CN102165067A

CN102165067A - 用于控制双子叶植物花发育的两个遗传元件的组合及在检测和选择方法中的应用

Info

Publication number: CN102165067A
Application number: CN2009801376989A
Authority: CN
Inventors: A·本达马内; A·布阿莱姆; C·特罗阿代克; M·安托万; C·多吉蒙特
Original assignee: National Institute Of Agronomique
Current assignee: National Institute Of Agronomique
Priority date: 2008-07-28
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2011-08-24
Also published as: WO2010012948A2; FR2934277A1; US20110314569A1; WO2010012948A3; IL210908A0; FR2934277B1; PT2318536T; ES2798147T3; EP2318536A2; BRPI0916338A2; EP2318536B1; IL210908A

Abstract

本发明的主题是用于控制双子叶植物花发育的两个遗传元件的组合，该组合分别包括：以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)，和以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，其理解为，至少将该第二遗传控制元件人为引入所述双子叶植物中。以上组合使得可能控制和/或改变双子叶植物的花的性别。

Description

用于控制双子叶植物花发育的两个遗传元件的组合及在检测和选择方法中的应用

技术领域

本发明涉及植物变种的选择，尤其是植物性型的选择领域。本发明涉及通过基因A和基因G的多态性分析进行的植物性别的基因型检测，以及所述检测的应用手段和获得性表型改变的植物的方法。

背景技术

杂种植物的产生在农学和农业中具有重要意义。实际上，由于杂种优势(heterosis，也称为杂种优势(hybrid vigour))现象，相对于其两个亲本的平均值，杂种植物显示许多性状的优越性。此优越性可以表现为，例如杂种相对于其亲本的更好的活力、更好的产率、对栽培杂种的培养基更高的适应性和更大的均一性。当亲本在遗传上距离更远时，此杂种优势甚至更大。

建立纯而稳定的品系(未来的杂种亲本)是建立表现最大杂种优势的纯系和可育杂种变种必不可少的步骤。因此，有必要建立纯而稳定的品系，然后杂交这些品系来获得杂种。

纯系的建立涉及植物的自花受精，以获得具有同一生殖质，对所有需要的生产力、产量的规律性或对疾病的抗性性状固定的植物。

因此有必要使用其性型允许自花受精的植物，例如雌雄同株同花植物来建立纯系。

现在，许多双子叶植物，尤其是葫芦科(Cucurbitaceae)可以是雌雄同株异花(monoecious)、雄花两性花同株(andromonoecious)、全雌花性(gynoecious)或雌雄同株同花(hermaphroditic)。

用来获得纯系的第一种技术包括植物的化学处理，以获得可以自花受精的植物，例如雌雄同株同花植物。

例如在甜瓜(Cucumis melo)中，喷洒乙烯合成的抑制剂，如硝酸银或硫代硫酸银导致雄蕊暂时出现在雌性花中(Rudich等，1969；Risser等，1979)。以这种方式，用全雌花性植物转化为雌雄同株同花植物来保持纯系。

但是，通过此方法产生纯系受化学品成本、其作用持续时间及其植物毒性作用限制。此外，就从具有长开花期的植物产生杂种而言，这类物质可以无效，因为处理后出现的新花可不受该化学处理影响。

因此，存在对使得可能控制双子叶植物花型发育和获得确定花型的植物的系统的需要。

此外，有必要进行大量杂交，以从纯系获得目的杂种，并在每一杂交时保留具有最有前景的表型的幼苗。

当将纯系彼此杂交时，能够选择进行杂交的方向并避免植物的自花传粉很重要，自花传粉可导致不具有所需的杂种优势的植物。

同样，由于双子叶植物性型的多样性，有必要分离同一幼苗的雄性花和雌性花以防止自花传粉。

第一种技术(尤其用于玉米)包括使用机械手段来去雄植物。但是，此技术证明是极其昂贵的，因为对于所进行的每一杂交，该技术需要去雄待防止其自花传粉的每株植物。

另一技术包括进行植物的化学去雄，阻断有活力的花粉的形成。因此，在甜瓜中，用乙烯利(乙烯前体)处理雌雄同株异花植物导致雄性花的暂时不出现。

如上文所述，用来产生短暂雄性不育的称为去雄剂的化学品有几个缺点，如高成本或相当大的毒性。

因此，上文所述的用于控制花型的机械或化学技术证明非常昂贵，尤其是因为有必要进行大量杂交来获得具有所需性状和可以推向市场的杂种植物。

因此，为了便于建立纯系和杂种，还存在对使得可能控制双子叶植物花型发育和获得确定花型的植物的系统的需要。

获得可以用于建立纯系的能够自花传粉的植物或不能自花传粉的植物来建立杂种的另一方式可以分别包括选择一个物种中存在的完全雌雄同株同花的个体，或完全雌性的个体。但是，这种技术也证明极其昂贵，因为其需要栽培大量植物，直到可能确定它们的性型。此外，此技术是随机的，因为花的性决定机制尤其依赖于环境因素。

根据另一途径，已存在鉴定和表征甜瓜中涉及控制花型的遗传决定子的尝试。在甜瓜中，性决定的遗传控制由两个主要的遗传决定子控制，分别是(1)雄花两性花同株遗传决定子(“a”)和(2)全雌花性遗传决定子(“g”)，每个决定子具有至少两个等位基因，其组合产生多种性表型。No.WO2007/125264下公开的PCT国际申请描述了遗传决定子(a)的鉴定和表征，发现其由编码氨基环丙烷羧酸合酶(ACS)的基因组成。因此，PCT申请No.WO 2007/125264提供了使得可能选择或产生具有显性等位基因(A)或隐性等位基因(a)的双子叶植物的检测和控制手段。遗传决定子(g)仍然完全未知。目前，初步的数据表明，具有未知性质和结构的遗传决定子(g)可位于由命名为M8和M30的标记定界的超过2.4兆碱基对的宽基因组区内。因为通常假设100千碱基对的植物基因组中平均存在12个可读框(“ORF”)，所以定界在标记M8和M30之间的基因组区域可能包含约300个可读框。

但是，在缺乏对第二全雌花性遗传决定子(或“g”)的表征的情况下，不可能使公众能够得到选择或控制花型发育的手段，以使得可能例如区分或产生严格雌性的植物群体，因为此表型完全由遗传决定子(g)控制。此外，只有在鉴定和表征遗传决定子(g)之后，才可能选择或获得完全雌雄同株同花的植物群体。

因此，存在对使得可能在不必栽培它们的情况下选择例如雌雄同株同花或雌性双子叶植物的方法的需要。

此方法应使得可能选择尤其是可以用来产生上文所述的纯系或杂种的植物。

发明概述

根据本发明，已鉴定和表征了全雌花性遗传决定子来控制双子叶植物花的发育，该双子叶植物是被子植物，且更确切而言是葫芦科的植物。

全雌花性遗传决定子(g)的鉴定和表征首次使得可能发展雄花两性花同株(a)和全雌花性(g)两个遗传决定子的组合，其允许完全控制双子叶植物的花型发育，无论所考虑的是哪种性表型。

因此，本发明提供两个遗传元件(A/a)和(G/g)的组合，其使得可能控制双子叶植物，尤其是葫芦科成员如甜瓜的花型发育。

现有技术中已显示，在生理学上，两个等位基因(A)和(a)彼此的不同在于蛋白质氨基丙烷羧酸合酶(也称为ACS)的不同的酶活性水平。

本发明人现已显示，在生理学上，本发明鉴定和表征的等位基因(G)和(g)彼此的不同在于新蛋白质，蛋白质CmWIP1的不同水平。

因此，本发明涉及用于控制双子叶植物花型发育的两个遗传元件的组合，所述组合分别包括：

a)以显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)的形式存在于所述双子叶植物中的第一遗传控制元件(A/a)，其中：

-显性等位基因(A)由允许蛋白质ACS(氨基丙烷羧酸合酶)表达的核酸(NA)组成，

-隐性等位基因(a)与显性等位基因的不同在于在所述双子叶植物中无功能的核酸(NA)，和

b)以显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)的形式存在于所述双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)，其中：

-显性等位基因(G)由允许蛋白质CmWIP1表达的核酸(NG)组成，

-隐性等位基因(g)与显性等位基因的不同在于在所述双子叶植物中无功能的核酸(NG)，

其理解为，至少将该第二遗传控制元件人为引入所述双子叶植物中。

在本发明的组合的某些实施方案中，对于第二遗传控制元件(G/g)，显性等位基因(G)和隐性等位基因(g)各自的特征如下：

-显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PG)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PG)调节的核酸，所述核酸编码蛋白质CmWIP1，

-隐性等位基因(g)与显性等位基因(G)的不同在于：

(i)核酸(NG)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pg)，或

(iii)对活性蛋白质CmWIP1的表达无功能的核酸(Ng)。

蛋白质ACS包括序列SEQ ID No.3的蛋白质或与序列SEQ ID No.3的蛋白质具有至少90％氨基酸同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的蛋白质。

蛋白质CmWIP1包括序列SEQ ID No.12的蛋白质或与序列SEQ IDNo.12的蛋白质具有至少90％氨基酸同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的蛋白质。蛋白质CmWIP1还包括序列SEQ ID No.16的蛋白质或与序列SEQ ID No.16的蛋白质具有至少90％氨基酸同一性，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的蛋白质。

在本发明的组合的某些实施方案中，对于第二遗传控制元件(A/a)，显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)各自的特征如下：

-显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PA)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码蛋白质ACS(氨基丙烷羧酸合酶)，

-隐性等位基因(a)与显性等位基因(A)的不同在于：

(i)核酸(NA)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pa)，或

(iii)对活性蛋白质ACS的表达无功能的核酸(Na)。

本发明还涉及这样的调节性多核苷酸(PG)和(Pg)。

本发明还涉及用于获得性表型已改变的转化的植物，以及这种植物的部分，尤其是其种子的方法。

本发明还涉及下文更详细定义的蛋白质CmWIP1或此蛋白质的片段，以及针对蛋白质CmWIP1的抗体。

本发明还涉及用于检测等位基因(A)、(a)、(G)和(g)在样品中的存在的方法。

附图描述

图1显示基因座g的定位克隆。

图1A显示染色体4上的基因座g的物理和遗传图谱。该基因座以两个标记M261和M335为界。虚线显示这些遗传标记在多个克隆BAC中的位置。

图1B以它们的方向预测显示见于BAC 102中的8个可读框或ORF(宽箭头)的示意图。三角形标记代表称为Gyno-hAT的DNA转座子的插入，其序列描述于SEQ ID No.14中。正是此转座子的插入诱导了CmWIP1基因启动子的甲基化并导致其失活。

图1C是基因座g附近两个关键重组事件的高分辨率作图。显示了多态性SNP，重组体P63.2和87.94确定了1.4kb的最终区域。

图2显示在插入基因座g的转座子DNA上进行的对内切核酸酶McrBr敏感的半定量PCR扩增的结果。

正义引物位于转座子序列中，而反义引物位于邻接转座子的基因组序列上。在不用内切核酸酶消化基因组DNA Gynadou的情况下，通过PCR扩增导致强扩增，表明转座子在此基因座上的存在。用内切核酸酶McrBC预消化后通过PCR扩增未显示任何扩增，这表明转座子的非常高的甲基化水平。无论提供什么支持均未针对PI124112获得扩增，因为转座子未插入基因座G。

图3显示基因座g上的甲基化分析。

图3A显示针对雌雄同株异花基因型(G-)PI124112和全雌花性基因型Gynadou(gg)，通过McrBR敏感的半定量PCR在最靠近基因座g的三个可读框或ORF上进行的扩增。扩增随着用McrBC预消化而缺乏表明DNA甲基化的存在。消化寡核苷酸以产生邻接针对各ORF预测的转录起始位点的扩增子(包含一部分启动子和一部分第一外显子)。

图3B显示DNA的甲基化和CmWIP1基因的结构。黑箭头表示通过“5′RACE”技术确定的转录起始位点，黑框表示两个外显子，第二外显子后的符号表示通过“3′RACE”技术确定的“3′UTR”序列末端。

用符号在基因的3′端区域上表示转座子的插入。通过用McrBC敏感的定量PCR扩增来测定CmWIP1完整序列中的DNA甲基化。每个值对应于来自至少3株植物，每个PCR反应进行三次的平均值。

图3C显示通过用亚硫酸氢盐测序进行的胞嘧啶甲基化分析。用亚硫酸氢盐处理后，扩增对应于启动子的高度甲基化部分的两个扩增子。通过直条显示甲基化胞嘧啶的百分比。

图4显示甜瓜(C.melo)不同基因库的基因座g上的甲基化分析。W1998、Bulgaria 14、Paul和Gynadou是等位基因g纯合的。PI161375、Vedrantais和PI124112是等位基因G纯合的。

图4A显示通过PCR扩增来在多个基因库中筛查转座子在基因座g上的插入的实验。为了验证插入的存在(上行)，正义引物位于转座子序列中，反义引物位于邻接该转座子的基因组序列中，其中用邻接插入位点的两条引物来验证转座子的缺乏(下行)。

图4A显示多个基因库中在CmWIP1基因上进行的McrBr敏感的半定量PCR扩增的结果。用McrBr消化后扩增的缺乏表明DNA甲基化的存在。

图5显示CmWIP1的信使RNA的表达谱分析。

通过定量PCR分析了CmWIP1的表达水平。每个值对应于来自至少三株植物的平均值。用遍在基因肌动蛋白基因的表达水平归一化CmWIP1的表达水平。

图6显示通过定量PCR在一组直至阶段6的花芽中分析的CmWIP1表达水平的分析结果。每个值对应于来自至少三株植物的平均值。用遍在基因肌动蛋白基因的表达水平归一化CmWIP1的表达水平。

图7显示通过TILLING技术鉴定的花表型的观察结果。与突变体P193L一样，将突变体S306F主茎的花与雌雄同株异花亲本的野生型雄性花和雌性花相比较。与突变体P193L一样，突变体S306F的花清楚地在第四螺旋(spiral)中显示子房的发育。突变体L77F是弱突变体。

