CN102168103B - 特异性检测转基因油菜rt73的标准分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性检测转基因油菜RT73的标准分子及其应用。构建了适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子，其包含转基因油菜RT73品系外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列，油菜内标准基因HMG和PEP片段，所述的标准分子高度特异于转基因油菜RT73品系的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及特异性检测转基因油菜RT73的标准分子及其应用。
背景技术
转基因作物在解决全世界日益严重的粮食危机的同时，也带来了食品安全和环境安全问题。因此，世界各国政府和相关国际组织非常重视转基因作物及其产品的监督和管理。作为转基因产品监管的重要技术支撑之一，核酸检测技术已成为转基因生物检测的最主要和常用的方法。而不论采用基于核酸或蛋白质的方法，在转基因检测时均必须使用标准物质(Reference materials)作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测[1-2]。
标准物质是具有一种或多种足够稳定、均一和确定的特性值，用于对设备进行校准、对测量方法进行评价或为材料定值的物质和材料[3]。目前实际检测中使用的标准物质多来源于国外研究机构，这些标准物质不仅价格昂贵，购买周期长，而且商业化品种不全，很难满足日常检测需求。标准分子(Referencemolecule)是一种重组质粒分子，其一般包含转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段以及物种特异性片段。由于操作简便、生产成本低、容易获得高纯度和高浓度DNA样品，且在一个标准分子中可容纳多个目标序列等突出优点，近年来，标准分子被认为是解决转基因作物检测标准物质缺乏的有效途径之一，已作为新型DNA标准物质用于转基因作物检测和定量分析[4-5]。但是，目前为止，本领域并没有在很多的转基因植物中普及开发标准分子，且开发出分析结果稳定、良好的标准分子还存在难度。难度之一主要在于构建标准分子的序列的选择，既要保证所选的序列具有代表性、序列片段长度合适，又要保证可准确地用于分析检测。另一方面难度在于合适的载体的选择，如载体的大小会影响标准分子的稳定性。
转基因油菜RT73品系由孟山都公司研发，是全球种植最广泛的转基因油菜品系，占全球油菜种植面积的45％左右[6]。RT73品系已先后在加拿大、日本、美国和澳大利亚批准环境释放，并在中国、欧盟等9个国家和地区批准用于食品或饲料加工原料[7]。中国每年进口几百万吨油菜籽，主要来自加拿大等国，而其中大部分为转基因油菜籽，并以RT73品系为主。
为了给中国转基因油菜RT73品系监管提供必要的技术支撑，有必要开发适于转基因油菜RT73品系特异性检测的、稳定可靠的标准分子。
发明内容
本发明的目的在于提供特异性检测转基因油菜RT73的标准分子、其构建方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种重组质粒，其包含(较佳地为5’→3’)以下序列片段：转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列，油菜内源标准基因HMG序列片段，油菜内源标准基因PEP序列片段。
在另一优选例中，所述的转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列如SEQ ID NO：1所示。
在另一优选例中，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述的油菜内源标准基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在另一优选例中，所述的重组质粒的大小为3000-5000bp。
在另一优选例中，所述的重组质粒的骨架质粒是pEASY-T3载体。
在本发明的另一方面，提供所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系。
在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系的方法，所述方法包括：以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。
在另一优选例中，采用PCR的方法扩增待测油菜及其来源样品中转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列以及油菜内源标准基因HMG序列片段或PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。
