CN102174085A - Dof(具有一指的dna结合)序列和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DOF(具有一指的DNA结合)序列和使用方法。具体地，提供了用于提高植物或植物部分的氮利用效率、增加植物或植物部分的碳固定、增加植物的谷粒产量或生物量生产、和/或增加植物的胁迫耐受性的方法和组合物。本发明的组合物和方法会通过调节至少一种具有Dof结构域或Dof结构域的生物活性变体或片段的Dof(代表具有一指的DNA结合)多肽的水平，调节这些不同的表型。

Description

DOF(具有一指的DNA结合)序列和使用方法

本申请是申请日为2006年11月7日的中国专利申请200680050650.0“DOF(具有一指的DNA结合)序列和使用方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及遗传学和分子生物学领域。更具体地，所述组合物和方法涉及植物的碳固定的调节，提高氮利用，提高产量和提高胁迫耐受性。

背景技术

近年来，通过常规育种来提高谷粒产量已经在玉米中达到平台。然后自然地采用一些替代性的、非常规的方法，它们可以用于得到额外的产量增加。由于在过去的约百年中选择谷粒产量期间，玉米的收获指数保持基本上不变，已经从增加每单位陆地面积的总生物量生产，实现了产量提高(Sinclair，等人，(1998)Crop Science 38：638-643；Duvick，等人，(1999)Crop Science 39：1622-1630；和，Tollenaar，等人，(1999)Crop Science 39：1597-1604)。该增加的总生物量已经通过增加种植密度来实现，所述增加种植密度已经导致适应性的表型改变，例如叶角和雄花穗大小的减小，前者会减少低矮叶的遮蔽，后者可能会增加收获指数(Duvick，等人，(1999)Crop Science 39：1622-1630)。

碳固定和氮同化作用是限制生物量生产的两个关键过程(Sinclair，等人，(1975)Science 189：565-567；Bhatia，等人.(1976)Science 194：1418-1421；Dhugga，等人(1989)Crop Sci.29：1232-1239；和Sinclair，等人，(1998)Crop Science 38：638-643)。使用硝态氮(它是玉米从土壤中获得的主要氮形式)制备蛋白的能量成本，从光合产物单位是制备碳水化合物所需能量成本的约2倍(Penning，等人，(1974)J.Theor.Biol.45：339-377和Sinclair，等人，(1975)Science 189：565-567)。与此相一致，作为选择在更高的种植密度的谷粒产量的结果，玉米谷粒中的蛋白浓度已经下降(Duvick，等人，(1999)Crop Science 39：1622-1630)。理想地，用最小量的应用氮来最大化谷粒产量。除了抬升肥料价格以外，流失和渗掉的硝酸盐造成不希望的环境效应(Frink，等人，(1999)PNAS 96：1175-1180)。鉴于一条开放途径是选择降低的谷粒蛋白含量(因为更大量的碳水化合物的积累，这可能反映为增加的谷粒产量)，另一途径是增加光合作用的速率(Leakey，等人，(2004)Global Change Biology 10：951-962)。

考虑到代谢途径的复杂性，单一基因改变不可能在提高生物量生产中取得丰硕成果(Morandini，等人，(2003)Trends in Plant Science 8：70-75)。但是，整个途径中不同组分的同步提高，可能克服(至少在一定程度上)代谢途径的复杂性。基因表达的上游调节因子会辅助实现该目的(Morandini，等人，(2003)Trends in Plant Science 8：70-75)。例如，单个的上游‘主调节’基因可以用于改变途径中多个代谢基因的表达(Rabinowicz，等人，(1999)Genetics 153：427-444；DellaPenna(2001)Plant Physiol 125：160-153；Morandini，等人，(2003)Trends in Plant Science 8：70-75)。这些类型的基因称作转录因子(TF)。TF在更高水平的分子级系运行，在多种生物学过程中起关键作用。这从下述事实显而易见：约5％的拟南芥基因组编码TF(约1500)，它们基于每个组特有的DNA-结合域，分成约50个不同的组(Riechmann，等人，(2000)Science 290：2105-2110)。

本领域需要可以使用这样的主调节序列来调节植物的碳固定和氮同化作用的方法和组合物。

发明内容

本发明的组合物包含分离的多肽，其包含选自下述氨基酸序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160，或其变体或片段。

所述组合物也包含分离的多核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列：包含SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152或153的核苷酸序列，或其变体或片段。

另外提供了包含这些序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至组织优选的启动子，包括、但不限于，叶优选的启动子，叶肉优选的启动子，维管束鞘优选的启动子，脉管优选的启动子，种子优选的启动子，胚乳优选的启动子，或胚优选的启动子。

提供了调节植物或植物部分中Dof多肽水平的方法。所述方法包含向植物或植物部分中引入包含本发明的Dof序列的异源多核苷酸。Dof多肽的水平可以升高或降低。这样的方法可以用于增加植物的产量，增加植物的氮利用效率，和/或改进植物的胁迫反应。

本发明的其它组合物包含分离的表达盒，其包含可操作地连接至叶优选的启动子或脉管优选的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：(a)编码包含SEQ ID NO：145所述氨基酸序列的Dof多肽的多核苷酸；(b)编码包含与SEQ ID NO：145具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的Dof多肽的多核苷酸，其中所述Dof多肽能调节转录；(c)当在植物中表达时会降低包含SEQ ID NO：145所述氨基酸序列的Dof多肽的表达水平的多核苷酸；和，(d)当在植物中表达时会降低包含与SEQ ID NO：145具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的Dof多肽的表达水平的多核苷酸，其中所述Dof多肽能调节转录。也提供了具有该表达盒的植物、植物部分、细胞和种子。

另外提供了提高植物的氮效率、增加植物的产量和改进植物的胁迫反应的方法。这样的方法包含向植物中引入异源多核苷酸；和，在植物中从可操作地连接的叶优选的启动子或脉管优选的启动子表达所述多核苷酸。在这样的方法中，异源多核苷酸的表达会调节至少一种包含SEQ ID NO：145所述氨基酸序列的Dof多肽或其生物活性变体或片段的水平。

附图说明

图1提供了来自水稻的不同Dof多肽的表征的Dof结构域的比对。

图2A和2B提供了来自玉米Dof家族的不同成员的Dof结构域的比对。强调显示了保守区。在比对的上面阐明了共有的Dof结构域(SEQ ID NO：145)。

具体实施方式

在下文中参考附图更完整地描述了本发明，其中显示了本发明的有些、但不是所有实施方案。实际上，本发明可以以许多不同的形式来实施，不应当理解为限于本文所述的实施方案；相反，提供了这些实施方案，使得本公开内容满足适用的法律要求。数字是指从头至尾的元素。

本发明所属领域的技术人员在具有前面描述所示的教导的益处后，会明白本文所述的本发明的许多改进和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于公开的具体实施方案，且改进和其它实施方案意在包括在所附权利要求书的范围内。尽管在本文中采用特定的术语，它们仅以普通的、描述性的含义使用，不用于限制目的。

I.概述

提供了用于提高植物或植物部分的氮利用效率、增加植物或植物部分的碳固定、增加植物的产量或生物量生产、和/或增加植物的胁迫耐受性的方法和组合物。本发明的组合物和方法会通过调节植物中至少一种具有Dof结构域的Dof多肽或具有Dof结构域的生物活性变体或片段的多肽的水平，调节这些不同的表型。

II.组合物

A.Dof多核苷酸和多肽

本发明的组合物包括Dof多核苷酸和多肽和它们的变体和片段，它们参与调节转录。Dof(代表具有一指的DNA结合(DNA binding with one finger))是在不同植物物种中发现的一个DNA结合蛋白家族。Dof家族的成员包含Dof结构域或其活性变体或片段，后者是参与DNA结合的高度保守的氨基酸序列。Dof结构域的特征在于具有C2-C2指结构的约50个氨基酸的保守区，它与基本区域缔合。Dof家族的特定成员的基本区域可以结合具有5’-T/AAAAG-3’核心的DNA序列。参见，例如，Lijavetzky，等人，(2003)BMC Evolutionary Biology 3：17和Yanagisawa，等人，(1999)Plant J.17：209。图1提供了来自几种表征的Dof多肽的Dof结构域的序列比对。Dof结构域的共有序列如SEQ ID NO：145所述。

本文使用的“Dof”序列包含具有保守的Dof结构域或Dof结构域的生物活性变体或片段的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。保守的Dof结构域如下：C-P-R-C-X-S-X-[DHN]-T-K-F-C-Y-[FY]-N-N-Y-[NS]-X-X-Q-P-R-[HY]-[FL]-C-[KR]-X-C-[RKQH]-R-[YH]-W-T-X-G-G-[TASV]-[LMI]-R(有阴影的残基在Dof成员之间高度保守，X代表任意氨基酸，[]围绕着在该位置可以发现的列举的氨基酸)。SEQ ID NO：145阐明了该保守的结构域。但是，应当认识到，Dof结构域共有序列中所述的保守序列可以改变，且仍然保持Dof活性(即，调节转录的能力)。参见，例如，Yanagisawa，等人，(2001)Plant Cell Physiol.42：813-22，和Lijavetzky，等人，(2003)BMC Evolutionary Biology 3：17和图1。表2也提供了来自不同玉米Dof多肽的代表性Dof结构域。当将该结构域置于适当多肽的背景中时，Dof结构域的生物活性片段和变体将继续保持调节转录的能力。

在一个实施方案中，本发明提供了分离的Dof多肽，其包含SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160所示的氨基酸序列。另外提供了多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152或153所述的核苷酸序列。在表1中描述了SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160的保守的Dof结构域。

本发明包括分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或它们的生物活性部分与实质上或基本上不含被发现在天然存在的环境中通常与多核苷酸或蛋白相随或相互作用的组分。因此，由重组技术制备时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白基本上不含其它细胞物质或培养基，当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学药品。最优地，“分离的”多核苷酸不含有在获取该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的序列(即位于多核苷酸5’和3’端的序列)(最优地，蛋白编码序列)。例如，在多种实施方案中，分离的多核苷酸可包含在获取该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然侧接该多核苷酸的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白包括含有小于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当重组制备本发明的蛋白或其生物活性部分时，最优地，培养基具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计)的化学前体或非目标蛋白的化学物质。

本发明的方法和组合物也包括Dof结构域或Dof多核苷酸的片段和变体和由此编码的蛋白。″片段″是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。多核苷酸片段可以编码保留天然蛋白的生物活性并从而调节转录的蛋白片段。或者，用于抑制或沉默(即，降低表达水平)Dof序列的片段不需要编码蛋白片段，但是仍然保留抑制目标Dof序列的表达的能力。另外，用作杂交探针的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段的范围可以是至少约18个核苷酸，约20个核苷酸，约50个核苷酸，约100个核苷酸和最高达编码本发明蛋白的全长多核苷酸。

编码Dof结构域或Dof多肽的多核苷酸片段会编码至少15，25，30，50，100，150，200，250，275，300，352，350，375，400，425，450，475，480个连续氨基酸或最高达全长Dof结构域或Dof蛋白中存在的氨基酸总数(即，SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160)。用作杂交探针、PCR引物或抑制构建体的Dof结构域或Dof多核苷酸的片段通常不需要编码Dof蛋白或Dof结构域的生物活性部分。

可以如下制备Dof结构域或Dof蛋白的生物活性部分：分离Dof多核苷酸的一部分，表达Dof蛋白的编码的部分(例如，通过体外重组表达)，和评价Dof蛋白的编码的部分的活性。作为Dof结构域或Dof核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，800，900，1,000，1,100，1,200，1,300，1,400，1,500，1,600，1,700，1,800，1,900，2,000，2,050，2,080个连续核苷酸或最高达全长Dof结构域或Dof多核苷酸中存在的核苷酸数目(即，SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152或153)。