Ov：子房；St：雄蕊。

图8A显示获自具有表型(A)的植物[上行]和具有表型(a)的植物[下行]的ACS基因信使RNA片段的比对，并显示区分(A)和(a)的核苷酸点突变。

图8B显示由图8A中的核酸编码的氨基酸序列的比对，包括具有表型(A)的植物[上行]和具有表型(a)的植物[第二行]，并显示区分(A)和(a)的氨基酸点突变。

图9显示具有甜瓜等位基因A或a的拟南芥(Arabidopsis thaliana)转基因植物的显微照片。图9A和9B显示，用等位基因A转化的植物的长角果(图9A-Cm-A和图9B)比野生植物(Col-0)和用等位基因(a)转化的植物的长角果短。

发明详述

根据本发明，已鉴定和表征了与之前在现有技术中描述的遗传决定子(A/a)相组合，在葫芦科中控制花型发育的遗传决定子(G/g)。

遗传决定子(G/g)的鉴定和表征首次向本领域技术人员提供了选择或产生具有所希望的性表型的双子叶植物，尤其是具有所希望的性表型的葫芦科植物如甜瓜的可能性。

如下文表1中所示，可回顾等位基因(A)控制植物的雄花两性花同株性状，而等位基因(G)控制植物的全雌花性性状。

表1

表型	基因型	花型
			雌雄同株异花	A-G-	雄性和雌性
雄花两性花同株	aaG-	雄性和两性
			雌雄同株同花	aagg	两性
全雌花性	A-gg	雌性

表1显示双子叶植物的基因型和花的性表型之间的对应关系。

本发明人现已显示，在生理学上，本发明已鉴定和表征的两个等位基因(G)和(g)的不同在于新蛋白质，蛋白质CmWIP1的不同水平。

通过与已知蛋白质的序列比较，本发明人显示，可将新蛋白质CmWIP1分类在WIP型锌指蛋白质家族中，该家族存在于包括双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和藓类植物的多种植物中。

从遗传的观点看，本发明人显示，等位基因(g)与等位基因(G)的不同在于与具有等位基因(G)的植物相比，植物中低水平的蛋白质CmWIP1，或者相对于具有等位基因(G)的植物所产生的蛋白质CmWIP1，产生突变的蛋白质CmWIP1。

本发明人还显示，等位基因(G)对等位基因(g)是显性的。

如已经指出的那样，现有技术中已显示，在生理学上，两个等位基因(A)和(a)的不同在于蛋白质氨基丙烷羧酸合酶(也称为ACS)酶活性的不同水平，该蛋白质是涉及乙烯合成的蛋白质。

现在，多项研究已显示，葫芦科的花生物学基因编码涉及乙烯生物合成或调节途径的蛋白质(Kamachi等，1997；Kahana等，2000)。

之前还已显示，等位基因(a)在生理上与等位基因(A)的不同在于与具有等位基因(A)的植物相比，植物中低水平的蛋白质ACS酶活性。

还已显示，等位基因(A)在心皮的promordia中表达，正是此表达阻断了雄蕊的发育。等位基因A的表达缺乏，或获自例如TILLING筛选的突变形式的蛋白质或获自具有突变A57V的等位基因“a”的蛋白质的表达不阻断雄蕊的发育。最后，还已显示等位基因(A)对等位基因(a)是显性的。

不希望受任意理论的限制，本发明人认为，可以将通过基因(G/g)和(A/a)的等位基因组合控制花型发育的系统推广至双子叶植物纲(Dicotyledoneae)，包括葫芦科。

-显性等位基因(A)由允许蛋白质ACS(氨基丙烷羧酸合酶)，优选序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS表达的核酸(NA)组成，

-显性等位基因(G)由允许蛋白质CmWIP1，优选序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1表达的核酸(NG)组成，

-隐性等位基因(g)与显性等位基因的不同在于在所述双子叶植物中无功能的核酸(NG)，和

其理解为，至少将第二遗传控制元件人为引入所述双子叶植物中。

表征等位基因(a)的非功能性核酸(NA)包含编码以下的核酸：(i)与SEQ ID No.3的蛋白质不同的蛋白质，包括突变的蛋白质A57V；或(ii)相对于SEQ ID No.3的蛋白质突变并导致失活的酶的其他任意形式的蛋白质；或(iii)其他非功能性ACS；或(iv)不表达的等位基因。

上文所述的两个遗传元件的组合使得可能控制和/或改变双子叶植物花的性别，并因此而相对于现有技术中使用的机械控制系统(其通常昂贵)或化学药品(其通常有毒)非常有利。

在本发明的意义内，“等位基因”指在一对同源染色体上占据一个位点或基因座的基因形式之一。基因的等位基因涉及同一遗传性状，但可以决定不同的表型。

显性等位基因是其表型表达水平比同源等位基因(称为隐性)的表型表达水平高的等位基因。显性可以是完全显性或部分显性。

隐性等位基因是只有在植物从其两个亲本中的每一个获得相同的等位基因时才在表型中表达的等位基因。相反，若存在显性同源等位基因，则隐性等位基因的表达被掩蔽。

因此，上文定义的组合以各对应于一种表型的不同状态的形式存在。

当第一遗传控制元件(A/a)以等位基因(A)的形式存在于双子叶植物中时，该植物具有雌雄同株异花或全雌花性表型。

当第一遗传控制元件(A/a)以等位基因(aa)的形式存在于植物中时，该植物具有雌雄同株同花或雄花两性花同株表型。

当存在于双子叶植物中的第二遗传控制元件(G/g)是等位基因(G)的形式时，该植物具有雌雄同株异花或雄花两性花同株表型。

当第二遗传控制元件(G/g)以等位基因(gg)的形式存在于植物中时，该植物具有雌雄同株同花或全雌花性表型。

表1中总结了等位基因和表型之间的对应关系。

-显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PG)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PG)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1(“甜瓜锌指蛋白质”)，

-隐性等位基因(g)与显性等位基因(G)的不同在于：

(i)核酸(NG)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pg)，或

(iii)对活性蛋白质CmWIP1的表达无功能的核酸(Ng)。

在本发明的组合的某些实施方案中，对于第一遗传控制元件(A/a)，显性等位基因(A)和隐性等位基因(a)各自的特征如下：

-显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PA)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS(氨基丙烷羧酸合酶)，

-隐性等位基因(a)与显性等位基因(A)的不同在于：

(i)核酸(NA)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pa)，或

(iii)对活性蛋白质ACS的表达无功能的核酸(Na)。

本说明书的其余部分提出了构成本发明的控制系统的部分的第一和第二遗传控制元件的变体或优选实施方案。

本发明的两个遗传控制元件的组合中的显性等位基因(G)的形式的遗传控制元件G/g

一般而言，相对于等位基因(G)不存在于所述植物中时观察到的水平，以显性等位基因(G)的形式存在于植物中的遗传控制元件G/g使得可能获得更高水平的蛋白质CmWIP1。

在本说明书的其余部分中，认为“高水平”的蛋白质CmWIP1对应于在其基因组中包含显性等位基因(G)的植物中测量的蛋白质CmWIP1的平均水平，而“低水平”的蛋白质CmWIP1对应于在其基因组中不包含显性等位基因(G)的植物中观察到的蛋白质CmWIP1的平均水平。

显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PG)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PG)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1。

-功能性调节性多核苷酸(PG)

本发明的功能性调节性多核苷酸或启动子(PG)由允许序列SEQ IDNo.12的蛋白质CmWIP1在双子叶植物中表达的核酸组成。

作为实例，这种启动子包含序列SEQ ID No.13的核酸或由其组成，其定位于序列SEQ ID No.10的CmWIP1基因的核酸的1位核苷酸至2999位核苷酸。

因此，在其中第二遗传元件由等位基因G组成的本发明的两个遗传元件的组合的实施方案中，调节性多核苷酸(PG)可以由这样的多核苷酸组成，该多核苷酸包含以下或由以下组成：(i)从序列SEQ ID No.10的核苷酸1至核苷酸2999的核苷酸序列；或(ii)与SEQ ID No.10的序列1-2999具有至少90％核苷酸同一性且具有功能的序列；或(iii)前述序列(i)和(ii)的具有功能的片段。

本发明还涉及上文定义的调节性多核苷酸(PG)，以及将在标题为“本发明的核酸”的部分中更详细地讨论的此核酸的片段。

本发明的功能性调节性多核苷酸(PG)还可以由已知指导编码蛋白质CmWIP1的核酸序列组成型或组织特异性表达的启动子组成。

因此，本发明的功能性调节性多核苷酸(PG)可以选自组织特异性启动子，如Theissen等，2001所述的A、B、C、D和E类“MADS盒”家族基因的启动子，或同源异形基因的任意其他启动子。

因此，本发明的功能性调节性多核苷酸(PG)可以选自：

-花椰菜花叶病毒的启动子35S，或启动子19S或有利地是描述于Kay等，1987的文章中的双组成型启动子35S(pd35S)，

-包含于McElroy等，1991所描述的pAct1-F4质粒中的后接ri3肌动蛋白内含子的ri3肌动蛋白启动子(pAR-IAR)，

-描述于PCT申请No.WO 90/02172或AXELOS等(1989)的文章中的编码植物延伸因子的基因的组成型启动子EF-1α；

-由3拷贝具有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因启动子转录活性的元件与根癌农杆菌甘露碱合酶基因启动子的转录激活元件融合组成的嵌合超级启动子(superpromoter)PSP(NI等，1995)；和

-向日葵的泛蛋白启动子(BINET等，1991)；

-玉米泛蛋白1的启动子(CHRISTENSEN等，1996)。

本发明的功能性调节性多核苷酸(PG)还可以由诱导型启动子组成。

因此，本发明涉及之前定义的用于控制双子叶植物花型的两个遗传元件的组合，其中调节性多核苷酸(PG)对诱导信号的作用敏感，且优选地，其中调节性多核苷酸(PG)是转录或翻译的诱导性多核苷酸激活剂。

当激活转录或翻译的调节性多核苷酸直接或间接对激活诱导信号的作用敏感时，其在本发明的意义中是“诱导性激活”多核苷酸。

根据本发明，“诱导性激活”型调节性多核苷酸是仅在外部信号存在下激活的调节序列。所述外部信号可以是转录因子的固定，且可以在调节性多核苷酸直接或间接对其敏感的激活诱导信号的作用下诱导转录因子的固定。

当将这种核酸结构(construction)用于细胞宿主中时，可以通过使转化的细胞宿主与激活调节性多核苷酸直接或间接对其敏感的激活诱导信号接触，来诱导编码本发明的蛋白质CmWIP1的多核苷酸的表达。

当希望此转化的细胞宿主中缺乏编码多肽CmWIP1的多核苷酸的表达时，则充分消除或抑制转录或翻译的调节性多核苷酸对其敏感的激活诱导信号的存在。

本领域技术人员可求助于他在调节性多核苷酸，尤其是在植物中有活性的调节性多核苷酸方面的一般技术知识来定义对应于以上实施方案的定义的结构。

能够控制编码蛋白质CmWIP1的核酸的调节序列可以是可通过特定代谢物诱导的调节序列，如：

-AOYAMA等(1997)所描述或McNELLYS等(1998)所描述的可由糖皮质激素诱导的调节序列；

-可由乙醇诱导的调节序列，如SALTER等(1998)所描述或CADDICK等(1998)所描述的调节序列；

-可由四环素诱导的调节序列，如由CLONTECH公司销售的调节序列；

-可由病原体或病原体产生的代谢物诱导的启动子序列；

-可由水杨酸或BTH或Aliette诱导的PR型基因的调节序列(Gorlach等，1996；Molina等，1998)；

-可由例如隶属于二苯甲酰肼家族的虫酰肼(产品索引RH5992，由ROHM&HAAS销售)诱导的蜕皮激素受体型的调节序列(Martinez等，1999)。

-编码蛋白质Cm WIP1的核酸

优选地，编码蛋白质CmWIP1的核酸从5′端至3′至少包含：

(i)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸3000至核苷酸3617的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，和

(ii)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸5458至核苷酸5901的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列。

在其他实施方案中，编码蛋白质CmWIP1的核酸包含核苷酸序列SEQID No.11。

本发明的系统的隐性等位基因(g)的形式的遗传控制元件G/g

一般而言，当存在于基因组中不包含显性等位基因(G)的植物中时，隐性等位基因(g)形式的遗传控制元件(G/g)不允许获得与存在等位基因(G)时获得的一样高的蛋白质CmWIP1的水平。

因此，可将等位基因(g)定义为使得不可能获得与等位基因(G)一样高的CmWIP1水平的对应于等位基因(G)的任意基因型改变。

隐性等位基因(g)与显性等位基因(G)的不同在于：

(i)核酸(NG)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pg)，或

(iii)对失活的蛋白质CmWIP1的表达无功能的核酸(Ng)。

作为实例，通过序列SEQ ID No.15的核酸来说明隐性等位基因(g)形式的控制元件G/g的一个实施方案，该核酸是编码CmWIP1的序列的等位基因，其中存在命名为“Gyno-hAT”的转座子核酸。在序列SEQ IDNo.15的核酸中，Gyno-hAT转座子定位于序列SEQ ID No.15的7167位核苷酸至15412位核苷酸。

在序列SEQ ID No.14的核酸中，Gyno-hAT转座子定位于序列SEQID No.14的10位核苷酸至8246位核苷酸。

-非功能性多核苷酸调节子(Pg)

本发明的非功能性调节性多核苷酸(Pg)或启动子是这样的核酸，其：

(i)不允许序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1在宿主细胞中表达，或

(ii)与用调节性多核苷酸(PG)观察到的水平相比，允许此蛋白质以低水平表达，或

(iii)与用调节性多核苷酸(PG)观察到的表达相比，允许蛋白质CmWIP1在植物一生中表达较短的时间。

在非功能性调节性多核苷酸(Pg)的某些实施方案中，所述多核苷酸(Pg)是甲基化的。例如，调节性多核苷酸(Pg)可以由甲基化核酸形式的调节性多核苷酸(PG)组成。

根据本发明，“甲基化核酸”或“甲基化调节性多核苷酸”指对应的核酸的(甲基化碱基数)/(非甲基化碱基数)比为至少5/1。因此，根据本发明，甲基化核酸包含具有至少6/1、7/1、8/1、9/1、10/1、11/1、12/1、13/1、14/1、15/1、16/1、17/1、18/1和20/1的(甲基化碱基数)/(非甲基化碱基数)比的核酸。