在本发明的另一方面，提供一种检测转基因油菜RT73品系的试剂盒，含有所述的重组质粒。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：扩增转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自以下的试剂：PCR扩增试剂(如DNA聚合酶)，电泳相关试剂(如琼脂糖)，DNA分子量标记，使用说明书等。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、标准分子pEASY-RT73结构示意图和插入序列
(A)标准分子pEASY-RT73结构示意图。RT733’，表示RT733’端品系特异性序列；HMG，表示油菜内标准基因HMG片段；PEP，表示油菜内标准基因PEP片段；SpeI和SacI分别表示对应的酶切位点；AmpR，表示氨苄青霉素抗性基因。
(B)标准分子pEASY-RT73中插入序列。RT73，转基因油菜RT73品系3’端旁邻序列(SEQ ID NO：1)；HMG，内标准基因HMG片段(SEQ ID NO：2)；PEP，内标准基因PEP片段(SEQ ID NO：3)。序列两端斜体字母标示标准分子构建中所用引物位置；下划线和双下滑线分别标示标准分子测试中普通PCR和实时荧光PCR检测引物位置；字母加灰部分表示普通PCR和实时荧光PCR检测引物共用序列。
图2、标准分子pEASY-RT73用于普通PCR扩增的特异性和灵敏度。
(A)以标准分子DNA为模板进行的PCR扩增；
(B)分别以对应的转基因油菜品系DNA为模板进行的扩增；泳道1为空白对照；泳道2-12分别为内标准基因HMG(219bp)、PEP(248bp)、油菜RT73(204bp)、MS1(194bp)、MS8(159bp)、RF1(200bp)、RF2(200bp)、RF3(282bp)、Oxy235(331bp)、Topas19/2(110bp)和T45(233bp)品系特异性序列的扩增。
(C)RT73品系特异性片段扩增；
(D)PEP片段扩增；(E)HMG片段扩增。泳道1为空白对照；泳道2-8分别为50000、5000、500、100、50、10和5拷贝标准分子DNA的扩增。箭头示扩增产物大小；M为DL2000分子量标记。
图3、以标准分子为标准品制作的标准曲线。图中标示标准曲线方程和R2值。
(A)转基因油菜RT733’端品系特异性序列；
(B)油菜内源标准基因PEP片段；
(C)油菜内源标准基因HMG片段。
具体实施方式
针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题，本发明人经过深入的研究，构建了适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子(即本发明的重组质粒)，其包含转基因油菜RT73品系3’端旁邻序列，油菜内标准基因HMG和PEP片段。对所述标准分子在定性和定量检测中的适用性进行验证表明，所述的标准分子高度特异于转基因油菜RT73品系。
特异性序列
为了构建特异性好、稳定性高、灵敏度高、适用性广的标准分子，本发明人经过了反复的研究，找到了合适的基因片段。所述的基因片段是转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列。较佳地，还克隆了油菜内源标准基因HMG和PEP片段。三种序列片段共同构建入适当的质粒(载体)中，从而用于转基因油菜RT73品系的特异性鉴定。
如本文所用，所述的“外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列”、“3’端邻接区序列”或“3’端旁邻序列片段”可互换使用。其中“3’端邻接区序列”或“3’端旁邻序列片段”是“外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列”的简称。
作为本发明的优选方式，所述的转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明人经过大量的试验发现，采用如SEQ ID NO：1所示序列的片段作为检测的目的片段，不仅PCR扩增效果良好，而且检测结果最为准确，其全面地涵盖了转基因油菜RT73品系检测所需的特异性检测区域，适用性广。
作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明的优选方式，所述的油菜内源标准基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
重组质粒
上述的三种序列片段插入到适当的质粒(载体)中，构成重组质粒(重组载体)，作为本发明的标准分子。
