CN102174421A - 产甘油酿酒酵母nau-zh-gy1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1及其应用，属于微生物发酵领域，该菌是从未加工的蜂蜜中分离得到，经鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号CGMCC No.4551。该菌株通过液体发酵，发酵培养物中富含有甘油，大量酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等微生物代谢物质，应用于反刍动物围产期饲料添加剂生产，甘油可作为能量补充物缓解能量负平衡；酵母菌和氨基酸、维生素等微生物代谢物质，可调节动物胃肠道菌群，拮抗病原微生物，提高机体免疫力，并促进营养物质转化吸收，提高生产性能，将是一种绿色、营养、安全、性价比高的新型饲料添加剂。

Description

产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1及其应用

技术领域

本发明涉及一种产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1及其应用，属于微生物发酵领域，是利用微生物发酵的方法生产甘油，适用于反刍动物饲料添加剂的生产。

背景技术

反刍动物的围产期是指妊娠后期(产前2～3周)至泌乳初期(产后2～3周)这一阶段，亦称为过渡期，由于妊娠后期采食量下降，干物质摄入减少，满足不了胎儿生长发育和自身能量代谢的需要，而产后泌乳高峰(产后4～6周)先于干物质摄入高峰(产后8～10周)，使机体处于能量负平衡这样一种营养应激状态。研究表明，妊娠后期胎儿消耗的葡萄糖可占母体所产生葡萄糖的46％，而泌乳高峰期消耗的葡萄糖则高达85％，因此常易导致能量代谢障碍，引发酮病、脂肪肝、产乳热等一系列围产期疾病，严重影响牛、羊等反刍动物养殖业的发展。

由于高产品种的引进、培育，高能饲料的开发、利用，规模化饲养程度的提高等原因，围产期能量代谢障碍疾病的发病率长期以来一直居高不下。我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的15.0％～30.0％，印度为14.7％，美国为5.0％，日本高达43.1％。我国奶牛脂肪肝的发病率超过30.0％，美国为35.0％～66.0％。据国外报道，1头酮病奶牛仅治疗药物及奶产量下降所造成的损失即达151～312美元。除此以外，奶牛酮病、脂肪肝还因其常常诱发真胃变位、胎衣不下及生产瘫痪等围产期其他的疾病，给奶牛业带来严重的经济损失。因此，防控高产奶牛围产期能量代谢障碍疾病是确保奶牛高效安全生产的重要任务之一。尽管这方面的研究报道很多，但始终未找到理想的解决方法。

反刍动物体内大部分葡萄糖是通过糖异生途径获取，糖异生作用是指各种生糖前体转变为糖元或葡萄糖的过程，对围产期的反刍动物有重要意义，是调节能量代谢障碍的重要途径。由于反刍动物主要靠瘤胃中微生物发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸提供能量，葡萄糖或其他碳水化合物难以直接进入血液或糖异生途径。甘油是一种生糖先质，它具有优于其他生糖先质的糖异生途径，在糖异生过程中通过甘油激酶转化为葡萄糖，而不依赖于限速酶丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。已有人将甘油作为生糖前体添加到围产期奶牛的日粮中，研究表明，甘油可以提高围产期奶牛的血糖，提高泌乳性能，调节血液代谢，降低酮体含量，起到缓解能量负平衡的作用。

目前用作围产期奶牛能量补充物的甘油主要来自生物柴油生产过程的副产物或工业合成，其加工过程中会引入工业有害物质，对奶牛食欲产生不良影响或对机体产生有害刺激；而高纯度甘油则成本高，限制了甘油的推广运用。

近年来，随着生物技术、微生物菌种、发酵工艺和提取分离等各方面技术的进展，使得发酵甘油生产变得具有可能，发酵法产甘油是利用微生物发酵淀粉质原料(玉米、红薯等)或糖蜜等原料物质产生甘油，是一种天然的甘油，克服了工业生产甘油的缺点。工业上常用的微生物有粉状毕赤酵母、产甘油假丝酵母等。但目前还未见有将发酵法生产的甘油用作饲料添加剂的报道，而且传统使用的产甘油酵母并非益生菌。