本领域技术人员可通过任意已知技术容易地测定(甲基化碱基数)/(非甲基化碱基数)比。本领域技术人员尤其可以使用本说明书的实施例中所述的亚硫酸氢盐测序法。

为了比较几个启动子的表达水平，本领域技术人员已知的一种简单技术包括将选择标记基因置于待测试的启动子的控制下。选择标记基因可以是例如本领域技术人员公知的除草剂BASTA抗性基因。

另一种技术可以包括用针对此蛋白质的抗体和描述于“本发明的多肽”部分中的方法，测量编码此蛋白质的序列处于不同启动子控制下时获得的蛋白质CmWIP1的水平。

如实施例中所示，非功能性启动子(Pg)的实例包括这样的启动子，其具有与功能性启动子(PG)相同的核苷酸序列，但其在细胞内或在体内处于非功能性甲基化形式。在实施例中阐述的具体实施方案中，启动子(Pg)的甲基化状态由位于距CmWIP1基因3′端不足1千碱基处的转座因子(TE)的存在引起。

非功能性多核苷酸(Pg)还可以是衍生自上文所定义的多核苷酸(PG)的任意多核苷酸，相对于调节性多核苷酸的核苷酸序列，其核苷酸序列包含一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失。

因此，本发明还涉及包含这样的核苷酸序列的核酸，相对于从序列SEQ ID No.10的核苷酸1至核苷酸2999的核酸，该核苷酸序列具有至少一个选自突变、插入或缺失的改变，当其控制所述蛋白质的表达时，相对于由序列SEQ ID No.10的核苷酸1至核苷酸2999的核酸控制的蛋白质CmWIP1的表达，所述改变的核酸导致降低的蛋白质CmWIP1的表达。

本发明还涉及如上文所定义的调节性多核苷酸(Pg)。

本发明还涉及包含调节性多核苷酸(Pg)的核酸和编码序列SEQ IDNo.12的蛋白质CmWIP1的核酸。

本发明还涉及本说明书中一般定义的用于控制双子叶植物花型发育的两个遗传元件的组合，其中调节性多核苷酸(Pg)对诱导信号的作用敏感，且优选地，其中调节性多核苷酸(Pg)是转录或翻译的诱导性阻抑物多核苷酸。

根据本发明，“阻抑物”调节性多核苷酸指其组成型活性可被外部信号阻断的调节序列。所述外部信号可以是缺乏由阻抑物调节性多核苷酸识别的转录因子的固定。可以在阻抑物调节性多核苷酸对其敏感的阻抑物诱导信号的作用下诱导转录因子固定的缺乏。

根据此第一个特定实施方案，在缺乏阻抑物调节性多核苷酸直接或间接对其敏感的阻抑物诱导信号的情况下，编码蛋白质CmWIP1的序列在细胞宿主中组成型表达。

由于对阻抑物调节性多核苷酸的直接或间接作用，使细胞宿主与阻抑物诱导信号接触具有抑制和/或阻断编码蛋白质CmWIP1的多核苷酸表达的作用。

为了影响本发明的包含阻抑物调节性多核苷酸的DNA结构，本领域技术人员可求助于其在植物基因表达方面的一般技术知识。

标题为“获得本发明的转化的植物的方法”的部分中描述了用此类型的调节性多核苷酸获得转化的植物的方法。

-对活性蛋白质Cm WIP1的表达无功能的核酸(Ng)

核酸(Ng)包括这样的核酸，其包含至少一部分编码活性蛋白质CmWIP1的序列，但当在双子叶植物细胞中将它们置于的功能性调节性多核苷酸的控制下时，其不允许活性蛋白质CmWIP1在所述植物中产生。

核酸(Ng)基本上包括这样的核酸(NG)，相对于参考核酸(NG)，其在至少一个内含子或一个外显子中存在一个或多个突变，每个突变选自(i)一个核苷酸或一个以上核苷酸的取代；(ii)一个核苷酸或至少两个连续核苷酸的缺失；和(iii)一个核苷酸或至少两个连续核苷酸的缺失。核酸(Ng)尤其包括编码失活的蛋白质CmWIP1的核酸。

在本发明的意义中，“编码失活的蛋白质CmWIP1的核酸”指编码这样的蛋白质的核酸，该蛋白质因一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而不同于序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1，且不具有SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1的生物学活性。

其还包括编码这样的蛋白质的核酸，该蛋白质因一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而不同于序列SEQ ID No.16的蛋白质CmWIP1，且不具有SEQ ID No.16的蛋白质CmWIP1的生物学活性。

尤其是，当其在不表达任何活性蛋白质CmWIP1，尤其是任何序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1或序列SEQ ID No.16的蛋白质CmWIP1的植物中表达时，所述失活的蛋白质CmWIP1分别诱导：

-与等位基因(a/a)以纯合形式存在于所述植物中组合的雌雄同株同花植物表型，

-与(i)等位基因(A/A)以纯合形式存在于所述植物中组合或与(ii)等位基因(A/a)以杂合形式存在于所述植物中组合的雌性植物表型。

实施例中显示，用编码失活的蛋白质CmWIP1的核酸获得了具有遗传元件(G/g)的等位基因(g)的植物。尤其是，实施例中显示，用编码蛋白质CmWIP1的核酸获得了具有遗传元件(G/g)的等位基因(g)的植物，相对于编码序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1的核苷酸序列SEQ ID No.11，该编码蛋白质CmWIP1的核酸具有单个核苷酸取代。

为了说明的目的，实施例显示了具有等位基因(g)，且其对应的核酸编码具有选自L77F、P193L和S306F(根据用于序列SEQ ID No.12的氨基酸编号)的氨基酸取代的突变的蛋白质CmWIP1的植物。

已在法国专利申请No.FR 2900415和PCT申请No.WO 2007/125264中描述了显性等位基因(A)的形式或显性等位基因(a)的形式的遗传控制元件A/a。

但是，由于遗传控制元件(A/a)是本发明的用于控制花型发育的两个遗传元件的组合的重要元件，所以下文再次描述其的主要特征。

本发明的组合的显性等位基因(A)的形式的遗传控制元件A/a

一般而言，相对于等位基因(A)不存在于所述植物中时观察到的水平，以显性等位基因(A)的形式存在于植物中的遗传控制元件A/a使得可能获得更高水平的活性蛋白质ACS。

在本说明书的其余部分中，认为“高水平”的蛋白质ACS对应于在基因组中包含显性等位基因(A)的植物中测量的蛋白质ACS的平均水平，而“低水平”的蛋白质ACS对应于在基因组中不包含显性等位基因(A)的植物中观察到的活性蛋白质ACS的平均水平。低水平的蛋白质ACS包括活性蛋白质ACS的水平为0，例如在表达包括具有突变A57V的等位基因“a”的产物的失活ACS的情况下。

显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，其包含：

(i)双子叶植物中的功能性调节性多核苷酸(PA)，和

(ii)其表达受该调节性多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS。

-功能性调节性多核苷酸(PA)

本发明的功能性调节性多核苷酸或启动子(PA)由允许序列SEQ IDNo.3的蛋白质ACS在双子叶植物中表达的核酸组成。

作为实例，这种启动子包含从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。

因此，在其中第一遗传控制元件由等位基因A组成的本发明两个遗传控制元件的组合的实施方案中，调节性多核苷酸(PA)可以由这样的多核苷酸组成，该多核苷酸包含以下或由以下组成：(i)从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列；或(ii)与SEQ ID No.1的序列1-5906具有至少90％核苷酸同一性且具有功能的序列；或(iii)前述序列(i)和(ii)的具有功能的片段。

因此，在本发明的两个遗传元件的组合的某些实施方案中，调节性多核苷酸(PA)包含序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列或由该核苷酸序列组成。

包含于本发明的两个遗传元件的组合中的功能性调节性多核苷酸(PA)还可以由已知指导编码蛋白质ACS的核酸序列组成型或组织特异性表达的启动子组成。

因此，包含于本发明的两个遗传元件的组合中的功能性调节性多核苷酸(PA)可以选自之前针对调节性多核苷酸(PG)的某些实施方案描述的组成型或组织特异性启动子的任一个。

本发明的功能性调节性多核苷酸(PA)还可以由诱导型启动子组成。

因此，本发明涉及上文定义的两个遗传元件的组合，其中调节性多核苷酸(PA)对诱导信号的作用敏感，且优选地，其中调节多核苷酸(PA)是转录和翻译的诱导性激活多核苷酸，其可以选自在调节性多核苷酸(PG)的某些实施方案中描述的诱导性激活多核苷酸的任一个。

当将这样的核酸结构用于细胞宿主中时，可以通过使转化的宿主细胞与激活调节性多核苷酸直接或间接对其敏感的激活诱导信号接触来诱导本发明的编码蛋白质ACS的多核苷酸的表达。

当希望此转化的细胞宿主中缺乏编码多肽ACS的多核苷酸的表达时，则充分消除或抑制转录或翻译的调节性多核苷酸对其敏感的激活诱导信号的存在。

本领域技术人员可求助于其在调节性多核苷酸，尤其是在植物中有活性的调节性多核苷酸方面的一般技术知识来定义对应于以上实施方案的定义的结构，尤其是针对调节性多核苷酸(PG)所述的结构。

-编码蛋白质ACS的核酸

优选地，编码蛋白质ACS的核酸从5′端至3′端至少包含：

(i)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，

(ii)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，和

(iii)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列。

本发明的组合的隐性等位基因(a)的形式的遗传控制元件A/a

一般而言，当存在于基因组中不具有显性等位基因(A)的植物中时，隐性等位基因(a)形式的遗传控制元件(A/a)不允许获得与存在等位基因(A)时获得的一样高的蛋白质ACS的水平。

因此，我们可将等位基因(a)定义为不允许获得ACS的活性水平的对应于等位基因(A)的任意基因型改变。

隐性等位基因(a)与显性等位基因(A)的不同在于：

(i)核酸(NA)不存在于该植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pa)，或

(iii)编码失活的蛋白质ACS的核酸，或

(iv)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pa)和编码失活的蛋白质ACS的核酸。

-非功能性多核苷酸调节子(Pa)

本发明的非功能性调节性多核苷酸(Pa)或启动子是这样的核酸，其：

(i)不允许序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS在宿主细胞中表达，或

(ii)与用调节性多核苷酸(PA)观察到水平相比，允许此蛋白质以低水平表达，或

(iii)与用调节性多核苷酸(PA)观察到的表达相比，允许蛋白质ACS在植物一生中表达较短的时间。

在非功能性调节性多核苷酸(Pa)的某些实施方案中，所述多核苷酸(Pa)是甲基化的。例如，调节性多核苷酸(Pa)可以由甲基化核酸形式的调节性多核苷酸(PA)组成。

另一种技术可以包括用针对此蛋白质的抗体和描述于“本发明的多肽”部分中的方法，测量编码此蛋白质的序列处于不同启动子控制下时获得的蛋白质ACS的水平。

作为实例，非功能性调节性多核苷酸(Pa)包括从序列SEQ ID No.2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

作为另一个实例，非功能性调节性多核苷酸(Pa)包括相对于从SEQID No.1的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列，包含一个或多个碱基取代、缺失或添加的某些核苷酸序列。

因此，在本发明的用于控制花型发育的两个遗传元件的组合中，非功能性调节性多核苷酸(Pa)可以包括通过本领域技术人员已知的方法之一改变的从序列SEQ ID No.2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

本发明还涉及本说明书中定义的用于控制花型发育的两个遗传元件的组合，其中等位基因(a)是包含序列SEQ ID No.2的核酸。所述序列SEQID No.2的核酸包含调节性多核苷酸(Pa)和编码序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS的核酸。

非功能性多核苷酸(Pa)还可以是衍生自上文定义的多核苷酸(PA)的任意多核苷酸，相对于调节性多核苷酸的核苷酸序列，其核苷酸序列包含一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失。

因此，在本发明的组合的某些实施方案中，多核苷酸(Pa)由包含这样的核苷酸序列的核酸组成，相对于从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸，该核苷酸序列具有至少一个选自突变、插入或缺失的改变，当其控制所述蛋白质的表达时，相对于由序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的蛋白质ACS的表达，所述改变的核酸导致降低的蛋白质ACS的表达。

本发明还涉及上文定义的用于控制花型发育的两个遗传元件的组合，其中调节性多核苷酸(Pa)对诱导信号的作用敏感，且优选地，其中调节性多核苷酸(Pa)是转录或翻译的诱导性阻抑物多核苷酸。

根据此第一特定实施方案，在缺乏阻抑物调节性多核苷酸直接或间接对其敏感的阻抑物诱导信号的情况下，编码蛋白质ACS的序列在所选择的细胞宿主中组成型表达。

由于对阻抑物调节性多核苷酸的直接或间接作用，使与阻抑物诱导信号接触的细胞宿主具有抑制和/或阻断编码蛋白质ACS的多核苷酸表达的作用。

为了产生本发明的包含阻抑物调节性多核苷酸的DNA结构，本领域技术人员可求助于其在植物基因表达方面的一般技术知识。

-对活性蛋白质ACS的表达无功能的核酸(Na)

核酸(Na)包括这样的核酸，其包含至少一部分编码活性蛋白质ACS的序列，但当在双子叶植物细胞中将它们置于的功能性调节性多核苷酸的控制下时，其不允许活性蛋白质ACS在所述植物中产生。