所述的重组质粒的骨架质粒可以有多种的选择，可以是一些商业化的质粒。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒的大小约为2000-5000bp；较佳地约为2000-4000bp；较佳地约为2500-4000bp；较佳地约为2500-3500bp。上述的骨架质粒在构建成本发明的重组质粒后，重组质粒的大小范围约在3000-6000bp；较佳地约为3000-5000bp；较佳地约为3500-4500bp。本发明人在研究中发现，适当大小的重组质粒，稳定性好，PCR扩增效果良好，有利于获得准确、稳定的检测结果。
一些具体的骨架质粒例如但不限于pEASY系列的载体、T系列载体、pUC系列载体、pBR系列载体等。作为本发明的优选方式，所述的骨架质粒是pEASY系列的载体(如pEASY-T3载体)。
以上的三种序列片段较佳地插入到质粒的多克隆位点中，形成串联的形式。三种序列片段在载体上的前后次序可以是变化的。只要它们能够被引物识别和扩增。作为本发明的优选方式，三种序列片段在载体上的次序，从5’→3’端，为转基因油菜RT73品系3’端旁邻序列，油菜内源标准基因HMG和PEP片段。
检测方法
本发明还提供了一种检测转基因油菜RT73品系的方法，所述方法包括：以所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。
在获得了本发明提供的标准分子后，本领域技术人员均了解如何进行待测油菜样品进行检测。以本发明的重组质粒作为标准分子，通常采用聚合酶链反应(PCR)的方法来进行品系的鉴定，也可采用基于核酸的其它检测方法，如芯片检测。
一种检测转基因油菜RT73品系的方法是：采用PCR的方法扩增待测油菜或其来源样品中转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列以及转基因油菜RT73品系的HMG序列片段或PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜或其来源样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。利用本发明的标准分子，可以构建出标准曲线，分别计算三种片段量(拷贝数)。使用标准分子DNA和转基因油菜基因组DNA进行PCR扩增时，两者之间的反应效率可能存在差异，因此可以通过测定校正系数(Conversion factor，Cf)进行校准。聚合酶链反应(PCR)是本领域技术人员公知的技术。
在本发明的实施例中，制备了标准分子pEASY-RT73，其高度特异于转基因油菜RT73品系。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中，三个目标片段的检测下限(LOD)均为10拷贝。实时荧光PCR检测的LOD均为25拷贝，定量下限(LOQ)均为50拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率介于0.96～1.02间，相关系数均大于0.999。分别以PEP和HMG为内标准基因对5个盲样的测试结果显示测量值与设定值间偏差(Bias)介于-14.13％～14.29％间，SD小于0.20，RSD小于18.0％。
因此，本发明的标准分子可很好的替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜RT73及其来源产品品系特异性检测。
试剂盒
一种检测转基因油菜RT73品系的试剂盒，含有所述的重组质粒(通常包含在容器中)。
所述的试剂盒还可含有：扩增转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列、转基因油菜RT73品系的HMG序列片段和/或转基因油菜RT73品系的PEP序列片段的特异性引物。以便于进行PCR扩增、检测。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、电泳等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、DNA聚合酶、扩增液、杂交液、限制性酶、对照液、洗液、电泳相关试剂(如琼脂糖)、DNA分子量标记等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料与方法
实验材料
转基因油菜RT73[10]、MS1×RF1[11]、MS1×RF2[12]、MS8×RF3[13]、T45[15]、Oxy235[14]和Topas 19/2[16]品系均为商品化的品系，且有文献公开。非转基因油菜籽样品为我国广泛推广的常规品种“秦优7号”。
油菜籽DNA提取和制备
用冷冻研磨机(美国SPEX公司FREEZER MILL 6850型)各各品系油菜籽样品分别研磨成均匀的粉末。使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat：#DP305-02)并按其操作步骤提取样品基因组DNA。用核酸蛋白含量测定仪(德国Eppendorf公司)测定浓度后，置-20℃保存。
