CN102164943A - 使用糖和聚乙烯亚胺保存多肽的方法 - Google Patents

Abstract

一种保存多肽的方法，包括(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述多肽的水溶液，其中所述聚乙烯亚胺的浓度以所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为25μM或更低，且所述糖的浓度或存在多于一种糖时的总糖的浓度大于0.1M；和(ii)干燥所述溶液以形成包含所述多肽的无定形固体基质。

Description

使用糖和聚乙烯亚胺保存多肽的方法

技术领域

本发明涉及保存多肽免于热降解和干燥的方法。本发明还涉及包括此保存的多肽的制品。

背景技术

一些生物分子十分地稳定，它们可在室温下分离、纯化并储存在溶液中。然而，这对涉及在低温下储存的许多材料和技术是不行的，已尝试加入稳定剂、冻干、真空干燥和风干来确保货架保存。

尽管有这些技术可用，但一些生物材料在储存期间仍显示出不令人满意的稳定性水平，且一些技术导致额外的费用且不便利。例如，冷藏运输和储存很昂贵，且温度控制中的任何间断会导致生物分子的效力降低。而且，在不断发展的世界中，冷藏运输对于国家间的药品运输通常不可行。

此外，冻干或冷冻干燥的压力对一些生物材料有伤害。生物药物的冻干涉及冷冻热敏性生物材料的溶液或悬液，随后进行一级干燥和二级干燥。此技术是基于将水在真空和零度以下温度下升华，而不经溶液的融化。冻干是制备固体蛋白和疫苗药物的关键步骤。冷冻生物材料中水蒸气的扩散率很低，因此此方法很耗时。此外，冷冻和干燥阶段均带来能使蛋白去折叠或变性的压力。

WO 90/05182描述了保护蛋白免受干燥时变性的方法。此方法包括将蛋白的水溶液与可溶性阳离子聚合电解质和环状多元醇混合，并将水从溶液中去除的步骤。虽然聚乙烯亚胺也适用，但二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)和壳聚糖是优选的聚合电解质。

WO-A-2006/0850082报道了包括糖、带电荷材料如组氨酸蛋白以及干燥或热敏性生物组分的干燥的或保存的制品。糖形成无定形固体基质。然而，如果对人或动物给药保存的生物组分，组氨酸可具有免疫后果。

WO 2008/114021描述了保存病毒颗粒的方法。此方法包括干燥一种或多种糖、聚乙烯亚胺和病毒颗粒的水溶液以形成包含病毒颗粒的无定形固体基质。水溶液包含以聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为15μM或更低浓度的聚乙烯亚胺，且糖浓度或存在多于一种糖时的总糖浓度大于0.1M。WO2008/114021公布于本申请的优先权日之后。

发明内容

现已发现与含一种、两种或更多种糖和聚乙烯亚胺(PEI)的水溶液混合的多肽制剂在干燥如冻干下保存良好。使用相对低浓度的PEI和相对高浓度的糖。所述多肽可为激素、生长因子、肽或细胞因子；抗体或其抗原结合片段；酶；或疫苗免疫原。本发明也可用于疫苗免疫原，如亚单位疫苗、缀合物疫苗或类毒素。

因此，本发明提供了用于保存多肽的方法，包括：

(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述多肽的水溶液，其中所述聚乙烯亚胺的浓度以所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为25μM或更低，且所述糖的浓度或存在多于一种糖时的总糖的浓度大于0.1M；和

(ii)干燥所述溶液以形成包含所述多肽的无定形固体基质。

本发明进一步提供了：

-包含可由本发明方法获得的保存的多肽的干粉；

-包含多肽、一种或多种糖和聚乙烯亚胺的保存的制品，其中所述制品为无定形固体形式；

-包含此干粉或保存的制品的密封瓶、安瓿或注射器；和

-赋形剂在多肽保存中的应用，所述赋形剂包括：

(a)蔗糖、水苏糖或棉子糖或它们的任何组合；和

(b)聚乙烯亚胺，其浓度以Mn计为25μM或更低，如5μM或更低。

附图说明

图1显示了从实施例1获得的结果。结果表明当使用含终浓度1.03M蔗糖、0.09M棉子糖和21nM PEI(以Mn为60,000计)的赋形剂时，保护人降钙素(hCT)免受冻干和/或热处理影响。图1显示了在对样品进行以下处理后，由ELISA测定的可检测的hCT的平均结果：

1.将降钙素重悬于PBS并冷冻

2.将降钙素重悬于PBS并冻干

3.将降钙素+糖混合物(蔗糖和棉子糖)冻干

4.将降钙素+糖混合物(蔗糖和棉子糖)冻干+加热

5.将降钙素+赋形剂(由蔗糖、棉子糖和PEI组成的保存混合物)冻干(本发明)

6.将降钙素+赋形剂(由蔗糖、棉子糖和PEI组成的保存混合物)冻干和热处理(本发明)

图2显示了从实施例2获得的结果。通过监测G-CSF刺激ERK1/2磷酸化的能力来评价针对热处理根据本发明的保存混合物(赋形剂)稳定G-CSF的能力。将HL60细胞血清饥饿24小时，并随后通过所述处理(100ng/mlG-CSF)刺激5分钟。全部细胞提取物用SDS-PAGE溶解，并随后转移至用抗磷酸化和总ERK1/2的抗体免疫标记的尼龙膜。

-板A显示：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和冻融G-CSF(与赋形剂混合并冷冻的标准G-CSF)样品。

-板B显示：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和赋形剂/HT G-CSF(与赋形剂混合并随后加热的G-CSF)样品。

-板C显示：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和G-CSF赋形剂/FD(与赋形剂混合并冻干的G-CSF)样品。

-板D显示：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和G-CSF赋形剂/FD/HT(与赋形剂混合、冻干并热处理的G-CSF)样品。

图3描述了实施例3的结果。在下述处理后，用ELISA评价抗人肿瘤坏死因子-α抗体(抗TNFα的大鼠单克隆抗体，Invitrogen目录号：SKU#RHTNFA00)的剩余活性：

1.抗hTNFα的大鼠mAb(测试)-未处理+PBS(4℃)

2.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在4℃储存。

3.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在65℃热处理24小时。

4.抗hTNFα的大鼠mAb-在65℃热处理24小时+PBS。

赋形剂包含终浓度为0.91M的蔗糖、0.125M的棉子糖和25nM PEI(以Mn为60,000计)。结果显示在抗体冻干之前，包含赋形剂能使所述抗体在显著长的时期内经受显著高水平的热刺激。

图4显示在冷冻并随后冻干过夜后，实施例4的荧光素酶在赋形剂(保存混合物)中的保存，所述赋形剂(保存混合物)包含终浓度为1.092M的蔗糖、0.0499M的棉子糖以及27nM、2.7nM或0.27nMPEI(Sigma目录号P3143，Mn 60,000)。可清楚看出，当在赋形剂存在下干燥时，可改进荧光素酶的热稳定性。

图5显示在冻干后，实施例5的β-半乳糖苷酶活性在赋形剂(保存混合物)中的保存，所述赋形剂(保存混合物)包含终浓度为0.97M的蔗糖、0.13M的棉子糖以及13μM、2.6μM、0.26μM、26nM或2.6nM PEI(Sigma目录号P3143，Mn 60,000)。此实施例清楚地表明当在赋形剂中干燥时，可显著改进的β-半乳糖苷酶的热稳定性。

图6显示实施例6的实验结果，以评价一系列赋形剂对抗人TNFα抗体提供的热稳定化作用。将在含各种浓度蔗糖(Suc)、棉子糖(Raf)和PEI的赋形剂中的抗体样品冻干并随后在45℃加热1周。

图7显示在实施例7中冻干(FD)后测定的赋形剂组成对抗TNFα抗体量的影响。描绘了HPLC峰面积。当在PBS中冻干时，未测定到抗体。当仅在糖中冻干时，损失显著量的抗TNFα抗体。当用糖和PEI冻干抗体时，测定到较多量的抗TNFα抗体。

图8描绘了实施例8的实验结果。抗TNFα抗体在1M糖(0.9M蔗糖和0.1M棉子糖)和0.0025nM PEI中冻干。

图9比较了实施例9中测试的冻干的流感血凝素(HA)与液体对照样品(液体PBS)的热稳定性。HA蛋白样品在PBS或含1M蔗糖/100mM棉子糖/16.6nM PEI(以Mn计)的赋形剂混合物中制备。随后将混合物冻干(FD)，二级干燥在-32℃和20℃间进行，以3天为周期。在冻干后，将样品中的一种在80℃下热刺激1小时(FD HT赋形剂)。

图10显示了实施例10中糖和PEI对牛血清白蛋白(BSA)冻干的荧光素酶的影响。此六部分图显示在冻干(FD)前或后加入时，糖混合物(sm)和PEI单独和一起对荧光素酶活性的影响。在分析前，将冻干样品在45℃保持2周，随后在室温下继续保持2周。显示的误差条为平均标准误差。

图11显示实施例11中所述的在糖/PEI赋形剂存在下冷冻β-gal的作用。在冻干后，与PBS相比，β-gal活性在蔗糖/棉子糖赋形剂中很高。与单独的蔗糖/棉子糖相比，13.3μM PEI以及蔗糖/棉子糖的存在进一步提高酶活性。误差条显示出平均标准误差。

图12显示了从实施例12获得的结果，实施例12使辣根过氧化物酶(HRP)样品经历冻干，随后进行2、4或6个热-冷冻循环，所述热-冷冻循环是通过将它们从-20℃冷冻器中取出，并将它们在冷冻器中再持续放置20小时前，将它们置于37℃孵育器4小时，进行2、4或6次。结果显示对于全部处理和储存条件，与仅有PBS相比，HRP活性在蔗糖、棉子糖和可选地PEI存在下保持更高。然而，在初始冻干阶段，糖以及PEI的存在显著降低HRP活性损失。

图13描述了从实施例13获得的结果。在存在和不存在赋形剂时，湿、干燥和冻干的醇氧化酶的活性显示为：

-D0至D16天：在37℃孵育(干燥和冻干的样品)；

-无MeOH：无甲醇加入(阴性对照)；

-湿：样品存储并测试而不干燥(即新制的)；

-FD：冻干；

-D：干燥的；

-G1&G2：分别根据WO 90/05182的实施例10的赋形剂混合物条件Gibson 1&2；和

-S1和S2：分别根据本发明的赋形剂混合物条件Stabilitech 1和2。

图14显示了对实施例14中重组人G-CSF诱导的HL-60细胞中磷酸化ERK1/ERK2水平的评价。G-CSF与含蔗糖、棉子糖和PEI的赋形剂混合，随后冻干(FD)并在56℃热处理(HT)。

图15显示在各种赋形剂下冻干和热刺激后，实施例15中IgM的回收率。误差条代表标准误差。

图16显示了实施例16中重组人G-CSF诱导的HL-60细胞中磷酸化ERK1/ERK2的水平。G-CSF与含蔗糖、棉子糖和PEI的赋形剂混合，随后冻干(FD)并在37℃或56℃热处理(HT)。

具体实施方式

概要

本发明涉及通过使活性剂接触保存混合物来保存活性剂。活性剂可为多肽，如激素、生长因子、肽或细胞因子；抗体或其抗原结合片段；或酶。活性剂可为疫苗免疫原，如亚单位疫苗、缀合物疫苗或类毒素。

保存混合物为PEI和一种、两种或更多种糖的水溶液。使用低浓度的PEI和相对高浓度的糖。随后将含活性剂的所得溶液干燥，以形成含此活性剂的无定形固体基质。基质在环境温度下存储稳定。如果需要给药含活性剂的水溶液，其可在使用前立即从固体基质重构。

因此，本发明能在干燥步骤和储存期间保存活性剂的结构和功能。因此，在干燥后，活性剂的生物学活性可保持。保存的活性剂表现出改进的耐热和抗干燥性，使得保存期延迟、易于储存和运输，以及避免在配送时需要低温运输系统。因此，保存混合物可提供如低温保护剂(保护免受冷冻损伤)、冻干保护剂(保护免受干燥损伤)和/或热保护剂(保护免受高于或低于4℃温度的损伤)的保护。

多肽

任何多肽适用于本发明。例如，多肽可为小于15个氨基酸如6至14个氨基酸的小肽(如催产素、环孢菌素)、15和50个氨基酸之间的较大肽(如降钙素、生长激素释放激素1-29(GHRH))、50和250个氨基酸之间长度的小蛋白(如胰岛素、人生长激素)、大于250个氨基酸长度的较大蛋白，或含两种或更多种多肽链的复合物的多亚基蛋白。多肽可为肽激素、生长因子或细胞因子。其可为抗原结合多肽、受体抑制剂、配体模拟物或受体封闭剂。通常，多肽为基本纯的形式。因此，其可为分离的多肽。例如，多肽可在重组制备后分离。

例如，多肽可为选自生长激素(GH)、催乳素(PRL)、人胎盘催乳激素(hPL)、促性腺激素(如黄体生成素、促卵泡激素)、促甲状腺激素(TSH)、阿黑皮素原(POMC)家族成员、血管加压素和催产素、利尿钠激素、甲状旁腺素(PTH)、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素和胃肠激素中的激素。