“变体”意在表示基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一或多个内部位点的一或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸的一或多个位点的一或多个核苷酸的取代。本文使用的“天然的”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性，编码Dof多肽或Dof结构域之一的氨基酸序列的那些序列。可使用公知的分子生物学技术，例如下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术，鉴定诸如这些天然存在的等位变体。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，例如通过例如定点诱变生成、但仍然编码能调节转录或能降低(即，抑制或沉默)Dof多核苷酸的表达水平的Dof结构域或Dof多肽的多核苷酸。一般而言，本发明的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸将具有至少至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的。

也可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比，对本发明的特定多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体进行评价。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160的多肽具有给定的序列同一性百分比的多肽的分离的多核苷酸。任何两条多肽之间的序列同一性百分比可以使用在本文其它地方说明的序列比对程序和参数计算得出。在通过比较多核苷酸编码的两条多肽之间的序列同一性百分比来对本发明的任何给定的多核苷酸对进行评价时，两条被编码的多肽之间的序列同一性百分比是至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

“变体”蛋白意在表示：通过在天然蛋白的一或多个内部位点的一或多个氨基酸的缺失或添加和/或在天然蛋白的一或多个位点的一或多个氨基酸的取代，从天然蛋白衍生的蛋白。本发明包含的变体蛋白是有生物活性的，也就是说它们仍然具有想要的天然蛋白的生物活性，即在本文所述的调节转录。这些变体可因为例如遗传多态性或或因为人为操纵而产生。如通过在本文其它地方说明的序列比对程序和参数所确定的，本发明Dof蛋白或Dof结构域的生物活性变体与Dof蛋白或共有Dof结构域的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。本发明Dof蛋白或Dof结构域的生物活性变体与该蛋白的区别在于少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个例如6-10个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或甚至少至1个氨基酸残基。

本发明的多核苷酸可以通过多种方式被改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这些操作的方法是本领域普遍已知的。例如，可以通过DNA中的突变，制备Dof蛋白或Dof结构域的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的。见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的指导，可见Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型，该文献在本文中引作参考。保守取代，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换，可能是最优的。

因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列和突变体形式。同样地，本发明的蛋白包括天然存在的蛋白及其变体和经修饰形式。这些变体仍然具有希望的活性(即，调节转录或降低目标Dof序列的表达水平的能力)。在具体实施方案中，将在编码变体的DNA中进行的突变不会将序列置于读码框之外，且不会产生能够形成二级mRNA结构的互补区域。参见，EP专利申请公开号75,444。

本文中包含的蛋白序列的缺失、插入以及取代预期不对蛋白特征产生根本变化。但是，当在进行取代、缺失或插入前难以预计这么做的准确效果时，本领域技术人员会知道：可以通过常规筛选实验对该效果加以评估。例如，可以通过测量多肽的调节转录的能力，评价Dof多肽的活性。多种方法可以用于测量该活性，包括，在核苷酸或多肽水平直接监视靶基因的表达水平。这种分析的方法是已知的，包括例如，RNA印迹，S1保护测定，蛋白印迹，酶法或比色测定。在具体实施方案中，可以如下测定序列是否具有Dof活性：监视靶基因的水平或活性的增加或降低，包括碳固定和氮同化作用途径中的各种酶。例如，在具体实施方案中，Dof序列可以调节靶基因的转录，例如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，胞质丙酮酸正磷酸二激酶基因，硝酸还原酶，谷氨酰胺合酶，谷氨酸合酶，谷氨酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶，和天冬酰胺合酶。参见，例如，Yanagisawa，等人，(2002)Trends in Plant Science 7：555-560和Yanagisawa，等人，(2000)Plant J.21：281-288，二者都在本文中引作参考。或者，测定调节转录活性的方法可以包括，监视植物表型的改变。例如，如本文其它地方进一步详述所讨论的，调节Dof多肽的水平可以导致增加的碳固定、提高的氮利用效率和谷粒产量，和改进的植物对环境胁迫的耐受性，包括无生命的胁迫例如干旱、热和氮胁迫。在本文其它地方的进一步详述中讨论了测定这些变化的方法。

变体多核苷酸和蛋白还包含通过诱变和重组步骤(例如DNA重排)获得的序列和蛋白。使用这样的步骤，可操纵一种或多种不同的Dof编码序列，以制造出具有理想性质的新的Dof序列或Dof结构域。以此方式，从一组相关的序列多核苷酸生成重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有显著的序列同一性且能够在体外或体内同源重组的序列区域。例如，使用该方法，编码目标结构域的序列基序可以在本发明的Dof基因和其它已知的Dof基因之间重排，以获得编码具有改良的目标性质的蛋白的新基因，例如在酶的情况下，提高的Km。这些DNA重排的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri，等人，(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore，等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang，等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri，等人，(1998)Nature 391：288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。

本发明的多核苷酸可以用于从其它生物体、尤其其它植物、更具体地其它单子叶植物分离对应序列。以此方式，基于与本文所述序列的序列同源性，PCR、杂交等方法可以用于鉴别这样的序列。本发明包括基于与本文所述整个DOF序列或其变体和片段的序列同一性分离的序列。这样的序列包括，作为公开的序列的直向同源物的序列。“直向同源物”意在表示下述基因，它们来自共同的祖先基因，且由于物种形成(speciation)在不同的物种中被发现。当它们的核苷酸序列和/或它们所编码的蛋白序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同源物。直向同源物的功能在物种间常常是高度保守的。因此，本发明包括可以沉默或抑制Dof序列的表达的分离的多核苷酸，或编码Dof蛋白且在严格条件下与本文公开的Dof序列杂交的多核苷酸，或其变体或片段。

在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目标植物中提取的cDNA或基因组DNA扩增相应DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域普遍已知的，且公开在Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。也见Innis，等人，编.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，编.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；和Innis和Gelfand，编.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，已知多核苷酸的全部或部分被用作探针，该探针能与来自选定生物体的经克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中存在的其它相应的多核苷酸选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，且可用可检测基团例如³²P或任何其它可检测标记对其进行标记。因此，例如，可通过对基于本发明DOF多核苷酸的合成寡核苷酸进行标记，来制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且在Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中公开。

例如，完整Dof多核苷酸或编码本文公开的Dof结构域的多核苷酸或其一个或多个部分，可用作为能够与相应的Dof多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在各种条件下实现特异性杂交，此类探针包含在Dof多核苷酸序列中特有的、且最优至少有约10个核苷酸的长度的序列，且最优地具有至少约20个核苷酸的长度。这样的探针可用于通过PCR从选定的植物扩增相应的Dof多核苷酸。该技术可用于从目标植物分离其它编码序列，或用作诊断实验以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括铺板DNA文库(plated DNA library)的杂交筛选(噬菌斑或菌落；见例如，Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

这些序列的杂交可在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意在表示下述条件：在该条件下探针将和其靶序列以相比于其它序列可检测的更高的水平杂交(例如，至少高于背景2倍)。严格条件是序列依赖性的且在不同环境下将不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件从而允许序列的一些错配由此检测到更低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是这样的条件，其中盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0至8.3，且温度对于短探针(例如10至50个多核苷酸)为至少约30℃，对长探针(例如大于50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)来实现。示例性的低度严格条件包括于37℃在30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，并于50至55℃在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)中洗涤。示例性的中度严格条件包括于37℃在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃在0.5×至1×SSC中洗涤。示例性的高度严格条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并于60至65℃在0.1×SSC中洗涤。可选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤持续时间将至少为足够达到平衡的时间长度。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体而言，T_m可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/l来估算；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞苷的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对的长度。T_m是50％的互补靶序列与完全配对的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，T_m降低约1℃；因此，T_m、杂交和/或洗涤条件可被调节以与具有人们需要的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％同一性的序列，T_m可被降低10℃。一般地，在确定的离子强度和pH下对于特定序列及其互补序列而言，严格条件被选定为比热解链温度(T_m)低5℃。但是，非常严格的条件可在比热解链温度(T_m)低1、2、3、4℃时使用杂交和/或洗涤；中度严格条件可在比热解链温度(T_m)低6、7、8、9或10℃时使用杂交和/或洗涤；低度严格条件可在比热解链温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃时使用杂交和/或洗涤。使用方程、杂交和洗涤组合物、以及人们需要的T_m，普通技术人员将理解：杂交和/或洗涤溶液的严格性的改变是被内在描述的。如果希望的错配程度导致了小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，最优地提高SSC浓度，使得更高的温度可被使用。关于核酸序列杂交的大量指导可在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel，等人，编.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)中找到。参见，Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

以下的术语被用于说明两条或多条核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)“比较窗”，(c)“序列同一性”和(d)“序列同一性百分比”。

(a)本文使用的“参照序列”是作为序列比较的基础被使用的确定序列。参照序列可以是特定序列的一部分(subset)或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因片段。

(b)本文使用的“比较窗”指多核苷酸序列的连续的特定片段，其中，为进行对两条多核苷酸的最优比对，在比较窗中的多核苷酸序列与参照序列(该序列不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)。通常，比较窗是长度为最少20个的连续核苷酸，可选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域的技术人员明白：为了避免由于在多核苷酸中包括缺口造成的与参照序列的高度相似性，典型地，引入缺口罚分，其从配对数目中减除。

用于比较的序列比对法是本领域公知的。因此，任何两条序列之间的百分比序列同一性的确定可以使用数学算法完成。这些数学算法的非限定性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局(global)比对运算；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的检索局部比对(search-for-local alignment)法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中对其进行了改进。

这些数学算法的计算机实现可用于序列的比较以确定序列同一性。这样的实现包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(获自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(2.0版)和GCG Wisconsin Genetics软件包，版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(获自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)。使用这些程序的比对可使用默认参数进行。CLUSTAL程序由Higgins等人(1988)Gene 73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS 8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331详细描述。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120权重残基表(weight residue table)、缺口长度罚分12以及缺口罚分4被用于ALIGN程序。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序，分值(score)＝100，字长(wordlength)＝12进行以获得与编码本发明的蛋白同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可使用BLASTX程序，分值＝50，字长＝3进行以获得与实施方案的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。为了实现带缺口的比对，用于比较目的，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述，Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)可被使用。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可用于进行迭代检索，该检索检测到分子间的远关联。见Altschul等人(1997)同上。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，相应程序的默认参数(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)可被使用。见www.ncbi.nlm.nih.gov。比对也可以通过人工观察进行。

除非另外声明，在此提供的序列同一性/相似性数值指使用GAP版本10使用以下参数获得的数值：使用缺口权重(GAP Weight)50和长度权重(Length Weight)3以及nwsgapdna.cmp计分矩阵获得的核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用缺口权重8和长度权重2以及BLOSUM62计分矩阵获得的氨基酸序列的％同一性和％相似性的数值；或使用它们的任何等同程序获得的数值。“等同程序”意在表示下述任何序列比较程序，对于任何两条待研究的序列，在与由GAP版本10产生的相应的比对比较时，该程序产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的百分比序列同一性的比对。

GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法以找出对两条完整序列的下述比对，所述比对将配对数量最大化且将缺口数量最小化。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，且产生具有最大数量配对碱基和最少缺口的比对。它可以提供以配对碱基为单位的缺口制造罚分(gap creation penalty)和缺口延伸罚分(gap extension penalty)。针对其插入的每个缺口GAP必须获得缺口制造罚分数量的配对利益。如果选择大于零的缺口延伸罚分，GAP还必须针对每个插入的缺口获得缺口长度乘以缺口延伸罚分的利益。在GCG Wisconsin Genetics软件包的版本10中对于蛋白序列的默认的缺口制造罚分值和缺口延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认的缺口制造罚分是50而默认的缺口延伸罚分是3。缺口制造和缺口延伸罚分可被表示为：选自由0至200组成的整数组中的整数。因此，例如，缺口制造和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP是最佳比对家族中的一员。该家族还有很多成员，但没有其它成员具有更好的性质。对于比对，GAP呈现了四个优良数据：质量、比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列的最大化的基准。比率是质量除以更短片段中的碱基数目。同一性百分比是真正匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似的符号的百分比。越过缺口的符号为忽略。当一对符号的计分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性被计分。在GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中使用的计分矩阵是BLOSUM62(见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)本文使用的关于两条多核苷酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”指：当在特定比较窗中以最大对应性进行比对时，两序列中完全相同的残基。当关于蛋白的序列同一性百分比被使用时，将认识到：不相同的残基位点常常是由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基由其它具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列由于保守取代不同时，序列同一性百分比可被上调，以针对取代的保守性质进行校正。由于此类保守取代而不同的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。进行这样的调节的方法是本领域技术人员公知的。典型地，调节方法包括将保守取代计分为部分而非完全错配，由此增加了序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸被给予1分且非保守取代被给予0分时，保守取代被给予0至1之间的分数。计算保守取代的得分，例如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中实现。

(d)本文使用的“序列同一性百分比”指：通过在比较窗中比较两条最优比对的序列从而确定的数值，其中对于两序列的最优比对而言，比较窗中的多核苷酸序列的部分与参照序列(该序列不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)。通过确定在两序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位点的数量，产生配对位点的数量，将配对位点的数量除以在比较窗中的位点的总数量，并将结果乘以100，产生序列同一性的百分比，从而计算百分比。

B.植物

在具体实施方案中，本发明提供了具有改变水平(即，增加或减少)的Dof序列的植物、植物细胞和植物部分。在有些实施方案中，所述植物和植物部分已经在它们的基因组中稳定掺入了至少一种编码包含如SEQ ID NO：145所述的Dof结构域的Dof多肽的异源多核苷酸，或其生物活性变体或片段。在一个实施方案中，编码Dof多肽的多核苷酸如SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152，153中的任一个所述，或是其生物活性变体或片段。

在其它实施方案中，提供了植物和植物部分，其中稳定整合到植物或植物部分的基因组中的异源多核苷酸包含这样的多核苷酸，当其在植物中表达时，会降低包含SEQ ID NO：145所述Dof结构域的Dof多肽或其活性变体或片段的水平。可以用于抑制Dof多肽的表达的序列包括、但不限于，SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，144，146，147，148，149，150，151，152或153所述的任一个序列，或其变体或片段。

在具体实施方案中，植物或植物部分中的异源多核苷酸可操作地连接至组织优选的启动子，例如种子优选的启动子(即，胚乳优选的启动子或胚优选的启动子)，脉管优选的启动子，或叶优选的启动子(即，维管束鞘优选的启动子或叶肉优选的启动子)。

如在本文其它地方的进一步详述中所讨论的，这样的植物、植物细胞和植物部分可以具有改变的表型，包括，例如，碳固定的调节，改进的氮利用效率，改进的产量或改进的胁迫耐受性。

本文使用的术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，可以再生植物的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物块，和植物或植物部分中完整的植物细胞，例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等。谷粒意在指商业种植者为了生长或繁殖物种以外的目的生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包含在本发明的范围内，前提是这些部分包含引入的或本文公开的异源多核苷酸。

本发明可以用于转化任意植物物种，包括、但不限于，单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物物种的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))，特别是那些用于种子油来源的芸苔属，苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、黍(例如珍珠黍(Pennisetum glaucum)、稷(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica))、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松类。

蔬菜包括西红柿(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、绿豆(Phaseolus vulgaris)、青豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)、以及甜瓜属(Cucumis)的成员例如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、芙蓉(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实现本发明的松类包括：例如松树，如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、小杆松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsuga canadensis)；白云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真杉例如银冷杉(Abies amabilis)和冷杉(Abies balsamea)；以及雪松例如北美乔柏(Thuja plicata)和阿拉斯加桧柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在特定实施方案中，实施方案的植物是农作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高梁、小麦、黍、烟草等)。在其它一些实施方案中，玉米和大豆植物是最优的，在另一些实施方案中，玉米植物是最优的。

感兴趣的其它植物包括提供感兴趣的种子的谷类植物、油籽植物和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子例如玉米、小麦、大麦、稻、高梁、黑麦等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。豆包括瓜儿豆、槐豆、胡芦巴、大豆、菜豆、豇豆、绿豆、青豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

“主题植物或植物细胞”是这样的，其中已经发生了改变，例如多肽的转化或引入，或是从这样改变的植物或细胞产生的、且包含该改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测量主题植物或植物细胞的表型变化的参照点。

对照植物或植物细胞可以包含，例如：(a)野生型植物或细胞，即，具有与产生主题植物或细胞的改变的原料相同的基因型；(b)具有与原料相同的基因型、但是已经用无效构建体(即，对目标性状没有已知作用的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)作为主题植物或植物细胞的后代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与主题植物或植物细胞相同、但是没有暴露于诱导目标基因的表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在不表达目标基因的条件下的主题植物或植物细胞本身。

C.多核苷酸构建体

术语″多核苷酸″的使用无意将本发明限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明的多核苷酸也包括序列的所有形式，包括、但不限于，单链形式，双链形式，发夹，茎-和-环结构等。

在本发明的方法和组合物中采用的不同多核苷酸可以提供在表达盒中，用于在目标植物中表达。所述表达盒包括可操作地连接到本发明的多核苷酸上的5′和3′调节序列。″可操作地连接″意在指2个或多个元件之间的功能连接。例如，目标多核苷酸和调节序列(即，启动子)之间的可操作连接是允许表达目标多核苷酸的功能连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或非相邻的。当用于指2个蛋白编码区的连接时，″可操作地连接″意指所述编码区在同一个读码框中。表达盒可以另外含有至少一个待共转化进生物体中的其它基因。或者，所述其它基因可以提供在多个表达盒上。这样的表达盒被提供了多个限制位点和/或重组位点，用于插入将在调节区的转录调节下的DOF多核苷酸。表达盒可以另外含有选择标记基因。

按照5′-3′转录方向，表达盒可以包括，转录和翻译起始区(即，启动子)，Dof多核苷酸，和在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。调节区(即，启动子，转录调节区，和翻译终止区)和/或Dof多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是天然的/类似的。或者，调节区和/或Dof多核苷酸可以对于宿主细胞或彼此是异源的。本文使用的“异源的”序列是源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，通过审慎的人工干预，在组成和/或基因组基因座上基本上从它的天然形式修饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸上的启动子是来自不同于多核苷酸来源物种的物种，或者，如果来自相同/类似物种，一个或二者基本上从它们的最初形式和/或基因组基因座修饰，或启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。本文使用的嵌合基因包含可操作地连接到转录起始区上的编码序列，所述转录起始区与所述编码序列异源。

尽管最佳地使用异源启动子来表达序列，可以使用天然启动子序列。这样的构建体可以改变植物或植物细胞中Dof的表达水平。因而，可以改变植物或植物细胞的表型。

终止区可以是转录起始区天然的，可以是可操作地连接的目标Dof多核苷酸天然的，可以是植物宿主天然的，或可以源自与启动子、目标Dof多核苷酸、植物宿主或它们的任意组合不同的另一来源(即，外来的或异源的)。方便的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见，Guerineau，等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon，等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen，等人，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe，等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas，等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi，等人，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。

在适当时，可以优化多核苷酸，以增强在转化的植物中的表达。也就是说，可以使用植物优选的密码子合成多核苷酸，用于提高表达。关于宿主优选的密码子选择的讨论，参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域可以得到合成植物优选的基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831，和5,436,391，和Murray，等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，它们在本文中引作参考。

已知其它序列修饰能提高在细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括将编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子重复序列和其它此类可能对基因表达不利的充分表征的序列去除。可将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，该水平通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得出。在可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可额外包含5’前导序列。这些前导序列可以增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)(Elroy-Stein，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯丫病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene 165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)(Virology 154：9-20)、和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的包膜蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。也见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。

在制备表达盒的过程中，可以对多种DNA片段加以操纵，由此提供正确定向的DNA序列，以及适用的话，在正确读码框内的DNA序列。为了这个目标，可以使用衔接子接头连接DNA片段，或可以包含其它的操作以提供方便的限制性位点，实现多余DNA的去除、限制性位点的去除等。为了这个目的，可包含体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、重取代(例如转换和颠换)等。

许多启动子可用于实践本发明，包括目标多核苷酸序列的天然启动子。可根据希望的结果对启动子加以选择。核酸可以与组成型的、组织优选的或其它启动子组合，以在植物中表达。

这些组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如在美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中公开的那些启动子。

组织优选的启动子可用于靶向特定植物组织中的增强表达。组织优选的启动子包括Yamamoto，等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata，等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen，等人，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell，等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart，等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp，等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini，等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto，等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco，等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka，等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia，等人，(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，此类启动子可以经修饰以用于弱表达。

叶优选的启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto，等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon，等人，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto，等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor，等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco，等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

也可以采用指导在不同类型的叶细胞中的表达的启动子。例如，叶肉优选的启动子是本领域已知的，包括、但不限于，C₄磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的启动子(Gowik，等人，(2004)The Plant Cell 16：1077-1090)；叶绿素a/b结合蛋白基因(cab)的启动子(Hudspeth，等人，(1992)Plant Physiology 98：458-464)；拟南芥启动子pRbcS2b(Moon，等人，A novel screening approach for selective non-cell autonomous proteins。American Society of Plant Biologists Abs#864)；胞质果糖-1，6-二磷酸酶基因(cy-FBPase基因)的启动子(美国申请公开US2002120955)；和，来自水稻和玉米的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)基因启动子(Schaffner，等人，(1991)The Plant Cell 9：997-1012)；这些参考文献中的每一篇在本文中引作参考。

其它感兴趣的叶优选的启动子包括维管束鞘优选的启动子。维管束鞘优选的启动子是本领域已知的，包括、但不限于，来自ppcA的启动子的修饰形式(Stockhaus(1997)Plant Cell 9：479)；和指导在维管束鞘细胞和脉管细胞中表达的ZjPck启动子(Nomura (2005)Plant and Cell Physiology 46(5)：754-761；这些参考文献中的每一篇在本文中引作参考。

脉管优选的启动子也是本领域已知的，包括、但不限于，美国申请公开号20040163146的启动子。

光诱导的不同启动子可以用于本发明的方法和组合物中。这样的启动子是本领域已知的，包括、但不限于，来自碳酸酐酶b(cab)或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的启动子(Simpson，等人，(1985)EMBO J4：2723-2729和Timko，等人，(1985)Nature 318：579-582)。

种子优选的启动子包括种子-特异性的启动子(在种子发育过程中有活性的那些启动子，例如种子储藏蛋白的启动子)，以及，种子-萌芽启动子(在种子萌芽过程中有活性的那些启动子)。参见，Thompson，等人，(1989)BioEssays 10：108，其在本文中引作参考。这样的种子优选的启动子包括、但不限于，Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶)(见WO00/11177和美国专利号6,225,529；其在本文中引作参考)，PCNA2(2003年3月13日提交的美国专利申请号10/388,359)和，CKX1-2(美国申请公开20020152500)。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-大豆聚球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝血素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、蜡质蛋白(waxy)、shrunken 1、shrunken 2、球蛋白1等。也见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2的种子优选的启动子；和WO 01/21783和6,403,862，其中公开了Zm40启动子；二者在本文中引作参考。