益生菌是指投入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主(人和动物)健康水平和健康佳态的活菌制剂及其代谢产物，主要包括乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌。在饲料工业中，益生菌添加剂是利用生物技术生产的微生物添加剂的一种，常用的酵母类益生菌有酿酒酵母。在美国，酵母添加剂已作为一种常规的饲料成分得到广泛的应用。其作用机制通常认为有：(1)酵母作为活菌，进入胃肠道后繁殖并活力增强，促进微生物繁殖和增强活性，能有效抑制病原微生物的繁殖，调节胃肠道微生态平衡，参与病原微生物菌群的生存竞争，排斥病原菌在胃肠道粘膜表面的附着，协助机体消除毒素及其代谢产物。(2)提高动物肠道消化酶活性。通过改善胃肠道环境和菌群结构，调控胃肠发酵。减少乳酸盐的产生，提高pH值稳定性，促进有益菌群繁殖及活力的提高，增加有益菌的有效浓度，促进胃肠对营养物质的分解、合成、消化、吸收和利用，从而增加采食量，改善动物对饲料的利用率，提高生产性能；提高动物对纤维素和矿物质的消化率；(3)增强机体免疫力和抗病力，防止毒素和废物的吸收，对动物消化系统起到保健作用；对幼年动物则可刺激胃肠道发育，保障动物健康；(4)酵母分泌的多种消化酶和未知生长因子，维生素、SOD、活性肽、辅酶等营养成分具有促生长作用，分泌的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，参与饲料的降解、消化，提高动物对营养物质的利用率，而且还有降解饲料中复杂碳水化合物(如果胶、葡聚糖、纤维素等)的酶，其中很多是动物本身不具有的酶。一些研究认为，酵母类饲料的作用是基于其提供重要的、能刺激微生物活性的营养因子。

综上所述，以特定的益生菌为菌种，利用各种淀粉质原料或糖蜜作为底物发酵生产甘油，将益生菌的发酵培养物作为围产期反刍动物饲料添加剂，可同时发挥甘油和益生菌的作用，甘油可作为能量补充物缓解能量负平衡；酵母菌和氨基酸、维生素等微生物代谢物质，可调节动物胃肠道菌群，拮抗病原微生物，提高机体免疫力，并促进营养物质转化吸收，提高生产性能。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种能生产甘油以及其他有益微生物代谢物质的酿酒酵母NAU-ZH-GY1，本发明的另一目的在于提供该酿酒酵母NAU-ZH-GY1在发酵产甘油的方法。本发明的又一目的在于提供该产甘油酿酒酵母在发酵产甘油中的应用。本发明的又一目的在于提供该产甘油酿酒酵母在生产反刍动物饲料添加剂中的应用。通过工业化发酵生产形成绿色、营养、安全、性价比高的新型反刍动物饲料添加剂。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供一种产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1，该菌株分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，2011年1月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.4551。

主要生物学特性：显微镜下观察，菌株细胞为近圆形，大小(4.1-8.2)微米*(5.2-9.5)微米，不产生醭膜；以多端芽殖进行无性繁殖；无假菌丝，有子囊孢子产生；琼脂平板上30℃培养24-36h后，菌落乳白色、隆起、表明光滑湿润，有光泽、质地均匀、边缘较整齐。

最适生长温度30℃，pH5.0。

能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖，不能发酵乳糖、纤维二糖、菊糖；不能同化硝酸钾、亚硝酸钠。

该菌株的26S rDNA D1/D2区域具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，与Genbank现有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同一区域碱基序列同源性均达到99％。

产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1发酵产甘油的方法，其过程如下：

1)培养基：

种子培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不调pH，115℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素4，玉米浆干粉5，氯化钠20，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，调节pH 5.0，115℃灭菌20min。

2)培养条件：

一级种子培养：为摇瓶发酵，用500ml三角瓶装种子培养基100mI，将产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1接入种子培养基中，30℃，150rpm摇床培养24小时。

二级种子培养：10L种子发酵罐装种子培养基6L，接种量5％，30℃，150rpm摇床培养24小时。

发酵罐培养：100L全自动搅拌发酵罐装发酵培养基60L，由种子罐流加接种，32℃，接种量10％，pH 5.0，300rpm，通气量0.5vvm，培养48h。

上述的产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1在发酵产甘油中的应用。

上述的产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1在生产反刍动物饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1。本发明还提供了产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1的发酵方法，所产甘油达35.6g/L，活菌数量达到3×10⁹CFU/mL。

