的反应性，所以如前所述，基于游离胺基，采用邻苯二甲醛(OPA)试验、以人血浆衍生的ApoA1(生物设计公司(Biodesign))标准品确定蛋白质浓度。通过甲酸处理切割rh-ApoA1的起始甲硫氨酸和His-tag，然后通过快速蛋白液相层析(FPLC)纯化。

ApoA1赖氨酸修饰

用PBS透析人血浆衍生的ApoA1并稀释到0.5mg/mL。如前所述进行赖氨酸的还原性甲基化。赖氨酸修饰的程度由OPA检测确定。然后用MPO反应缓冲液透析ApoA1，赖氨酸被修饰的ApoA1的蛋白浓度利用BCA试剂确定。

ApoA1MPO和次氯酸修饰

如前所述制备终浓度为57nmol/L的MPO，将其加入经MPO反应缓冲液广泛透析的100μg/mL(3.5μmol/L)的ApoA1中。通过在37℃下每隔15分钟加入与ApoA1不同摩尔比的4等分过氧化氢来启动反应，温育持续90分钟后，加入2mmol/L的L-甲硫氨酸终止反应。就ApoA1的化学修饰来说，在37℃下，每隔15分钟将不同浓度的4等分次氯酸钠(NaOCl)加入溶于MPO缓冲液的100μg/mL ApoA1中。经过60分钟的总温育时间后，加入2mmol/L的L-甲硫氨酸终止反应。

ABCA1-依赖性胆固醇流出检测

如前所述，用[³H]胆固醇标记RAW264.7小鼠巨噬细胞，并用0.3mmol/L的8Br-cAMP处理以诱导ABCA1活性。洗涤细胞，有0.3mmol/L 8Br-cAMP存在和有或没有各种ApoA1制备物存在的条件下，对其在无血清培养基中进行4小时的追踪。短暂离心沉淀碎片后测定追踪介质中的放射性。在计数前蒸发闪烁计数瓶内的溶剂，利用己烷∶异丙醇(3∶2)进行萃取来确定细胞的放射性。胆固醇流出百分比以100X(介质dpm)/(介质dpm+细胞dpm)计算。

脂质结合活性检测

如前所述，通过抑制磷脂酶C(PLC)介导的人低密度脂蛋白聚集来测定ApoA1的脂质结合活性。我们早已证明，这种检测方法得到的结果与DMPC分散清除检测观察到的相似，但是灵敏度更高且所需ApoA1更少。该检测中使用的ApoA1的终浓度是12.5μg/mL，足以将起始的LDL聚集率降低约75％。

ApoA1交联检测

在SDS样品缓冲液中对每条泳道上的250ngApoA1进行变性处理，再将其置于10％的氨基丁三醇-甘氨酸凝胶上在SDS存在下进行电泳，然后将所述蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。依次用山羊抗人ApoA1第一抗体(1∶1000稀释，DiaSorin)和兔抗山羊HRP偶联抗体(1∶1000稀释)探测所述膜，利用增强的化学发光底物对ApoA1进行显像。

结果

人粥样斑中的ApoA1修饰

我们测定了分离自人动脉粥样硬化细胞的ApoA1是否包含修饰的色氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸残基。通过串联质谱法，我们在所有四个色氨酸位点，第8、50、72、108位均能检测到单羟基色氨酸残基，在ApoA1内的第108位检测到双羟基色氨酸(图1A-F)。我们之前曾在体外MPO修饰的ApoA1中的W72残基处检测到单-和双-羟基色氨酸(Peng，D.Q.，Wu，Z.，Brubaker，G.，Zheng，L.，Settle，M.，Gross，E.，Kinter，M.，Hazen，S.L.和Smith，J.D.(2005)J Biol Chem 280，33775-33784)。此外，我们还在第48个和第112个残基处检测到甲硫氨酸亚砜(图1D、E)。为了寻找MPO产生的HOCl进行的赖氨酸修饰，我们联用稳定同位素稀释HPLC和在线串联质谱分析来定量测定2-氨基己二酸，其是MPO产生的氧化剂氧化赖氨酸的终产物。分离自六个健康志愿者血浆的ApoA1中的2-氨基己二酸水平较低但是还可以检测到，而分离自六个人动脉粥样硬化样本的ApoA1中的平均水平则突出地上升约16倍(图2，双尾t检验p＝0.005)。所以，在生理学上，ApoA1的色氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸氧化发生在人粥样斑中。所以我们设法确定这些修饰中的哪一个负责产生接受细胞胆固醇能力降低的功能异常性ApoA1修饰。