胚特异性的启动子包括球蛋白1(Glb-1)，ESR(美国申请公开20040210960)和lecl(2000年11月22日提交的美国专利申请号09/718,754)。其它胚特异性的启动子公开在Sato，等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122；Nakase，等人，(1997)Plant J 12：235-56；和Postma-Haarsma，等人，(1999)Plant Mol.Biol.39：257-71。胚乳优选的启动子包括在美国专利申请公开20040237147中公开的γ-玉米醇溶蛋白，启动子epp1和eep2。其它胚乳特异性的启动子公开在Albani，等人，(1985)EMBO 3：1505-15；Albani，等人，(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62；Albani，等人，(1993)Plant J.5：353-55；Mena，等人，(1998)The Plant Journal 116：53-62，和Wu，等人，(1998)Plant Cell Physiology 39：885-889。也可以使用未成熟的穗组织优选的启动子。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择标记基因被用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物，例如草胺膦(glufosinate ammonium)、溴草腈(bromoxynil)、咪唑啉酮、和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)的抗性的基因。其它选择标记包括表型标记例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol129：913-42)、以及黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，见Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54)。关于其它选择标记，一般地见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao，等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley，等人，(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu，等人，(1987)Cell 48：555-566；Brown，等人，(1987)Cell 49：603-612；Figge，等人，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404；Fuerst，等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle，等人，(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines，等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow，等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim，等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski，等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb，等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt，等人，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen，等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva，等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka，等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill，等人，(1988)Nature 334：721-724。这些公开物在本文中引作参考。选择标记基因的以上列表并不意味着限定。任何选择标记基因可用于本发明。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可与目标多核苷酸序列的任意组合相叠加，以便建立具有希望的性状的植物。本文使用的性状是指源自特定序列或序列集合的表型。建立的组合也可以包括任意一个目标多核苷酸的多个拷贝。本发明的多核苷酸也可叠加疾病或杀虫剂抗性的所需性状(例如，烟曲霉毒素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones，等人，(1994)Science 266：789；Martin，等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos，等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂例如草丁膦(phosphinothricin)或basta(例如bar基因)；和草甘磷抗性(EPSPS基因))；以及对于加工或加工产物而言所希望的性状，如高油(例如美国专利号6,232,529)；改进的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO94/11516))；改进的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利号5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进聚羟基烷酸(PHAs)的表达)，它们的公开内容在本文中引作参考。也可以将本发明的多核苷酸与提供农艺学性状(例如雄性不育(例如见美国专利号5,583,210)、茎强度、花期)或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因靶向(例如WO 99/61619；WO00/17364；WO 99/25821))的多核苷酸组合，它们的公开内容本文中引作参考。

这些叠加组合可以通过任何方法产生，所述方法包括但不限于通过任何传统的或TopCross方法或遗传转化法杂交育种植物。如果通过遗传转化植物将这些序列叠加，目标多核苷酸序列可以在任何时刻以任何顺序组合。例如，包含一种或多种想要的性状的转基因植物可用作靶，以通过随后的转化引入其它性状。所述性状可与用转化盒的任何组合提供的目标多核苷酸在共转化步骤中同时引入。例如，如果两个序列将被引入，该两个序列可以被包含在分开的转化盒(反式)或包含在相同的转化盒(顺式)中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些例子中，引入将抑制目标多核苷酸表达的转化盒是人们希望的。这可与其它抑制盒或过量表达盒的任意组合相组合，以在植物中产生想要的性状的组合。还认识到，可以使用位点特异性重组系统将多核苷酸序列在想要的基因组位点叠加。见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些文献在本文中引作参考。

D.引入方法

本发明的方法包括将多肽或多核苷酸引入植物。“引入”意在表示将多核苷酸或多肽提供给植物，其提供方式使得序列能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不依赖于特定的将序列引入植物的方法，只要多核苷酸或多肽能够进入至少一个植物细胞即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“稳定转化”意在表示引入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组，并能够由其后代遗传。“瞬时转化”意在表示多核苷酸被引入植物且不整合进植物的基因组，或多肽被引入植物。

转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方案可根据目标转化植物或植物细胞的类型(即单子叶或双子叶)而变化。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌-介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)以及生物射弹粒子加速(见例如Sanford等人，美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；和，5,932,782；Tomes等人(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；以及Lec1转化(WO 00/28058)。也参见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利号5,736,369(荞麦)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker-介导转化)；D’Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12：250-255以及Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(通过根瘤农杆菌的玉米)；它们在本文中引作参考。

在特定实施方案中，可使用各种瞬时转化法将Dof序列或其变体和片段提供给植物。这些瞬时转化法包括但不限于：将Dof蛋白或其变体和片段直接引入植物，或将Dof转录物引入植物。这样的方法包括例如显微注射或粒子轰击。见例如Crossway，等人，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185；Nomura，等人，(1986)Plant Sci.44：53-58；Hepler，等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180和Hush，等人，(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784，所有这些文献在本文中引作参考。或者，可使用本领域已知技术将Dof多核苷酸瞬时转化进植物。此类技术包括病毒载体系统和以能防止DNA随后释放的方式进行的多核苷酸沉淀。因此，可发生从粒子结合的DNA的转录，但其释放整合进基因组的频率被大大降低。此类方法包括使用包被了聚乙亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。

在其它实施方案中，通过将植物与病毒或病毒核酸接触，本发明的多核苷酸可被引入植物。通常，这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子。技术人员知道，Dof序列、或其变体或片段可首先作为病毒多蛋白的一部分被合成，随后可通过体内或体外的蛋白水解对该多蛋白进行加工，生成想要的重组蛋白。进一步地，技术人员知道，本发明的启动子也包含用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。将多核苷酸引入植物并在其中表达由其编码的蛋白、涉及病毒DNA或RNA分子的方法是本领域已知的。见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，和Porta等人(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221；它们在本文中引作参考。

用于在植物基因组的特定位点将多核苷酸靶向插入的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在想要的基因组位点的插入通过位点特异性重组系统实现。见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些文献在本文中引作参考。简言之，本发明的多核苷酸可被包含在转移盒中，该盒由两个不引起重组的重组位点侧接。转移盒被引入下述植物，所述植物具有被稳定引入其基因组的靶位点，该位点由两个不引起重组的重组位点侧接，这些重组位点对应于转移盒的位点。提供合适的重组酶，转移盒被整合进靶位点。目标多核苷酸由此被整合进植物基因组中的特定染色体位点。

可根据常规方法将已转化的细胞培养为植物。见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。这些植物随后可生长，并由相同转化株或不同株授粉，得到的具有想要的表型特征的组成型表达的后代被鉴定出来。可培养两代或更多代，以确保想要的表型特征的表达被稳定维持且被遗传，随后收获种子以确保想要的表型特征的表达已被实现。以这种方式，本发明提供了经转化的种子(也被称作“转基因种子”)，所述种子具有稳定掺入它们的基因组的本发明的多核苷酸，例如多核苷酸的表达盒。

III.使用方法

A.调节至少一种Dof序列或其变体或片段在植物或植物部分中 的表达的方法

在本发明的方法的背景下，多肽的“调节的水平”或“调节水平”是指基因产物的表达、浓度或活性的任意增加或降低，包括表达、浓度或活性的任意相对增加。在转录或翻译水平调节靶基因产物的表达、或调节靶基因产物的活性的任意方法或组合物，可以用于实现靶基因产物的调节的表达、浓度或活性。一般而言，所述水平相对于适当对照植物、植物部分或细胞增加或降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。本发明中的调节可以发生在植物生长过程中和/或之后至希望的发育阶段。在具体实施方案中，在单子叶植物、尤其玉米中调节本发明的多肽。

可以直接测量具有Dof结构域或其生物活性变体或片段的多肽的表达水平，例如，通过测定植物中Dof多肽的水平，或间接测量，例如，通过测量编码该蛋白的多核苷酸的水平，或通过测量植物中Dof多肽的活性。测量Dof多肽的活性的方法记载在本文其它地方。

在具体实施方案中，将本发明的多肽或多核苷酸引入植物细胞。随后，使用本领域技术人员已知的方法，例如但不限于，DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析，选择具有引入的本发明序列的植物细胞。使通过前述实施方案改变或修饰的植物或植物部分在植物形成条件下生长足以调节植物中本发明多肽的浓度和/或活性的时间。植物形成条件是本领域众所周知的，且在本文其它地方简单讨论。

也认识到，通过使用不能在转化的植物中指导蛋白或RNA的表达的多核苷酸，可以调节多肽的水平和/或活性。例如，本发明的多核苷酸可以用于设计多核苷酸构建体，后者可以用于改变或突变生物体的基因组核苷酸序列的方法中。这样的多核苷酸构建体包括、但不限于，RNA:DNA载体，RNA:DNA突变载体，RNA:DNA修复载体，混合双链体寡核苷酸，自互补RNA:DNA寡核苷酸，和重组寡核苷酸酶。这样的核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见，美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972；和5,871,984；它们都在本文中引作参考。也参见，WO 98/49350，WO 99/07865，WO99/25821，和Beetham，等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；在本文中引作参考。

因此认识到，本发明的方法不依赖于完整多核苷酸向基因组中的掺入，仅仅依赖于作为多核苷酸向细胞中引入的结果，改变植物或其细胞。在本发明的一个实施方案中，可以在向细胞中引入多核苷酸后，改变基因组。例如，多核苷酸或其任意部分，可以掺入植物基因组中。本发明基因组的改变包括、但不限于，核苷酸向基因组中的添加、缺失和取代。尽管本发明的方法不依赖于任意特定数目的核苷酸的添加、缺失和取代，认识到这样的添加、缺失或取代包含至少一个核苷酸。

在一个实施方案中，增加Dof多肽的活性和/或水平。通过给植物提供Dof多肽或其生物活性变体或片段，可以增加Dof多肽的水平和/或活性。如本文其它地方所讨论的，许多给植物提供多肽的方法是本领域已知的，包括、但不限于，将Dof多肽直接引入植物，或向植物中引入(瞬时或稳定地)编码具有Dof活性的多肽的多核苷酸构建体。也认识到，本发明的方法可以采用不能在转化的植物中指导蛋白或RNA的表达的多核苷酸。因而，通过改变编码Dof多肽的基因或它的启动子，可以增加Dof多肽的水平和/或活性。参见，例如，Kmiec，美国专利5,565,350；Zarling，等人，PCT/US93/03868。因此，提供了诱变的携带Dof基因的突变的植物，其中所述突变会增加Dof基因的表达或增加编码的Dof多肽的活性。

在其它实施方案中，通过向植物中引入抑制多肽的水平或活性的多核苷酸，降低或消除本发明Dof多肽的活性和/或水平。所述多核苷酸可以直接(通过阻止Dof信使RNA的翻译)或间接(通过编码抑制编码Dof蛋白的Dof基因的转录或翻译的多肽)抑制Dof的表达。抑制或消除植物中基因的表达的方法是本领域众所周知的，任意这样的方法可以用于本发明中，以抑制植物中至少一种Dof序列的表达。在本发明的其它实施方案中，通过用编码抑制Dof多肽活性的多肽的序列转化植物细胞，降低或消除Dof多肽的活性。在其它实施方案中，通过破坏编码Dof多肽的基因，可以降低或消除Dof多肽的活性。本发明包括诱变的携带Dof基因的突变的植物，其中所述突变会降低Dof基因的表达或抑制编码的Dof多肽的Dof活性。