本发明中涉及的酵母菌为酿酒酵母，是农业部允许的可直接用于饲喂的益生菌，其发酵所产甘油天然、无毒副作用、安全可靠。该酵母应用于反刍动物围产期饲料添加剂生产，发酵后无需提取甘油，生产工艺简单，对环境无污染，所产甘油能补充动物能量，缓解动物能量负平衡，纠正能量代谢障碍；培养物中大量酿酒酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等有益微生物生理代谢物质，可调节动物胃肠道菌群，拮抗病原微生物，提高机体免疫力和抗病力，促进营养物质的转化和吸收，提高生产性能，将是一种绿色、营养、安全、性价比高的新型饲料添加剂。

具体实施方式

实施例1：产甘油菌株的分离

称量样品(未加工的蜂蜜)10g，放入盛有90mL无菌生理盐水的三角烧瓶中，振荡20min，制成菌悬液，吸取0.1mL菌悬液接种于麦芽汁琼脂培养基，28℃培养箱培养24h。

挑选出酵母菌，分别进行产甘油发酵培养，摇床150rpm，温度28℃，培养48h。培养基配方(g/L)：葡萄糖200，尿素2，KH₂PO₄0.4，不调pH，115℃灭菌20min。

筛选得到一株甘油产量较高的菌，命名为NAU-ZH-GY1，经鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，2011年1月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.4551。

主要生物学特性：显微镜下观察，菌株细胞为近圆形，大小(4.1-8.2)微米*(5.2-9.5)微米，不产生醭膜；以多端芽殖进行无性繁殖；无假菌丝，有子囊孢子产生；琼脂平板上30℃培养24-36h后，菌落乳白色、隆起、表明光滑湿润，有光泽、质地均匀、边缘较整齐；

最适生长温度30℃，pH5.0；

能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖，不能发酵乳糖、纤维二糖、菊糖；不能同化硝酸钾、亚硝酸钠。

该菌株的26S rDNA D1/D2区域具有序列1所示的碱基序列，与Genbank现有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同一区域碱基序列同源性均达到99％。

实施例2：利用产甘油菌株NAU-ZH-GY1发酵产甘油

1)培养基：

种子培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不调pH，115℃灭菌20min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素4，玉米浆干粉5，氯化钠20，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，调节pH 5.0，115℃灭菌20min。

2)培养条件：

一级种子培养：为摇瓶发酵，用500ml三角瓶装种子培养基100mI，将产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1接入种子培养基中，30℃，150rpm摇床培养24小时。

二级种子培养：10L种子发酵罐装种子培养基6L，接种量5％，30℃，150rpm摇床培养24小时。

发酵罐培养：100L全自动搅拌发酵罐装发酵培养基60L，由种子罐流加接种，32℃，接种量10％，pH 5.0，300rpm，通气量0.5vvm，培养48h。

3)发酵结果：甘油35.6g/L，活菌数量3×10⁹CFU/mL。

动物试验

1.试验动物及饲养管理

8只本地成年雄性(去势)2～3岁健康山羊，平均体重18.76±0.94kg，编号为1～8。手术安装永久性瘤胃瘘管。试验期间试验动物采用单栏舍饲，基础日粮组成为精料和苜蓿干(基础精粗比为1∶2)，精料每次饲喂90g/只(精料为玉米、豆粕和麸皮按质量比65∶25∶10混合而成)，苜蓿草180g/只，每天8:00和17:00各饲喂一次，保证充足饮水。苜蓿干草的主要成分(％，质量百分比)：干物质90.54，粗蛋白17.52，粗脂肪2.62，粗纤维29.05，钙1.64，磷0.36。

2.试验设计

试验采用4×4完全拉丁方试验设计，将8只瘘管羊随机分为4组。将试验分为4期，每期预试验7天，正式试验15天。对照组C饲喂基础日粮；低剂量组L饲喂基础日粮+酵母培养物(含甘油30g和酵母菌2.07×10⁹CFU)/头·天；中剂量组M饲喂基础日粮+酵母培养物(含甘油60g和酵母菌4.04×10⁹CFU)/头·天；高剂量组H饲喂基础日粮+酵母培养物(含甘油90g和酵母菌6.07×10⁹CFU)/头·天。每天8:00将酵母培养物经瘤胃瘘管直接添加到瘤胃中。