标准分子(质粒)构建
根据转基因油菜RT733’端品系特异性序列和油菜内源标准基因HMG、PEP片段设计标准分子构建用引物(表1)，这些引物的扩增区域涵盖了转基因油菜RT73品系检测所涉及的较为全面的检测区域。
以转基因油菜RT73品系的基因组DNA为模板，以L2-RT73-3-F和L2-RT73-3-R为引物，扩增获得转基因油菜RT73品系3’端邻接区序列(316bp)。
以转基因油菜RT73品系的基因组DNA为模板，以HMG-F和HMG-R为引物，扩增获得转基因油菜RT73品系HMG片段(311bp)。
以转基因油菜RT73品系的基因组DNA为模板，以PEP-F和PEP-R为引物，扩增获得转基因油菜RT73品系PEP(307bp)片段。
采用pEASY-T3(购自北京全式金生物技术有限公司)为基础载体，将转基因油菜RT73品系外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列(316bp)采用T-A克隆方式连接到载体中，得到pEASY-RT73-1。进一步将PEP(307bp)和HMG片段(311bp)通过重叠PCR技术整合为一个重组片段，并通过SpeI和SacI酶切位点克隆到pEASY-RT73-1中，得到标准分子pEASY-RT73。标准分子分别送英潍捷基(上海)贸易有限公司和鼎安生物技术(上海)有限公司进行质粒全基因测序。
表1、标准分子构建中设计的引物
标准分子质粒DNA提取和制备
培养4mL已达对数生长期的pEASY-RT73大肠杆菌菌液，采用Axygen质粒DNA小量提取试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司，Cat：#AP-MN-P-50)并按其操作步骤提取和纯化质粒DNA。用核酸蛋白含量测定仪(德国Eppendorf公司)测定浓度后，置-20℃保存。
标准分子适用性鉴定
(a)标准分子用于普通PCR检测的适用性鉴定
标准分子pEASY-RT73中仅包含转基因油菜RT733’端品系特异性序列，油菜内源标准基因HMG和PEP片段，因此标准分子应特异于上述三个片段的检测。利用我国现行标准中油菜内标准基因HMG[8]和PEP[9]检测引物，转基因油菜RT73[10]、MS1[11]、RF1[11]、RF2[12]、MS8[13]、RF3[13]、Oxy235[14]、T45[15]和Topas19/2[16]品系特异性检测引物分别扩增标准分子DNA以检测标准分子的特异性。
为了鉴定pEASY-RT73用于普通PCR检测的灵敏度，本发明采用两种PCR体系和三种不同型号PCR仪进行扩增，并进行了三位研究人员参与的实验室内部验证。试剂包括TakaRa Premix Ex Taq(大连宝生物公司，Cat.D332)和BocaiTaq(上海申能博彩生物技术有限公司，Cat.B31)；使用仪器包括MastercyclerGradient PCR仪(德国Eppendorf公司)，AB Thermal Cycler PCR仪(美国应用生物系统公司)和PTC-225PCR仪(美国MJ Reserarsh公司)。
将标准分子DNA稀释至104、103、102、20、10、2和1拷贝/μL，使用普通PCR检测引物(表2)分别扩增RT733’端品系特异性序列(204bp)，HMG片段(219bp)和PEP片段(248bp)，确定以标准分子为标准品在普通PCR检测中的LOD值。
采用25μL体系进行PCR反应，包括1×Premix Ex Taq(TakaRa Premix ExTaq体系)或1×PCR缓冲液，0.40mM dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶(Bocai Taq体系)；0.20μM上下游引物，以及5μL DNA模板。反应条件为95℃10min；95℃30s，60℃/55℃40s(RT73，HMG片段60℃；PEP片段55℃)，72℃40s，40个循环；72℃延伸5min。所有反应重复3次，PCR产物利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(b)标准分子用于实时荧光PCR检测的适用性鉴定
将标准分子DNA稀释至106、105、104、103、102和10拷贝/μL。对三个目标片段(RT733’端旁邻序列、HMG、PEP)分别进行实时荧光PCR扩增，每次设3个平行重复，实验重复3次，计算R2和反应效率(E)，制作标准曲线。
反应效率E计算公式：E＝10-1/K-1(K为标准曲线斜率)。
以10、5和2拷贝/μL标准分子DNA为模板，扩增25次反应检测标准分子用于实时荧光PCR检测的LOD和LOQ。