在植物遗传工程的几个方面，希望降低特定基因的活性(也称作基因沉默或基因抑制)。基因沉默的许多技术是本领域技术人员众所周知的，包括、但不限于，反义技术(参见，例如，Sheehy，等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8805-8809；和美国专利号5,107,065；5,453,566；和5,759,829)；共抑制(例如，Taylor(1997)Plant Cell 9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12)：340-344；Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Finnegan，等人，(1994)Bio/Technology 12：883-888；和Neuhuber，等人，(1994)Mol.Gen.Genet.244：230-241)；RNA干扰(Napoli，等人，(1990)Plant Cell 2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)Genes Dev.13：139-141；Zamore，等人，(2000)Cell 101：25-33；和Montgomery，等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15502-15507)，病毒诱导的基因沉默(Burton，等人，(2000)Plant Cell 12：691-705；和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2：109-113)；靶-RNA-特异性的核酶(Haseloff，等人，(1988)Nature 334：585-591)；发夹结构(Smith，等人，(2000)Nature 407：319-320；WO99/53050；WO 02/00904；WO 98/53083；Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk，等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini，等人，BMC Biotechnology 3：7，美国专利公开号20030175965；Panstruga，等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140；Wesley，等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；美国专利公开号20030180945；和，WO 02/00904，它们都在本文中引作参考)；核酶(Steinecke，等人，(1992)EMBO J.11：1525；和Perriman，等人，(1993)Antisense Res.Dev.3：253)；寡核苷酸-介导的靶向修饰(例如，WO 03/076574和WO99/25853)；Zn-指靶向分子(例如，WO 01/52620；WO 03/048345；和WO 00/42219)；转座子标记技术(Maes，等人，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner，等人，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat，等人，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai，等人，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice，等人，(1999)Genetics 153：1919-1928；Bensen，等人，(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena，等人，(1996)Science 274：1537-1540；和美国专利号5,962,764)；它们各自在本文中引作参考；和本领域技术人员已知的其它方法或上述方法的组合。

认识到，使用本发明的多核苷酸，可以构建与Dof序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义结构体。构建反义核苷酸，以与对应的mRNA杂交。可以修饰反义序列，只要该序列与对应的mRNA杂交并干扰对应的mRNA的表达。以此方式，可以使用与对应的反义序列具有70％、优选80％、更优选85％序列同一性的反义结构构建体。此外，可以使用反义核苷酸的一部分来破坏靶基因的表达。一般而言，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300个、400个、450个、500个、550个或更多个核苷酸的序列。

本发明的多核苷酸也可以以有义方向用于抑制内源基因在植物中的表达。以有义方向使用多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常包含，用包含驱动在植物中的表达的启动子的DNA构建体转化植物，所述启动子可操作地连接至与内源基因的转录物相对应的多核苷酸的至少一部分。通常，这样的核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有显著的序列同一性，优选大于约65％序列同一性，更优选大于约85％序列同一性，最优选大于约95％序列同一性。参见，美国专利号5,283,184和5,034,323；在本文中引作参考。

因而，许多方法可以用于减少或消除Dof多肽或其生物活性变体或片段的活性。另外，可以使用方法的组合来减少或消除至少一种Dof多肽的活性。进一步认识到，可以调节单个Dof序列的水平来生产希望的表型。或者，可能希望调节(增加和/或降低)具有Dof结构域或其生物活性变体或片段的多个序列的表达水平。为了降低单个Dof序列(或高度相关的Dof序列)的水平，可以使用抑制构建体，后者靶向特定Dof序列或Dof序列的特定子集的抑制。或者，如果希望抑制广范围的Dof序列，抑制构建体可以使用在Dof家族成员之间高度保守的序列，例如Dof结构域。

如上面所讨论的，可以使用许多种启动子来调节Dof序列的水平。在一个实施方案中，调节至少一种Dof多肽的水平的异源多核苷酸的表达，可以由组织优选的启动子、尤其是叶优选的启动子(即，叶肉优选的启动子或维管束鞘优选的启动子)和/或种子优选的启动子(即，胚乳优选的启动子或胚优选的启动子)来调节。

B.调节植物中碳固定、氮同化作用、产量和/或胁迫耐受性的方 法

氮同化作用是植物的生长和发育所必需的，因此，将大量的氮肥用于植物，以最大化作物产量。但是，除了构成单一最昂贵的农业输入外，这样的氮肥对环境具有负面影响。因此，提供了增加植物或植物部分的同化氮的能力、从而提高植物产量的方法和组合物。这样的方法包含，调节植物或植物部分中至少一种具有Dof结构域的Dof多核苷酸的水平，从而增加氮同化作用(增加氮利用效率)和/或植物产量。

通过测定植物或植物部分中的氮含量，可以测定氮同化作用的增加。例如，增加氮同化作用的水平可以包含，植物或植物部分的总氮含量比对照植物或植物部分增加约0.1％、0.5％、1％、3％5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大。或者，增加的氮含量水平可以包括，与对照植物或植物部分相比，植物或植物部分中氮水平总体增加了约0.5倍，1倍，2倍，4倍，8倍，16倍或32倍。测定氮水平的方法是已知的。参见，例如，Yanagisawa，等人，(2004)PNAS 101：7833-7838和Stitt，等人，(1989)Methods Enzymol.174：518-552，二者都在本文中整体引作参考。

通过测定植物或植物部分中的氨基酸水平，也可以测定氮同化作用的增加。″增加氨基酸水平″包括植物或植物部分中氨基酸水平的任意增加。例如，增加氨基酸水平可以包含，植物或植物部分的总氨基酸含量比对照植物或植物部分增加了约0.1％、0.5％、1％、3％5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大。或者，增加的氨基酸水平可以包括，与对照植物或植物部分相比，植物或植物部分中氨基酸水平总体增加了约0.5倍，1倍，2倍，4倍，8倍，16倍或32倍。

另外认识到，氨基酸水平的增加不需要是氨基酸水平的总体增加，也包括单一氨基酸或氨基酸组合的水平的变化。在该实施方案中，氨基酸水平的增加不需要是氨基酸浓度的总体增加，也包括不同氨基酸的比例的变化。例如，氨基酸含量的增加可以通过升高水平的谷氨酰胺或谷氨酸反映出来，它们是氮利用的良好标志物。参见，例如，Stitt，等人，(1999)Plant Cell Environ.22：583-621，Matt，等人，(2002)Plant J.30：663-677，和Foyer，等人，(2003)J.Exp.Bot.54：585-593，和Yanagisawa，等人，(2004)PNAS 101：7833-7838，它们都在本文中引作参考。

通过监视植物对氮胁迫的耐受性，也可以测定氮同化作用的增加(氮利用效率的增加)。在本文其它地方的进一步详述中讨论了这样的测定。简而言之，通过测定植物或植物部分在低氮条件下是否表现出比对照植物或植物部分更好的生长，可以测定对氮同化作用的调节。这样的表型可以包含，在低氮生长条件下，叶没有变色。参见，例如，Yanagisawa，等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci 101：7833-7838，它们在本文中引作参考。

所述方法和组合物另外可以用于增加植物的产量。本文使用的术语″提高的产量″是指，任意测量的植物产物的产量的任意提高。产量的提高可以包含，测量的植物产物增加了0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。或者，增加的植物产量可以包含，测量的植物产物增加了约0.5倍，1倍，2倍，4倍，8倍，16倍或32倍。例如，从具有本处理的作物产生的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量相对于从在相同条件下种植的未处理的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的增加，可以视作提高的产量。

也提供了提高植物的胁迫耐受性的方法。本发明的方法包含，调节植物或植物部分中具有Dof结构域的多肽的水平，并从而增加植物的胁迫耐受性。

本文使用的无生命的胁迫耐受性包括、但不限于，增加的产量，生长，生物量，健康或其它度量，与适宜的对照植物相比，它会指示对胁迫的耐受性，所述胁迫包括、但不限于，热胁迫，盐胁迫，冷胁迫(包括萌发过程中的冷胁迫)，热胁迫，水胁迫(包括但不限于干旱胁迫)，和氮胁迫(包括高和低氮)。

″热耐受性″在本文中定义为，植物在热或较热的温度会不利地影响适宜的对照植物的生长、活力、产量和/或大小的条件下生长的能力的度量。在热胁迫条件下，表现出提高的热耐受性的植物比非热耐受的植物生长得更好。

″冷耐受性″在本文中定义为，植物在冷或较冷的温度会不利地影响适宜的对照植物的生长、活力、产量和/或大小的条件下生长的能力的度量。在冷胁迫条件下，表现出提高的冷耐受性的植物比非冷耐受的植物生长得更好。

本文定义的″干旱″是指，干燥阶段、尤其在长时间时，可以造成对作物的损害或阻止它们的成功生长(即，降低的活力，生长，大小，根长度，和/或各种其它生理和物理度量)。在干旱胁迫条件下，表现出提高的干旱耐受性的植物比非干旱耐受的植物生长得更好。

“氮胁迫”在本文中定义为，在有氮存在下的增加或降低，它可以造成对作物的损害或阻止它们的成功生长(即，降低的活力，生长，大小，根长度，和/或各种其它生理和物理度量)。在低和/或高氮胁迫条件下，表现出提高的氮胁迫耐受性的植物比相同物种的适宜对照植物生长得更好。测定提高的氮胁迫耐受性的方法是已知的。参见，例如，Sepehri，等人，(2003)Journal of Biol.Sciences 3：578-584；Henry，等人，(1992)Int J Plant Sci 153：178-85；Banzinger，等人，(2000)Breeding for Drought and Nitrogen Stress Tolerance in Maize：From Theory to Practice.Mexico，D.F.：CIMMYT；Dhugga and Waines(1989)Crop Science 29：1232；和Sicher，等人，(2005)Pysiologia Plantarum 123：219，它们各自在本文中引作参考。

因此，提供了多种增加氮同化作用、增加产量、和/或增加植物的胁迫耐受性的方法。在一个实施方案中，增加氮同化作用和/或增加产量和/或增加植物或植物部分的胁迫耐受性包含，向植物或植物部分中引入异源多核苷酸；和，在植物或植物部分中表达异源多核苷酸。以此方式，异源多核苷酸的表达会调节植物或植物部分中至少一种Dof多肽的水平，其中所述Dof多肽包含具有SEQ ID NO：145所述氨基酸序列的Dof结构域或该结构域的变体或片段。

在具体实施方案中，Dof多肽的水平的调节包含，至少一种Dof多肽的水平的增加。以此方式，引入植物中的异源多核苷酸会编码具有Dof结构域或其生物活性变体或片段的多肽。在具体实施方案中，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152或153所述序列中的至少一个，和/或其生物活性变体或片段。

在其它实施方案中，调节至少一种Dof多肽的水平包含，降低至少一种Dof多肽的水平。以此方式，引入植物中的异源多核苷酸不需要编码功能性Dof多肽，但是该多核苷酸的表达会导致包含Dof结构域或Dof结构域的生物活性变体或片段的Dof多肽的降低的表达。在具体实施方案中，具有降低的水平的Dof多肽如SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160中的至少一个所述，或是其生物活性变体或片段。

可以用于调节Dof多肽的水平的示例性启动子如本文其它地方所述。在一个实施方案中，调节至少一种Dof多肽的水平的异源多核苷酸的表达，可以由组织优选的启动子、尤其是脉管优选的启动子、叶优选的启动子(即，叶肉优选的启动子或维管束鞘优选的启动子)和/或种子优选的启动子(即，胚乳优选的启动子或胚优选的启动子)来调节。

实验

实施例1玉米Dof序列的序列分析和表达数据

进行了SEQ ID NO：1-144和146所述Dof序列的序列分析。图2总结了由SEQ ID NO：1-144和146编码的Dof结构域。使用可公开得到的EMBOSS工具组中的″Needle″程序，建立图2所述的比对。该程序使用Needleman-Wunsch算法。对于蛋白，使用GAP缺省参数(即，缺口罚分为8)。也参见，emboss.sourceforge.net/apps/needle.html。

表1总结了与SEQ ID NO：1-144和146，和147-160编码的多肽具有最高序列同一性和相似性的序列。表2总结了SEQ ID NO：1-144和146编码的多肽之间具有的总序列同一性百分比。使用VNT19.0AlignX工具(2002年2月4日)，建立表2提供的比对数据，该工具是Vector NTI Suite 7.1的组件。