所有动物于正式试验的第16天清晨空腹，采集瘤胃液样品检测微生物蛋白、氨氮和挥发性脂肪酸，采集颈静脉血液样品检测血浆葡萄糖。

3.样品检测

3.1瘤胃微生物蛋白

瘤胃微生物蛋白(MCP)参照Makkar分步离心法进行样品的预处理，考马斯亮蓝(G250)比色法测定蛋白含量，使用的标准蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，含量为96％～99％Albumin(Sigma)。

(1)试剂配制：

考马斯亮兰溶液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中(保证充分溶解)，加入85％(W/V)的磷酸溶液100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。过夜搅拌后，过滤使用，保质期一周。

(2)标准曲线的配制

将制备好的1mg·mL^-1牛血清蛋白(BSA)母液用双蒸水逐级稀释十个浓度点制作标准曲线。

(3)样品分析

瘤胃液取出解冻用涡旋器涡旋振荡45s～1min(使微生物和食糜分离)在1000r·min^-1转速下离心5min。吸取上清1.5mL于2mL离心管中在低温冷冻离心机中以12000r·min^-1的转速离心30min。取出样品弃上清，向底物中加入0.8mL 0.25mol·L^-1的NaOH，混匀后在100℃水浴锅中水浴20min。反应完全后于12000r·min^-1低温(4℃)离心30min，然后吸取上清100μL，加入5mL制备好的考马斯亮蓝溶液，混匀后于波长595nm处用721分光光度计比色。

3.2氨氮

以硫酸铵为标准品，采用酚-次氯酸比色法。具体步骤如下：

(1)试剂配制：

A试剂：准确称取0.0126g亚硝基铁氰化钠，加50mL ddH₂O溶解后移入250mL的容量瓶中(戴手套)然后加入2.5058g苯酚(在50～60℃水浴中化开，再用小烧杯称量)，混匀后用双蒸水定溶到250mL，摇匀，棕色瓶4℃保存。

B试剂：准确称取1.2505g氢氧化钠加入100mL双蒸水，溶解后加12.6645g的Na₂HPO₄·12H₂O温热搅拌溶解，冷却至室温后加入12.5mL 5.25％次氯酸钠混匀，然后加双蒸水到250mL定容后用滤纸过滤，滤液放置在塑料瓶中4℃避光保存。

(2)标准曲线的制备：

标准储备液即5mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液：配置前将(NH₄)₂SO₄80℃烘干2h。准确称取0.066g烘干的(NH₄)₂SO₄溶于100mL 0.1mol·L^-1盐酸(0.56mL浓盐酸定容到100mL)中即得标准储备液。把上述标准储备液用双蒸水稀释到1mmol·L^-1作为母液，然后逐级稀释为十个浓度点制作标准曲线。

(3)样品分析：

将瘤胃液取出解冻，按3000r·min^-1的转速离心10min以便除去食糜颗粒。离心后吸取0.2mL上层液(必要时应适当稀释)至10mL塑料管中，先加入1.5mL A液，再加入1.5mL B液，用涡旋混合仪混匀后放置在75～85℃水浴锅中反应15min。待反应完全用冰水冷却至室温，用分光光度计在630nm下比色。

3.3挥发性脂肪酸

以巴豆酸为内标用气相色谱法测定挥发性脂肪酸

用5mmol·L-1的巴豆酸作为内标校正，以乙酸(Acetate，A)、丙酸(Propionate，P)、丁酸(Butyrate，B)的标准品各自的保留时间来定性，以三种酸的面积与浓度回归直线方程来定量。然后上样，建立三种酸的面积与浓度回归直线方程。

(1)试剂配制和标准曲线的建立：用5级梯度色谱标准混合建立回归直线。

用移液枪准确吸取344μL乙酸、373μL丙酸、184μL正丁酸和43.6mg的巴豆酸置于100mL的容量瓶中，用氯仿定容，即得混合标准液。其浓度分别为乙酸60mmol·L^-1、丙酸50mmol·L^-1、正丁酸20mmol·L^-1、巴豆酸5mmol·L^-1。将上述混合标准液依次倍比稀释，配制成5级梯度的标准混合液。

酸性吸附剂的配制：按重量比30∶1∶20准确称取无水硫酸钠、50％硫酸(V/V)及硅藻土混匀而成。配制时先将无水硫酸钠研碎，然后加入50％的硫酸，最后加入硅藻土研磨混匀。制备好的酸吸附剂要密封保存，防止吸水变潮，影响测量结果。