多肽可为速激肽(如P物质、肛褶蛙肽、神经激肽A、章鱼唾腺精、神经激肽B)、血管活性肠肽(如VIP(血管活性肠肽；PHM27)、PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活肽)、肽PHI 27(肽组氨酸异亮氨酸27)、GHRH 1-24(生长激素释放激素1-24)、胰高血糖素、分泌素)、胰多肽相关肽(如NPY、PYY(肽YY)、APP(禽类胰多肽)、PPY(胰多肽)、阿片肽(如阿黑皮素原(POMC)肽、脑啡肽五肽、前强啡肽原肽、降钙素肽(如降钙素、糊精、AGG01)或其它肽(如B型利尿钠肽(BNP))。

多肽可为选自表皮生长因子(EGF)家族成员、血小板源性生长因子(PDGF)家族成员、成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员、转化生长因子-β(TGF-β)家族成员、转化生长因子-α(TGF-α)、促红细胞生成素(Epo)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子(IGF-II)中的生长因子。通常，生长因子为转化生长因子β(转化生长因子-β)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF9)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、表皮生长因子(EGF)或肝细胞生长因子(HGF)。

多肽可为选自白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、干扰素-γ(INF-γ)和集落刺激因子(CSF)中的细胞因子。通常，细胞因子为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

多肽可为血液凝固因子，如因子VIII、因子V、血管性血友病因子或凝血因子III。

抗体

本发明所用的抗体可为完整抗体或其抗原结合片段。

完整抗体

在一个实施方式中，抗体为免疫球蛋白(Ig)单体、二聚体、四聚体、五聚体、或其它低聚体。每个抗体单体可包括四条多肽链(如，典型的抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成)。或者，每个抗体单体由两条多肽链组成(如重链抗体由两条相同的重链组成)。

抗体可为任何种类或同种型的抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，或任何亚类的抗体(如IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA亚类IgA1或IgA2)。通常，抗体为IgG，如IgG1、IgG2或IgG4抗体。通常，抗体为IgG1或IgG2抗体。

通常，抗体或抗原结合片段源自哺乳动物。因此，抗体可为灵长类、人类、啮齿类(如小鼠或大鼠)、兔、羊、猪、马或骆驼抗体或其抗体片段。抗体或抗体片段可源自鲨鱼。

抗体可为单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体获得自抗抗原单决定簇的基本同源的抗体群。多克隆抗体群包括抗不同表位的抗体的混合物。

抗原结合片段

抗原结合片段可为保持抗原结合能力的抗体任何片段，如Fab、F(Ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、单链Fv(scFv)、二硫化物连接的scFv、双链抗体、线性抗体、结构域抗体或多特异性抗体。此片段包括一个或多个抗原结合位点。在一个实施方式中，抗原结合片段包括四个构架区(如FR1、FR2、FR3和FR4)和三个互补决定区(如CDR1、CDR2和CDR3)。适用于检测片段与抗原结合能力的方法描述在本文中且为本领域所熟知，如免疫分析和噬菌体展示。

抗体结合片段可为单特异性、双特异性或多特异性抗体。多特异性抗体对至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或更多个不同表位或抗原具有结合特异性。双特异性抗体能够结合两个不同表位或抗原。例如，双特异性抗体可包括两对VH和VL，每个VH/VL对结合单个抗原或表位。制备双特异性抗体的方法为本领域所熟知，如包括共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对、将具有所需结合特异性的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合，或将抗体片段化学连接。

双特异性抗体“双链抗体”包括与相同多肽链中轻链可变区连接的重链可变区(VH-VL)。双链抗体可使用连接体(如肽连接体)产生，所述连接体过短而无法使相同链上两个结构域之间配对，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，且产生具有两个抗原结合位点的二聚分子。

适合的scFv抗体片段可包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽连接体，使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。

用于本发明方法中的结构域抗体可基本上由轻链可变区(如VL)或重链可变区(如VH)组成。重链可变区可源自常规四链抗体或重链抗体(如骆驼科(Camelidae)VHH)。

修饰

完整抗体或其片段可连接其它部分，如可用于将两个或更多个片段或抗体连接在一起的连接体。此连接体可为化学连接体或可与片段或完整抗体一起以融合蛋白的形式存在。因此，连接体可用于将具有相同或不同结合特异性的完整抗体或片段连接在一起。

在另一个实施方式中，抗体或抗原结合片段与其它部分如毒素、治疗药物(如化疗药)、放射性同位素、脂质体或前药活化酶连接。其它部分的类型将取决于抗体或抗原结合片段的最终用途。

抗体或抗原结合片段可结合一个或多个小分子毒素(如卡奇霉素、美登素、新月霉素(trichothene)和CC1065)或酶促活性毒素或其片段(如白喉毒素、源自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、泻果素、巴豆毒素、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素或新月霉素(tricothecenes))。

适用于连接抗体或抗原结合片段的放射性同位素包括但不限于Tc⁹⁹、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²和P³²。

抗体或抗原结合片段可连接如转化或能够将前药转化为活性抗癌药的前药活化酶。例如，碱性磷酸酶可用于将含磷酸盐(酯)的前药转化为游离药物，芳基硫酸酯酶(arylsufatase)可用于将含硫酸盐(酯)的前药转化为游离药物，胞嘧啶脱氨酶可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶；且蛋白酶如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶可用于将含肽的前药转化为游离药物。酶可为已被鉴定可用于抗癌基因治疗中大量前药代谢的硝基还原酶。或者，具有酶促活性的抗体或抗原结合片段可用于将前药转化为游离活性药。

适合的化疗药可包括但不限于烷基化剂如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、异环磷酰胺、美法仑；硝基脲如卡莫司汀和福莫司汀；抗代谢药(anti-metabolite)如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸和蝶罗呤；嘌呤类似物如氟达拉滨和硫咪嘌呤；嘧啶类似物如环胞苷、阿扎胞苷、卡莫氟和去氧氟尿苷；紫杉烷如红豆杉醇和多西他赛；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在另一个实施方式中，抗体或抗体片段可为聚乙二醇化的(PEGylated)。因此，一个或多个聚乙二醇分子可共价连接抗体分子或抗体片段分子。一至三个聚乙二醇分子可共价连接每个抗体分子或抗体片段分子。此聚乙二醇化主要用于降低抗体或抗体片段的免疫原性和/或增加抗体或抗体片段的循环半衰期。

嵌合、人源化或人抗体

在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段为包括来自不同天然抗体的序列的嵌合抗体或其片段。例如，嵌合抗体或抗原结合片段可包括与特定物种的抗体或抗体种类中对应序列相同或同源的部分重和/或轻链，而链的剩余部分与其它物种的抗体或抗体种类中对应序列相同或同源。通常，嵌合抗体或抗原结合片段包括小鼠和人抗体成分的嵌合体。

非人抗体的人源化形式为包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。适合的人源化抗体或抗原结合片段可包括如下述免疫球蛋白，其中受体的抗体或抗原结合片段的高可变区(如源自CDR)的残基被非人物种(供体的抗体)如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和性和/或容量(capacity)的非人灵长类的高可变区的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的一些构架区残基可被相应的非人残基取代。

作为人源化的另一种选择，可产生人抗体或抗原结合片段。例如，可产生下述转基因动物(如小鼠)，其在缺少内源性免疫球蛋白产生时通过免疫能够产生人抗体全部组成成分(repertoire)。例如，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链结合区(J_H)基因的纯合子缺失可导致完全抑制内源性抗体产生。可将人种系免疫球蛋白基因转移至此种系突变小鼠，以在抗原刺激下产生人抗体。人抗体或抗原结合片段也可使用噬菌体展示技术在体外产生。

标靶

能够结合任何标靶抗原的抗体或抗原结合片段适用于本发明的方法中。抗体或抗原结合片段能够结合与自免疫病(如I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩(Crohn)病和重症肌无力)、癌症或炎症状态、骨质疏松、阿尔莫茨海默症有关的抗原，或细菌或病毒抗原。

特别地，抗体或抗原结合片段可结合的标靶可为CD抗原、生长因子、生长因子受体、细胞表面受体如凋亡受体、蛋白激酶或肿瘤蛋白。因此，抗体或抗原结合片段如嵌合的、人源化的或人IgG1、IgG2或IgG4单克隆抗体或抗体片段能够结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、糖蛋白IIb/IIIa、CD33、CD52、CD20、CD11a、CD3、RSV F蛋白、HER2/neu(erbB2)受体、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、抗TRAILR2抗体(抗肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体2)、补体系统蛋白C5、α4整联蛋白或IgE。

更具体地，在抗癌单克隆抗体的内容中，抗体或抗原结合片段可为能够结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)、粘蛋白-1(MUC1/Can-Ag)、EGFR、CD20、癌胚抗原(CEA)、HER2、CD22、CD33、Lewis Y和前列腺特异性膜抗原(PMSA)的抗体或抗体片段。此外，抗体通常为嵌合的、人源化的或人IgG1、IgG2或IgG4单克隆抗体。

适合的单克隆抗体包括但不限于：英夫利西单抗(嵌合抗体、抗TNFα)、阿达木单抗(人抗体、抗TNFα)、巴利昔单抗(嵌合抗体、抗IL-2)、阿昔单抗(嵌合抗体、抗GpIIb/IIIa)、达利珠单抗(人源化抗体、抗IL-2)、吉妥单抗(人源化抗体、抗CD33)、阿仑单抗(人源化抗体、抗CD52)、依决洛单抗(鼠Ig2a、抗EpCAM)、利妥昔单抗(嵌合抗体、抗CD20)、帕利珠单抗(人源化抗体、RSV标靶)、曲妥珠单抗(人源化抗体、抗HER2/neu(erbB2)受体)、贝伐单抗(人源化抗体、抗VEGF)、西妥昔单抗(嵌合抗体、抗EGFR)、艾库组单抗(人源化抗体、抗补体系统蛋白C5)、依法珠单抗(人源化抗体、抗CD11a)、替伊莫单抗(鼠抗体、抗CD20)、莫罗莫那单抗-CD3(鼠抗体、抗T细胞CD3受体)、那他珠单抗(人源化抗体、抗α4整联蛋白)、尼妥珠单抗(人源化的IgG1、抗EGF受体)、奥马珠单抗(人源化抗体、抗IgE)、帕尼单抗(人抗体、抗EGFR)、兰尼单抗(人源化抗体、抗VEGF)、兰尼单抗(人源化抗体、抗VEGF)和I-131托西莫单抗(人源化抗体、抗CD20)。

抗体的制备

适合的单克隆抗体可通过如杂交瘤方法(如由Kohler et al Nature 256：495(1975)首次描述)、重组DNA方法和/或随后从噬菌体或其它抗体库中分离。

杂交瘤技术包括用所需免疫原免疫宿主动物(如小鼠、仓鼠或猴子)以刺激产生或能够产生特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可在体外免疫。随后，使用适合的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。

作为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的另一种选择，抗体或抗体片段也可从抗体噬菌体库中分离。特别地，噬菌体展示可用于确定用于本发明方法的抗原结合片段。通过使用用于抗原-抗体结合相互作用高通量筛选的噬菌体展示，可从噬菌体展示库中分离噬菌体外壳蛋白上展示的抗原结合片段。通过将靶抗原固定在固体支持物上，显示能够结合此抗原的抗体的噬菌体将保留在支持物上，而其它将被冲洗掉。例如在重复多轮选择或淘选后，保持结合的那些噬菌体随后可被洗脱和分离。最后选择中被洗脱的噬菌体可用于感染适合的细菌宿主，从此细菌宿主中可收集噬菌粒，且相关的DNA序列被切除和测序以确定相关的抗原结合片段。

使用本领域熟知的技术从动物中分离包含所需抗体的多克隆抗血清。通过将此抗原(免疫原)注入动物，有时在多次注射后，可使用动物如绵羊、兔或山羊来产生抗目的抗原的抗体。在收集抗血清后，可使用免疫吸附纯化或本领域已知的其它技术来纯化抗体。

本发明方法中所用的抗体或抗原结合片段可从天然存在的核苷酸序列和人工序列重组制备。这类序列可为例如：通过PCR从适合的天然存在的模板(如从细胞分离的DNA或RNA)分离、从文库(如表达文库)分离的核苷酸序列、通过(使用任何适合的已知技术，如错配PCR)向天然存在的核苷酸序列中引入突变所制备的核苷酸序列、通过使用重叠引物的PCR所制备的核苷酸序列，或通过使用DNA合成用技术所制备的核苷酸序列。也可使用如亲和力成熟(如从人工、随机或天然存在的免疫球蛋白序列起始)、CDR移植、贴面(veneering)、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段和用于工程化免疫球蛋白序列的其它技术等技术。

根据本领域技术人员熟知的技术，此类目的核苷酸序列可用于在体外或体内制备本发明用的抗体或抗原结合片段。

对于重组制备单克隆抗体或抗原结合片段，将其编码核酸分离并插入可复制的载体以用于进一步克隆或表达。载体元件通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。用于在载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞为原核细胞、酵母或高等真核细胞如大肠杆菌(E.coli)和哺乳动物细胞，如CHO细胞。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞源自多细胞生物体。宿主细胞用制备抗体用的表达或克隆载体转化，并培养在适当调整的常规营养物培养基中，以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。