采用Hot Start qPCR Master Mix I试剂盒(上海睿诚生物科技有限公司)和AB PRISM(R)7300定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行实时荧光PCR检测，引物和探针序列见表2。采用25μL体系，包括1×Hot Start qPCR MasterMix I；0.40μM引物和0.32μM探针(RT73、PEP片段)或0.40μM引物和0.20μM探针(HMG片段)；5μL DNA模板。扩增条件为95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，45个循环。
(c)以标准分子为标准品对实际样品的检测
使用标准分子DNA和转基因油菜基因组DNA进行PCR扩增时，两者之间的反应效率可能存在差异，因此需要测定校正系数(Cf)进行校准。采用400、200、100、50和25ng纯合转基因油菜RT73品系基因组DNA测定Cf值。设置3次平行重复，实验重复3次。通过标准分子构建的标准曲线分别计算三个片段拷贝数。
Cf＝RT73品系特异性序列拷贝数/HMG或PEP片段拷贝数。
将研磨好的纯合RT73油菜籽和非转基因油菜籽干粉按照质量百分比进行混合，配制四个含有不同转基因油菜RT73百分比含量样品，包括10％、5％、1％和0.5％(w/w)。对各样品进行实时荧光PCR扩增，获得样品内源标准基因和RT73品系特异性序列的Ct值，根据标准曲线方程计算拷贝数，并根据以下公式计算各样品转基因油菜RT73成分百分比，通过Bias，SD和RSD值分析测定百分比结果的准确度和精确度。
转基因成分含量(％)＝RT73品系特异性序列拷贝数/(HMG或PEP片段拷贝数*Cf)。
表2普通PCR和实时荧光PCR检测引物及探针
实时荧光PCR
II.实施例
实施例1、标准分子构建
为了构建适于转基因油菜RT73品系特异性检测标准分子，将RT733’端旁邻序列(316bp)，油菜内源标准基因PEP(307bp)和HMG(311bp)三个片段克隆至pEASY-T3载体中，得到pEASY-RT73(图1)，作为标准分子，该标准分子的大小为3935bp。3次质粒全基因测序结果与目标序列一致，表明质粒pEASY-RT73构建成功。
实施例2、标准分子用于普通PCR检测的适用性鉴定
(a)特异性测试
采用九种转基因油菜品系特异性检测引物对标准分子的特异性进行测试，结果如图2所示。以标准分子DNA为模板的扩增中，仅可在RT733’端品系特异性序列和内源标准基因PEP、HMG扩增中得到明显目的条带(图2A)。
以转基因油菜T45、Oxy235、MS8、MS1、RF1、RF2、RF3和Topas19/2品系特异性检测引物进行扩增时无明显可见条带产生，而各检测体系对应的阳性对照均有目的条带产生(图2B)。
因此，标准分子pEASY-RT73高度特异于转基因油菜RT73品系检测。
(b)检测灵敏度测试
采用两种PCR体系和三种不同型号PCR仪进行普通PCR扩增，并进行了三位研究人员参与的实验室内部验证。结果表明，无论采用哪种PCR体系和PCR扩增仪，可扩增三个目标片段的最低标准分子DNA为10拷贝(2拷贝/μL，5μL模板)。三位研究人员检测结果一致。10拷贝标准分子DNA相当于100ng油菜基因组DNA中含有约0.01％RT73成分。由于篇幅有限，仅列出Takara公司PCR试剂在Eppendorf仪器上的扩增电泳图(图2C-E)。
实施例3、标准分子用于实时荧光PCR检测的适用性鉴定
(a)标准曲线的制作
以梯度稀释的标准分子DNA为模板，对三个目标片段(RT733’端旁邻序列、HMG、PEP)进行实时荧光PCR扩增，制作标准曲线。如图3所示，三个目的片段的标准曲线斜率分别为-3.27，-3.38和-3.43，反应效率分别为1.02、0.98和0.96，R2均大于0.999。
因此，标准曲线适于对样品进行进一步定量分析。
(b)检测限(LOD)和定量限(LOQ)测试
以50拷贝DNA为模板的25次扩增中，RT73品系特异性序列、PEP和HMG三个目标片段均有25次得到扩增曲线，RSD值分别为2.04％、3.06％和1.70％；以25拷贝DNA为模板，三个目的片段均有24次(96％)得到扩增曲线；以10拷贝DNA为模板，三个目的片段分别有23(92％)、22(88％)和21(84％)次得到扩增曲线。因此，针对三个目标片段的LOD均为25拷贝标准分子DNA(检出率≥95％)。而为了得到稳定的定量结果(检出率为100％，RSD≤25％)，三个检测体系均需要至少50拷贝标准分子DNA，因此LOQ为50拷贝标准分子DNA。
(c)Cf值测定
采用五个浓度纯合转基因油菜RT73品系DNA测定Cf值。标准分子pEASY-RT73中包含两个油菜内标准基因(PEP和HMG)，因此对两套体系均进行了Cf值测定。结果如表3所示，以PEP和HMG为内源标准基因的平均Cf值分别为1.24和1.03，SD值分别为0.09和0.06，RSD值分别为7.25％和6.08％，所有偏差值均在可接受范围内[20]。