表3总结了玉米Dof序列的表达数据，并提供了具有经典MPSS数据的指定组织的每百万的平均份数。

实施例2.调节玉米的氮同化作用的Dof序列过表达

用含有在UBI启动子控制下的Dof序列(例如Zm-DOF1，9，10，11，14，15，16，17，18，20，21或22)和选择标记基因PAT的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟的玉米胚(Wohlleben，等人，(1988)Gene 70：25-37)，所述选择标记基因PAT会赋予对除草剂双丙氨磷(Bialaphos)的抗性。或者，将选择标记基因提供在分开的质粒上。如下进行转化。培养基配方如下。

靶组织的制备

将穗去壳，在30％Clorox漂白剂+0.5％Micro去垢剂中表面灭菌20分钟，用无菌水漂洗两次。切割未成熟胚，将胚轴一侧向下(盾片一侧向上)放置，每个平板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区域内排列，为轰击做准备。

制备含有可操作地连接到泛素启动子上的Dof序列的质粒载体。使用如下的CaCl₂沉淀方法，将该质粒DNA和含有PAT选择标记的质粒DNA沉淀至1.1μm(平均直径)的钨沉淀物上：100μl水中制备好的钨粒子；10μl(1μg)Tris EDTA缓冲液中的DNA(1μg总DNA)；100μl 2.5M CaCl₂；和，10μl 0.1M亚精胺。

将各试剂顺序加入钨粒子悬浮液中，同时保持在多管振荡器上。对最终的混合物简单地进行超声处理，在恒定的振荡下放置10分钟。在沉淀阶段后，将试管简单离心，去除液体，用500ml 100％乙醇洗涤，并离心30秒。再一次将液体去除，并将105μl 100％乙醇加入最终的钨粒子沉淀物中。为进行粒子枪轰击，对钨/DNA粒子进行简单的声处理，并取10μl点样于各个大载体(macrocarrier)的中心，且允许其在轰击前干燥约2分钟。

在粒子枪(美国专利号5,240,855)中以#4水平轰击样品平板。所有样品在650PSI下接受单次轰击，从每试管制备的粒子/DNA中取出总计10等份。

在轰击后，将胚放置在560Y培养基上2天，随后转移至含有3mg/l双丙氨磷的560R选择培养基中，且每2周进行继代培养。在选择约10周后，将选择抗性的愈伤组织克隆转移至288J培养基上，以起始植物再生。在体细胞胚成熟(2-4周)后，将发育良好的体细胞胚转移至用于萌发的培养基上，转移至光照培养室中。约7-10天后，将发育中的植物苗转移至试管中的272V不含激素的培养基中7-10天，直至苗充分形成。随后将植物转移插入含有盆栽土的平板(等同于2.5”盆)，并在生长箱中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，随后转移至经典的600罐(1.6加仑)中，培养至成熟。监控植物，并对氮利用效率的增加、产量的增加、或胁迫耐受性的增加评分。

轰击培养基(560Y)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson氏维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l维生素B1、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(在用KOH调节至pH 5.8后用D-I H₂O调节体积)；2.0g/l水晶洋菜(Gelrite)(在用D-I H₂O调节体积后加入)；以及8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)含有4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s维生素混合物(1000×SIGMA-1511)、0.5mg/l维生素B1、30.0g/l蔗糖、和2.0mg/l 2，4-D(在用KOH调节至pH 5.8后用D-I H₂O调节体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I H₂O调节体积后加入)；以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨磷(二者均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储备液(0.100g烟酸、0.02/l维生素B1、0.10g/l维生素B6、和0.40g/l甘氨酸，用处理后的D-I H₂O调节体积)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调节至pH 5.6后用处理后的D-I H₂O调节体积)；3.0g/l Gelrite(在用D-I调节体积后加入)；以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨磷(在将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。不含激素的培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素(0.100g烟酸、0.02g/l维生素B1、0.10g/l维生素B6、和0.40g/l甘氨酸，用处理后的D-I H₂O调节体积)、0.1g/l肌醇、和40.0g/l蔗糖(在调节至pH 5.6后用处理后的D-I H₂O调节体积)；以及6g/l细菌琼脂(在用处理后的D-I H₂O调节体积后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实施例3.玉米中多个Dof序列的抑制

使用设计成靶向编码来自例如Zm-Dof1的Dof结构域序列的核苷酸序列的RNAi构建体，可以靶向抑制多个玉米Dof序列。简而言之，为了靶向多个Dof序列，使用编码Dof结构域的DNA序列(或与Dof结构域具有至少70％、80％、90％、或更大序列同一性的序列)，并用于制备载体中的反向重复序列。例如，可以使用具有Zm-Dof 1(Dof结构域)::ADH1内含子1::ATTB2::Zm-Dof 1(Dof结构域)的恒定区。

为了用特异性靶向至少一种Dof序列的一个或多个抑制构建体进行农杆菌介导的玉米转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840，和PCT专利公开WO98/32326；它们的内容在本文中引作参考)。简而言之，从玉米中分离出未成熟的胚，将胚与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将可操作地连接到种子优选的启动子上的Dof抑制序列转移进至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，将未成熟的胚浸入农杆菌悬浮液中以起始接种。将胚与农杆菌共同培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，将未成熟的胚在固体培养基上培养。在该共培养阶段后，进行可选的“静止”步骤。在该静止步骤中，在至少一种抗生素的存在下培养胚，已知该抗生素在不加入植物转化株的选择剂时能抑制农杆菌的生长(步骤3：静止步骤)。在具有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚以去除农杆菌，并为受感染细胞提供静止期。此后，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，生长中的经转化愈伤组织被收集(步骤4：选择步骤)。在具有选择剂的固体培养基上培养未成熟的胚，造成经转化细胞的选择性生长。愈伤组织随后再生成为植物(步骤5：再生步骤)，且在固体培养基上对在选择培养基上生长的愈伤组织加以培养，以再生植物。

Dof序列表达的降低可以通过测定Dof转录物的水平来直接测量，或表达的降低可以通过测定氮同化作用的增加、胁迫反应的增加或产量的增加来测量。

实施例4.玉米中单个靶Dof序列的抑制

使用设计成靶向目标Dof序列子集的RNAi构建体，可以靶向抑制单个Dof序列或Dof序列子集。例如，可以单个靶向DOF1，DOF10，和DOF14。简而言之，为了抑制单个Dof基因，可以使用对每个Dof特异的DNA序列(即，3′UTR，5′UTR或CDS的特定区域)来制备反向重复序列。例如，可以靶向Dof 1 3′UTR，即Dof 14编码序列的一个区域或Dof 10编码序列的一个区域。例如，构建包含Zm-Dof 1(3′UTR)::ADH1内含子1::ATTB2::Zm-Dof 1(3′UTR)的恒定区，或包含Zm Dof 14::ADH1内含子1::ATTB2::Zm Dof 14的恒定区，或包含Zm Dof 10::ADH1内含子1::ATTB2::Zm Dof 10的恒定区。

为了用特异性靶向至少一种Dof序列的一个或多个抑制构建体进行农杆菌介导的玉米转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840，和PCT专利公开WO98/32326；它们的内容在本文中引作参考)。简而言之，从玉米中分离出未成熟的胚，将胚与农杆菌的悬浮液接触，其中该细菌能够将可操作地连接到种子优选的启动子上的Dof抑制序列转移进至少一个未成熟胚的至少一个细胞(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，将未成熟的胚浸入农杆菌悬浮液中以起始接种。将胚与农杆菌共同培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，将未成熟的胚在固体培养基上培养。在该共培养阶段后，进行可选的“静止”步骤。在该静止步骤中，在至少一种抗生素的存在下培养胚，已知该抗生素在不加入植物转化株的选择剂时能抑制农杆菌的生长(步骤3：静止步骤)。在具有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养未成熟胚以去除农杆菌，并为受感染细胞提供静止期。此后，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，生长中的经转化愈伤组织被收集(步骤4：选择步骤)。在具有选择剂的固体培养基上培养未成熟的胚，造成经转化细胞的选择性生长。愈伤组织随后再生成为植物(步骤5：再生步骤)，且在固体培养基上对在选择培养基上生长的愈伤组织加以培养，以再生植物。

Dof序列表达的降低可以通过测定Dof转录物的水平来直接测量，或表达的降低可以通过测定氮同化作用的增加、胁迫反应的增加或产量的增加来测量。

实施例5.调节大豆的氮同化作用

如下用含有可操作地连接到叶优选的启动子上的至少一种Dof序列的表达盒的质粒，轰击大豆胚。为了诱导体细胞胚，即子叶，将大豆品种A2872的表面-灭菌的、未成熟的种子切成3-5mm长，在26℃、在光照或黑暗中在适宜的琼脂培养基上培养6-10周。然后切离生成次生胚的体细胞胚，置于合适的液体培养基中。重复选择作为早期球形阶段的胚繁殖的体细胞胚群后，如下所述维持悬浮液。

在旋转摇床(150rpm)上于26℃将大豆胚发生悬浮培养物保持在35ml液体培养基中，用荧光灯提供16∶8小时白天/夜晚循环。通过将约35mg组织接种到35ml液体培养基中，每两周将培养物进行继代培养。

然后通过粒子枪轰击的方法(Klein，等人，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利号4,945,050)，转化大豆胚发生悬浮培养物。

可以用于促进大豆转化的选择标记基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，等人，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz，等人，(1983)Gene 25：179-188)和来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区域组成的转基因。可以将包含可操作地连接到叶优选的启动子上的Dof序列的抑制盒的表达盒分离为限制性片段。然后可以将该片段插入携带标记基因的载体的独特的限制位点。

向50μl 60mg/ml中，加入1μm金颗粒悬浮液(按顺序)：5μl DNA(1μg/μl)，20μl亚精胺(0.1M)，和50μl CaCl₂(2.5M)。然后将颗粒制品搅拌3分钟，在微量离心机中旋转10秒，去除上清液。然后在400μl 70％乙醇中洗涤DNA-包被的颗粒1次，重新悬浮于40μl无水乙醇中。可以将DNA/颗粒悬浮液声处理3次，每次1秒。随后将5μl DNA+包被的金颗粒加样至各个大载体盘中。

将约300-400mg的2周龄悬浮培养物置于空的60x15mm培养皿中，使用移液管将残留液体从组织上去除。对于每次转化实验，正常轰击约5-10个平板的组织。膜破裂压力设定为1100psi，将箱体抽真空至28英寸汞柱的真空度。将组织放在离留置筛(retaining screen)约3.5英寸处，且轰击3次。轰击后，将组织分成2半，放回到液体中，如上所述进行培养。

轰击后5-7天，将液体培养基更换为新鲜培养基，轰击后11-12天，更换为含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基。该选择培养基每周更新。轰击后7-8周，观察到从未经转化的坏死胚发生细胞簇中生长出绿色的经转化的组织。取走分离出的绿色组织，接种至各烧瓶中，以生成新的、无性繁殖的转化的胚发生悬浮培养物。各个新株系被作为独立的转化事件加以处理。这些悬浮液随后可继代培养，并维持为未成熟的胚簇，或通过各个体细胞胚的成熟和萌发再生为整株植物。