当使用重组技术时，抗体可在细胞内产生或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，第一步，将宿主细胞的死细胞或裂解的细胞通过离心或超滤去除。当抗体分泌到培养基中时，将来自表达系统的上清液首先使用商购的蛋白浓缩过滤器浓缩。从细胞制备的抗体组合物可使用如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化。

纯化的抗体随后可被分离并可选地制成抗原结合片段和/或衍生化。

酶

任何蛋白酶适用于本发明。此类酶包括活性位点且能够结合底物。酶可为由一种多肽链组成的单体。或者，酶可为二聚体、四聚体或由多个多肽链组成寡聚体。二聚体、四聚体或寡聚体可分别为同型或异型二聚体、四聚体或寡聚体。例如，在提供全部生物学活性或酶功能前，酶需要形成聚集体(如二聚体、四聚体或寡聚体)。酶可为变构酶、脱辅基酶或全酶。

酶可缀合另一部分(如配体、抗体、碳水化合物、效应器分子或蛋白融合伴侣)和/或结合一个或多个辅因子(如辅酶或辅基)。

酶缀合的部分可包括凝集素、亲和素、代谢物、激素、核苷酸序列、类固醇、糖蛋白、糖脂或这些组分的任意衍生物。

辅因子包括无机化合物(如金属铁，如铁，镁、锰、钴、铜、锌、硒、钼)或有机化合物(如黄素或血红素)。适合辅酶包括核黄素、硫胺素、叶酸，其可携带由NAD或NADP⁺携带的氢负离子(H^-)，由辅酶A携带的乙酰基、由叶酸携带的甲酰基、次甲基或甲基，和由S-腺苷甲硫氨酸携带的甲基。

在另一个实施方式中，酶可为聚乙二醇化的，特别是如果酶是向患者给药的治疗性酶。因此，一个或多个聚乙二醇分子可共价结合酶分子。一至三个聚乙二醇分子可共价结合每个酶分子。此聚乙二醇化主要用于降低酶的免疫原性和/或增加酶的循环半衰期。

适合的酶包括按国际生物化学与分子生物学联盟的酶分类系统EC编号分类的任何酶，包括氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)。典型的酶是工业上使用的任何酶。

特异于任何类型底物的酶适用于本发明。适合的酶的实例包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、丝氨酸蛋白酶、内肽酶(如半胱氨酸内肽酶)、半胱天冬酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶、颗粒酶、木瓜蛋白酶、胰腺弹性蛋白酶、水稻素(oryzin)、胞浆素、肾素、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶、尿激酶、淀粉酶(如α-淀粉酶)、木聚糖酶、脂肪酶、转谷氨酰胺酶、细胞壁降解酶、葡聚糖酶(如β-葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、凝固酶、乳蛋白水解产物、细胞壁降解酶、凝血酶、裂纤酶、溶菌酶、纤维降解酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、聚合酶、蛋白酶、甘露聚糖酶或葡糖淀粉酶。

因此，根据本发明保存的酶可为用于治疗疾病或其它医学症状的治疗性酶、用于工业上生产大量产品如葡萄糖或果糖、食品加工和食品分析、洗衣和自动洗碗去污剂、织物、纸浆、纸和动物饲料工业中的酶、用作合成或精细化工、诊断应用如临床诊断、生物传感器或遗传工程中的催化剂。

可用于本发明的治疗性酶包括：

-DNA酶，如重组DNAase I，如裂解患囊肿性纤维化儿童的肺粘液中的DNA的阿法链道酶或链道酶；

-胃脂肪酶，如Meripase，其是用于治疗与外分泌胰腺脂肪酶不足有关的脂吸收不良的重组哺乳动物胃脂肪酶；

-甘露糖封端的葡糖脑苷脂酶，如伊米苷酶，其是用于治疗戈谢病(Gaucher disease)的重组甘露糖封端的葡糖脑苷脂酶，所述戈谢病是由缺乏葡糖脑苷脂酶所引起的遗传疾病；

-α-半乳糖苷酶，其用于治疗相关的糖原储存疾病，即法布里病(Fabry disease)；

-腺苷脱氨酶(ADA)，如培加酶，其用于治疗ADA缺乏，即严重的联合免疫缺陷；

-苯丙氨酸解氨酶，如聚乙二醇化的重组苯丙氨酸解氨酶Kuvan，其用于治疗苯酮尿；

-组织纤溶酶原激活物、尿激酶和链激酶，其可用于血液纤维蛋白溶解以治疗血块；

-尿酸盐氧化酶，如Elitek(拉布立酶)，其是由遗传修饰的酵母产生的，且用于治疗或预防患有白血病或淋巴瘤的患者中高尿酸血症的重组尿酸盐氧化酶；

-L-天门冬酰胺酶，其用于治疗儿童急性成淋巴细胞白血病；

-因子VIIa，由患有血友病的患者使用；

-因子IX，其用于治疗血友病B；和

-过氧化物歧化酶，如牛过氧化物歧化酶奥古蛋白，其用于治疗家族性肌萎缩侧索硬化。

用于食品应用如烘焙中的酶包括淀粉酶、木聚糖酶、氧化还原酶、脂肪酶、蛋白酶和谷氨酰胺转氨酶。用于果汁生产和水果加工中的酶包括细胞壁降解酶。用于酿酒中的酶包括淀粉糖化(mashing)中的细菌α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和葡糖淀粉酶、发酵中的真菌α-淀粉酶和后发酵中的半胱氨酸内肽酶。用于奶制品应用中的酶包括凝固酶、脂肪酶、溶菌酶、乳蛋白水解产物、谷氨酰胺转氨酶和β-半乳糖苷酶。用于去污剂组合物中的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和甘露聚糖酶。用于动物饲料中的酶包括纤维降解酶、植酸酶、蛋白酶和淀粉酶。用于纸浆和纸加工中的酶包括纤维素酶和半纤维素酶。

或者，酶可为用于研究和开发应用中的酶。例如，荧光素酶可用于细胞培养物、单个细胞和整个生物体中基因表达的实时成像。此外，荧光素酶可用作分子研究中的报告蛋白，例如以测试荧光素酶转染细胞中特定启动子的转录活性。酶也可用在药物设计中，例如用在实验室中测试酶抑制剂。此外，酶可用于生物传感器(如，使用葡萄糖氧化酶的血糖生物传感器)。

荧光素酶可为萤火虫、甲虫或苹绕实蝇(railroad worm)的荧光素酶，或其衍生物。特别地，荧光素酶可源自北美萤火虫(Phorinus pyralis)、源氏萤(Luciola cruciata)(日本萤火虫)、平家螢(Luciola lateralis)(日本萤火虫)、东欧萤火虫(Luciola mingelica)(俄罗斯萤火虫)、Beneckea hanegi(海洋细菌荧光素酶)、Pyrophorus plagiophthalamus(叩头虫)、Pyrocelia miyako(萤火虫)、Ragophthalamus ohbai(苹绕实蝇)、Pyrearinus termitilluminans(叩头虫)、Phrixothrix hirtus(苹绕实蝇)、Phrixothrix vivianii、姬螢(Hotaria parvula)和Photuris pensilvanica，以及它们的突变体。

通常，α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶源自细菌(如大肠杆菌)、哺乳动物(如人、小鼠、大鼠)或其它真核细胞。

酶可为天然存在的酶或人工酶。此酶可源自宿主动物、植物或微生物。

酶生成中用的微生物菌株可为天然菌株，或通过连续培养和选择，或使用重组DNA技术突变和选择而源自天然菌株的突变体菌株。例如，微生物可为真菌，如Thermomyces acermonium、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、脉孢属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)。酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)或毕赤酵母(Pishia pastoris)也可用于生产本发明方法中用的酶。

人工酶可使用本领域公知的蛋白质工程化技术如合理设计、定向进化和DNA改组得到。

宿主生物体可用编码所需酶的核苷酸序列转化，并在诱导酶产生并促进酶从细胞和/或培养基中回收的条件下培养。

疫苗免疫原

适用于本发明的疫苗免疫原包括疫苗的任何免疫原性组分。疫苗免疫原包括当用作针对特定疾病或医学症状的疫苗时，可引发个体免疫应答的抗原。疫苗免疫原可在疫苗制剂配制前由自身提供，或其可作为疫苗制剂的一部分提供。疫苗免疫原可为亚单位疫苗、用作疫苗的缀合物或类毒素。疫苗免疫原可为蛋白质、细菌特异性蛋白质、粘蛋白、糖蛋白、肽、脂蛋白、多糖、肽聚糖、核蛋白或融合蛋白。

疫苗免疫原可源自微生物(如细菌、病毒、真菌)、原生动物、肿瘤、恶性细胞、植物、动物、人或过敏原。疫苗免疫原优选不为病毒颗粒。因此，疫苗免疫原优选不为完整病毒或病毒粒、病毒样颗粒(VLP)或病毒核衣壳。此类病毒颗粒的保存描述在WO 2008/114021。

疫苗免疫原可为人工的，如使用重组DNA技术得到。免疫原可为疾病相关抗原，如病原体相关抗原、肿瘤相关抗原、过敏相关抗原、神经缺陷相关抗原、心血管疾病抗原、类风湿性关节炎相关抗原。

特别地，疫苗免疫原源自的病原体可包括人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(A、B和C类)、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、风疹病毒、人类T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、牛痘病毒、沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟菌属(Neisseria)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、衣原体(Clamydia)、博德特氏菌属(Bordetella)，如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、疟原虫(Plasmodium)、(Coxoplasma)、肺炎球菌(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、隐球菌(Cryptococcus)、链球菌(Streptococcus)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、耶尔森氏菌属(Yersinia)，且特别是鼠疫杆菌(Yersinia pestis)、葡萄球菌(Staphylococcus)、嗜血杆菌(Haemophilus)、白喉(Diptheria)、破伤风(Tetanus)、百日咳(Pertussis)、埃希氏菌属(Escherichia)、假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、内阿米巴属(Entamoeba)、贾第鞭毛虫属(Giardia)和锥虫属(Trypanasoma)。疫苗可进一步用于提供针对多种兽病，如口蹄疫(包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3和Asia-1)、冠状病毒、蓝舌病、猫白血病毒、禽流感、尼帕和亨德拉病毒(hendra and nipah virus)、瘟病毒、犬细小病毒和牛病毒性腹泻病毒的适合的免疫应答。

肿瘤相关抗原包括如黑素瘤相关抗原、哺乳动物癌症相关抗原、结肠直肠癌相关抗原或前列腺癌相关抗原。

过敏原相关抗原包括疫苗中适用的任何过敏原抗原，以在给药疫苗的个体中抑制过敏反应(如源自花粉、尘螨、昆虫、食物过敏原、灰尘、毒物、寄生虫的抗原)。

亚单位疫苗免疫原

适合的亚单位疫苗免疫原包括源自微生物(如病毒或细菌)的蛋白、脂蛋白或糖蛋白的任何免疫原性亚基。或者，亚单位疫苗免疫原可源自疾病相关抗原，如肿瘤相关蛋白。亚单位疫苗免疫原可为天然存在的分子或人工蛋白亚基。疫苗免疫原可为全长病毒或细菌蛋白、糖蛋白或脂蛋白，或全长病毒或细菌蛋白、糖蛋白或脂蛋白的片段。

适用作亚单位疫苗免疫原的病毒蛋白可源自结构或非结构性病毒蛋白。甚至在缺少病毒其它部分下，适合的病毒亚单位免疫原也能够刺激对象免疫系统。适合的病毒亚单位疫苗免疫原包括衣壳蛋白、表面糖蛋白、包膜蛋白、六聚体蛋白、纤维蛋白、外壳蛋白，或此类蛋白或糖蛋白的免疫原性片段或衍生物。

例如，病毒亚单位疫苗免疫原可由流感A、B或C病毒的表面蛋白组成。特别地，疫苗免疫原可为血球凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和/或PB2，或这些蛋白中任一种的免疫原性衍生物或片段。免疫原可为HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15和/或HA16，它们的任意免疫原性片段或衍生物和HA蛋白、片段或衍生物的任意组合。神经氨酸酶可为神经氨酸酶1(N1)或神经氨酸酶2(N2)。

病毒亚单位疫苗免疫原可为乙肝病毒的病毒包膜蛋白或其片段或衍生物。例如，亚单位疫苗免疫原可为乙肝表面抗原(HbsAg)或其免疫原性片段或衍生物。

通常，细菌亚单位疫苗免疫原为细菌细胞壁蛋白(如鞭毛蛋白、外膜蛋白、外表面蛋白)、多糖抗原(如来自脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia))、毒素，或此类蛋白、多糖或毒素的免疫原性片段或衍生物。

天然存在蛋白的衍生物包括具有一个或多个氨基酸添加、取代和/或删除的蛋白。此类氨基酸修饰可使用本领域已知的技术，如定点突变产生。

亚单位疫苗免疫原可为融合蛋白，其包括与如细菌或病毒蛋白或其免疫原性片段或衍生物连接的融合蛋白伴侣。适合的融合蛋白伴侣可防止融合蛋白表达后，病毒融合蛋白组装为多聚体形式。例如，融合蛋白伴侣可防止病毒样结构的形成，如果病毒蛋白在缺少融合蛋白伴侣下重组表达，此病毒样结构可自发形成。适合的融合蛋白伴侣也可有助于融合蛋白的纯化，或增强融合蛋白产物的重组表达。融合蛋白可为麦芽糖结合蛋白、能够结合金属离子的聚组氨酸片段、抗体结合的抗原、S-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、表位标签、绿色荧光蛋白、链霉亲和素或二氢叶酸还原酶。