ApoA1的赖氨酸修饰

在ApoA1的两亲性结构中，21个赖氨酸残基大多位于疏水面两侧和附近。MPO引起的赖氨酸修饰是负责MPO诱导的ApoA1功能丧失的一个有吸引力的候选因素，如我们之前证明的那样，MPO修饰ApoA1的赖氨酸残基，ApoA1赖氨酸残基广泛的化学修饰改变其正电荷，导致ApoA1胆固醇受体活性的丧失。但是我们还发现，还原性甲基化引起的赖氨酸修饰可以保持赖氨酸的正电荷，仅造成ApoA1功能适度降低。ApoA1经还原性甲基化作用，从而引起92％的赖氨酸修饰，或经控制温育并以MPO反应缓冲液进行广泛透析。利用催化剂量的MPO和摩尔比升高的H₂O₂∶ApoA1进行修饰反应。利用经cAMP类似物预处理以诱导ABCA1的胆固醇标记的RAW264巨噬细胞检测对反应产物的胆固醇受体活性。修饰反应中没有H₂O₂时，甲基化和非甲基化对照ApoA1具有强而等同的ABCA1依赖性胆固醇受体活性。随着H₂O₂的剂量不断增加，甲基化和对照ApoA1样品的胆固醇受体活性以相似模式下降(图3)。此外，通过CD对这些制备物的α螺旋含量进行估计，甲基化和对照ApoA1制品类似地对α螺旋含量的MPO/H₂O₂剂量依赖性降低敏感。虽然赖氨酸伯胺基经还原性甲基化转变为叔胺基后会降低其化学反应活性，但是不会对ApoA1功能产生保护作用，所以MPO引起的ApoA1赖氨酸修饰不大可能导致ApoA1功能丧失。

甲硫氨酸修饰对MPO诱导的ApoA1功能丧失不具有保护作用

然后我们将注意力转向之前涉及MPO诱导的ApoA1功能丧失的三个ApoA1甲硫氨酸残基。为了将所有三个甲硫氨酸取代为缬氨酸，我们使用在N末端添加有另外的甲硫氨酸起始密码子和6His-tag的重组人ApoA1(rh-ApoA1)。我们之前曾证明，rh-ApoA1与血浆衍生的ApoA1在胆固醇受体活性、脂质结合活性以及对MPO介导功能丧失的易感性方面具有相似特性。我们采用定点诱变产生了ApoA1表达构建物，其编码三个内部甲硫氨酸转变为缬氨酸的蛋白质，我们将其称为rh-ApoA1 3MV(3个甲硫氨酸转变为缬氨酸)。起始甲硫氨酸不能取代。但是如前所述(Ryan，R.O.，Forte，T.M.和Oda，M.N.(2003)Protein Expr.Purif.27，98-103)，由于第2位的谷氨酸取代为天冬氨酸后在His-tag附近产生独特的甲酸敏感性天冬氨酸-脯氨酸二肽，可以通过甲酸温育化学切割该甲硫氨酸和His-tag。我们已确定，无论起始甲硫氨酸和His-tag保持完整或被除去，与野生型rh-ApoA1相比，rh-ApoA1 3MV具有相似的ABCA1依赖性胆固醇受体活性。此外，无论是否具有N末端甲硫氨酸，rh-ApoA1 3MV和野生型rh-ApoA1对高剂量(H₂O₂∶ApoA1＝15∶1)MPO介导的胆固醇受体活性丧失具有等同的易感性(图4A)。rh-ApoA1和3MV变体的MPO修饰在不同和适度的H₂O₂∶ApoA1摩尔比下进行，低摩尔比下，3MV变体对胆固醇受体活性丧失更为敏感(图4B)。例如，H₂O₂∶ApoA1摩尔比为1.4时，野生型ApoA1胆固醇受体活性的丧失可以忽略不计，而3MV变体则丧失掉大约一半的胆固醇受体活性。所以我们发现，ApoA1中的三个甲硫氨酸实际上通过无害地吸收氧化剂而发挥保护作用，而并没有在ApoA1功能的氧化损伤中起作用。