表3采用纯合转基因油菜RT73品系基因组DNA测试Cf值结果
实施例4、以标准分子为标准品的盲样测试
为了鉴定以标准分子为标准品建立的定量检测体系的准确性和精确性，采用0％，0.5％，1％，5％和10％含量转基因油菜样品进行测试。准确性采用Bias衡量，精确性采用SD和RSD衡量。结果如表4所示，以PEP为内源标准基因时，测出五个样品的转基因成分含量分别为0％，0.43％，1.07％，4.32％和9.97％，Bias介于-14.13％～7.06％，SD值小于0.15，RSD值小于11.0％。以HMG为内源标准基因时，五个样品的转基因成分含量分别为0％，0.56％，1.14％，5.30％和10.53％，Bias在5.28％～14.29％间，SD值小于0.20，RSD值小于18.0％，所有偏差值均在可接受范围内。因此，本发明构建的标准分子pEASY-RT73适于用作转基因油菜RT73品系的定量检测。
表4分别以PEP和HMG为内源标准基因的盲样测试结果
结论与讨论
目前，转基因作物及其产品检测所需的标准物质主要来源于植物原材料。但是其来源十分有限，生产标准物质的过程复杂且成本较高，制备和贮存条件苛刻，而且已商品化标准物质涵盖的作物品系只有不足30种，给转基因产品检测带来很大困难，同时也制约了转基因作物检测技术的发展。
基于此，本研究构建了适于全世界种植量最大的转基因油菜品系RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73，其包含一段转基因油菜RT733’端品系特异性序列及油菜内源标准基因PEP和HMG各一段序列，各段序列均涵盖了我国现行的国家标准和行业标准以及国际公开刊物发表的检测区域范围。经验证，标准分子pEASY-RT73高度特异于转基因油菜RT73品系检测。以标准分子为标准品的普通PCR扩增中，三个目标片段的检测下限均为10拷贝标准分子DNA，相当于含有约0.01％转基因油菜RT73成分(100ng基因组DNA)。对三个目标序列进行实时荧光PCR检测的LOD均为25拷贝，LOQ均为50拷贝。以标准分子为标准品构建的标准曲线反应效率在0.96～1.02之间，R2均大于0.999。分别以PEP和HMG为内标准基因对5个盲样检测结果显示Bias介于-14.13％～14.29％间，SD值小于0.20，RSD值小于18.0％。因此，标准分子pEASY-RT73可很好的替代植物来源的阳性标准品用于转基因油菜RT73及其来源产品品系特异性定性和定量检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (7)
1.一种重组质粒，其特征在于，其包含以下序列片段：转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列，油菜内源标准基因HMG序列片段，油菜内源标准基因PEP序列片段；
所述的转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的油菜内源标准基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的油菜内源标准基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的大小为3000-5000bp。
3.权利要求1-2任一所述的重组质粒的用途，用于作为标准分子，检测转基因油菜RT73品系。
4.一种检测转基因油菜RT73品系的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1所述的重组质粒为标准分子，测定待测油菜样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用PCR的方法扩增待测油菜及其来源样品中转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列以及油菜内源标准基因HMG序列片段或PEP序列片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的重组质粒的扩增结果进行比较，从而获得待测油菜及其来源样品中转基因油菜RT73品系的存在与否以及存在量。
6.一种检测转基因油菜RT73品系的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的重组质粒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有：扩增转基因油菜RT73品系的外源插入片段与油菜基因组DNA的3’端邻接区序列、油菜内源标准基因HMG序列片段和/或油菜内源标准基因PEP序列片段的引物。
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