亚单位疫苗免疫原可使用本领域公知的用于制备如分离的肽、蛋白、脂蛋白或糖蛋白的技术制备。例如，编码目的重组蛋白的基因可从病原体中鉴定并分离，且在大肠杆菌和一些其它适合大量生产蛋白的宿主中表达。随后将目的蛋白从宿主细胞中分离和纯化(如通过使用亲和层析纯化)。

在病毒亚单位免疫原的情况下，亚单位可在分离病毒颗粒后纯化，或在重组DNA克隆和在适合的宿主细胞表达病毒亚单位蛋白后纯化。用于制备病毒颗粒的适合的宿主细胞必须能够被病毒感染，且能够产生所需的病毒抗原。此宿主细胞可包括微生物、培养的动物细胞、转基因植物或昆虫幼虫。一些目的蛋白可作为可溶性蛋白由宿主细胞分泌。在病毒包膜或表面蛋白的情况中，此类蛋白需要用去污剂溶解，以将它们从病毒包膜中提取，随后通过相分离来去除去污剂。

亚单位疫苗免疫原可在相同制剂中组合，且可与一种、两种、三种或更多种其它亚单位疫苗免疫原一起保存。

类毒素

本发明可用于类毒素。类毒素为源自如病原体、动物或植物的毒素，其有免疫原性，但已被灭活(如通过遗传突变、化学处理或与其它部分接合)以消除对标靶对象的毒性。毒素可为如蛋白、脂蛋白、多糖、脂多糖或糖蛋白。因此，类毒素可为已被类毒素化的内毒素或外毒素。

类毒素可为源自破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素、肉毒杆菌毒素、艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)毒素、霍乱毒素、志贺氏菌毒素、炭疽毒素、细菌的溶细胞素或肺炎球菌溶血素和其片段或衍生物的类毒素。因此，类毒素可为破伤风类毒素、白喉类毒素或百日咳类毒素。类毒素可源自的其它毒素包括从动物如西部菱斑响尾蛇(Crotalis atrox)或植物分离的毒物。通常，类毒素源自肉毒杆菌毒素或炭疽毒素。例如，肉毒杆菌毒素可源自肉毒梭菌(Clostridium botulinum)血清型A、B、C、D、E、F或G。源自肉毒杆菌毒素的疫苗免疫原可在相同制剂中组合，且可与源自肉毒杆菌毒素的一种或多种其它疫苗免疫原(如源自肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F或G，如A、B和E的免疫原的组合)一起保存。

炭疽毒素可源自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)菌株。类毒素可由炭疽毒素的一种或多种组分或此类组分的衍生物，如保护性抗原(PA)、水肿因子(EF)和致死因子(LF)组成。通常，源自炭疽毒素的类毒素由保护性抗原(PA)组成。

类毒素可缀合另一个部分如作为融合蛋白以用作类毒素疫苗。缀合类毒素中适合的部分包括辅助类毒素(如组氨酸标签)纯化或降低对标靶对象毒性的物质。或者，类毒素可通过增加其连接抗原的免疫原性而起到佐剂的作用。例如，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的B多糖可与白喉类毒素组合。

疫苗免疫原可在相同制剂中组合，且可与一种、两种、三种或更多种疫苗免疫原一起保存。例如，白喉类毒素可与破伤风类毒素和百日咳类毒素(DPT)一起保存。白喉类毒素可仅与破伤风类毒素一起保存，或白喉类毒素可与白喉类毒素、破伤风类毒素和非细胞的百日咳(DTaP)一起保存。

用于制备类毒素的技术为本领域技术人员所熟知。毒素基因可克隆并在适合的宿主细胞中表达。毒素产物随后被纯化，并可使用如福尔马林或戊二醛化学转变为类毒素。或者，可通过添加、删除和/或取代一种或多种氨基酸将毒素基因工程化，使得其编码具有降低或无毒性的毒素。修饰的毒素可随后在适合的宿主细胞中表达并分离。毒素基因的毒性也可通过将毒素基因或其片段与其它部分(如多糖或多肽)缀合来灭活。

缀合疫苗免疫原

缀合疫苗免疫原可为抗原(如多糖或其它半抗原)和刺激与其连接抗原的免疫原性的载体部分(如肽、多肽、脂蛋白、糖蛋白、粘蛋白或其任何免疫刺激性衍生物或片段)的缀合物。例如，缀合物疫苗免疫原可为与目标免疫原(如多糖)缀合的重组蛋白、重组脂蛋白或重组糖蛋白。

缀合疫苗免疫原可用在抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，脑膜炎双球菌(meningococcus)(菌株A、B、C、X、Y和W135)或肺炎球菌菌株。例如，疫苗可为如七价肺炎球菌CRM197缀合疫苗(PCV7)、MCV-4或B型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗。

缀合疫苗免疫原可在相同制剂中组合，且可与一种、两种、三种或更多种其它缀合疫苗免疫原一起保存。

用于制备缀合多糖-蛋白缀合物的方法为本领域所熟知。例如，缀合可经由连接体(如B-丙酰氨基、硝基苯基-乙胺、卤代烷基卤化物、配糖键)发生。

保存混合物

本发明的保存混合物包括一种或多种糖和聚乙烯亚胺(PEI)的水溶液。水溶液可为缓冲液。溶液可为HEPES溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)或纯水。

适用于本发明的糖包括还原性糖，如葡萄糖、果糖、甘油、乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖；和非还原性糖，如蔗糖。糖可为单糖、二糖、三糖或其它寡糖。术语“糖”包括糖醇。

预想单糖如半乳糖和甘露糖；二糖如乳糖和麦芽糖；三糖如棉子糖，且四糖如水苏糖。海藻糖、伞形糖、毛蕊花糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽酮糖、松二糖、松三糖和蜜二糖也适用于本发明。适合的糖醇为甘露醇。

优选地，水溶液为选自蔗糖、棉子糖和水苏糖中一种、两种或三种糖的溶液。特别地，蔗糖是葡萄糖和果糖的双糖；棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖组成的三糖；且水苏糖是由两个Dα-半乳糖单元、一个Dα-葡萄糖单元和一个Dβ果糖单元顺序连接组成的四糖。优选蔗糖和水苏糖的组合，特别是蔗糖和棉子糖的组合。

当至少两种糖用在本发明的保存混合物中，生物活性的保存特别有效。因此，一种或多种糖的溶液包括至少两种、至少三种、至少四种或至少五种糖的溶液。设想2、3、4、5、6、7、8、9、10等种糖的组合。优选地，两种或更多种糖的溶液包括蔗糖和棉子糖，或蔗糖和水苏糖。

PEI是以重复化学单元-(CH₂-CH₂-NH)-为特征的脂族多胺。本文的PEI包括聚乙烯亚胺均聚物或共聚物。聚乙烯亚胺共聚物可为随机或嵌段共聚物。例如，PEI可由聚乙烯亚胺和其它聚合物如聚乙二醇(PEG)的共聚物组成。聚乙烯亚胺可为直链或支链的。

PEI也包括聚乙烯亚胺的衍生形式。聚乙烯亚胺在不同位置包含氮原子。氮原子存在于末端氨基如R-NH₂，中间的基团如中断聚合物结构内烷基或烯基基团的基团，如R-N(H)-R’，和在聚合物支链的交叉处如R-N(-R’)-R”，其中R、R’和R”可为如烯基。除了氢原子之外，或用来替代氢原子，烷基或芳基可连接氮中心。此烷基和芳基可被取代或不被取代。烷基通常为C1-C4烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。芳基通常为苯基。

PEI可为已与各种其它聚合物如聚乙二醇共价连接的聚乙烯亚胺。PEI的其它修饰形式已经产生，且一些是可商购的：支链PEI 25kDa、

PEI-SS-PEG、PEI-g-PEG、PEG-共聚-PEI、PEG-g-PEI、PEI-共聚-L乳酰胺-共聚-琥珀酰胺、PEI-共聚-N-(2-羟乙基-乙烯亚胺)、PEI-共聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、PEI-g-PCL-嵌段-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-g-葡聚糖10000和PEI-g-转铁蛋白-PEG、

-g-PEI。PEI可为全甲基化的聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺-乙烷磺酸。

PEI可在宽范围的数均分子量(Mn)内如300Da至800kDa间获得。优选地，数均分子量在300至2000Da间、500至1500Da间、1000至1500Da间、10至100kDa间、20至100kDa间、30至100kDa间、40至100kDa间、50至100kDa间、60至100kDa间、50至70kDa间或55至65kDa间。约60kDa的相对高Mn的PEI或1200Da的相对低Mn的PEI是适合的。

优选地，PEI的重均分子量(Mw)在500Da至1000kDa间。优选地，PEI的Mw在500Da至2000Da间、1000Da至1500Da间，或1至1000kDa间、100至1000kDa间、250至1000kDa间、500至1000kDa间、600至1000kDa间、750至1000kDa间、600至800kDa间、700至800kDa间。约750kDa的相对高Mw或1300Da的相对低Mw是适合的。

PEI的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)可由本领域技术人员公知的方法确定。例如，Mw可通过光散射、小角度中子散射(SANS)、X射线散射或沉降速度来确定。Mn可通过如凝胶渗透色谱、粘度计(Mark-Houwink方程)和诸如蒸汽压力osometry或端基滴定等依数的方法来确定。

各种形式的PEI是可商购的(如Sigma，Aldrich)。例如，本文所用的支链的，相对高分子量形式的PEI(约60kDa Mn和约750kDa Mw)是可商购的(Sigma P3143)。此PEI可由下式表示：

本文所用的相对低分子量形式的PEI可是可商购的(如Aldrich 482595)，其具有1300Da的Mw和1200D的Mn。

在本发明中，提供了包含PEI水溶液和一种、两种或多种糖的保存混合物。通常，活性剂与保存混合物混合以提供用于干燥的水溶液。特定活性剂所用的PEI和糖的浓度将取决于活性剂。浓度可由常规实验确定。因此，可选择产生最好溶解度的最佳PEI和糖浓度。PEI和糖可协同作用以改进溶解度。

干燥用水溶液中糖的浓度大于0.1M。优选地，干燥用水溶液中糖的浓度，或如果存在大于一种糖，干燥用水溶液中糖的总浓度为至少0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.75M、0.9M、1M或2M，最高至饱和，如在室温下饱和，或最高至3M、2.5M或2M。糖浓度，或如果存在大于一种糖，糖的总浓度可为0.5至2M。当存在大于一种糖，每种糖可以0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.75M、0.9M、1M或2M，最高至饱和，如在室温下饱和，或最高至3M、2.5M或2M的浓度存在。

干燥用水溶液中PEI的浓度以Mn计通常在20μM或更低的范围内，或优选15μM或更低的范围内。PEI浓度以Mw计可为10μM或更低。在保存生物学活性时，这种PEI浓度特别有效。

在本发明的优选实施方式中，提供的PEI以Mn计的浓度小于5μM、小于500nM、小于100nM、小于40nM、小于25nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于0.075nM、小于0.05nM、小于0.025Nm或小于0.0025nM。通常，PEI浓度以Mn计为0.0025nM或更高、0.025nM或更高，或0.1nM或更高。适合的PEI浓度以Mn计在0.0025nM至5μM间，或在0.025至200nM间。此外，优选的浓度范围在0.1nM至5μM间和0.1nM至200nM间。

优选地，以Mw计，PEI浓度小于5μM、小于1μM、小于0.1μM、小于0.01μM、小于5nM、小于4nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于0.05nM、小于0.02nM、小于0.002nM或小于0.1nM。通常，以Mw计，PEI浓度为0.00001nM或更高、0.001nM或更高，或0.01nM或更高。以Mw计，适合的PEI浓度在0.00001至20nM间，在0.0001至20nM间，或在0.0001至5nM间。

通常，发现相比于相对低分子量PEI，相对高分子量PEI在较低浓度下有效。因此：

-当使用如20至1000kDa范围内的相对高Mw PEI时，基于Mw，优选0.001至5nM的PEI浓度。当使用如300Da至10kDa范围内的相对低Mw PEI时，优选0.0001至10μM的PEI浓度。

-当使用如20至1000kDa范围内的相对高Mn PEI时，基于Mn，优选0.001至100nM的PEI浓度。当使用如1Da至10kDa范围内的相对低Mn时，使用0.0001至10μM的PEI浓度。

在一个实施方式中，初始接触活性剂的保存混合物包括以Mn计小于2μM的PEI，和浓度为至少0.1M、至少0.2M、至少0.3M、至少0.4M、至少0.5M、至少0.75M、至少0.9M、至少1M或至少2M的一种或多种糖的溶液。

当一种或多种糖的溶液包括两种或更多种糖时，PEI的最有效浓度将取决于保存混合物中所用糖的具体类型。例如，当两种或更多种糖中的一种为蔗糖且其它糖为水苏糖时，基于Mn，小于2μM浓度的PEI，特别是0.025nM至2μM浓度的PEI在保存时有效。在优选的实施方式中，本发明的方法包括将活性剂与(i)一种或多种糖的水溶液，其中这些糖中的一种为蔗糖且其它糖为水苏糖，和(ii)基于Mn，浓度小于2μM的PEI混合。