核酸(Na)基本上包括这样的核酸(NA)，相对于参考核酸(NA)，其在至少一个内含子或一个外显子中存在一个或多个突变，每个突变选自(i)一个核苷酸或一个以上核苷酸的取代；(ii)一个核苷酸或至少两个连续核苷酸的缺失；和(iii)一个核苷酸或至少两个连续核苷酸的缺失。核酸(Na)尤其包括编码失活的蛋白质ACS的核酸。

在本发明的意义中，“编码失活的蛋白质ACS的核酸”指编码这样的蛋白质的核酸，该蛋白质因一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而不同于序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS，且不具有SEQ ID No.3的蛋白质ACS的生物学活性。图8中显示了说明这种核酸的实例。

尤其是，此类失活的蛋白质ACS不允许S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸盐)。

本发明的核酸

如上文所述，已表征了包含于本发明的用于控制花型发育的两个遗传元件的组合中的第二遗传控制元件(G/g)的两个等位基因变体(G)和(g)。

本发明人将序列SEQ ID No.10的核酸鉴定为对应于显性等位基因变体(G)的核酸，且其在植物中的甲基化形式对应于基因(G/g)形式的第二遗传控制元件的隐性等位基因变体(g)。

在本发明的用于控制花发育的两个遗传元件的组合中，至少将该两个遗传控制元件的第二个人为引入植物中。

如上文所述，所述引入引起该植物的花的性别改变，其是本发明所需的目的之一。

因此，序列SEQ ID No.10的核酸构成本发明的部分目的。

因此，本发明涉及包含与核苷酸序列SEQ ID No.10，或与序列SEQ IDNo.10的片段具有至少95％核苷酸同一性的多核苷酸的核酸，只要所述核酸具有上文定义的等位基因(G)的功能特征。

与上文定义的核酸序列互补的核酸也构成本发明的部分。

本发明的另一个目的是由与序列SEQ ID No.10，或与序列SEQ ID No.10的片段，或与互补序列的核酸具有至少95％核苷酸同一性的多核苷酸组成的核酸，只要所述核酸具有上文定义的等位基因(G)的功能特征。

本发明还涉及包含序列SEQ ID No.10的核酸的至少12个、优选至少15个和最优选至少20个连续核苷酸的核酸，其理解为所述核酸在其定义中包括了本说明书中定义的本发明的核酸的“片段”。

本发明还涉及包含序列SEQ ID No.10或由序列SEQ ID No.10组成的核酸。

由序列SEQ ID No.10定义的等位基因(G)从5′端至3′端分别包含：

a)具有此基因的转录和/或翻译调节元件的非编码序列，位于第一外显子上游，从序列SEQ ID No.10的1位核苷酸至2999位核苷酸；

b)所谓的“编码”区，其包含基因(G/g)的两个外显子和内含子，此编码区位于序列SEQ ID No.10的3000位核苷酸至5901位核苷酸；和

c)位于编码区下游的非编码区，从序列SEQ ID No.10的5902位核苷酸至7621位核苷酸。

下文表2中给出了基因G/g的两个外显子和内含子的结构特征的细节。基因(G/g)的等位基因(G)和(g)的两个外显子和内含子的结构特征非常相似，以至于在某些实施方案中，等位基因(G)和(g)的外显子可以编码同一序列SEQ ID No.12的蛋白质。如上文所述，对应于等位基因(G)和(g)的核苷酸序列之间的主要差异可以存在于：

(i)在对应于这两个等位基因的上游调节序列中，对于等位基因(G)，其在植物中是非甲基化的，而对于等位基因(g)，其在植物中是甲基化的，

(ii)或外显子序列中，因为引起蛋白质CmWIP1序列中的氨基酸取代的单个核苷酸取代足以获得等位基因(g)。

表2

基因G/g的外显子序列

本发明还涉及包含基因G/g的外显子多核苷酸的至少12个连续核苷酸的核酸，如上文表2中所述的多核苷酸1和2，其包含于序列SEQ ID No.10的核酸中。

所述核酸编码蛋白质CmWIP1的至少一部分，且尤其可以插入重组载体中，该重组载体预期用于在用此重组载体转化的宿主细胞或植物中表达对应的翻译产物，以获得基因型(G)的植物。

所述核酸还可以用来合成预期用于在样品中检测或扩增包含于基因(G/g)中的核苷酸序列的核苷酸探针和引物。

必要时，上文所述的序列可以具有一个或多个突变，优选以下类型的一个或多个突变，该突变类型诱导合成失活的蛋白质CmWIP1并改变具有所述突变的基因(G/g)的植物的性型。所述序列符合上文一般定义的编码失活的蛋白质CmWIP1的核酸的定义。

表3

基因(G/g)的内含子序列

本发明还涉及包含上文表3中所述的基因(G/g)的内含子多核苷酸的至少12个连续核苷酸的核酸，其包含于序列SEQ ID No.10的核酸中。

所述核酸可以用作寡核苷酸探针或引物来检测基因(G/g)的至少一个拷贝在样品中的存在，或用来扩增基因(A/a)内的特定靶序列。

所述核酸还可以用来扩增基因(G/g)内的特定靶序列，或通过正义或共抑制途径，或通过双链RNA(Wassenegger等1996；Kooter等1999)在干扰中的用途来抑制该靶序列。所述核酸还可以用来发现基因(G/g)的功能性等位基因变体，该变体可以用于选择具有特定性型的植物的方法中。

本发明的编码蛋白质Cm WIP1的其他核酸

本发明还涉及包含与开始于序列SEQ ID No.10的3000位核苷酸并结束于5901位核苷酸的核苷酸序列具有至少95％核苷酸同一性的多核苷酸的核酸，以及互补序列的核酸。

本发明还涉及与开始于序列SEQ ID No.10的3000位核苷酸并结束于5901位核苷酸的核苷酸序列具有至少95％核苷酸同一性的核酸，以及互补序列的核酸。

本发明还涉及包含开始于序列SEQ ID No.10的3000位核苷酸并结束于5901位核苷酸的核苷酸序列的核酸，或互补序列的核酸。

本发明还涉及由开始于序列SEQ ID No.10的3000位核苷酸并结束于5901位核苷酸的核苷酸序列组成的核酸，或互补序列的核酸。

本发明的另一个目的包括核酸，该核酸至少包含：

(i)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸3000至核苷酸3617的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，

(ii)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸5458至核苷酸5901的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，和

本发明还涉及核酸，该核酸从5′端至3′端包含：

(i)从序列SEQ ID No.10的核苷酸3000延伸至核苷酸3617的序列，和

(ii)从序列SEQ ID No.10的核苷酸5458延伸至核苷酸5901的序列。

编码蛋白质CmWIP1的核酸还可以包含本领域技术人员已知的常规前导序列和终止子序列。

基因(G/g)的转录和翻译产物及本发明的多肽

编码蛋白质CmWIP1的基因组核酸的表达导致信使RNA(其cDNA是序列SEQ ID No.11的核酸)的合成，这也是本发明的目的之一。

因此，本发明还涉及包含氨基酸序列SEQ ID No.12的多肽(在本说明书中也称为“蛋白质CmWIP1”)，以及与序列SEQ ID No.12具有至少95％氨基酸同一性的多肽，或多肽的片段或变体。

本发明的与序列SEQ ID No.12具有至少95％氨基酸同一性的蛋白质CmWIP1的实例包括序列SEQ ID No.16的蛋白质，其与序列SEQ ID No.12的蛋白质的不同在于丝氨酸残基的缺失。

本发明的蛋白质CmWIP1的片段包含序列SEQ ID No.12的多肽的至少10、50、100、200、300、320、330、340、345或353个连续氨基酸。

本发明还涉及包含与序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1的序列具有至少95％氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽。

有利地，与序列SEQ ID No.12的多肽的序列具有至少96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％氨基酸同一性的多肽或序列SEQ ID No.12的多肽的肽片段也构成本发明的部分。

一般而言，本发明的多肽是分离的或纯化的形式。

可以按照本领域技术人员公知的技术，例如描述于AUSUBEL等(1989)中的技术，通过遗传重组获得本发明的多肽。

还可以通过均质溶液中或固相中的常规化学合成技术来制备本发明的多肽。

作为实例，可以通过HOUBEN WEIL(1974)所述的均质溶液中的技术，或通过MERRIFIELD(1965a；1965b)所述的固相合成技术来制备本发明的多肽。

优选地，本发明的多肽的变体多肽保留其被针对序列SEQ ID No.12的多肽的抗体识别的能力。

本发明的由基因(G/g)编码的多肽，如氨基酸序列SEQ ID No.12的多肽，或多肽的变体或肽片段尤其用于制备抗体，该抗体预期用于检测序列SEQ ID No.12的多肽，或多肽的肽片段在样品中的存在和/或表达。

除检测由基因(G/g)编码的多肽或这种多肽的肽片段在样品中的存在之外，针对这些多肽的抗体还用于定量序列SEQ ID No.12的多肽在例如植物细胞中的合成，并从而在不必栽培该植物的情况下确定其的性别。

在本发明的意义中，“抗体”尤其指多克隆或单克隆抗体或片段(例如F(ab)′2、F(ab)片段)或包含识别本发明的靶多肽或多肽片段的原始抗体的结构域的任意多肽。

可以按照KOHLER和MILSTEIN(1975)所述的技术从杂交瘤制备单克隆抗体。

本发明还涉及如在KOZBOR等(1983)所述的三源杂交瘤(trioma)技术或杂交瘤技术中产生的针对上文所述的多肽，或多肽的片段或变体的抗体。

本发明还涉及美国专利No.4,946,778或MARTINEAU等(1998)中所述的单链抗体片段Fv(ScFv)。

本发明的抗体还包括RIDDER等(1995)所述的利用噬菌体库获得的抗体片段或REINMANN等(1997)和LEGER等(1997)所述的人源化抗体。本发明的抗体制剂可以用于免疫学检测测定中，该测定旨在用于鉴定存在于样品中的序列SEQ ID No.3的多肽，或多肽的肽片段的存在和/或量。

本发明的抗体还可以包含同位素或非同位素(例如荧光)检测标记或可以按照本领域技术人员公知的技术与诸如生物素的分子偶联。

因此，本发明还涉及用于检测本发明的多肽在样品中的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使待测试的样品与上文所述的抗体接触；

b)检测形成的抗原/抗体复合物。

本发明还涉及用于检测本发明的多肽在样品中的存在的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：

a)上文定义的抗体；

b)根据需要，检测形成的抗原/抗体复合物所需的一种或多种试剂。

本发明的另一个目的包括在植物选择程序中使用上文定义的核酸或核酸的等位基因变体来获得花型已改变的植物。

包含功能性调节性多核苷酸(PG)的核酸

因此，当将其人为引入植物中时，所述功能性调节性多核苷酸(PG)使得可能改变这种植物的花的性别，且尤其使得可能获得能够自花传粉的雄性和雌性或雄性和两性的植物。

因此，本发明还涉及包含与开始于序列SEQ ID No.10的1位核苷酸并结束于2999位核苷酸的核苷酸序列具有至少95％核苷酸同一性的多核苷酸的核酸，以及互补序列的核酸。

本发明还涉及与开始于序列SEQ ID No.10的1位核苷酸并结束于2999位核苷酸的核苷酸序列具有至少95％核苷酸同一性的核酸，以及互补序列的核酸。

本发明还涉及包含开始于序列SEQ ID No.10的1位核苷酸并结束于2999位核苷酸的核苷酸序列的核酸或互补序列的核酸。

本发明还涉及由开始于序列SEQ ID No.10的1位核苷酸并结束于2999位核苷酸的核苷酸序列组成的核酸或互补序列的核酸。

在本说明书中，从序列SEQ ID No.10的1位核苷酸延伸至2999位核苷酸的调节性多核苷酸也称为序列SEQ ID No.13的核酸。

本发明还涉及包含上文定义的调节性多核苷酸的至少12个连续核苷酸的核酸。

所述核酸可以用作寡核苷酸探针或引物来检测基因(G/g)的等位基因(G)的至少一个拷贝在样品中的存在，扩增基因(G/g)内的特定靶序列。所述核酸还可以用来发现基因(G/g)的功能性等位基因变体，或可以用于选择具有特定性型的植物的方法中。

利用上文所述核酸的检测方法描述于标题为“本发明的选择方法”的部分中。

所述核酸还可以用来通过反义或共抑制途径，或通过双链RNA(Wassenegger等1996；Kooter等1999)在干扰中的用途来抑制基因(G/g)内的特定靶序列。

包含非功能性调节性多核苷酸Pg的核酸

(i)不允许序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWIP1在宿主细胞中表达，或

(ii)与用调节性多核苷酸(PG)观察到的水平相比，允许此蛋白质以很低的水平表达，或

因此，当将其人为引入植物中，例如取代多核苷酸(G)时，所述非功能性调节性多核苷酸(Pg)使得可能改变这种植物的花的性别，且尤其使得可能获得能够自花传粉的雌雄同株同花植物，或雌性植物。

所述核酸可以用作寡核苷酸探针或引物来检测基因(G/g)的等位基因(a)的至少一个拷贝在样品中的存在，或扩增基因(G/g)内的特定靶序列。

最后，本发明涉及包含上文定义的一种或多种核酸的组合的核酸，例如在(PG)或(Pg)型启动子控制下编码功能性蛋白质CmWIP1的核酸。

一般定义

根据本发明，可以使用本领域技术人员已知的任意常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。例如SAMBROOK等(1989)；GLOVER(1985)；GAIT(1984)；HAMES和HIGGINS(1984)；BERBAL(1984)；和AUSUBEL等(1994)描述了此类技术。

优选地，本发明的任意核酸和任意多肽是分离的或纯化的形式。

在本发明的意义中，术语“分离的”指已从其最初的环境(其天然定位于其中的环境)移出的生物物质。例如，以天然状态存在于植物中的多核苷酸不是分离的。从其在其中天然插入该植物基因组中的邻近核酸分离的相同多核苷酸是分离的。可将此类多核苷酸引入载体中和/或可将此类多核苷酸引入组合物中，但其仍然处于分离的状态，因为载体或组合物不构成其天然环境。