ApoA1的色氨酸残基在ApoA1功能中发挥作用

接着我们通过将四个色氨酸残基各自改为亮氨酸(rh-ApoA1 4WL)或苯丙氨酸(rh-ApoA1 4WF)来检测ApoA1色氨酸残基的作用。由于在针对宽范围ApoA1剂量进行的胆固醇流出研究中4WL变体丧失了大部分的胆固醇受体活性，而4WF变体则保持了该活性(图5A)，色氨酸残基的芳香性似乎对ApoA1的胆固醇受体活性是关键的。我们采用K2d算法，通过CD检测了这些蛋白质的预计α螺旋含量，发现野生型蛋白质含有57％的α螺旋，而4WL和4WF变体的α螺旋含量则分别上升为79％和77％。所以4WL变体流出和脂质结合活性的丧失不能归因于螺旋含量的损失。

rh-ApoA1和4WF变体在H₂O₂剂量不断增加时均易受MPO/C1^-/H₂O₂氧化系统的影响。图5B显示代表4个不同实验的研究结果，每个实验使用各蛋白质的两种独立制备物。如之前所观察到的，野生型ApoA1的ABCA1依赖性胆固醇受体活性被不断增加的MPO诱导氧化作用所抑制；但是4WF变体甚至在H₂O₂∶ApoA1比为15时仍然保持了该活性。

MPO/Cl^-/H₂O₂氧化系统可以生成HOCl(漂白活性剂)，我们和其他人在之前已证明，HOCl处理ApoA1会导致胆固醇受体和脂质结合活性丧失。所以我们将野生型ApoA1和4WF变体置于剂量不断增加的HOCl之下。与关于MPO修饰系统的发现相似，4WF变体的胆固醇受体活性耐受该处理，而野生型rh-ApoA1的流出活性则受到剂量不断增加的HOCl的损伤(图6)。

通过DMPC乳化液清除法检测rh-ApoA1和4WF变体的脂质结合活性，两种蛋白质表现出等同的活性(图7A)。与rh-ApoA1(图4B)相比，采用PLC介导的LDL凝聚试验(图7B)，rh-ApoA1 4WF的无细胞脂质结合活性也耐受MPO介导的抑制作用。

ApoA1的MPO修饰导致广泛交联，从而产生二聚体、多聚体以及可能的分子内交联。我们之前已证明，在所有7个色氨酸均转变为苯丙氨酸的变体内，MPO介导的ApoA1交联模式并未改变。当在H₂O₂剂量不断增加时，将rh-ApoA1和4WF变体置于MPO/Cl^-/H₂O₂氧化作用(使用与图5B中流出实验相同的蛋白质产物)下时，我们发现变性凝胶中两种蛋白质迁移的改变与分子间交联一致。但是迁移模式不同，4WF变体在70kD处有一条清晰的主要条带，而野生型蛋白质则在55到65kD之间产生了一个清晰度较低的主要条带区域(图8)。两种蛋白质单体的迁移均发生了改变，可能表明分子内交联或氨基酸修饰。虽然4WF变体耐受MPO介导的胆固醇受体活性丧失，但是该变体对MPO诱导的交联作用却更为敏感，特别是在低剂量的H₂O₂下。我们还通过CD分析了这些修饰蛋白的结构，发现两种蛋白质均对α螺旋含量损失易感，而4WF变体的易感起始值更高些。

我们还利用POCP和野生型或4WF ApoA1通过胆酸盐透析制备了rHDL。通过约9.8、12和17nm处非变性凝胶，估计二者产生相似模式的rHDL圆盘，且没有任何剩余的无脂质ApoA1(图9)。我们对野生型和4WF rHDL进行了测试，二者对于介导RAW264.7细胞的非ABCA1依赖性胆固醇流出的等同能力(图10)，而不具有ABCA1依赖性受体活性，如完全脂质化ApoA1所预期。