当两种或更多种糖的水溶液包括蔗糖和水苏糖的水溶液时，发现PEI的优选浓度小于2μM，或在0.0025nM至2μM的范围内。因此，在另一个实施方式中，本发明的方法包括将活性剂与(i)蔗糖和水苏糖的水溶液和(ii)浓度为0.0025nM至2μM的PEI混合。优选地，基于Mn，当使用相对高分子量如10至100kDa的PEI时，基于Mn，PEI的浓度为0.1至100nM。

当在保存混合物中使用两种糖的组合，本发明人研究了这些糖的不同摩尔浓度比例对活性剂的保存的影响。一种糖与另一种糖的特定摩尔浓度特别有效，但确切的比例取决于所用糖的类型。因此，在本发明的一个实施方式中，其中两种或更多种糖中的一种包括蔗糖，蔗糖相对于其它糖的浓度为3∶7至9∶1的摩尔浓度比例、优选至少4∶6的比例、至少50∶50的比例、至少6∶4的比例、至少7∶3的比例、至少8∶2的比例或至少9∶1的比例。在蔗糖和水苏糖的情况下，至少3∶7、至少4∶6、至少50∶50、至少6∶4、至少7∶3、至少3∶1、至少8∶2或至少9∶1的蔗糖与水苏糖的摩尔浓度比例表明特别有效的保存。优选地，两种或更多种糖的溶液包括蔗糖和水苏糖摩尔浓度比例为50∶50至8∶2的溶液。

在另一个实施方式中，本发明的保存混合物包括(i)两种或更多种糖的水溶液，其中糖中的一种为蔗糖，且蔗糖的浓度相对于其它糖为3∶7至9∶1的摩尔浓度比例，和(ii)基于Mn，浓度小于100nM或浓度在0.025至100nM间的PEI。

保存

本发明的保存技术特别针对于干燥、冷冻和/或热刺激的活性剂保存。活性剂的保存通过干燥与本发明保存混合物混合的活性剂来进行。在干燥时，形成无定形固体。“无定形”是指无结构的且不具有可观察的规则或重复的分子结构(即非晶形)。

通常，干燥通过冻干、速冻(snap-freezing)、真空干燥、喷雾干燥或喷雾冻干来进行。优选喷雾冻干，特别优选冻干。通过将水从材料中去除并将材料密封在瓶中，材料可易于储存、运输和随后重构成其初始形式。因此，活性剂可在环境温度下以适合的形式储存并运输，而无须冷冻。

冻干

冻干是通常用于保存易腐烂材料或使材料更易于运输的干燥方法。冻干是制备固体蛋白和疫苗药物的关键步骤。然而，在此过程期间，生物材料经受冷冻和干燥压力，这能够使蛋白去折叠或变性。而且，水蒸气从冷冻生物材料扩散的速率很低，因此此方法耗时。本发明的保存技术能保护生物材料免受冻干步骤的干燥和/或热压力。

此技术有三个主要阶段，称为冷冻、初级干燥和二级干燥。冷冻通常使用冻干器进行。在此步骤中，重要地是将生物材料在其共晶点下冷冻，所述共晶点是材料的固和液相可共存的最低温度。这保证在后续步骤中会发生升华而非融化。或者，无定形材料不具有共晶点，但具有临界点，在初级和二级干燥期间必须将产物保持在临界点之下以防止回熔或瓦解。

在初级干燥期间，压力降低，且向材料提供足够的热以使水升华。在此阶段，材料中约95％的水升华。初级干燥可很缓慢，因为过度的热会降解或改变生物材料的结构。为了控制压力，使用部分真空，这会加速升华。冷的冷凝器室和/或冷凝器板提供了用于水蒸气在其上再固化的表面。

在二级干燥过程中，在冷冻过程中被吸收的水分子升华。温度升高至比初级干燥阶段更高，以打破水分子和冷冻的生物材料之间已形成的物理化学相互作用。通常，也降低压力以促进升华。在完成冻干过程后，材料被密封前，通常用诸如氮气等惰性气体破坏真空。

速冻

在一个实施方式中，干燥通过冷冻混合物，如通过速干进行。术语“速冻”是指如通过将产品浸入液氮中所进行的几乎即刻冷冻。在一些实施方式中，其是指在小于1至2秒内完成的冷冻步骤。

真空干燥

在某些实施方式中，干燥使用约1300Pa下的真空干燥进行。然而，真空干燥并非本发明所必须的，且在其它实施方式中，接触多肽的保存混合物被旋转(即旋转干燥)或冻干(如下所述)。有利地是，本发明的方法进一步包括使含活性剂的保存混合物经历真空。便利地，应用20,000Pa或更低压力，优选10,000Pa或更低压力的真空。有利地是，应用至少10小时，优选16小时或更长的真空。如本领域技术人员所知，真空应用的周期将取决于样品的大小、所用的机器和其它参数。

喷雾干燥和喷雾冻干

在另一个实施方式中，干燥通过将与本发明保存混合物混合的活性剂喷雾干燥或喷雾冻干来进行。这些技术为本领域技术人员所熟知，且包括通过诸如空气、无氧气体或氮气或液氮(在喷雾冻干的情况下)干燥液体进料的方法。液体进料被雾化为雾状液滴。随后，液滴通过接触干燥室中的气体或液氮来干燥。

无定形固体基质

干燥活性剂和保存混合物的共混物以形成无定形固体基质。共混物可干燥至各种残留水分含量，以在高于冷冻温度如在约4℃至约45℃范围内，或在低于冷冻温度如在约0至-70℃或更低范围内提供长期保存。因此，无定形固体基质可具有5wt％或更低、4wt％或更低、2wt％或更低的含水量。

在本发明的一个实施方式中，无定形固体以干粉形式获得。无定形固体可采用自由流动颗粒的形式。其通常在密封瓶、小瓶或注射器中以粉末提供。如果为了吸入，粉末可在干粉吸入器中提供。或者，无定形固体基质可作为贴剂提供。

在固体支持物上干燥

在本发明的另一个实施方式中，包含活性剂的混合物在固体支持物上干燥。固体支持物包括小球、试管、基质、塑料支持物、微量滴定皿、微芯片(如硅、硅-玻璃或金芯片)或膜。在另一个实施方式中，提供了固体支持物，根据本发明保存在固体支持物上的活性剂被干燥或附着。

测量多肽保存

与诸如激素、生长因子、肽或细胞因子相关的保存是指在暴露于干燥、冷冻、温度低于0℃、低于-5℃、低于-10℃、低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃、冻干、室温、温度高于-10℃、高于-5℃、高于0℃、高于5℃、高于10℃、高于15℃、高于20℃、高于25℃或高于30℃的条件下，多肽抵抗物理或化学降解、聚集和/丧失生物活性，生物学活性例如刺激细胞生长、细胞增殖或细胞分化的能力、刺激细胞信号通路、结合激素受体或保留抗体结合用的表位的能力。多肽的保存可用很多不同方式测量。例如，多肽的物理稳定性可使用检测聚集、沉淀和/或变性的手段测量，如基于肉眼检查浊度，或肉眼检查由紫外光散射或体积排阻色谱测定的颜色和/或清晰度来确定。

多肽生物活性保存的评价将取决于所评价的生物活性的类型。例如，生长因子刺激细胞增殖的能力可使用本领域公知的大量不同技术(如监测S期细胞的细胞培养测试，或碱基类似物(如溴脱氧尿苷(BrdU))的掺入)评价，以作为细胞增殖中的变化指示。细胞增殖或细胞分化的各个方面可使用诸如免疫荧光、免疫沉淀、免疫组化等技术监测。

表位保存的评价和抗体-多肽复合物的形成可使用免疫分析如酶联免疫分析(ELISA)确定。

本发明的保存的多肽的应用

无定形形式的保存的多肽使多肽能存储较长时间，并可最大程度延迟多肽的搁置寿命。保持多肽的效力和功效。根据本发明保存的多肽的具体应用取决于多肽的性质。然而，通常多肽在使用前，多肽的水溶液从含多肽的干燥的无定形固体基质重构。

在诸如激素、生长因子、肽或细胞因子等治疗性多肽的情况下，多肽的水溶液可通过将如注射用无菌水或磷酸盐缓冲液加入至含保存多肽的干粉来重构。根据标准技术，随后对患者给药多肽的溶液。给药可为任何适合的模式，包括肠胃外、经静脉、经肌肉、经腹腔、透皮、经肺途径，或适合地，通过直接用导管灌输。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，与其它药物的共同给药、征兆迹象和医师考虑的其它因素。

通常，根据本发明保存的治疗性多肽以纯化形式与药理学上适合的载体一起使用。通常，这些载体包括水或醇/水溶液、乳液或悬液，任何包括盐和/或缓冲介质的载体。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringers右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸化的Ringers。如果需要将多肽复合物保存在悬液中，适合的生理学上可接受的辅料可选自诸如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐等增稠剂。经静脉载体包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，如含Ringers右旋糖的那些。防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在。

如上所述，根据本发明保存的其它多肽可用作诊断剂。

测量抗体或抗原结合片段的保存

与抗体或抗原结合片段相关的保存是指在暴露于干燥、冷冻、温度低于0℃、低于-5℃、低于-10℃、低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃、冻干、室温、温度高于-10℃、高于-5℃、高于0℃、高于5℃、高于10℃、高于15℃、高于20℃、高于25℃或高于30℃的条件下，抗体或抗原结合片段抵抗物理或化学降解和/或生物活性的丧失，如蛋白聚集或降解、抗原结合能力的丧失、中和标靶、刺激免疫应答、刺激效应器细胞或活化补体途径的能力的丧失。

因此，抗体或抗原结合片段的保存可通过许多不同方法测量。

例如，抗体的物理稳定性可使用检测聚集、沉淀和/或变性的手段测量，如基于肉眼检查浊度，或肉眼检查由紫外光散射或体积排阻色谱测定的颜色和/或清晰度来确定。

抗体或抗原结合片段的化学稳定性可通过检测和定量化学变形的抗体或片段来评价。例如，抗体或片段的大小变化可使用体积排阻色谱、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评价。其它类型的化学变化，包括电荷变化可使用本领域公知技术，如离子交换层析或等电聚焦来评价。

抗体或抗原结合片段的生物活性的保存也可通过测定如抗体或抗原结合片段结合抗原、引起免疫应答、中和标靶(如病原体)、刺激效应器功能(如调理、噬菌、脱粒、释放细胞因子或细胞毒素)或激活补体途径的能力来评价。用于测量此生物学功能的适合的技术为本领域所公知。例如，动物模型可用于测试抗体或抗原结合片段的生物学功能。抗原结合试验如免疫分析可用于如检测抗原结合能力。

确定抗体是否结合样品中的抗原可通过本领域任何已知方法进行，以用于检测两个蛋白部分间的结合。结合可通过测量结合发生时抗体或抗原的变化特征如光谱变化来确定。可将保存的抗体或抗原结合片段结合抗原的能力对比参比抗体(如与保存的抗体或抗原结合片段具有相同特异性，但未根据本文所述的方法保存的抗体)。

通常，用于检测抗体-抗原结合的方法在水溶液中进行。在特定实施方式中，抗体或抗原被固定在固体支持物上。通常，此支持物是进行此方法的容器的表面，如微量滴定板的孔的表面。在其它实施方式中，支持物可为板(如硝基纤维素或尼龙板)或小球(如琼脂糖或乳胶)。

在优选的实施方式中，保存的抗体样品被固定在固体支持物(如上述支持物)上。当支持物接触抗原时，抗体可结合抗原并与抗原形成复合物。可选地，随后清洗固体支持物的表面以去除任何未与抗体结合的抗原。结合在固体支持物上(通过与抗体结合)的抗原的存在可随后确定，表明抗体结合抗原。这可通过如使固体支持物(其可具有与其结合的或未与其结合的抗原)接触特异性结合抗原的试剂来完成。

通常，试剂为能够以特异性方式结合抗原的第二抗体，而此抗原与同样与自己结合的，先被固定的样品抗体结合。第二抗体可被可检测性标记直接或间接标记。第二抗体可通过接触特异于第二抗体Fc区的第三抗体被间接标记，其中此第三抗体带有可检测性标记。

可检测性标记的实例包括酶，如过氧化物酶(如辣根过氧化物酶)、磷酸酶、放射性元素、金(或其它胶体金属)或荧光标记。酶标记可使用化学发光或发色类系统检测。

在单个实施方式中，抗原被固定在固体支持物上，且保存的抗体随后接触固定的抗原。抗原-抗体复合物可使用能够结合抗原或固定的抗体的第二抗体测量。

可使用非均相免疫分析(需要去除未结合的抗体或抗原的步骤)或均相免疫分析(不需要此步骤)来测量保存的抗体或抗原结合片段结合抗原的能力。与非均相分析相反，在均相分析中，在加入全部分析组分后无需额外的流体操作，可分析候选抗体与抗原的结合相互作用。实施例包括荧光共振能量转移(FRET)和Alpha Screen。