术语“纯化的”不要求物质排除其他化合物的存在以绝对纯的形式存在。相反，其是相对的定义。

纯化起始物质或天然物质至少一个数量级、优选2或3和优选4或5个数量级后，多核苷酸或多肽处于纯化的状态。

为了本说明书的目的，表述“核酸序列”可以用来不加区别地指多核苷酸或核酸。表述“核苷酸序列”包括遗传物质自身，且因此不限于关于其序列的信息。

术语“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核苷酸序列”包括单链形式或双链体形式的超过一个核苷酸的RNA序列、DNA序列、cDNA序列或RNA/DNA杂种序列。

术语“核苷酸”指天然核苷酸(A、T、G、C)以及包含至少一个修饰如(i)嘌呤类似物；(ii)嘧啶类似物；或(iii)糖类似物的修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸描述于例如PCT申请No.WO 95/04064中。

为了本发明的目的，当第一核苷酸的每个碱基与方向相反的第二多核苷酸的互补碱基配对时，认为第一多核苷酸与第二多核苷酸“互补”。互补碱基是A和T(或A和U)，C和G。

根据本发明，与第二参考核酸具有至少95％同一性的第一核酸将与此第二参考多核苷酸具有至少95％、优选至少96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％核苷酸同一性，两条序列间的百分比同一性按下文所述测定。

在本发明的意义中，通过比较窗比较最佳比对的两条序列来测定这两条核酸序列间的“百分比同一性”。

因此，相对于参考序列(其不包含这些添加或这些缺失)，核苷酸序列在比较窗中的部分可以包含添加或缺失(例如“缺口”)。

按如下计算百分比同一性，确定针对所比较的两条序列观察到相同核酸碱基的位置数，然后用两个核酸碱基间存在同一性的位置数除以比较窗中的总位置数，之后将结果乘以100来获得两条序列间的百分比核苷酸同一性。

可以使用已知算法通过计算机来完成用于比较的序列的最佳比对。

最优选地，用CLUSTAL W软件(1.82版)测定百分比序列同一性，参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝″full″；(3)OUTPUT FORMAT＝″aln w/numbers″；(4)OUTPUT ORDER＝″aligned″；(5)COLOR ALIGNMENT＝″no″；(6)KTUP(word size)＝″default″；(7)WINDOW LENGTH＝″default″；(8)SCORE TYPE＝″percent″；(9)TOPDIAG＝″default″；(10)PAIRGAP＝″default″；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREETYPE＝″none″；(12)MATRIX＝″default″；(13)GAP OPEN＝″default″；(14)END GAPS＝″default″；(15)GAP EXTENSION＝″default″；(16)GAP DISTANCES＝″default″；(17)TREE TYPE＝″cladogram″和(18)TREE GRAPH DISTANCES＝″hide″。

与本发明的核酸具有至少95％核苷酸同一性的核酸包括本发明的核酸的“变体”。

本发明的核酸的“变体”指这样的核酸，其与参考核酸的不同在于相对于参考核酸具有一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。本发明的核酸的变体可以是天然来源的，如天然存在的等位基因变体。所述变体核酸还可以是例如通过诱变技术获得的非天然核酸。

一般而言，以这样的方式减少参考核酸与“变体”核酸之间的差异，使得参考核酸与变体核酸具有非常相似，且在许多区域中相同的核苷酸序列。变体核酸中存在的核苷酸修饰可以是沉默的，这意味着它们不影响可以由此变体核酸编码的氨基酸序列。

变体核酸中的核苷酸修饰还可以导致可以由此变体核酸编码的多肽序列中的一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失。

最优选地，具有可读框的本发明的变体核酸编码这样的多肽，其保留与由参考核酸编码的多肽相同的功能或相同的生物学活性。

最优选地，包含可读框的本发明的变体核酸编码这样的多肽，其保留被针对由参考核酸编码的多肽的抗体识别的能力。

包含于植物基因组中且与编码蛋白质CmWIP1的核酸具有至少95％核苷酸同一性的蛋白质CmWIP1的直向同源基因的核酸形成编码蛋白质ACS的核酸的变体部分。

本发明的核酸的“片段”指长度相对于参考核酸减少的核苷酸序列，在共同的部分上具有与参考核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的核酸片段。所述本发明的核酸的片段具有参考核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸，当然，本发明的核酸片段的最大核苷酸长度受限于参考核酸的最大核苷酸长度。

探针和引物

本发明的核酸，尤其是核苷酸序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11、它们的至少12个核苷酸的片段、调节性多核苷酸(PG)和(Pg)以及互补序列的核酸可以用来检测基因(G/g)的核苷酸序列的至少一拷贝，或基因(G/g)的片段或等位基因变体在样品中的存在。

尤其是，以上衍生自序列SEQ ID No.10，尤其是衍生自调节性多核苷酸(PG)的探针和引物可以用来检测等位基因(G)在双子叶植物中的存在。

在高严格性杂交条件下与选自序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11的核酸，或调节性多核苷酸(PG)或(Pg)杂交的核苷酸探针和引物也构成本发明的部分。

因此，本发明还涉及可用作与上文定义的核酸特异性杂交的探针或引物的核酸。

利用下文给出的杂交条件来进行长度为20个碱基的核酸、探针或引物的杂交。

杂交的水平和特异性取决于多个参数，如：

a)探针或引物必须与之杂交的核酸制剂的纯度；

b)探针或引物的碱基组成，碱基对G-C具有比碱基对A-T或A-U高的热稳定性；

c)探针或引物与核酸之间的同源碱基序列的长度；

d)离子力：杂交率随离子力和孵育时间的增加而增加；

e)孵育温度；

f)探针或引物将要杂交的核酸的浓度；

g)变性剂，如促进氢键断裂的物质，如甲酰胺或尿素的存在，其增加杂交的严格性；

h)孵育时间，杂交率随孵育时间而增加；

i)体积排除剂(volume excluding agent)，如葡聚糖或硫酸葡聚糖的存在，其增加杂交率，因为它们增加了探针或引物和将要杂交的核酸在制剂内的有效浓度。

定义严格条件的参数取决于50％的配对链分开的温度(Tm)。

对于包含超过360个碱基的序列，Tm由以下关系定义：

Tm＝81.5+0.41(％G+C)+16.6Log(阳离子浓度)-0.63(％甲酰胺)-(600/碱基数)(Sambrook等，(1989)，9.54-9.62页)。

对于长度小于30个碱基的序列，Tm由以下关系定义：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

在适宜的严格条件(其中非特异性序列不杂交)中，杂交温度为Tm以下约5至30℃，优选5至10℃。

本发明的“高严格性杂交条件”指杂交温度在Tm以下5℃的杂交条件。

取决于需杂交的核酸的长度和碱基组成或取决于按照本领域技术人员已知的技术选择的标记的类型，可以调整上文所述的杂交条件。

可以例如按照HAMES和HIGGINS(1985)的工作中或AUSUBEL等(1989)的工作中所给出的指导来调整适宜的杂交条件。

为了说明的目的，用于长度为200个碱基的核酸的杂交条件如下：

预杂交

与杂交相同的条件

持续时间：过夜

杂交

5x SSPE(0.9M NaCl，50mM磷酸钠pH 7.7，5mM EDTA)

5x Denhardt′s(0.2％PVP，0.2％聚蔗糖，0.2％SAB)

100μg/ml鲑鱼精子DNA

0.1％SDS

持续时间：过夜。

洗涤：

2x SSC，0.1％SDS 10分钟65℃

1x SSC，0.1％SDS 10分钟65℃

0.5x SSC，0.1％SDS 10分钟65℃

0.1x SSC，0.1％SDS 10分钟65℃.

本发明的核苷酸探针或引物包含本发明的核酸，尤其是序列SEQ IDNo.10或SEQ ID No.11或其互补序列的核酸、与选自序列SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或其互补序列的序列具有95％核苷酸同一性的核酸、在高严格性杂交条件下与选自序列SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或其互补序列的序列杂交的核酸的至少12个连续核苷酸。

优选地，本发明的核苷酸探针或引物将具有本发明的核酸的至少12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸的长度。

备选地，本发明的核苷酸探针或引物将由长度为本发明的核酸的12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、60、100、150、200、300、400、500、1000、2000或3000个连续核苷酸的片段组成和/或包含这样的片段。

可以通过本领域技术人员公知的任意适宜的方法来制备本发明的核苷酸引物或探针，包括通过克隆和限制酶的作用，或通过按照如NARANG等(1979)或BROWN等(1979)的磷酸二酯法、BEAUCAGE等(1980)的二乙基氨基磷酸盐法的技术或欧洲专利No.EP 0707592中所述的在固体支持物上的技术直接化学合成。如果希望，可以通过掺入可检测的分子(即可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的标记)来标记本发明的每一核酸，包括上文所述的寡核苷酸探针和引物。

例如，此类标记可以由放射性同位素(³²P、³H、³⁵S)、荧光分子(5-溴脱氧尿苷、荧光素、乙酰氨基芴)或配体如生物素组成。

优选地，通过引物延伸在多核苷酸内掺入标记的分子，或通过在5′或3′端添加标记的分子来标记探针。

核酸片段的非放射性标记的实例尤其描述于法国专利No.FR 7810975中或URDEA等(1988)或SANCHEZ PESCADOR等(1988)的文章中。

有利地，本发明的探针可以具有允许信号放大的性质的结构特征，如URDEA等(1991)或欧洲专利No.EP 0225807(Chiron)中所述的探针。

本发明的寡核苷酸探针尤其可以用于与编码蛋白质CmWIP1的任意核酸，尤其是序列SEQ ID No.10或SEQ ID No.11的核酸的Southern类型的杂交，或在希望对应的转录物在样品中表达时用于与RNA杂交。

本发明的探针还可以用来检测PCR扩增产物或用来检测错配。

可以将本发明的核苷酸探针或引物固定在固体支持物上。所述固体支持物为本领域技术人员公知，且包括微量滴定板的孔表面、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纤维素膜(strip)或微粒如胶乳颗粒。

因此，本发明还涉及可用作核苷酸探针或引物的核酸，其特征在于其包含上文定义的核酸，尤其是核苷酸序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11的核酸的至少12个连续核苷酸。

本发明还涉及可用作核苷酸探针或引物的核酸，其特征在于其由本发明的核酸，最优选选自核苷酸序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11的序列的核酸的至少12个连续核苷酸的多核苷酸组成。

如上文所描述，所述核酸的特征还可以在于用可检测的分子对其进行标记。

可以用作核苷酸探针或引物来检测或扩增基因(G/g)的基因组序列、mRNA或cDNA的核酸的特征还可以在于其选自以下序列：

a)在高严格性杂交条件下与序列SEQ ID No.10或SEQ ID No.11的核酸杂交的核苷酸序列；和

b)包含序列SEQ ID No.10或SEQ ID No.11的核酸的至少12个连续核苷酸的序列。

本发明的载体、细胞和植物

在本发明的用于控制双子叶植物花型发育的两个遗传元件的组合中，为了能够将遗传控制元件的至少一个人为引入双子叶植物中，必须将上文定义的核酸和调节性多核苷酸引入载体中，然后引入细胞中。

因此，本发明还涉及载体、细胞和转化的植物，其包含调节性多核苷酸(PG)和(Pg)，编码活性或无活性的蛋白质CmWIP1的核酸，以及对应于上文所述的等位基因(G)和(g)的核酸和上文定义的引物。

载体

可以将上文定义的核酸(后文称为目的核酸)插入适宜的载体。

在本发明的意义中，“载体”指不区分单链或双链形式的DNA或RNA的环型或线型分子。

优选本发明的重组载体是表达载体，或更具体而言是插入载体、转化载体或整合载体。

其尤其可以是细菌或病毒来源的载体。

在所有情况下，将目的核酸置于一个或多个含有调节其在所讨论的植物中表达的信号的序列控制下，调节信号或者全都包含在目的核酸中，如前一部分中所述的核酸结构的情况，或者它们中的一个或多个，或所有调节信号都包含在目的核酸所插入的接受载体中。

本发明的重组载体有利地包含适宜的转录起始和终止序列。

此外，本发明的重组载体可以包含需要其表达的宿主细胞中的一个或多个功能性复制起点，如果需要，加上选择标记核苷酸序列。

本发明的重组载体还可以包含一个或多个在本说明书上文中定义的表达调节信号。

本发明优选的细菌载体是例如载体pBR322(ATCC号37017)或如pAA223-3(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，美国)的载体。

我们还可以提到其他市售载体，如载体pQE70、pQE60、pQE9(Qiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pMH16A、pMH18A、pMH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG(Stratagene)。

它们还可以是杆状病毒类型的载体，如用来转染源自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的品系Sf9(ATCC号CRL 1711)的细胞的载体pVL1392/1393(Pharmingen)。

优选地，对于本发明的载体的主要应用(包括获得编码蛋白质CmWIP1的序列在植物中的稳定的且优选诱导性表达)，我们将求助于针对目的序列在植物细胞中的表达特别调整的载体，如以下载体：

-载体pBIN19(Bevan等)，由CLONTECH公司(Palo Alto，California，美国)销售；

-载体pBI 101(Jefferson，1987)，由CLONTECH公司销售；

-载体pBI121(Jefferson，1987)，由CLONTECH公司销售；

-载体pEGFP；Yang等(1996)，由CLONTECH公司销售；

-载体pCAMBIA 1302(Hajdukiewicz等，1994)；

-Japan Tobacco(EP 672752和Ishida等，1996)所描述的衍生自载体pSB12和pSB1的中间载体和超级二元(superbinary)载体。

细胞

最广泛用于将核酸引入细菌细胞的方法可以用于本发明的范围内。这可以是接收细胞与包含DNA的细菌原生质体的融合、电穿孔、用发射物轰击、通过病毒载体感染等。通常用细菌细胞来扩增包含含有本发明的核苷酸序列的构建体的质粒的数目。培养细菌，然后通过本领域技术人员公知的方法(见已提到的方案手册)分离质粒，包括市售的质粒纯化试剂盒，例如来自Pharmacia Biotech的EasyPrepl或来自Qiagen的QIAexpressExpression System。然后操作如此分离和纯化的质粒以产生将用于转染植物细胞的其他质粒。