(2)色谱分析条件具体为：色谱柱为Agilent19091F-413 HP-FFAP毛细管柱(30.0m×320μm×0.25μm)；柱箱：程序升温，柱箱温度140℃(4min)至240℃(2min)，50℃(1min)。分流比为30∶1，进样量为1μL。检测器FID温度为250℃。

(3)瘤胃液预处理：

将瘤胃液取出解冻，在1000r·min^-1转速下离心5min。取离心后的瘤胃液上清1mL至事先加有3mL 0.5mM％巴豆酸氯仿溶液和2.4g酸性吸附剂的10mL具有塞的玻璃管中。立即加塞，混匀后吸取0.5mL上清至Agilent GC瓶，准备测定。

3.4血浆葡萄糖：采用BECKMAN全白动生化仪分析。

4.试验结果

由表1可得饲喂不同剂量含甘油的酵母培养物，H组丙酸含量显著高于对照组(P＜0.05)，H组乙酸丙酸比例极显著低于对照组(P＜0.01)；H组氨氮浓度显著低于对照组(P＜0.05)；实验组微生物蛋白含量均显著高于对照组(P＜0.05)；H组血浆葡萄糖浓度显著高于对照组(P＜0.05)。

表1围产期饲喂含甘油的酵母培养物对山羊瘤胃发酵和血浆葡萄糖的影响

注：^*表示与对照组差异显著

5.讨论

酵母培养物的饲喂提高了H组的丙酸含量，可能是甘油促进了瘤胃中产丙酸菌的生长，也可能是培养物中酵母菌的作用。

有报道称如果碳水化合物和可溶性氮提供的比较充足的情况，活酵母能够促进微生物的生长，减少氮的损失。本试验在饲喂酵母培养物后，H组氨氮浓度下降，微生物蛋白浓度增加，还有可能是甘油一方面甘油抑制了瘤胃蛋白质分解菌的生长或降低了蛋白质分解活性，使过瘤胃蛋白质增加，另一方面，甘油为微生物提供生长所需能量，促进微生物利用氨氮合成微生物蛋白，使瘤胃微生物蛋白质的合成增加。

山羊血糖浓度的提高，说明饲喂产甘油酵母培养物对升血糖有作用，可能是通过促进瘤胃内丙酸的产量，或者甘油直接吸收进入血液的结果，这为产甘油酵母培养物在反刍动物饲料添加剂上的应用提供了依据。

试验结论：围产期饲喂含甘油的酿酒酵母培养物，可以有效改善山羊能量代谢和调节胃肠道菌群。

优点：该酵母应用于反刍动物围产期饲料添加剂生产，发酵后无需提取甘油，生产工艺简单，对环境无污染，所产甘油具有补充能量缓解动物能量负平衡，纠正能量代谢障碍的作用；培养物中大量酿酒酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等有益微生物生理代谢物质，可调节动物胃肠道菌群，拮抗病原微生物，提高机体免疫力和抗病力，促进营养物质的转化和吸收，提高生产性能，将是一种绿色、营养、安全、性价比高的新型饲料添加剂。

Claims (5)

1.一种产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1，该菌株分类命名为：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，2011年1月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.4551。

2.根据权利要求1所述产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1，其特征在于所述菌株的26S rDNAD1/D2区域具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，其与Genbank现有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同一区域碱基序列同源性均达到99％。

3.利用权利要求1所述的产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1发酵产甘油的方法，其特征在于过程如下：

1)培养基：

种子培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素2，酵母膏4，不调pH，115℃灭菌20min；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖200，尿素4，玉米浆干粉5，氯化钠20，硫酸镁0.5，氯化钙0.1，调节pH 5.0，115℃灭菌20min；

2)培养条件：

一级种子培养：为摇瓶发酵，用500ml三角瓶装种子培养基100mI，将产甘油酿酒酵母NAU-ZH-GY1接入种子培养基中，30℃，150rpm摇床培养24小时；

二级种子培养：10L种子发酵罐装种子培养基6L，接种量5％，30℃，150rpm摇床培养24小时；

发酵罐培养：100L全自动搅拌发酵罐装发酵培养基60L，由种子罐流加接种，32℃，接种量10％，pH 5.0，300rpm，通气量0.5vvm，培养48h。

4.权利要求1所述的产甘油酿酒酵母在发酵产甘油中的应用。

5.权利要求1所述的产甘油酿酒酵母在生产反刍动物饲料添加剂中的应用。