可使用竞争性或非竞争性非均相免疫分析。例如，在竞争性免疫分析中，测试样品中未标记的保存的抗体可通过其与已知抗原结合能力的标记抗体(对照样品，如在干燥、热处理、冻干和/或存储前取样的抗体)竞争的能力来测量。两种抗体竞争结合有限量的抗原。未标记抗体结合抗原的能力与测量的标记量成反比。如果样品中的抗体能够抑制参比抗体和抗原间的结合，则这表明此抗体能够结合抗原。

适用于测量本发明保存的抗体的抗原结合能力的具体分析包括酶联免疫分析如酶联免疫吸附分析(ELISA)、均相结合分析如荧光共振能量转移(FRET)、荧光偏振免疫分析(FPIA)、微粒酶免疫分析(MEIA)、化学发光磁免疫分析(CMIA)、alpha-screen表面等离子共振(SPR)和本领域技术人员已知的用于分析抗体-抗原相互作用的其它蛋白或细胞分析。

在一个实施方式中，使用ELISA分析，使抗原接触固体支持物(如微量滴定板)，所述固体支持物的表面已包被根据本发明保存的抗体或抗原结合片段(或参比抗体，如未根据本发明的方法保存的抗体)。可选地，随后将板用缓冲液清洗以去除非特异性结合的抗体。将能够结合抗原的第二抗体应用于板，且可选地随后进行另一次清洗。第二抗体可直接或间接连接可检测的标记。例如，第二抗体可连接酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，其在有适合底物时可产生比色产物。

在单个实施方式中，固体支持物包被有抗原，且使保存的抗体或抗原结合片段接触固定的抗原。特异于抗原的抗体作为保存的抗体可用于检测抗原-抗体复合物。

在另一个实施方式中，保存的抗体和标靶的结合相互作用使用表面等离子共振(SPR)分析。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用，而无需标记任何相互作用物。BIA芯片的结合表面(结合事件的指示物)处质量的变化导致表面附件光折射率的变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)。折射率的变化产生可检测的信号，其作为生物分子间实时反应的指示物被测量。

来自SPR的信息可用于正确和定量测量平衡解离常数(D_D)和动力参数，包括用于生物分子与标靶结合的K_on和K_off。

通常，在根据本发明保存且所得产品在37℃孵育7天后，抗体形成抗体-抗原复合物的能力是此孵育前或甚至是本发明保存和此孵育前抗体形成此复合物能力的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

保存的抗体或其抗原结合片段的应用

保存的抗体或其抗原结合片段可应用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用，和体外分析和试剂应用。

在诊断应用中，可分析体液如血液、尿液、唾液、痰、胃液、其它血液流体组分、尿液或唾液或身体组织中结合保存的抗体或抗原结合片段的抗原的存在量。分析可通过本领域已知的许多常规方法如免疫分析(如RIA，ELISA)进行。

例如，可将体液样品加入到含抗体的分析混合物和用于检测抗原结合的抗体的标记系统中。通过比较使用测试样品获得的结果和使用对照样品获得的那些结果，可确定特异于特定疾病或病症的抗原的存在。在疾病或病症的诊断中，可使用此方法来定性或定量确定与特定疾病或病症相关的抗原。

其它技术可用在诊断应用中，如Western分析和通过标准免疫组化步骤的原位蛋白检测，其中可标记保存的抗体或抗原结合片段以适用于具体所用的技术。当与层析支持物如树脂复合时，保存的抗体或抗原结合片段也可用在亲和层析步骤中。

诊断应用包括医院、医生诊所和门诊部、商业参考性实验室、血库和家中的人临床测试。非人诊断应用包括食品检测、水检测、环境检测、生物防御、兽医检测和生物传感器。

保存的抗体或抗原结合片段也可用在研究应用，如药物开发、基础研究和学术研究中。最常见地，抗体用在研究应用中以鉴定和定位细胞内和细胞外蛋白。本文所述的保存的抗体或抗原结合片段可用在常规实验室技术，如流式细胞术、免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫组化、免疫荧光、ELISA或ELISPOT中。

诊断、治疗或研究应用中所用的保存的抗体或抗原结合片段可存储在固体支持物上。例如，在诊断应用中，通过干燥固体支持物(如微量滴定板、板或小球)上含患者样品的混合物和本发明的保存混合物，患者样品如体液(血液、尿液、唾液、痰、胃液等)可根据本文所述的方法保存。可随后使用如免疫分析如ELISA来检测保存的患者样品(如血清)中抗体的存在。

或者，通过干燥固体支持物上含抗体或抗原结合片段的混合物和本发明的保存混合物，目的抗体或抗原结合片段可根据本文所述的方法保存。通过使患者样品接触连接有目的抗体或抗原结合片段的固体支持物，可检测患者样品中特定抗原的存在。抗原-抗体复合物的形成可引起可测量的信号。形成的抗原-抗体复合物的存在和/或量可用于提示疾病、感染或医学病症的存在或提供预后。

对于治疗应用，本文所述的保存的抗体或抗原结合片段通常用在预防、抑制或治疗炎症状态、过敏超敏性(allergic hypersensitivity)、癌症、细菌或病毒感染和/或自免疫病(包括例如，但不限于I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病和重症肌无力)。

抗体可本身作为治疗剂，或可标靶针对特定细胞类型、组织或位置的治疗剂或其它部分。在一个实施方式中，本发明的保存的抗体或抗原结合片段缀合放射性同位素、毒素、药物(如化疗药)、酶前药或脂质体，以治疗各种疾病或病症。

测量酶保存

与酶相关的保存是指在暴露于干燥、冷冻、温度低于0℃、低于-5℃、低于-10℃、低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃、冻干、室温、温度高于-10℃、高于-5℃、高于0℃、高于5℃、高于10℃、高于15℃、高于20℃、高于25℃或高于30℃的条件下，酶抵抗物理降解和/或生物活性的丧失，如蛋白降解、催化活性降低、丧失结合底物的能力、产物产量降低、酶效率(如k_cat/K_m降低)降低或反应速率降低。酶的保存可用很多不同方式测量。例如，酶的物理稳定性可使用检测聚集、沉淀和/或变性的手段测量，如基于肉眼检查浊度，或肉眼检查由紫外光散射或体积排阻色谱测定的颜色和/或清晰度来确定。

酶催化活性的保存可使用酶分析来评价，以测定一段时间内底物的消耗或产物的产量。保存的酶的催化活性可与未根据本发明保存的具有相同特异性的参比酶比较。

反射性同位素掺入、底物荧光或化学发光、酶促反应产物或辅因子或与此底物结合的物质、产物或辅因子的变化可用于监测此分析中酶的催化活性。

例如，可使用连续的酶分析(如分光光度分析、荧光分析、量热分析、化学发光分析或光散射分析)或不连续的酶分析(如放射测量或色谱分析)。与连续分析相反，不连续分析包括在特定间隔取样酶反应，和测定这些样品中产物产量或底物消耗的量。

例如，分光光度分析包括测量产物和反应物之间吸光度的变化。此分析能够连续测量反应速率，且适用于引起吸光度变化的酶反应。分光光度分析的类型将取决于所监测的具体酶/底物反应。例如，辅酶NADH和NADPH在其还原形式下吸收UV光，但在其氧化形式下不吸收UV光。因此，使用NADH作为底物的氧化还原酶因为消耗辅酶，所以可依据UV吸光度的降低来分析。

放射测量分析包括掺入或释放放射活性，以在酶促反应一段时间内测量产物的量(需要将样品去除和计数)。适用于这些分析的放射性同位素的实例包括¹⁴C、³²P、³⁵C和¹²⁵I。当底物转化为产物，诸如质谱等技术可用于监测适合同位素的掺入或释放。

色谱分析通过色谱将反应混合物分离为其组分来测量产物形成。适合的技术包括高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱。

荧光分析使用底物与产物的荧光差异来测量酶反应。例如，还原形式可为荧光的，且氧化形式可为非荧光的。在此类氧化反应中，反应可在荧光降低后。还原反应可通过荧光的增加来监测。也可使用在酶催化反应中释放荧光染料的合成底物。

化学发光分析可用于涉及发光的酶反应。此类发光可用于检测产物形成。例如，涉及荧光素酶的酶反应包括从其底物萤光素产生光。发光可通过诸如光度计或改进的光学显微镜等光感装置检测。

本发明的保存的酶的应用

无定形形式的保存的酶使酶能存储较长时间，并可最大程度延迟酶的搁置寿命。保持酶的效力和功效。根据本发明保存的酶的具体应用取决于酶的性质。然而，通常酶在使用前，酶的水溶液从含酶的干燥的无定形固体基质重构。

例如，在治疗性酶的情况下，酶的水溶液可通过将如注射用无菌水或磷酸盐缓冲液加入至含保存的酶的干粉来重构。根据标准技术，随后对患者给药酶的溶液。给药可为任何适合的模式，包括肠胃外、经静脉、经肌肉、经腹腔、透皮、经肺途径，或适合地，通过直接用导管灌输。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，与其它药物的共同给药、征兆迹象和医师考虑的其它因素。

通常，根据本发明保存的治疗性酶以纯化形式与药理学上适合的载体一起使用。通常，这些载体包括水或醇/水溶液、乳液或悬液、任何包括盐和/或缓冲介质的载体。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringers右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸化的Ringers。如果需要将多肽复合物保存在悬液中，适合的生理学上可接受的辅料可选自诸如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐等增稠剂。经静脉载体包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，如含Ringers右旋糖的那些。防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在。

因此，根据本发明保存的酶可用作诊断剂、用于生物反应器、大量产品如葡萄糖或果糖的生产、食品加工和食品分析、洗衣和自动洗碗去污剂、织物、纸浆、纸和动物饲料工业、用作精细化工合成、临床诊断或研究应用如遗传工程中的催化剂。

测量疫苗免疫原保存

与疫苗免疫原相关的保存是指在干燥、冷冻、温度低于0℃、低于-5℃、低于-10℃、低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃、冻干、室温、温度高于-10℃、高于-5℃、高于0℃、高于5℃、高于10℃、高于15℃、高于20℃、高于25℃或高于30℃的条件下，疫苗免疫原抵抗物理或化学降解和/或生物活性的丧失，例如蛋白降解、丧失刺激细胞或体液免疫应答的能力，或丧失刺激抗体产生或结合抗体的能力。

疫苗免疫原的保存可用很多不同方式测量。例如，免疫原性可通过测量疫苗免疫原结合免疫原特异性抗体的能力来评价。这可在本领域已知的检测针对疫苗免疫原的抗体的各种免疫分析中测试。通常，对抗体的免疫分析将包括选择和制备测试样品，如保存的疫苗免疫原的样品(或未根据本发明方法保存的疫苗免疫原的参比样品)，并随后在可形成抗原-抗体复合物的条件下，用特异于目的免疫原的抗血清孵育。

此外，流感血凝素和神经氨酸酶的抗体可在血凝素抑制和神经氨酸酶抑制测试、使用红血球的凝集测试中或使用单向免疫扩散按常规方法分析。SRD是基于支持琼脂糖凝胶基质中抗原和其同源抗体间可见反应的形成。病毒免疫原加入到凝胶中，且使同源抗体从应用的点径向扩散通过固定的免疫原。可测量的乳白色区由所得的抗原-抗体复合物产生。

保存的疫苗免疫原的应用

本发明的保存的疫苗免疫原用作疫苗。例如，保存的亚单位疫苗免疫原、缀合物疫苗免疫原或类毒素免疫原分别适合用作亚单位、缀合物或类毒素疫苗。作为疫苗，本发明的保存的疫苗免疫原可用于治疗或预防大量病症，包括但不限于病毒感染，病毒感染的结局包括但不限于病毒、动物或昆虫诱导的中毒、癌症和过敏。此类抗原包含将刺激宿主免疫系统产生体液和/或细胞型抗原特异性应答的一种或多种表位。

本发明保存的疫苗免疫原可用作预防或治疗病毒感染中的疫苗，所述病毒例如人类乳头状瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(A、B和C型)、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺瓦克病毒、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、风疹病毒、人类T细胞淋巴瘤病毒I型(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)丁型肝炎病毒、痘病毒和牛痘病毒。疫苗可进一步用于提供针对多种兽病，如口蹄疫(包括血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3和Asia-1)、冠状病毒、蓝舌病、猫白血病毒、禽流感、尼帕和亨德拉病毒(hendra and nipah virus)、瘟病毒、犬细小病毒和牛病毒性腹泻病毒的适合的免疫应答。或者，疫苗可用于提供针对动物或昆虫诱导毒性(如由蛇毒液或其它动物毒物诱导)的适合的免疫应答。在一个实施方式中，疫苗为多价疫苗。

本发明的疫苗组合物包括与含一种或多种糖和PEI的本发明保存混合物混合的疫苗免疫原。疫苗组合物可进一步适合的缓冲液和添加剂，如抗生素、佐剂或增强疫苗免疫原对免疫系统特定细胞呈递的其它分子。