为了允许置于适宜的调节序列控制下的本发明的目的核酸的表达，必须将本说明书中定义的核酸或重组载体引入宿主细胞中。可以按照本领域技术人员公知的技术，在体外进行本发明的多核苷酸向宿主细胞的引入。

本发明还涉及通过本发明的核酸或通过上文定义的重组载体转化的宿主细胞。

优选所述转化的宿主细胞是细菌、真菌或植物来源的。

因此，尤其可能使用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)或根癌农杆菌的多个菌株的细菌细胞。

有利地，转化的细胞是植物细胞或植物原生质体。

在可以按照本发明的方法转化的细胞中，作为实例，我们可以提到双子叶植物，尤其是隶属于葫芦科的双子叶植物的细胞，下文在标题为“本发明的植物”的部分中详述了葫芦科的成员。

通过杂交本发明的植物获得的杂种植物也构成本发明的部分。

优选地，其是隶属于甜瓜物种的植物的细胞或原生质体。

本发明还涉及目的核酸在产生性表型改变的转化的植物中的用途。

本发明还涉及本说明书中定义的重组载体在产生性表型改变的转化的植物中的用途。

本发明还涉及通过目的核酸转化的细胞宿主在产生性表型改变的转化的植物中的用途。

本发明还涉及包含多个上文定义的宿主细胞的转化的植物。

本发明的转化的植物

本发明还涉及转化的多细胞植物，其特征在于其包含通过至少一个上文定义的核酸，或通过包含这种核酸的重组载体转化的一个宿主细胞或多个宿主细胞。

在需要过量表达蛋白质CmWIP1的情况下，转化的植物可以包含编码蛋白质CmWIP1的核酸的多个拷贝。当我们希望获得产生雄性和雌性花的植物或产生雌性和两性花的植物时，尤其需要过量表达蛋白质CmWIP1。

在其中蛋白质ACS也过量表达(等位基因A以纯合或杂合状态存在)的本发明的两个遗传元件的组合的实施方案中，过量表达蛋白质CmWIP1的植物产生雄性和雌性花。

在其中缺乏活性蛋白质ACS的表达的本发明的两个遗传元件的组合的实施方案中，过量表达蛋白质CmWIP1的植物产生雄性和两性花。

因此，本发明还涉及其花为雄性和雌性的上文定义的转化的植物，和其花为雄性和两性的上文定义的转化的植物。

在需要过量表达蛋白质ACS的情况下，转化的植物可以包含编码蛋白质ACS的核酸的多个拷贝。当我们希望获得产生雌性花的不能自花传粉的植物时，尤其需要过量表达蛋白质ACS。

在其中蛋白质CmWIP1也过量表达(等位基因G以纯合状态存在)的本发明的两个遗传元件的组合的实施方案中，过量表达蛋白质ACS的植物产生雄性和雌性花。

在其中缺乏活性蛋白质CmWIP1的表达的本发明的两个遗传元件的组合的实施方案中，过量表达蛋白质ACS的植物产生雌性花。

因此，本发明还涉及其花为雄性和雌性的上文定义的转化的植物和其花完全为雌性的上文定义的转化的植物。

本发明的转化的植物全都以人为引入其基因组中的形式包含至少本发明的组合的第二遗传元件，其选自上文定义的核酸和调节性多核苷酸。

通过杂交本发明的转化的植物获得的杂种植物也构成本发明的部分。

本发明还涉及本说明书中定义的转化的植物的任意部分，如根，还有气生部分，如茎、叶、花和尤其是种子或果实。

本发明还涉及由上文定义的转化的植物产生的植物种子。

通常，所述转化的种子包含一个或多个在其基因组中含有上文定义的第一和第二遗传控制元件的一个或多个拷贝的细胞，该拷贝是人为引入所述双子叶植物中的，其允许以受控和诱导性方式，按需要以高水平或低水平合成蛋白质CmWIP1。

根据本发明的转化的植物的优选实施方案，目的是以受控的方式表达蛋白质CmWIP1，这意味着，转化的植物并非仅包含人为引入其细胞中，且优选引入其基因组中的一个或多个拷贝作为编码蛋白质CmWIP1的多核苷酸的功能性拷贝，而天然存在于野生植物中的编码CmWIP1的基因(G/g)的序列具有至少一个引起基因(G/g)的表达缺陷的突变。

本发明的转化的植物是双子叶植物，优选其隶属于葫芦科，且尤其是隶属于选自以下的属：

Abobra、Acanthosicyos、盒子草属(Actinostemma)、Alsomitra、Ampelosicyos、Anacaona、Apatzingania、Apodanthera、Bambekea、冬瓜属(Benincasa)、三裂瓜属(Biswarea)、假贝母属(Bolbostemma)、Brandegea、泻根属(Bryonia)、Calycophysum、泻瓜属(Cayaponia)、Cephalopentandra、Ceratosanthes、Chalema、Cionosicyos、西瓜属(Citrullus)、红瓜属(Coccinia)、Cogniauxia、Corallocarpus、Cremastopus、Ctenolepis、Cucumella、Cucumeropsis、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、Cucurbitella、辣子瓜属(Cyclanthera)、Cyclantheropsis、Dactyliandra、Dendrosicyos、Dicoelospermum、Dieterlea、毒瓜属(Diplocyclos)、Doyerea、喷瓜属(Ecballium)、刺瓜属(Echinocystis)、Echinopepon、三棱瓜属(Edgaria)、Elateriopsis、Eureiandra、Fevillea、Gerrardanthus、锥形果属(Gomphogyne)、Gurania、Guraniopsis、金瓜属(Gymnopetalum)、绞股蓝属(Gynostemma)、Halosicyos、Hanburia、Helmontia、雪胆属(Hemsleya)、波棱瓜属(Herpetospermum)、油渣果属(Hodgsonia)、Ibervillea、藏瓜属(Indofevillea)、Kedrostis、葫芦属(Lagenaria)、Lemurosicyos、丝瓜属(Luffa)、Marah、Melancium、马交儿属(Melothria)、Melothrianthus、Microsechium、苦瓜属(Momordica)、Muellerargia、帽儿瓜属(Mukia)、Myrmecosicyos、棒锤瓜属(Neoalsomitra)、Nothoalsomitra、Odosicyos、Oreosyce、Parasicyos、Penelopeia、Peponium、Peponopsis、Polyclathra、Posadaea、Praecitrullus、Pseudocyclanthera、Pseudosicydium、Psiguria、Pteropepon、Pterosicyos、Raphidiocystis、Ruthalicia、Rytidostylis、Schizocarpum、裂爪属(Schizopepon)、Sechiopsis、佛手瓜属(Sechium)、Selysia、Seyrigia、Sicana、Sicydium、棘瓜属(Sicyos)、Sicyosperma、Siolmatra、罗汉果属(Siraitia)、茅瓜属(Solena)、Tecunumania、发藤胡芦属(Telfairia)、赤瓟属(Thladiantha)、栝楼属(Trichosanthes)、Tricyclandra、Trochomeria、Trochomeriopsis、Tumamoca、Vaseyanthus、Wilbrandia、碧雷鼓属(Xerosicyos)、翅子瓜属(Zanonia)、马瓞儿属(Zehneria)、Zombitsia或史葫芦属(Zygosicyos)。

优选地，转化的植物隶属于黄瓜属，且隶属于甜瓜物种。

本发明的检测方法

本发明人的控制花型发育的系统的鉴定使得可能发展具有下文详述的主要特征的极其简单的检测植物性表型的方法。

本发明还涉及检测等位基因(G)或(g)的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使上文定义的一个核苷酸探针或多个核苷酸探针与待测试的样品接触；和

2)检测一个或多个探针和存在于样品中的核酸之间形成的任意复合物。

以上检测方法可以与PCT申请No.WO 2007/125264中所述的检测等位基因(A)或(a)的存在的方法共同使用，其包括以下步骤：

这两种检测方法使得可能选择其表型和基因型总结于表1中的植物。

可以通过本领域技术人员已知的任意技术，尤其是使用“本发明的探针和引物”部分中所述的标记的探针或引物来进行核酸和探针间的复合物的检测。

这些方法尤其有利，因为它们避免了必须栽培双子叶植物来获知其性表型。因此，有可能以更低的成本来进行大量植物样品的性表型检测。

本发明的选择方法

以上检测方法可以用于下文详述的选择方法。

本发明还涉及选择隶属于葫芦属(genus Cucurbitaceae)的植物的花型的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)例如用上文定义的核酸测定等位基因(G)和(g)在隶属于葫芦科的目的植物中的存在，和

b)阳性选择在其基因组中具有等位基因(G)或等位基因(g)的植物。

以上选择方法可以与描述于PCT申请No.WO 2007/125264中的选择隶属于葫芦属的植物的花型的方法共同使用，该方法的特征在于其包括以下步骤：

a)例如用上文定义的核酸或针对蛋白质ACS的抗体测定等位基因(A)和(a)在隶属于葫芦科的目的植物中的存在；和

b)阳性选择在其基因组中具有等位基因(A)或等位基因(a)的植物。

因此，可以有利地利用以上检测方法来对等位基因(A)、(a)、(G)和(g)的存在进行测定。

通过参考显示基因型和表型之间的对应关系的表1，本领域技术人员可以容易地组合上文定义的选择方法，以获得例如完全雌性表型或雌雄同株同花的植物。

获得本发明的转化的植物的方法

可以通过现已构成本领域技术人员的部分常识的大量方法中的任意一种来获得本发明的转化的植物。

下文描述了获得本发明的转化的植物的方法。

通过“TILLING”获得转化的植物的方法

“TILLING”(定向诱导基因组局部损伤，Targeted Induced LocalLesions IN Genomes)是基于内切核酸酶检测DNA双链中的错配和在未配对的碱基处切割DNA的能力的反向遗传学技术。此技术使得可能检测通过将植物暴露于诱变化学药品产生的单个突变点。因此，TILLING技术允许鉴定给定基因的一系列等位基因，尤其是良好地适于允许在目的靶基因中选择通过化学诱变诱导的突变的高通量筛选方法的应用。

Tilling技术为本领域技术人员公知，其尤其是由McCallum等(2000，Plant Physiology，卷123：439-442)描述。

对于本发明的需要，Tilling技术尤其良好地适于获得和选择已将第二遗传控制元件(G/g)的等位基因(g)人为引入其中的植物。

根据本发明，Tilling技术还可以成功地用来获得和选择已将第一遗传控制元件(A/a)的等位基因(a)人为引入其中的植物。

当然，从前文看开，Tilling技术适合用于获得和选择已人为将第二遗传控制元件(G/g)的等位基因(g)和第一遗传控制元件(A/a)的等位基因(a)引入其中的植物。

例如按照包括以下步骤的方法，可以用Tilling技术获得在编码蛋白质CmWIP1的基因中人为突变的双子叶植物：

a)通过化学诱变产生一群突变体双子叶植物；

b)从步骤a)中产生的突变体植物群体选择在编码蛋白质CmWIP1的基因中具有一个突变或一个以上突变的植物；

c)从步骤b)中选择的突变体植物选择表达表型(g)的植物。

在以上方法的某些实施方案中，例如用Koornbeef等(1982，MutatRes，卷93：109-123)所述的方法，通过将种子暴露于诱变剂，例如暴露于甲磺酸乙酯，由化学诱变目的双子叶植物的种子来进行步骤a)。

然后，从之前暴露于诱变剂的种子产生一群植物M1。然后使植物M1自花受精，以产生一群植物M2，其是在该方法的步骤a)中产生的突变体植物群体。

然后，在步骤b)中，从步骤a)中产生的植物群体的每一植物提取DNA，进行靶基因(此处为编码蛋白质CmWIP1的基因)核酸的扩增，并通过与未突变的靶基因序列比较来研究突变在靶基因序列中的存在。然后选择在编码靶基因(此处为编码蛋白质CmWIP1的基因)的基因序列中突变的植物。

在步骤b)的某些实施方案中，首先混合从几株植物M2，例如20株植物M2提取的DNA，并在所提取的DNA的混合物(“库”)上对靶基因序列中的突变进行检测，以减少必须进行的突变检测的步骤数。

然后用适宜的核酸引物进行通过PCR扩增靶序列的步骤，并加热产生的扩增子，然后冷却，以在来自未在靶核酸上突变的植物的原始DNA和在靶核酸上突变的植物的原始DNA之间产生DNA异源双链体。

然后，在在错配水平切割的内切核酸酶的存在下孵育DNA异源双链体。之后变性并分开经切割的异源双链体。随后例如通过电泳或通过变性条件下的HPLC(DHPLC)将分开的DNA链呈交至合适突变的检测步骤。

在步骤b)的某些实施方案中，通过例如McCallum等(2000，PlantPhysiol.，卷123：439-442)所述的变性条件下的HPLC(“DHPLC”)技术来检测靶基因中的突变。

然后，在步骤c)中，从在靶基因上突变的植物(在此情况下为在编码蛋白质CmWIP1的基因中突变的植物)选择表达与遗传控制元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型的植物。

如上文已提到，根据本发明，可以利用Tilling技术来获得转化的植物，其包含本说明书中所述的等位基因(G/g)和(A/a)的组合的任意一个。

因此，在以上方法的某些实施方案中，可能在步骤b)中选择(i)在编码蛋白质CmWIP1的基因中具有一个突变或一个以上突变的植物和(ii)在编码蛋白质ACS的基因中具有一个突变或一个以上突变的植物。

在这些特定实施方案中，然后在步骤c)中从在两个靶基因上突变的植物(即在编码蛋白质CmWIP1的基因中和编码蛋白质ACS的基因中突变的植物)选择植物，该植物表达与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型和与遗传元件(A/a)的等位基因(a)相关的表型二者。

本发明还涉及改变花型的双子叶植物，在其基因组中，已在编码蛋白质CmWIP1的基因中引入了至少一个突变。

本发明还涉及已在编码蛋白质CmWIP1的基因序列中人为突变的改变花型的双子叶植物，所述植物表达与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型。