实施例6.操纵玉米中的ZM-DOF

用ZM-UBI PRO(一种强组成型启动子)驱动几种ZM-DOF的编码区，用于在玉米中过表达。终止子序列(NOS或PINII)用在DOF编码区的下游。在所有转基因事件中，‘UBI:MOPAT:PINII’用作除草剂抗性的选择标记，在它们中的有些事件中，转基因的‘ZM-LTP2PRO:RFP:PINII’用于分离转基因种子和分离非转基因种子。在有些情况下，其它启动子例如ZM-PEPC1和ZM-GOS2也用于分别驱动ZM-DOF的叶肉细胞特异性的和弱组成型的表达。按照农杆菌介导的玉米转化方法，将所有这些载体转化进introEF09B基因型中。在所有过表达转基因事件中，在T0事件中进行关于转基因拷贝数、转基因表达和肌动蛋白控制的分子分析。在每个构建体中，筛分T0事件在构建体内的高、中和低转基因表达水平(参见，表4)。选择单拷贝转基因表达(和/或RFP表达种子)事件，用于进一步实验。当被ZM-UBI启动子驱动时，来自B73近交的ZM-DOF1等位基因在几个不同的转化实验中表现为致命的。因此，通过RT-PCR，克隆来自玉米近交H84的公开的(Yanagisawa和Izui(1992)JBC 288：16028)ZM-DOF1等位基因。来自B73和H84近交的DOF1等位基因在蛋白水平是97％一致的。磷酸化位点预测分析揭示，在47位的丝氨酸(它是100％概率的推定磷酸化位点)存在于B73中，但是在ZM-DOF1的H84等位基因中缺少。已经知道转录因子的翻译后修饰(例如磷酸化)会修饰它们的活性。使用来自H84近交的ZM-DOF1等位基因的转化实验目前正在进展中。还建立了Zm-DOF1，7，10和14的RNAi载体。从列表中挑取2个DOF1RNAi载体(PHP26339和26340)，因为T0转基因事件的分子分析没有显示出内源DOF1 mRNA的任何显著减少。来自11个不同ZM-DOF相关的PHP的单个转基因拷贝和转基因表达植物目前在遗传苗圃(GN)中，以繁殖用于进一步实验和将来田地评价测交的种子。6个PHP目前在转化管道中，预期在该年末T0事件将在温室中。另外，已经为玉米转化准备好含有12个不同DOF相关的PHP的重组质粒转化农杆菌。在表4中总结了所有DOF-相关的PHP和它们的目前状态的细节。

表4

EST	PHP#或pRG#	启动子	基因
				cpls1s.pk012.e5(部分的)	PHP25990	ZM-UBI	ZM-DOF1-B73
cpls1s.pk012.e5(部分的)	PHP25991	ZM-PEPCI	ZM-DOF1-B73

cta1n.pk0008.h10	PHP25995	ZM-UBI	ZM-DOF14
				p0031.ccmay70rb	PHP25996	ZM-UBI	ZM-DOF17
csc1c.pk006.n23	PHP25997	ZM-UBI	ZM-DOF20
				p0095.cwsbj71ra	PHP25998	ZM-UBI	ZM-DOF16
p0111.cipmh48r	PHP26337	ZM-UBI	ZM-DOF9
				cpf1c.pk006.i22a	PHP26338	ZM-UBI	ZM-DOF10
cpls1s.pk012.e5(部分的)	PHP26339	ZM-UBI	ZM-DOF1RNAi
				cpls1s.pk012.e5(部分的)	PHP26340	ZM-UBI	ZM-DOF1RNAi
cie1s.pk002.a5	PHP27070	ZM-UBI	ZM-DOF10RNAi
				cpf1c.pk006.i22a	PHP26910	ZM-UBI	ZM-DOF11
cen1.pk0109.b4：fis	PHP27748	ZM-UBI	ZM-DOF7
				cen1.pk0109.b4：fis	PHP27749	ZM-GOS2	ZM-DOF7
cco1n.pk082.a18	PHP28364	ZM-UBI	ZM-DOF12
				cds3f.pk001.j20	PHP28365	ZM-UBI	ZM-DOF13
cfp5n.pk066.b23	PHP28866	ZM-UBI	ZM-DOF5(7-2)
				cfp5n.pk066.b23	PHP28863	ZM-GOS2	ZM-DOF5(7-2)
通过RT-PCR，没有EST	PHP28864	ZM-UBI	ZM-DOF1-H84
				通过RT-PCR，没有EST	PHP28865	ZM-PEPC 1	ZM-DOF1-H84
cbn10.pk0039.e7	PHP26911	ZM-UBI	ZM-DOF15
				cest1s.pk002.f23	PHP26924	ZM-UBI	ZM-DOF21
cepe7.pk0012.h2	PHP26912	ZM-UBI	ZM-DOF18
				cco1n.pk072.j23	PHP26913	ZM-UBI	ZM-DOF22
cta1n.pk0008.h10	PHP26923	ZM-UBI	ZM-DOF14RNAi
				cen1.pk0109.b4：fis	PHP27750	ZM-UBI	ZM-DOF7RNAi

cpls1s.pk012.e5(部分的)	pRG974	35S-TET-OP	ZM-DOF1-B73
				cfp7n.pk005.a14	pRG1020	ZM-UBI	ZM-DOF8
cfp3n.pk069.i19	pRG1029	ZM-UBI	ZM-DOF28
				cfp7n.pk069.o21	pRG1021	ZM-UBI	ZM-DOF30
cfp1n.pk071.e24	pRG1022	ZM-UBI	ZM-DOF33
				cfp2n.pk002.k24	pRG1023	ZM-UBI	ZM-DOF34

这些玉米转基因事件的后续详细表型分析(肉眼观察的，分子的，生化的/酶的，生理的，胁迫等)正在进行中。

实施例7.拟南芥中的ZM-DOF过表达

除了在玉米中过表达ZM-DOF以外，制备了过表达在组成型ZM-UBI启动子控制下的ZM-DOF的拟南芥转基因系。在有些情况下，弱组成型(ZM-GOS2)或叶肉细胞特异性的启动子(ZM-PEPC1)也用于驱动ZM-DOF的表达。终止子序列(NOS或PINII)用在DOF编码区的下游。在所有转基因事件中，‘UBI:MOPAT:PINII’用作除草剂抗性的选择标记。通过农杆菌介导的‘Floral-Dip’方法(Clough和Bent(1998)Plant Journal 16：735)，将它们的过表达载体转化进拟南芥生态型Columbia-0。在土壤中筛选T0种子的T1转化体的除草剂抗性。为了转基因T1事件的分子分析，进行RT-PCR来检测转基因表达、肌动蛋白控制和基因组DNA在RNA制品中的存在。在每个构建体中，筛分T1事件在构建体内的高、中和低转基因表达水平(参见附表5)。进行用于进一步研究的转基因表达事件。在所有拟南芥转基因系中，建立26个不同的过表达PHP，它们代表22个不同的ZM-DOF。在下表中总结了拟南芥中不同ZM-DOF过表达实验的状态。

表5

EST	PHP#/pRG#	启动子	基因
				RT-PCR	PHP25990	ZM-UBI	ZM-DOF1-B73
RT-PCR	PHP25991	ZM-PEPC1	ZM-DOF1-B73
				通过RT-PCR，没有EST	PHP28864	ZM-UBI	ZM-DOF1-H84
通过RT-PCR，没有EST	PHP28865	ZM-PEPC1	ZM-DOF1-H84
				cfp5n.pk066.b23	PHP28863	ZM-GOS2	ZM-DOF5
cfp5n.pk066.b23	PHP28866	ZM-UBI	ZM-DOF5
				cen1.pk0109.b4：fis	PHP27748	ZM-UBI	ZM-DOF7

cen1.pk0109.b4：fis	PHP27749	ZM-GOS2	ZM-DOF7
				cfp7n.pk005.a14	pRG1020	ZM-UBI	ZM-DOF8
p0111.cipmh48r	PHP26337	ZM-UBI	ZM-DOF9
				cpf1c.pk006.i22a	PHP26338	ZM-UBI	ZM-DOF10
cpf1c.pk006.i22a	PHP26910	ZM-UBI	ZM-DOF11
				cco1n.pk082.a18	PHP28364	ZM-UBI	ZM-DOF12
cds3f.pk001.j20	PHP28365	ZM-UBI	ZM-DOF13
				cta1n.pk0008.h10	PHP25995	ZM-UBI	ZM-DOF14
cbn10.pk0039.e7	PHP26911	ZM-UBI	ZM-DOF15
				p0095.cwsbj71ra	PHP25998	ZM-UBI	ZM-DOF16
p0031.ccmay70rb	PHP25996	ZM-UBI	ZM-DOF17
				cepe7.pk0012.h2	PHP26912	ZM-UBI	ZM-DOF18
csc1c.pk006.n23	PHP25997	ZM-UBI	ZM-DOF20
				cest1s.pk002.f23	PHP26924	ZM-UBI	ZM-DOF21
cco1n.pk072.j23	PHP26913	ZM-UBI	ZM-DOF22
				cfp3n.pk069.i19	pRG1029	ZM-UBI	ZM-DOF28
cfp7n.pk069.o21	pRG1021	ZM-UBI	ZM-DOF30
				cfp1n.pk071.e24	pRG1022	ZM-UBI	ZM-DOF33
cfp2n.pk002.k24	pRG1023	ZM-UBI	ZM-DOF34

这些拟南芥转基因系的后续详细表型分析(肉眼观察的，分子的，生化的/酶的，生理的，胁迫等)正在进行中。

实施例8.拟南芥中UBI PRO::ZM-DOF1-H84(PHP28865)的过 表达增量调节AtPEPC1和AtPPDK1

在拟南芥中过表达的初期实验中，在ZM-UBI启动子控制下的来自B73玉米近交系的ZM-DOF1等位基因没有产生任何转基因表达事件。该发现与在玉米转化实验中发现的结果相一致。通过幼叶RNA的RT-PCR，制备来自H84玉米近交系的公开ZM-DOF1(Yanagisawa和Izui(1992)JBC 288：16028)等位基因的克隆。来自B73和H84近交系的DOF1等位基因在蛋白水平具有97％同一性。用ZM-UBI启动子过表达来自H84近交系的ZM-DOF1等位基因，导致几个转基因表达事件，几个事件表现出AtPEPC1(At3g14940)和AtPPDK1(At5g08570)的显著增量调节，这与在公开的研究(Yanagisawa，等人，(2004)PNAS 101：7833)中报道的结果相一致。实验还建立了几个转基因拟南芥系，它们过表达来自B73和H84近交系的ZM-DOF1等位基因，二者都在叶肉细胞特异性的ZM-PEPC1启动子控制下，AtPEPC1、AtPPDK1表达水平没有可检测的显著差异。

实施例9 ZM-DOF7是胚乳特异性的基因

初期的Lynx MPSS表达分析表明，ZM-DOF7仅在胚乳文库中表达。为了证实该结论，在从玉米近交系B73的不同器官分离的总RNA上，进行饱和的RT-PCR(35个循环)。使用从V3幼苗、未成熟的穗、成熟的叶、胚乳(14DAP)、幼叶、节间和根分离的总RNA，进行RT-PCR实验，使用ZM-DOF7基因特异性的(P894BC#11843&P895BC#188944)和AT-Actin2(P815BC#99547&P816BC#99548)引物。RT-PCR数据揭示，ZM-DOF7仅在测试的不同器官的胚乳(14DAP)中表达。

实施例10 ZM-DOF10和ZM-DOF14的亚细胞定位

为了测定亚细胞定位，用RFP标记ZM-DOF10和ZM-DOF14，并用强组成型ZM-UBI启动子驱动。还将在ZM-UBI启动子控制下的表达单独RFP的载体用作对照。将这3个构建体轰击进洋葱表皮细胞，用于RFP融合蛋白定位。结果清楚地显示，ZM-DOF10-RFP和ZM-DOF14-RFP主要定位在核中，而单独的RFP或多或少地存在于每个地方(例如，胞质)。初期的Lynx MPSS表达分析揭示，ZM-DOF10在顶端分生组织和未成熟的穗文库中表达。为了进一步测定ZM-DOF10的空间表达图谱，在V3芽顶端分生组织(SAM)和未成熟的穗顶尖和基底上进行原位杂交实验。来自ZM-DOF10的有义和反义链的杂交数据对比表明，DOF10在V3SAM的特定细胞层中表达，而在未成熟的穗中，该基因仅在顶尖(活跃生长的细胞，分生组织)表达。