可使用本领域熟知的各种佐剂，以增加疫苗的功效和/或调节体液和细胞免疫应答。适合的佐剂包括但不限于含水包油乳液的佐剂或油包水佐剂，如矿物油、含铝的佐剂、含角鲨烯/磷酸盐的佐剂、完全/不完全弗氏佐剂、细胞因子、免疫刺激复合物(ISCOM)和起到增强疫苗功效的免疫刺激剂作用的任何其它物质。含铝的佐剂包括磷酸铝和氢氧化铝。ISCOM可包括胆固醇、脂质和/或皂苷。ISCOM可诱导大范围的系统性免疫应答。

本发明的疫苗组合物可为冻干(冷冻干燥)形式，以提供适合的储存和最大程度延迟制剂的搁置寿命。这使得疫苗能长时间储存且有助于保持免疫原性、效力和功效。本发明的保存混合物特别适用于保存病毒物质以在冻干/冷冻干燥方法中遇到的抵抗干燥和热胁迫。因此，保存混合物适合在收集之后且样品经历冻干步骤之前立即加入到疫苗免疫原中。

为了测量根据本发明制备的疫苗的保存，疫苗的效力可使用本领域熟知的技术测量。例如，可在适合的动物模型中，通过监测针对疫苗的抗体的生成或免疫细胞应答，测定细胞和体液免疫应答的产生。可将根据本发明方法制备的疫苗样品诱导免疫应答的能力与未经历相同保存技术的疫苗进行比较。

以下实施例说明本发明。

实施例1-稳定降钙素

1.样品制备

小瓶干燥hCT(人降钙素)的获得自Sigma(编号T3535)，并在实验前使用生产商指明的质量含量在PBS中复原为终浓度3μg/μl。

按4份1.82M蔗糖溶液∶1份0.75M棉子糖∶1份PEI(PEI浓度以Mn计为150nM)制备蔗糖和棉子糖(糖混合物)和PEI(Sigma目录号：P3143-50w/v％水溶液；M_n 60,000)的水溶液。将50μl等分试样的赋形剂加入3μlhCT中，并用PBS将体积调至60μl。糖和PEI的终浓度为：

-蔗糖：1.03M

-棉子糖：0.09M

-PEI：21nM(以M_n为60,000计)

对于对照，使用PBS替换赋形剂。制备如下多种60μl等分试样用于测试：

1.将降钙素重悬于PBS并冷冻

2.将降钙素重悬于PBS并冻干

3.降钙素+糖混合物，冻干

4.降钙素+糖混合物，冻干+加热(45℃持续16小时)

5.降钙素+赋形剂，冻干(本发明)

6.降钙素+赋形剂，冻干和热处理(45℃持续16小时)(本发明)

将60μl等分试样分装入单个玻璃瓶中(Adelphi Glass)，并冷冻或冻干。将瓶在Modulyo D冻干器中冻干(Thermo-Fisher)。更具体地，将其中部分塞有橡皮塞的瓶在-80℃下在含30ml水的冻干器盘中冷冻。将冷冻的瓶转移至预冷冻干器的冻干器制动架并干燥16小时。在从冻干器移出前，将橡皮塞在真空下完全塞入瓶中。

随后将冷冻和冻干样品组的瓶存储在-20℃下或进行热激。随后，使用无菌ddH₂O(双蒸水)将干燥的样品重构至其初始的60μl体积。50μl的各个溶液随后用于每个梯度的第一次稀释。

2.ELISA方法

NUNC ELISA板(MaxiSorp^TM Surface)在室温下用以1∶2000在PBS中稀释的100μl纯化的兔抗人降钙素单克隆抗体(Abcam，编号ab8553)包被2小时。在4℃下用100μl封闭液(5％蔗糖、5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液；新配制)封闭过夜前，将孔用PBS清洗一次。随后将板用PBS清洗3次。

在稀释梯度的制备中，向每孔中加入50μl PBS。随后将按上述“样品制备”制备的0.15ug/ml hCT样品以50μl等分试样加入到每个稀释梯度的第一个孔中，以得到0.075ug/ul的初始浓度，且每个梯度依次稀释2倍。从每个梯度的最后稀释点去除50μl溶液，使得全部孔包含50μl。随后将板在室温下孵育2小时，并用PBS清洗3次。

随后加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体。将以1∶2000在PBS中稀释的100μl纯化的单克隆HRP-缀合的小鼠抗hCT抗体(Abcam，编号ab11484)加入到每个孔中，并在室温下孵育2小时。随后，将孔用含0.05％吐温20的100μl PBS清洗一次并随后用PBS清洗5次。

随后量化结合的活性hCT。在黑暗中孵育30分钟前，向每个孔中加入100μl新配制的比色试剂混合物(TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)和H₂O₂)。随后，将板在450nm下用自动读板器读取，并将光密度(OD)值以Excel输出。

3.结果和讨论

图1总结了结果。图1显示了在对上述样品进行较长时间热激后，由ELISA测定的可检测的hCT(使用450nm波长下的OD)的平均结果。可清楚地看出当使用1.03M蔗糖、0.09M棉子糖和21nM PEI(以Mn计)的赋形剂时，冻干样品的稳定性显著改进。令人感兴趣地，与未经历冻干或热激而经历第二次冷冻的阳性对照相比，糖和PEI的组合基本保护冻干样品。

实施例2-人重组G-CSF的保存

1.材料和方法

材料

磷酸化特异性ERK1/2的抗体购自Sigma(Dorset，UK)，抗ERK 2抗体购自(Zymed UK)。PEI(Mn 60,000；Sigma目录号：P3143)、蔗糖(Sigma)、棉子糖(Fluka)、PBS(Sigma)、玻璃瓶(Adelphi glass)、橡皮塞(Adelphi glass)和G-CSF(Sigma)。

样品制备

将G-CSF冻干样品重构为10μg/ml浓度。将160μl蔗糖(1.82M)和40μl棉子糖(0.75M)与50μl PEI(150nM浓度，以Mn计)混合以完成保存混合物。加入50μl重构的G-CSF溶液并充分混合。糖和PEI的终浓度为：

-蔗糖：0.91M

-棉子糖：0.125M

-PEI：25nM(以M_n计)

将最终混合物的100μl等分试样分装入单个瓶中、冷冻或冻干。按实施例1所述，冻干过夜。随后将冷冻和冻干样品组的样品存储在-20℃下或在37℃加热2小时。在孵育后，使用前将样品在RPMI中重构。

组织培养

HL60细胞(无支原体)保存在添加有10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的含酚红的RPMI 1640中将细胞每周传代，并每隔2-3天更换培养基。

细胞刺激试验

对于刺激试验，将HL60细胞收集并以每孔5×10⁵的密度转移至6孔板的无血清培养基中。在24小时后，将细胞用图2(100ng/ml G-CSF)所示且如下所述的处理刺激5分钟：

-图2板A：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和冻融G-CSF(与赋形剂混合并冷冻的标准G-CSF)样品。

-图2板B：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和赋形剂/HT G-CSF(与赋形剂混合并随后加热的G-CSF)样品。

-图2板C：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和G-CSF赋形剂/FD(与赋形剂混合并冻干的G-CSF)样品。

-图2板D：对照(血清饥饿+PBS)，UT G-CSF(未处理的G-CSF)和G-CSF赋形剂/FD/HT(与赋形剂混合、冻干并热处理的G-CSF)样品。

全部细胞提取物用SDS-PAGE溶解，并随后转移至用抗磷酸化和总ERK1/2的抗体免疫标记的尼龙膜。

用于免疫印迹的全部细胞提取物的制备

将细胞悬浮物收集(1000rpm持续5分钟)并用冰冷的PBS清洗。随后，将粒状细胞用提取缓冲液裂解(1％(v/v)Triton X100、10mM Tris-HCl，pH7.4、5mM EDTA、50mM NaCl、50mM氟化钠、2mM Na₃VO₄和1片CompleteTM抑制剂混合物(Boehringer)，以每10ml缓冲液计)，并通过26-规格针头匀浆6次。

将溶解产物在冰浴10分钟，随后离心澄清(4℃，14,000rpm持续10分钟)。蛋白浓度使用BSA试剂(Biorad，Inc.)定量。将等量的蛋白(50mg)用SDS-PAGE(10％凝胶)溶解并进行免疫印迹分析。抗原-抗体相互作用使用ECL(Pierce，UK)检测。

2.结果

结果显示在图2中。在血清饥饿条件下，70-80％的细胞停滞在G0。磷酸化ERK1/2水平的评价显示与预期一样，血清饥饿的载体处理的对照中表达受限。G-CSF(天然)显示增强磷酸化，而对总ERK1/2水平无任何影响。此外：

-如图2A所示，与保存混合物(赋形剂)混合的G-CSF显示出与天然G-CSF类似的图。

-与未处理的G-CSF相比，对将G-CSF与赋形剂混合随后进行热处理的作用的评价表明活性显出降低(图2B)。

-与未处理的G-CSF形式相比，将G-CSF与赋形剂组合随后进行冻干显示出保持G-CSF效力(图2C)。

-特别注意到赋形剂结合冻干显示出保护G-CSF免受热灭活(将图2D和图2B比较)。

实施例3-抗TNFα抗体的稳定化

1.实验概述

制备以下抗人人肿瘤坏死因子-α抗体的样品(抗TNFα大鼠单克隆抗体，Invitrogen目录号：SKU#RHTNFA00)，并在下述处理后，用ELISA试验通过它们保留的结合hTNFα的正常功能活性评价它们的保存：

1.抗hTNFα的大鼠mAb(测试)-未处理+PBS(4℃)(对照)

2.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在4℃储存

3.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在65℃热处理24小时

4.抗hTNFα的大鼠mAb-在65℃热处理24小时+PBS

赋形剂包含终浓度为0.91M的蔗糖、0.125M的棉子糖和25nM PEI(M_n为60,000)。将ELISA板(NUNC ELISA板(MaxiSorp^TM))用抗hTNFα的大鼠单克隆抗体(大鼠hTNFαmAb)包被。将hTNFα加入板中并使其结合包被的板。结合的hTNFα用生物素化的多克隆大鼠抗hTNFα抗体检测，随后在比色反应中通过加入100μl TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和过氧化氢)使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物显示。

在黑暗中孵育30分钟后，通过加入50μl 1N盐酸来终止反应。随后，ELISA板在450nm下用ELISA读数器(Synergy HT)读取。结果绘制为Excel。

2.方法

材料

NUNC ELISA板(MaxiSorp^TM)。抗hTNFα的大鼠mAb(目录号：SKU#RHTNFA00，Invitrogen，200μg/ml)。抗hTNFα检测试剂盒(

EIA，测定设计，目录号：900-099)

赋形剂制备

赋形剂通过将160μl蔗糖(1.82M)、40μl棉子糖(0.75M)和50μl PEI(150nM浓度，以Mn 60,000计)混合来制备。

用于冻干(FD)的样品的制备

制备以下样品，并在所述一段时间后在ELISA测试中测定。

1.抗hTNFα的大鼠mAb(测试)-未处理+PBS(4℃)(对照)

2.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在4℃储存

3.抗hTNFα的大鼠mAb-冻干+赋形剂并在65℃热处理24小时

4.抗hTNFα的大鼠mAb-在65℃热处理24小时+PBS

将50μl未稀释的抗TNFα抗体(大鼠mAb)加入到250μl上述赋形剂中。赋形剂混合物中每种组分的终浓度为0.91M蔗糖、0.125M棉子糖和25nM PEI(以Mn为60,000计)。将100μl等分试样加入冻干瓶中并用VirTis冻干器处理。

在样品冻干后，将瓶储存在4℃或热处理不同时间，并在试验前在PBS(333μl/100μl FD等分试样)中重构。

将50μl对照(以上样品1)大鼠mAb(用PBS以1∶20稀释)和50μl各重构溶液涂布到ELISA板上，4℃下过夜。剩余测试根据生产商说明进行(

EIA，测定设计，目录号：900-099)。

ELISA的建立

将ELISA板用50μl(1∶20稀释)纯化的抗hTNFα大鼠mAb涂布并在4℃孵育过夜(o/n)。

人TNFα标准物根据生产商说明(起始浓度1000pg/ml)制备，并一式两份分配在板上。

根据商购试剂盒(如上的

EIA)说明，分配抗hTNFα的兔多克隆抗体、链酶亲和素缀合的辣根过氧化物酶、TMB底物和终止液。简单地说，在每次孵育步骤后，在加入下一种试剂并在37℃孵育60分钟前，进行4次清洗。在加入终止液后，将板在450nm读数。空白孔(包被有抗hTNFα的大鼠mAb，但未加入重组hTNFα)作为平行对照。

试剂盒的预包被的ELISA条带作为平行的阳性对照，以确定商购试剂盒的全部所用试剂有效(数据未显示)。

3.结果

按照以上处理，ELISA能使我们评价剩余抗体活性的水平。结果显示在图3中。

显然，在抗体冻干之前，包含赋形剂能使所述抗体在显著长的时期内经受显著高水平的热刺激。在PBS中稀释并经历热刺激的抗体在相同时间段内丧失大于40％的效力。

实施例4-荧光素酶的保存

全部溶液在5ml玻璃瓶(Adelphi Glass)中制备。加入180μl蔗糖(1.82M，Sigma)和20μl水苏糖(0.75M，Sigma)，得到总体积200μl的糖混合物。随后加入50μl各种浓度的PEI(Sigma目录号P3143，Mn 60,000)以得到保存混合物。最后，加入50μl 0.1mg/ml的荧光素酶(Promega)或50μl的磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma)，并将混合物涡旋。PEI和糖的终浓度为：