本发明还涉及改变花型的双子叶植物，在其基因组中，(i)已在编码蛋白质CmWIP1的基因中引入了至少一个突变和(ii)已在编码蛋白质ACS的基因中引入了至少一个突变。

本发明还涉及(i)在编码蛋白质CmWIP1的基因序列中和(ii)在编码蛋白质ACS的基因序列中人为突变的改变花型的双子叶植物，所述植物表达(i)与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型和(ii)与遗传元件(G/g)的等位基因(a)相关的表型二者。

获得转化的植物的其他方法

本发明首先涉及为了将等位基因(G)插入不包含此等位基因的植物中的目的而获得转化的植物的方法。

因此，本发明涉及获得隶属于葫芦科的具有雌性花的转化的植物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)通过核苷酸序列(NG)或包含所述核酸的重组载体转化在其基因组中不具有等位基因(G)的目的植物的至少一个植物细胞；

b)选择步骤a)中获得的已将核酸(NG)整合入其基因组中的转化的细胞；

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物。

此类方法尤其有用，因为其使得可能将等位基因(G)插入植物基因组中，从而该植物将具有雌雄同株异花或雄花两性花同株表型。

本发明还涉及为了抑制植物中的等位基因(G)或用等位基因(g)取代等位基因(G)来获得雌雄同株同花表型的植物或雌性类型的植物的目的而转化植物的方法。

因此，本发明涉及用于获得隶属于葫芦科的具有两性花或雌性花的转化的植物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)在植物中用等位基因(g)取代等位基因(G)；

b)选择步骤a)中获得的已将等位基因(g)整合入其基因组中的转化的细胞；

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物；

d)杂交步骤c)中获得的植物来获得不再具有等位基因(G)的植物。

在以上方法的第一实施方案中，步骤a)包括通过上文定义的“反义”类型的核酸转化在其基因组中具有等位基因(G)的植物，并选择不再具有等位基因(G)的植物。

为了用改变结构的核酸(其不允许获得对应于等位基因(G)的表型)取代核酸(NG)的一些或全部的目的，通过利用同源重组现象可以获得相同的结果。

所述改变结构的核酸可以由调节性多核苷酸(Pg)或编码具有改变的序列的蛋白质CmWIP1的核酸组成。

因此，本发明涉及用于获得隶属于葫芦科的具有两性花的转化的植物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)通过调节性多核苷酸(Pg)或通过编码改变的蛋白质CmWIP1的核酸，或包含这种核酸的重组载体转化包含等位基因(G)的目的植物的至少一个植物细胞；

b)选择步骤a)中获得的已将调节性多核苷酸(Pg)或编码改变的蛋白质CmWIP1的核酸的一个拷贝整合入其基因组中的转化的细胞。

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物；

此类方法尤其有用，因为其使得可能获得不再包含等位基因(G)的雌雄同株同花或全雌花性型植物。

以上方法可以与PCT申请No.WO 2007/125364中所述的为了插入等位基因(A)的目的而转化植物的方法一起使用。

这种先前的方法用于获得隶属于葫芦科的具有雌性花的转化的植物，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)通过核苷酸序列(NA)或包含这种核酸的重组载体转化在其基因组中不包含等位基因(A)的目的植物的至少一个植物细胞；

b)选择步骤a)中获得的已将核酸(NA)整合入其基因组中的转化的细胞；

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物。

本发明还涉及为了用等位基因(a)取代等位基因(A)的目的而转化植物的方法。

这种先前的方法用于获得隶属于葫芦科的具有两性花的转化的植物，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)在植物中，用等位基因(a)取代等位基因(A)；

b)选择步骤a)中获得的已将等位基因(a)整合入其基因组中的转化的细胞；

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生转化的植物；

d)杂交步骤c)中获得的植物来获得不再具有等位基因(A)的植物。

因此，可以以表1为基础将以上方法彼此组合，以便获得已讨论过其产业重要性的完全雌性或完全雌雄同株同花的植物。

为了简化用于获得完全雌性或完全雌雄同株同花的植物的方法，可能在上文定义的方法中进行一个居先的步骤，在该步骤中，例如通过在野生型表型的植物群体中随机插入Mutator转座子，对天然存在于植物中的基因(A/a)和(G/g)进行突变，然后例如利用实施例中所述的核苷酸探针或引物来在所获得的突变体中检测这些突变体中基因型为(aagg)的突变体。

根据此优选实施方案，本发明的转化的植物的特征在于，其具有基因型(aagg)和全为两性(雌雄同株同花)的花。

在用于获得上文定义的转化的植物的方法的一个实施方案中，当使用多核苷酸(NG)时，其包含诱导性激活调节性多核苷酸(PG)。

因此，本发明还涉及用于获得其发育产生具有雌性花的植物的植物种子的方法，其包括以下步骤：

a)在缺乏诱导性激活多核苷酸对其敏感的诱导信号的情况下，栽培通过包含诱导性激活调节性多核苷酸(PG)的核苷酸序列(NG)，或通过包含此核酸的重组载体转化的，在其基因组中不具有本说明书中定义的等位基因(G)的目的植物；

b)使a)中定义的转化的植物与诱导性激活多核苷酸对其敏感的诱导性激活信号接触；

c)回收成熟种子，其发育完全产生具有雌性花的植物。

在另一个实施方案中，用诱导性抑制调节性多核苷酸(Pg)来取代天然存在于植物中的调节性多核苷酸，以在特定的时间降低蛋白质CmWIP1的水平。

-获得只具有雌性花的植物的优选方法

最优选地，本发明涉及获得只具有雌性花的植物的方法，其特征在于其包括：

-通过应用以上检测方法来检测等位基因(A)、(a)、(G)和(g)；和

-利用上文定义的选择方法或获得转化的植物的方法，获得包含等位基因(A)的一个拷贝而不包含等位基因(G)的拷贝的植物。

按照以上方法获得的植物只具有雌性花，因此从产业角度看尤其有意义，因为它们不能自花传粉。因此，为了获得杂种植物的目的，这些植物可以用于选择方法中。

-获得只具有两性花的植物的优选方法

最优选地，本发明涉及获得只具有两性花的植物的方法，其特征在于其包括：

-通过应用上文定义的检测方法来检测等位基因(A)、(a)、(G)和(g)；和

-利用上文定义的选择方法或获得转化的植物的方法，获得无等位基因(A)的拷贝且无等位基因(G)的拷贝的植物。

按照以上方法获得的植物只具有两性花，因此从产业角度看尤其有意义，因为它们能够自花传粉。因此，这些植物可以用于建立纯系的方法中。

转化本发明的植物的方法

最广泛用于将核酸引入植物细胞中的方法可以用于本发明的范围内。

可以通过多种方法来进行植物细胞的转化，例如，在二价阳离子(Ca²⁺)的存在下在聚乙二醇溶液中孵育植物原生质体后将前述载体转入该原生质体中、电穿孔(Fromm等1985)、粒子枪的使用、或细胞质或细胞核显微注射(Neuhaus等，1987)。

可以用在本发明的范围内的转化植物细胞的方法之一是用包含含有目的序列的载体的细菌细胞宿主感染植物细胞。细胞宿主可以是根癌农杆菌(An等1986)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)(Guerche等1987)。

优选地，通过用二元系统(Watson等，1994)转移根癌农杆菌诱导肿瘤的染色体外环状质粒Ti的T区来进行植物细胞的转化。为此，构建了两种载体。在这些载体之一中，通过缺失来去除右边缘和左边缘以外的DNA-T区，在它们之间插入选择标记，以允许植物细胞中的选择。二元系统的另一个配偶体是辅助质粒Ti，其是不再具有DNA-T但仍包含转化植物细胞所必需的毒力基因vir的修饰质粒。此质粒保持在农杆菌(Agrobacterium)中。

根据优选实施方案，shida等(1996)所述的方法可以应用于双子叶植物的转化。根据另一流程，使用钨或金粒子枪，按照Finer等(1992)所述的方法进行转化。

还通过以下实施例来说明但不限制本发明。

实施例

实施例1：遗传控制元件(G/g)的鉴定

通过在等位基因g分离的12660株植物的群体中筛选重组元件来进行基于作图的基因座g的克隆。为了分析的目的，使产生自杂交PI124112(雌雄同株异花基因型A-G-)x Gynadou(全雌花性基因型A-gg)的F1代植物与Gynadou回交以产生F2代群体。

基因座g位于染色体4上的标记M261和M365之间的间隔中(见图1A)。

为了产生该基因座的物理图谱，将标记M261和M365固定在来自雌雄同株异花基因型的基因组文库的四个不同克隆BAC中。

此间隔内的SNP分析揭示了两个非常关键的重组体，其最终使得可能将基因座g缩减至雌雄同株异花BAC克隆102中的1.4kb的区域(见图1C)。此克隆的注释使得可能在此区域中鉴定8个可读框(ORF)(见图1B)。当在具有隐性等位基因的全雌花性基因型中测序对应的区域时，未在此间隔周围的8个可读框中发现显著的多态性。

但是，在通过定位克隆定界的1.4kb的区域内发现了8kb的插入(图1B)。此插入对应于hAT家族的DNA转座子，称为Gyno-hAT(序列No.14)，是广泛存在的一组转座因子(TE)。

由于此DNA转座子是通过定位克隆在最短的间隔中发现的，且由于此转座子对应于此基因座上的雌雄同株异花和全雌花性基因型之间唯一显著的多态性，所以此转座因子(TE)非常有可能负责性决定表型。

实施例2：遗传控制元件(G/g)的表征

由于转座因子(TE)受到诱导转座抑制和不正常基因组重排抑制的外遗传抑制(“沉默”)，所以通过对内切核酸酶McrBC敏感的PCR扩增检查了基因座g上的转座子DNA的甲基化状态。

观察到该转座子是高度甲基化的(见图2)。

通过在最靠近转座子的三个可读框(ORF)上进行对内切核酸酶McrBC敏感的PCR扩增，分析了基因座g周围基因的DNA甲基化潜在程度(extension)。

此分析揭示，在具有转座子的全雌花性基因型中，只有称为ORF3的可读框(其位于距离基因座g不足1kb处)特异性甲基化(图3A)。可读框ORF3编码锌指转录因子C2H2，且与植物特有的WIP亚家族的成员(Sagasser等，2002)同源。

为了获得关于基因组序列CmWIP1的DNA甲基化谱的更精确的信息，通过对内切核酸酶McrBC敏感的定量PCR在植物PI124112(G-)和Gynadou(gg)中筛选整个基因CmWIP1(见图3B)。与雌雄同株异花基因型相比，Gynadou的基因组DNA在转录起始位点附近的启动子区中显示高度甲基化(图3B)。

DNA甲基化在全雌花性基因型的第一外显子、内含子和3′UTR序列附近也较多，但程度较低。

为了研究CmWIP1的DNA的甲基化谱，在启动子Cm WIP1的高度甲基化区域上进行亚硫酸氢盐测序。亚硫酸氢盐测序确认了全雌花性植物的过度甲基化表型。

当然，甲基化总是在基因座g上具有转座子的植物的启动子中较多，且还在胞嘧啶残基中观察到了甲基化，该胞嘧啶残基在雌雄同株异花基因型中完全不甲基化(见图3)。

然而，有趣地，在PI124112的启动子中观察到了显著的DNA甲基化。

在启动子CmWIP1中检测到显著的DNA甲基化的事实可解释转座因子(TE)在附近插入时表达抑制(“沉默”)的明显程度。在等位基因g为隐性的多个基因库中确认了Cm WIP1的过度甲基化，这增强了转座子DNA的存在和此基因更高的甲基化状态之间的相关性(图4)。

这些结果强烈地表明，在具有等位基因g的植物中，转座子引起的抑制(“沉默”)的程度引起的CmWIP1的过度甲基化可能是性决定的原因。

已将启动子区中胞嘧啶残基的过度甲基化与降低的基因表达相联系，其可导致CmWIP1转录物产生水平的降低。

实施例3：控制元件(G/g)的表达调节谱

为了测试基因CmWIP1启动子区的过度甲基化可诱导此基因的表达降低这一假设，分析了CmWIP1的mRNA的调节谱。在性决定和花发育期间，通过定量PCR测定CmWIP1的表达水平。

在PI124112(G-)的雄性花和Gynadou(gg)的雌性花中比较了转录物的相对水平。

通常，已将葫芦科中的性决定和花发育划分为从花分生组织的起始至开花的12个阶段(Bai等，2004)。性决定的过程(即不适当的性器官在最初的两性花芽中的败育)大致发生在阶段7和8。

在本实例中，已显示，基因CmWIP1在阶段6在雄性花芽中强表达，且其表达在随后的阶段中快速降低(图5)。相反，在雌性花芽中，无论在花发育的哪个阶段，都检测到CmWIP1的mRNA处于非常低的水平。值得注意的是，CmWIP1在生殖发育的早期阶段在雄性花芽中的瞬时高表达与心皮发育的败育同时发生，这描述于最近在葫芦科方面的工作中(Hao等，2003；Bai等，2004)。

为了测定Cm WIP1的mRNA的时空表达谱，进行了PI124112(G-)的雄性花和Gynadou(gg)的雌性花的原位杂交。在雄性花芽中，在花发育早期大约阶段6检测到了CmWIP1的mRNA，这与通过定量PCR分析的结果一致。

已发现，CmWIP1的mRNA的定位强烈地限制在雄性花芽的第四螺旋中。此定位对应于初级心皮，在雄性花中，其将在下一个阶段中停止发育。

在发育的任何阶段，在雌性花芽中都检测不到CmWIP1的mRNA。这些结果确认了已通过定量PCR分析在Gynadou的雌性花中揭示的非常低的表达水平(见图7)。

在两性花芽(aagg)和雌雄同株异花基因型的雌性花芽中，CmWIP1在与性决定相联系的发育阶段(直至阶段6)中的表达水平也非常低(图6)。换言之，在所有基因型中，CmWIP1在花发育的早期阶段在将发育为成熟雌性结构的花中的表达仍然低。总结起来，这些结果强烈地表明，CmWIP1在甜瓜的性决定中，尤其是在雄性花芽心皮发育的败育中起作用。