我们合成了之前所述的螺旋两亲性肽p18，其在第2位含有色氨酸残基。我们还合成了将色氨酸替换为苯丙氨酸(P18WF)或亮氨酸(P18LF)的类似物。我们证明该无色氨酸肽具有剂量依赖性ABCA1介导的胆固醇受体活性(图11)。

根据以上对本发明的描述，本领域的技术人员应该意识到改进、改动和修改。本领域技术人员知晓的改进、改动和修改确应为随附的权利要求书所涵盖。本发明引用的所有参考文献、出版物和专利通过引用全文纳入本文。

Claims

1.一种纯化多肽，其包含能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物，所述ApoA1模拟物具有的氨基酸序列包含含有至少一个色氨酸的ApoA1或ApoA1的模拟物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个来自所述ApoA1或ApoA1的模拟物的色氨酸被氧化耐受性氨基酸所取代。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoA1模拟物耐受以下氧化作用的至少一种：MPO引起的氧化作用、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/Cl^-系统相关的氧化作用、HOCl/OCl^-引起的氧化作用、MPO产生的活性氮引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统相关的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、过氧亚硝酸根(ONOO^-)引起的氧化作用、亚硝基过氧碳酸根(ONOOCO₂ ^-)引起的氧化作用或ONOO^-在有CO₂或缓冲液中有HCO₃ ^-存在下起作用时生成产物引起的氧化作用。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID NO：1的至少一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoA1模拟物基本由约天然ApoA1的5到50个氨基酸组成，其包含至少一个色氨酸，且所述至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

6.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述ApoA1模拟物包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2-69组成的组，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性氨基酸，且至少一个X用于取代氧化剂耐受性残基。

7.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个“D”氨基酸残基。

8.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所有或大多数对映体氨基酸是“D”氨基酸。

9.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含保护基团。

10.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含多组氨酸标签。

11.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽在给予对象时耐受对髓过氧化酶(MPO)失活作用引起的氧化失活作用。

12.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是融合蛋白。

13.一种纯化载脂蛋白多肽，其包含天然载脂蛋白的氨基酸序列，所述氨基酸序列通过将天然氨基酸序列的一个或多个色氨酸残基取代为氧化剂耐受性氨基酸而得到修饰。

14.一种包含如权利要求1所述多肽和药学可接受的赋形剂的药物组合物。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物配制成通过以下途径给予对象：口服、鼻部给药、直肠给药、腹膜内注射、血管内注射、皮下注射、经皮给药、吸入给药和肌肉内注射。

16.一种治疗心血管疾病的方法，包括以下步骤：

给予对象能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物，所述ApoA1模拟物具有的氨基酸序列包含含有至少一个色氨酸的ApoA1或ApoA1的模拟物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个来自ApoA1或ApoA1的模拟物的色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物耐受以下氧化作用的至少一种：MPO引起的氧化作用、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/Cl^-系统相关的氧化作用、HOCl/OCl^-引起的氧化作用、MPO产生的活性氮引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统相关的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、过氧亚硝酸根(ONOO^-)引起的氧化作用、亚硝基过氧碳酸根(ONOOCO₂ ^-)引起的氧化作用或ONOO^-在有CO₂或缓冲液中有HCO₃ ^-存在下起作用时生成产物引起的氧化作用。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，包含SEQ ID NO：1的至少一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物基本由天然ApoA1的约5到50个氨基酸组成，其包含至少一个色氨酸，且所述至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2-69组成的组，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性氨基酸，且至少一个X用于取代氧化剂耐受性残基。

22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述多肽在给予对象时耐受髓过氧化酶(MPO)失活作用引起的氧化失活作用。

23.一种促进胆固醇流出细胞的方法，包括以下步骤：

给予所述细胞生物学有效剂量的能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物，所述ApoA1模拟物具有的氨基酸序列包含含有至少一个色氨酸的ApoA1或ApoA1的模拟物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoA1模拟物的氨基酸序列中至少一个来自ApoA1或ApoA1的模拟物的色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述多肽不实质性抑制载脂蛋白脂质结合和胆固醇流出。