实施例11.Dof序列的变体

A.没有改变编码的氨基酸序列的Dof序列的变体核苷酸序列

将在SEQ ID NO：1，2，4，5，7，8，10，11，13，14，16，17，19，20，22，23，25，26，28，29，31，32，34，35，37，38，40，41，43，44，46，47，49，50，52，53，55，56，58，59，61，62，64，65，67，68，70，71，73，74，76，77，79，81，83，84，86，87，89，90，92，93，95，96，98，99，101，102，104，105，107，108，110，111，113，114，116，117，119，120，122，123，125，126，128，129，131，132，134，136，137，139，140，142，143，146，147，148，149，150，151，152，或153中所述的Dof核苷酸序列，用于建立变体核苷酸序列，与适当的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比，它们的读码框的核苷酸序列具有约70％、76％、81％、86％、92％和97％核苷酸序列同一性。使用标准的密码子表，建立这些功能变体。尽管改变了变体的核苷酸序列，由读码框编码的氨基酸序列没有变化。

B.Dof序列的变体氨基酸序列

建立了Dof序列的变体氨基酸序列。在该实施例中，改变了一个氨基酸。具体而言，评论了SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160所述的读码框，以确定适宜的氨基酸改变。通过进行蛋白比对(与其它直向同源基因和来自不同物种的其它基因家族成员比对)，选择要变化的氨基酸。参见图1和表1。选择被认为没有在高选择压力(非高度保守的)下且相当容易取代为具有类似化学特征(即，类似功能侧链)的氨基酸。使用图1、表1所示的蛋白比对和SEQ ID NO：145所述的共有序列，可以改变适当的氨基酸。一旦识别出靶氨基酸，实施例6A所述的操作如下。使用该方法，建立与SEQ ID NO：3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，60，63，66，69，72，75，78，80，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，135，138，141，144，154，155，156，157，158，159或160具有约70％、75％、81％、86％、92％和97％核酸序列同一性的变体。

C.Dof序列的其它变体氨基酸序列

在该实施例中，建立了相对于参照蛋白序列具有82％、87％、92％和97％同一性的人工蛋白序列。该后一努力需要从图1和2所述的比对识别保守区和可变区，然后慎重地应用于氨基酸取代表。下面将更详细地讨论这些部分。

主要基于Dof蛋白之间或其它Dof蛋白之间的保守区，测定改变的氨基酸序列。参见图1，2和表1。基于序列比对，用小写字母表示可能改变的Dof序列的不同区域，而保守区用大写字母表示。认识到，可以在下面的保守区中进行保守取代，而不改变功能。另外，技术人员会理解，本发明的Dof序列的功能变体可以在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变化。

然后建立以80-85％、85-90％、90-95％、和95-100％同一性区间不同于起始序列的人工蛋白序列。靶向这些区间的中点，自由度是例如±1％。通过定制的Per表格软件，可以实现氨基酸取代。在下面的表6中提供了取代表。

表6.取代表

首先，识别出不应当改变的蛋白中的任意保守氨基酸，并“划界”以避免发生取代。第一个甲硫氨酸当然自动地加入该列表中。接着，作出变化。

在任何情况下，H，C，和P都没有改变。改变首先发生在异亮氨酸，从N-末端扫描至C-末端。然后亮氨酸，在列表中依次向下，直到达到希望的靶。可以进行中间数字取代，以避免造成变化的反转。列表排序是1-17，所以在亮氨酸之前从需要量的异亮氨酸变化开始，依次向下至甲硫氨酸。显然，以此方式许多氨基酸不需要变化。L，I和V涉及2个交替的最佳取代的50∶50取代。

变体氨基酸序列写为输出。Per表格软件用于计算同一性百分比。使用该方法，建立与对应SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列具有约82％、87％、92％和97％氨基酸同一性的Dof序列的变体。

冠词″一个″和″一种″在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)的冠词语法对象。作为实例，″一个元件″是指一个或多个元件。

在说明书中提及的所有公开物和专利申请对本发明所属的技术领域的技术人员的水平是说明性的。所有的公开物和专利申请在本文中引作参考，与各公开物或专利申请被特别地、各个地在本文中引作参考一样。

尽管为了清楚理解的目的，通过图解和实施例对前文所述的发明进行了一些细节描述，但某些改变和变化可在所附权利要求书的范围内得到实现。

Claims (43)

1.分离的多肽，其包含选自下述的氨基酸序列：

(a)包含SEQ ID NO：39或97的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO：39或97具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有调节转录的能力；和，

(c)包含SEQ ID NO：39或97的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述多肽保留调节转录的能力。

2.分离的多核苷酸，其包含选自下述的核苷酸序列：

(a)包含SEQ ID NO：38或96的核苷酸序列；

(b)编码包含SEQ ID NO：39或97的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID NO：38或96具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有调节转录的能力的多肽，或所述多核苷酸在植物中的表达会降低至少一种Dof多肽的表达；

(d)包含SEQ ID NO：38或96或其互补序列的至少40个连续核苷酸的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有调节转录的能力的多肽，或所述多核苷酸在植物中的表达会降低至少一种Dof多肽的表达；

(e)在严格条件下与a)或b)的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中所述严格条件包含37℃下50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃-65℃下在0.1X SSC中洗涤，其中所述多核苷酸编码具有调节转录的能力的多肽，或所述多核苷酸在植物中的表达会降低至少一种Dof多肽的表达；和，

(f)编码与SEQ ID NO：39或97具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有调节转录的能力的多肽，或所述多核苷酸在植物中的表达会降低至少一种Dof多肽的表达。

3.包含权利要求2的多核苷酸的表达盒。

4.权利要求3的表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至驱动植物中的表达的启动子。

5.权利要求4的表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至组织优选的启动子、组成型启动子或诱导型启动子。

6.权利要求5的表达盒，其中所述组织优选的启动子是叶优选的启动子，叶肉优选的启动子，维管束鞘优选的启动子，种子优选的启动子，胚乳优选的启动子，或胚优选的启动子。

7.植物或植物部分，其包含可操作地连接至驱动植物中的表达的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含权利要求2的核苷酸序列。

8.权利要求7的植物或植物部分，其中所述植物是单子叶植物。

9.权利要求8的植物或植物部分，其中所述单子叶植物是玉米，小麦，水稻，大麦，高梁或黑麦。

10.权利要求8的植物或植物部分，其中所述单子叶植物是玉米。

11.权利要求7的植物或植物部分，其中所述植物是双子叶植物。

12.权利要求11的植物或植物部分，其中所述双子叶植物是大豆，芸苔，向日葵，棉花或苜蓿。

13.权利要求7-12中任一项的植物或植物部分，其中所述多核苷酸稳定掺入植物基因组中。

14.权利要求7-13中任一项的植物部分，其中所述植物部分是细胞。

15.一种种子，具有稳定掺入其基因组中的权利要求2的多核苷酸。

16.调节植物或植物部分中Dof多肽的水平的方法，其包含向所述植物或植物部分中引入包含权利要求2的核苷酸序列的异源多核苷酸，和表达所述异源多核苷酸。

17.权利要求16的方法，其中所述多核苷酸稳定整合到植物或植物部分的基因组中。

18.权利要求16或17的方法，其中所述植物是双子叶植物。

19.权利要求18的方法，其中所述双子叶植物是大豆，芸苔，向日葵，棉花或苜蓿。

20.权利要求16或17的方法，其中所述植物是单子叶植物。

21.权利要求20的方法，其中所述单子叶植物是玉米，小麦，水稻，大麦，高梁或黑麦。

22.权利要求16-21中任一项的方法，其中所述多核苷酸可操作地连接至组织优选的启动子，组成型启动子，或诱导型启动子。

23.权利要求22的方法，其中所述组织优选的启动子是叶优选的启动子，叶肉优选的启动子，维管束鞘优选的启动子，种子优选的启动子，胚乳优选的启动子，或胚优选的启动子。

24.权利要求16-23中任一项的方法，其中增加Dof多肽的水平。

25.权利要求16-23中任一项的方法，其中降低Dof多肽的水平。

26.权利要求16-25中任一项的方法，其中增加植物的产量。

27.权利要求16-25中任一项的方法，其中增加所述植物或植物部分的氮利用效率。

28.权利要求16-25中任一项的方法，其中改进植物的胁迫反应。

29.增加植物的氮利用效率的方法，其包含

a)向所述植物中引入异源多核苷酸；和，

b)在所述植物中从可操作地连接的叶优选的启动子或脉管优选的启动子表达所述多核苷酸；

其中所述异源多核苷酸的表达会调节包含SEQ ID NO：39或97所述氨基酸序列或其生物活性变体或片段的至少一种Dof多肽的水平，其中所述生物活性变体与SEQ ID NO：39或97具有至少80％序列同一性，且所述Dof多肽能调节转录。

30.增加植物产量的方法，其包含

a)向所述植物中引入异源多核苷酸；和，

b)在所述植物中从可操作地连接的叶优选的启动子或脉管优选的启动子表达所述多核苷酸；

其中所述异源多核苷酸的表达会调节包含SEQ ID NO：39或97所述氨基酸序列或其生物活性变体或片段的至少一种Dof多肽的水平，其中所述生物活性变体与SEQ ID NO：39或97具有至少80％序列同一性，且所述Dof多肽能调节转录。

31.改进植物的胁迫反应的方法，其包含

a)向所述植物中引入异源多核苷酸；和，

b)在所述植物中从可操作地连接的叶优选的启动子或脉管优选的启动子表达所述多核苷酸；

其中所述异源多核苷酸的表达会调节包含SEQ ID NO：39或97所述氨基酸序列或其生物活性变体或片段的至少一种Dof多肽的水平，其中所述生物活性变体与SEQ ID NO：39或97具有至少80％序列同一性，且所述Dof多肽能调节转录。

32.权利要求29，30或31的方法，其中所述异源多核苷酸编码Dof多肽。

33.权利要求29，30或31的方法，其中所述异源多核苷酸的表达会降低至少一种Dof多核苷酸的水平。

34.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中所述叶优选的启动子包含维管束鞘优选的启动子或叶肉优选的启动子。

35.分离的表达盒，其包含可操作地连接至异源叶优选的启动子或脉管优选的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：

a)编码包含SEQ ID NO：39或97所述氨基酸序列的Dof多肽的多核苷酸；

b)编码包含与SEQ ID NO：39或97具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的Dof多肽的多核苷酸，其中所述Dof多肽能调节转录；和，

c)当在植物中表达时会降低包含SEQ ID NO：39或97所述氨基酸序列的Dof多肽的表达水平的多核苷酸；和，

d)当在植物中表达时会降低包含与SEQ ID NO：39或97具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的Dof多肽的表达水平的多核苷酸，其中所述Dof多肽能调节转录。

36.包含权利要求35的异源表达盒的植物或植物部分。

37.权利要求36的植物或植物部分，其中所述植物是单子叶植物。

38.权利要求37的植物或植物部分，其中所述单子叶植物是玉米，小麦，水稻，大麦，高梁或黑麦。

39.权利要求36的植物或植物部分，其中所述植物是双子叶植物。

40.权利要求39的植物或植物部分，其中所述双子叶植物是大豆，芸苔，向日葵，棉花或苜蓿。

41.权利要求35-40中任一项的植物或植物部分，其中所述多核苷酸稳定掺入植物基因组中。

42.权利要求35-41中任一项的植物部分，其中所述植物部分是细胞。

43.一种种子，具有稳定掺入其基因组中的权利要求35的表达盒。

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