实施例4：元件(G/g)控制下的花型决定

为了更详细地研究CmWIP1在甜瓜的性决定和花发育中的作用，发展了反向遗传学途径来鉴定此蛋白质的功能。

采用了用TILLING技术(定向诱导基因组局部损伤)来筛选用甲磺酸乙酯(EMS)诱变的雌雄同株异花基因型(A-G-)群体的策略。

群体的筛选靶向CmWIP1的两个外显子。根据与相近的同源物的比对，蛋白质Cm WIP1由两个不同的结构域组成，分别是特有的N端结构域和在锌指WIP蛋白质中保守的C端结构域。

鉴定了在CmWIP1的编码序列中具有单个碱基取代的三个突变体。核苷酸取代产生以下氨基酸修饰：L77F、P193L和S306F。氨基酸取代位于CmWIP1特有的N端部分中，或位于该蛋白质的高度保守的C端结构域中。

与同一EMS家族的野生型纯合植物相比，在纯合突变体植物M2中观察了花的表型。

与野生型雄性花相比，三个突变体等位基因显示了心皮的重新发育(图7)。

突变体P193L和S306F成为全雌花性，这确认了CmWIP1是雌蕊群基因。突变体L77F是弱突变体。

来自实施例的结果显示，见于全雌花性植物中的CmWIP1的表等位基因(epiallele)清楚地是可传递的，且与表型共分离，因为通过定位克隆实验在多个基因库(见图4)和超过一万两千个配子中观察到了基因型-表型的相关性。

有趣地，且与外遗传调节一致，偶尔观察到体细胞发育期间的表型回复，且其与CmWIP1的DNA序列的脱甲基作用相关。

表明基因CmWIP1的调节涉及花的性决定的实施例的结果都是更有意义的，因为WIP型锌指蛋白质的编码基因见于包括单子叶植物、裸子植物和藓类植物的多种植物中。此外，可回顾WIP型锌指蛋白质的C端结构域是高度保守的。

因此，在花发育的早期，双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和藓类植物基因组中CmWIP1或同一家族的基因的调节在转录或转录后水平的控制是这样的，以在植物中产生受控的花型发育方向。

实施例5：遗传控制元件(A/a)的空间和时间表达

为了研究等位基因A的形式的遗传控制元件A/a的表达，用对等位基因A特异的探针在植物上，更确切而言是在基因型AA GG、aaGG、AAgg和aagg的雄性、雌性和雌雄同株同花植物的花分生组织上进行原位杂交。在花分生组织A中，表达在局部很强，在雌雄同株异花、雄花两性花同株、全雌花性和雌雄同株同花植物的雌性和两性花的心皮原基(primordia)中特异性地检测到杂交信号。参考针对黄瓜描述的花的不同发育阶段(Bai等，2004)，在甜瓜中，基因(A/a)在可以在雄性花和雌性花之间进行形态学区分之前的花分生组织发育的早期阶段表达。

在雄性和两性花中，未在花药中检测到表达。这些数据表明，等位基因(A)在雌性花的心皮中的表达阻止了雄蕊的发育。两性花中的隐性等位基因(a)具有与雌性花中的等位基因A相同的表达谱，可以从这一事实得出结论，基因A的功能依赖于其表达的组织特异性，以及所合成的蛋白质ACS的性质。

实施例6：拟南芥中的转基因

通过用农杆菌属转化拟南芥，研究了基因A/a和蛋白质ACS对不属于葫芦科的植物的花的性表型和花的结构的潜在影响。拟南芥的转基因植物具有甜瓜的等位基因A或在花结构和长角果水平显示表型(图9A和9B)。事实上，拟南芥转化体的长角果比野生拟南芥植物的长角果短，且拟南芥转化体的花的结构也严重受影响。这些结果使得可能将甜瓜基因(A/a)的用途扩展至不属于葫芦科的双子叶植物。

综上，通过克隆基因A(称为CmACS-7)和基因B(称为CmWIP1)，表明蛋白质CmWIP1在心皮中的表达抑制心皮的发育，而CmACS-7或任意其他能够产生乙烯的酶在心皮中的表达抑制雄蕊的发育。因此，本领域技术人员可以在植物，优选葫芦科成员的心皮中表达蛋白质CmWIP1来阻断心皮的发育，或相反地抑制蛋白质CmWIP1在心皮中的表达来促进心皮的发育。

本领域技术人员还可以在植物，优选葫芦科成员的心皮中表达蛋白质CmACS-7来阻断雄蕊的发育，或相反地抑制蛋白质CmACS-7在心皮中的表达来促进雄蕊的发育。因此，CmACS-7和CmWIP1的活性或突变体蛋白质的表达的组合将使得可能产生表1中所述的不同花型。

作者还已在其他物种中鉴定了CmACS-7和CmWIP1的直向同源物。在黄瓜(Cucumis sativa)中，基因座M编码CmACS-7的直向同源物。

序列表

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Claims

1.用于控制双子叶植物花型发育的两个遗传元件的组合，所述组合分别包括：

-所述显性等位基因(A)由允许序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS(氨基环丙烷羧酸合酶)表达的核酸(NA)组成，

-所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因的不同在于在所述双子叶植物中无功能的核酸(NA)，和

-所述显性等位基因(G)由允许序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWlPl(“甜瓜锌指蛋白质”)表达的核酸(NG)组成，

-所述隐性等位基因(g)与所述显性等位基因的不同在于在所述双子叶植物中无功能的核酸(NG)，其理解为至少将所述第二遗传控制元件人为引入所述双子叶植物中。

2.权利要求1的组合，其特征在于对于所述第一遗传控制元件(A/a)，所述显性等位基因(A)和所述隐性等位基因(a)各自的特征如下：

-所述显性等位基因(A)由核酸(NA)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PA)，和

(ii)其表达受所述调节性多核苷酸(PA)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.3的蛋白质ACS(氨基环丙烷羧酸合酶)，

-所述隐性等位基因(a)与所述显性等位基因(A)的不同在于：

(i)核酸(NA)不存在于所述植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pa)，或

(iii)对活性蛋白质ACS的表达无功能的核酸(Na)。

3.权利要求1和2中任一项的组合，其特征在于所述编码蛋白质ACS的核酸从5′端至3′端至少包含：

(i)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸5907至核苷酸6086的多核苷酸具有至少95％同一性的序列，

(ii)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸6181至核苷酸6467的多核苷酸具有至少95％同一性的序列，

和

(iii)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％同一性的序列。

4.权利要求1至3中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PA)包含从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列。

5.权利要求1至4中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(Pa)包含从序列SEQ ID No.2的核苷酸1至核苷酸3650的核苷酸序列。

6.权利要求1至5中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PA)和/或调节性多核苷酸(Pa)对诱导信号的作用敏感。

7.权利要求1至6中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PA)是转录或翻译的诱导性激活多核苷酸。

8.权利要求1至7中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(Pa)是转录或翻译的诱导性阻抑物多核苷酸。

9.权利要求1的组合，其特征在于所述第二遗传控制元件(G/g)，所述显性等位基因(G)和所述隐性等位基因(g)各自的特征如下：

-所述显性等位基因(G)由核酸(NG)组成，其包含：

(i)在双子叶植物中有功能的调节性多核苷酸(PG)，和

(ii)其表达受所述调节性多核苷酸(PG)调节的核酸，所述核酸编码序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWlP1(“甜瓜锌指蛋白质”)，

-所述隐性等位基因(g)与所述显性等位基因(G)的不同在于：

(i)核酸(NG)不存在于所述植物中，或

(ii)在双子叶植物中无功能的调节性多核苷酸(Pg)，或

(iii)对活性蛋白质CmWlP1的表达无功能的核酸(Ng)。

10.权利要求1至9中任一项的组合，其特征在于所述编码蛋白质CmWlPl的核酸从5′端至3′端至少包含：

11.权利要求9至10中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PG)包含核苷酸序列SEQ ID No.11。

12.权利要求9至11中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PG)和/或调节性多核苷酸(Pg)对诱导信号的作用敏感。

13.权利要求9至12中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(PG)是转录或翻译的诱导性激活多核苷酸。

14.权利要求9至12中任一项的组合，其特征在于所述调节性多核苷酸(Pg)是转录或翻译的诱导性阻抑物多核苷酸。

15.核酸，其从5′端至3′端至少包含：

(i)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸3000至核苷酸3617的多核苷酸具有至少98.5％同一性的一条序列，和

(ii)与从序列SEQ ID No.10的核苷酸5458至核苷酸5901的多核苷酸具有至少99.5％同一性的序列。

16.序列SEQ ID No.10的核酸，其为权利要求9中定义的等位基因(G)的形式。

17.核酸，其包含从序列SEQ ID No.10的核苷酸3000延伸至核苷酸5901的核苷酸序列。

18.核酸，相对于从序列SEQ ID No.10的核苷酸1至核苷酸2999的核酸，其包含具有至少一个选自突变、插入或缺失的改变的核苷酸序列，当其控制所述蛋白质的表达时，相对于受从序列SEQ ID No.10的核苷酸1至核苷酸2999的核酸控制的蛋白质CmWlP1的表达，所述改变的核酸导致序列SEQ ID No.12的蛋白质CmWlP1的改变的表达。

19.重组载体，其包含权利要求9至14的任一项中定义的核酸或权利要求15至18中任一项的核酸。

20.宿主细胞，其由权利要求9至14的任一项中定义的核酸，或由权利要求15至18中任一项的核酸，或由权利要求19的重组载体转化。

21.权利要求20的宿主细胞，其特征在于其是隶属于葫芦科植物的细胞，且优选是隶属于甜瓜物种的植物的细胞。

22.隶属于葫芦科的植物，其由权利要求9至14的任一项中定义的核酸或权利要求15至18中任一项的核酸，或由权利要求19的重组载体转化。

23.权利要求22的转化的植物，其特征在于其包含至少一个权利要求1中定义的等位基因(G)。

24.转化的植物，其包含权利要求20或21的多个宿主细胞。

25.由两种核酸转化的宿主细胞，其分别：

(i)由选自以下的核酸转化：

-权利要求1至8的任一项中定义的决定等位基因A或(a)的核酸，

-核酸，其从5′端至3′端至少包含：

(iii)与从序列SEQ ID No.1的核苷酸7046至核苷酸7915的多核苷酸具有至少95％同一性的一条序列，

-序列SEQ ID No.1的核酸，其为权利要求2中定义的等位基因(A)的形式，

-序列SEQ ID No.2的核酸，其为权利要求2中定义的等位基因(a)的形式，

-包含从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5906的核苷酸序列的核酸，

-核酸，相对于从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸，其包含具有至少一个选自突变、插入或缺失的改变的核苷酸序列，当其控制所述蛋白质的表达时，相对于受从序列SEQ ID No.1的核苷酸1至核苷酸5907的核酸控制的蛋白质ACS的表达，所述改变的核酸导致序列SEQID No.3的蛋白质ACS的改变的表达，

-包含从序列SEQ ID No.2的核苷酸1延伸至核苷酸3650的序列的核酸，

(ii)由权利要求9至14的任一项中定义的核酸，或由权利要求15至18中任一项的核酸，或由权利要求19的重组载体转化。

26.权利要求25的宿主细胞，其特征在于其是隶属于葫芦科植物的细胞，且优选是隶属于甜瓜物种的植物的细胞。

27.转化的植物，其包含权利要求25或26的多个宿主细胞。

28.核酸，其可用作与权利要求10至14的任一项中定义的核酸或权利要求15至18中任一项的核酸特异性杂交的探针或引物。

29.用于检测权利要求1中定义的定位基因(G)或(g)的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使权利要求28的一个核苷酸探针或多个核苷酸探针与待测试的样品接触；

30.用于获得在编码蛋白质CmWlP1的基因中人为突变的植物的方法，其包括以下步骤：

a)通过化学诱变产生一群突变体双子叶植物；

b)从步骤a)中产生的突变体植物的群体选择在编码蛋白质CmWlP1的基因中具有一个突变或一个以上突变的植物；

c)从步骤b)中选择的突变体植物选择表达表型(g)的植物。

31.权利要求30的方法，其特征在于还在编码蛋白质ACS的基因中突变所述植物和在于：

-在步骤b)中，选择(i)在编码蛋白质CmWlP1的基因中具有一个突变或一个以上突变和(ii)在编码蛋白质ACS的基因中具有一个突变或一个以上突变的植物，

-在步骤c)中，从在编码蛋白质CmWlP1的基因中和在编码蛋白质ACS的基因中突变的植物选择表达与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型和与遗传元件(A/a)的等位基因(a)相关的表型二者的植物。

32.已在编码蛋白质CmWlP1的基因序列中人为突变的具有改变的花型的双子叶植物，所述植物表达与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型。

33.已(i)在编码蛋白质CmWlP1的基因序列中和(ii)在编码蛋白质ACS的基因序列中人为突变的具有改变的花型的双子叶植物，所述植物表达(i)与遗传元件(G/g)的等位基因(g)相关的表型和(ii)与遗传元件(A/a)的等位基因(a)相关的表型二者。

34.用于获得隶属于葫芦科的转化的植物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)由权利要求1中定义的核苷酸序列(NG)或包含这种核酸的重组载体转化在其基因组中不包含权利要求1中定义的等位基因(G)的目的植物的至少一个植物细胞；

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生为转化的植物。

35.用于获得隶属于葫芦科的转化的植物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)在植物中，通过权利要求1中定义的等位基因(g)取代权利要求1中定义的等位基因(G)，

b)选择衍生自步骤a)中获得的已将等位基因(g)整合入其基因组中的植物的转化的细胞，

c)从步骤b)中获得的转化的细胞再生为转化的植物，

d)杂交步骤c)中获得的植物来获得不再具有权利要求1中定义的等位基因(G)的植物。