25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物耐受以下氧化作用的至少一种：MPO引起的氧化作用、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/Cl^-系统相关的氧化作用、HOCl/OCl^-引起的氧化作用、MPO产生的活性氮引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统相关的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、过氧亚硝酸根(ONOO^-)引起的氧化作用、亚硝基过氧碳酸根(ONOOCO₂ ^-)引起的氧化作用或ONOO^-在有CO₂或缓冲液中有HCO₃ ^-存在下起作用时生成产物引起的氧化作用。

26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，包含SEQ ID NO：1的至少一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物基本由天然ApoA1的约5到50个氨基酸组成，其包含至少一个色氨酸，且所述至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2-69组成的组，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性氨基酸，且至少一个X用于取代氧化剂耐受性残基。

30.一种减轻对象中炎性病症的一种或多种症状的方法，包括：

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述炎性病症包括动脉粥样硬化。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述炎性病症包括狭窄。

33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，还包括给予所述对象抑制素的步骤。

34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物耐受以下氧化作用的至少一种：MPO引起的氧化作用、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/Cl^-系统相关的氧化作用、HOCl/OCl^-引起的氧化作用、MPO产生的活性氮引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统相关的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、过氧亚硝酸根(ONOO^-)引起的氧化作用、亚硝基过氧碳酸根(ONOOCO₂ ^-)引起的氧化作用或ONOO^-在有CO₂或缓冲液中有HCO₃ ^-存在下起作用时生成产物引起的氧化作用。

35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，包含SEQ ID NO：1的至少一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

37.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物基本由天然ApoA1的约5到50个氨基酸组成，其包含至少一个色氨酸，且所述至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2-69组成的组，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性氨基酸，且至少一个X用于取代氧化剂耐受性残基。

39.一种缓和MPO氧化剂导致的ApoA1、其包含色氨酸的片段或其模拟物的胆固醇流出功能丧失的方法，包括将所述ApoA1、其片段或其模拟物的至少一个色氨酸残基用于取代氧化剂耐受性氨基酸，所述方法包括：

用还原剂耐受性氨基酸取代所述ApoA1、其片段或其模拟物的至少一个色氨酸残基。

40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

41.一种治疗对象的内皮细胞损伤的方法，所述方法包括：

给予对象能促进胆固醇流出荷脂细胞的ApoA1模拟物，所述ApoA1模拟物具有的氨基酸序列包含含有至少一个色氨酸的ApoA1或ApoA1的模拟物的至少一部分氨基酸序列，所述ApoA1模拟肽的氨基酸序列中至少一个来自ApoA1或ApoA1的模拟物的色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，内皮细胞损伤发生在血管损伤之后。

43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoA1的给予量组以促进对象中的内皮细胞迁移。

44.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物耐受以下氧化作用的至少一种：MPO引起的氧化作用、MPO产生的氧化剂、MPO产生的活性氯化物引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/Cl^-系统相关的氧化作用、HOCl/OCl^-引起的氧化作用、MPO产生的活性氮引起的氧化作用、与MPO/H₂O₂/NO₂ ^-系统相关的氧化作用、二氧化氮引起的氧化作用、过氧亚硝酸根(ONOO^-)引起的氧化作用、亚硝基过氧碳酸根(ONOOCO₂ ^-)引起的氧化作用或ONOO^-在有CO₂或缓冲液中有HCO₃ ^-存在下起作用时生成产物引起的氧化作用。

45.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述氧化剂耐受性氨基酸是苯丙氨酸。

46.如权利要求41所述的方法，其特征在于，包含SEQ ID NO：1的至少一部分，其中X选自色氨酸或苯丙氨酸，且至少一个X是苯丙氨酸。

47.如权利要求41所述的方法，其特征在于，ApoA1模拟物基本由天然ApoA1的约5到50个氨基酸组成，其包含至少一个色氨酸，且所述至少一个色氨酸被氧化剂耐受性氨基酸所取代。

48.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述ApoA1模拟物包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2-69组成的组，其中X是色氨酸或氧化剂耐受性氨基酸，且至少一个X用于取代氧化剂耐受性残基。