-PEI：21nM、2.7nM或0.27nM

-蔗糖：1.092M，和

-水苏糖：0.0499M。

也设定含300μl PBS的对照。全部瓶都设定为一式三份。

将瓶在Modulyo D冻干器中冻干(ThermoFisher)。更具体地，将其中部分塞有橡皮塞的瓶在-80℃下在含30ml水的冻干器盘中冷冻。将冷冻的瓶转移至预冷冻干器的冻干器制动架并干燥16小时。在从冻干器移出前，将橡皮塞在真空下完全塞入瓶中。

瓶中包含自由流动的冻干粉末。粉末通过加入1ml PBS来重构。将100μl各种所得溶液转移至96孔板。根据生产商说明，将荧光素酶分析试剂加入各个孔中，并在Synergy 2光度计上读取发光值。

结果显示在图4中。使用PRISM Graphpad软件(版本4.00)进行学生T检验，以分析不同赋形剂之间的显著性。P值总结为^*p＜0.10；^**p＜0.05；^***p＜0.005。

实施例5-β-半乳糖苷酶的保存

全部溶液在5ml玻璃瓶(Adelphi Glass)中制备。加入160μl蔗糖(1.82M，Sigma)和40μl棉子糖(1M，Sigma)，得到总体积200μl的糖混合物。随后加入50μl各种浓度的PEI(Sigma目录号P3143，Mn 60,000)以得到保存混合物。最后，加入50μl β-半乳糖苷酶(100单位/ml，Sigma)或50μl的磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma)，并将混合物涡旋。PEI和糖的终浓度为：

-PEI：13μM、2.6μM、0.26μM、26nM或2.6nM

-蔗糖：0.97M，和

-棉子糖：0.13M。

为了评价没有糖时PEI的作用，将50μl PEI加入250μl PBS中。也建立含300μl PBS的对照。全部瓶一式三份建立。

将瓶在Modulyo D冻干器中冻干(ThermoFisher)。更具体地，将其中部分塞有橡皮塞的瓶在-80℃下在含30ml水的冻干器盘中冷冻。将冷冻的瓶转移至预冷冻干器的冻干器制动架并干燥16小时。在从冻干器移出前，将橡皮塞在真空下完全塞入瓶中。

瓶包含自由流动的冻干粉末。粉末通过加入1ml PBS来重构。将100μl各种所得溶液转移至96孔板。β-半乳糖苷酶活性使用X-gal作为底物分析。

结果显示在图5中。使用PRISM Graphpad软件(版本4.00)进行学生T检验，以分析不同赋形剂之间的显著性。P值总结为^*p＜0.10；^**p＜0.05；^***p＜0.005。

实施例6-抗TNFα抗体的稳定化

1.材料

L929细胞(ECCAC 85011426)

PEI(Sigma P3143，批号127K0110，Mn 60,000)

蔗糖(Suc，Sigma 16104，批号70040)

棉子糖(Raf，Sigma R0250，批号039K0016)

磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma D8662，批号118K2339)

水(Sigma W3500，批号8M0411)

溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)

抗人TNFα的纯化抗体(Invitrogen RHTNFAOO，批号555790A和477758B)。制备每ml PBS 200μg的储备液，并存储在2-8℃下。

5ml玻璃瓶(Adelphi Tubes VCD005)

14mm冻干塞子(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)

14mm盖(Adelphi Tubes CWPP14)

总回收HPLC瓶(Waters 18600384C，批号0384691830)

2.方法

样品的制备

根据表1所列的组分，用PBS配制赋形剂。PEI浓度以Mn计。随后，将250μl各种赋形剂混合物和10μg抗TNFα抗体的50μl PBS溶液置于具有适当标签的5ml玻璃瓶中，并涡旋。在涡旋后，将瓶转移至VirTis Advantage冻干器的制动架(Biopharma Process Systems)。在冻干前，瓶中蔗糖、棉子糖和PEI的终浓度显示在表1中。

将样品用VirTis Advantage冻干器冻干约3天。在进行真空前(初始为200毫托)，将样品在-40℃下冷冻1小时。架子温度和真空通过此方法调节，且将冷凝器保持在-40℃。延长步骤8，直到在停止真空前塞好样品。所用的干燥循环显示如下：

在冻干后，将玻璃瓶在真空下塞紧，并转移至MaxQ 4450孵育器(Thermo Scientific)以在45℃下热激1周。在孵育后，制备用于L929分析的样品。具体地，将样品在无菌蒸馏水中重构。

用于评价TNFα中和的L929试验

抗体活性使用抗TNFα中和试验来测量。为此，使用L929细胞(小鼠C3H/An结缔组织)。3.5×10⁵细胞/ml的悬液在含2％FBS的RPMI中制备，向96孔板的每个孔中加入100μl细胞悬液，并在37℃和5％CO₂下孵育过夜。在单个96孔板中，通过向每个孔中加入50μl含2％FBS的RPMI，建立重组TNFα的中和。将50μl的10μg/ml浓度的对照大鼠抗人TNFα抗体(Caltag)加入到3-12列。

进行1∶2的稀释。将50μl重组人TNFα(Invitrogen)加入到2-12的孔列中。所得的抗体细胞因子混合物在37℃下孵育2小时。在孵育后，将每孔50μl的抗体细胞因子溶液转移至含L929细胞的板的对应孔中。向每孔中加入50μl0.25μg/ml的放线菌素。

将板在37℃和5％CO₂的潮湿孵育器中孵育24小时。5μg/ml MTT的5ml新制储备液用PBS配制。向每孔中加入20μl MTT溶液。随后将细胞孵育(37℃，5％CO₂)3-4个小时以将MTT代谢。在孵育后，将培养基倒掉并将孔干燥。

将甲臢产物(formazan product)重悬于100μl DMSO，在摇床上放置5分钟，以将甲臢与溶剂充分混合。将板在Synergy HT读板器上读数，光密度在560nm下读取。随后减去670nm下的背景以得到最终的O.D.。

3.结果

结果显示在图6中。通过改变糖浓度和PEI浓度，此实验建立了赋形剂浓度的最佳化矩阵。高O.D.对应于良好的抗体稳定性，且反映出抗TNFα抗体对TNFα的有效中和。

如图6所示，在45℃刺激一周后，较高浓度的蔗糖/棉子糖显示出在热刺激后提供更多保护。此外，当与较高浓度的糖组合使用时，此实验中所用的较高浓度的PEI提供了更多保护。

实施例7-抗TNFα抗体的稳定化

1.材料

与实施例6相同。

2.方法

在50ml falcon管中，向10ml PBS中加入10g蔗糖来配制蔗糖溶液，以得到1.8M的储备液浓度。将溶液在微波炉中轻微加热以促进溶解。在50mlfalcon管中，向5ml PBS中加入2.5g棉子糖来配制棉子糖溶液，以得到0.63M的储备液浓度。将溶液在微波炉中轻微加热以完成溶解。一旦完全溶解，通过向16ml蔗糖溶液中加入4ml棉子糖溶液来配制糖混合物。

通过将1g PEI溶解在50ml PBS中来配制浓度以Mn计为0.167mM的PEI溶液。此外，用PBS稀释PEI溶液。

冻干PBS对照用抗体批号477758B制备，且全部其它样品用抗体批号555790A制备。通过向玻璃瓶中加入100μl糖混合物、100μl PEI溶液和100μl抗TNFα抗体来制备用于冻干的样品。这些样品的最终糖和PEI浓度显示如下。PFD＝在冻干前；FD＝冻干。

如实施例6所述，将样品涡旋并使用VirTis Advantage冻干器(Biopharma Process Systems)冻干。在干燥完成时，将样品塞好并盖紧。在60℃下热处理1周后，分析样品的组。

将冻干和热处理的样品重悬于150μl水中。将样品转移至HPLC玻璃瓶。通过体积排阻HPLC(移动相PBS，环境温度)在280nm下测量吸光度(流速0.3ml/分钟，约1200psi)，比较100μl注射液。确定峰面积。

3.结果

结果显示在图7中。当在PBS中冻干时，未测定到抗体。当仅在糖中冻干时，损失显著量的抗TNFα抗体。当用糖和PEI冻干抗体时，测定到较多量的抗TNFα抗体。

实施例8-抗TNFα抗体的稳定化

按照实施例6的步骤，制备含0.9M蔗糖、0.1M棉子糖和0.0025nM PEI的抗TNFα抗体的PBS样品。按实施例6所述将样品冻干。随后将样品在45℃热处理2周。将热处理的样品用含2％FBS的RPMI重构。在实施例6所述的L929试验中评价TNFα中和。结果显示在图8中。实现良好的抗体稳定化。

实施例9-流感血凝素的稳定化

1.材料

聚乙烯亚胺(P3143，Mn 60,000)

蔗糖(Sigma)

棉子糖(Fluka)

Dulbecco磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma)

玻璃瓶(Adelphi glass)

橡皮塞(Adelphi glass)

UV透明96孔微量滴定板

Maxisorb 96孔ELISA板(Nunc)

柠檬酸(Sigma)

兔抗羊Ig的HRP缀合物(AbCam)

30％H₂O₂溶液(Sigma)

邻苯二胺(OPD)片(Sigma)

H₂SO₄(Sigma)

多克隆单特异性羊抗H1抗体(Solomon Islands)(NIBSC)

聚氧山梨醇单月桂酸酯(吐温20)(Sigma)

非脱脂奶粉(Marvel)

菠罗蛋白酶溶解的，纯化的X31(H3N2)的流感血凝素(HA)

2.方法

样品的制备

将每瓶1×57μg的流感HA蛋白用475μl无菌蒸馏水(SDW)重构，以得到120μg/ml储备液。随后将此储备液进一步用SDW稀释为1/4，并随后用PBS或含蔗糖、棉子糖和PEI组合以及无菌蒸馏水的赋形剂混合物稀释为1/6。这导致含终浓度1M蔗糖/100mM棉子糖/16.6nM PEI(以Mn计)的赋形剂中HA的终浓度为5μg/ml。

将这些溶液的200μl等分试样置于5ml瓶中以用于冻干(FD)。使用实施例6所述的方法，在VirTis Advantage冻干器中进行冷冻干燥和二次干燥。在冻干后，将赋形剂中的一种冻干样品在80℃水浴中热激1小时。随后，将全部样品平衡至环境温度，将冻干样品用200μl SDW重构，且将全部样品从1μg/ml初始浓度起以两倍稀释梯度通过下述ELISA滴定。

ELISA方法

将用PBS稀释的50μl各个样品加入到Maxisorb 96孔ELISA板(Nunc)的适合孔中。轻拍板以确保在整个孔底上均匀分布，并将板盖住并在37℃下孵育1小时。制备由PBS、5％脱脂奶粉和0.1％吐温20组成的封闭液。将板用流动PBS清洗3次，清除洗出物并随后拍干。

用封闭液以1∶200稀释配制羊抗H1抗体(多克隆单特异性羊抗H1抗体)，并每孔加入50μl。将板盖住并在37℃下孵育1小时。随后将板用PBS清洗3次。

用封闭液以1∶1000稀释配制兔和羊IgG、IgA和IgM。随后，向每孔中加入50μl此溶液。随后将板盖住并在37℃下孵育1小时。随后将板用PBS清洗3次。

随后，通过在pH 5.0的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中加入OPD(邻苯二胺)至终浓度0.4μg/ml来配制底物/OPD溶液。随后，向每个试验孔中加入50μl0.4μg/ml 30％H₂O₂溶液，并将板在环境温度在孵育10分钟。通过加入向每孔加入50μl1M H₂SO₄来终止反应，并在490nm下读取吸光度。

3.结果

结果显示在图9中。液体PBS代表仅在PBS中的HA的对照样品。与无赋形剂的冻干样品(FD PBS)相比，通过ELISA在含蔗糖、棉子糖和PEI赋形剂(FD赋形剂和FD HT赋形剂)的冻干HA样品中检测出更多的HA。

实施例10-荧光素酶的保存

1.方法

荧光素酶储备物购自Promega Corporation(编号E1701)且由1mg浓度13.5mg/ml的纯化蛋白组成，对应于使用约60kDa分子量时的2.13x10^-4M。将储备物解冻，并以4μL等分试样在-45℃再冷冻(未接触、未加入任何赋形剂)。随后将这些等分试样用于全部实验。

萤光素作为包括ATP的试剂盒(编号E1500)购自Promega Corporation。因此将此试剂盒称为萤光素试剂，且其由需要用前混合的一对小瓶组成。一个瓶包括冻干粉末和另外10ml冷冻的液体。为了制得储备物，将这些瓶混合，并随后在标准的1.5ml Eppendorf管中，以1ml等分试样在-20℃下再冷冻。将瓶和重构的萤光素试剂在-20℃，不透光的盒中储存，并仅在几乎黑暗的条件下移出。

将赋形剂(下述)和牛血清白蛋白(BSA)溶解并用PBS稀释，以最小化真实PBS浓度与所用PBS缓冲液间的偏差。BSA储备物以100mg/ml配制，并随后稀释以得到1mg/ml的工作浓度。无论是够用于稀释荧光素酶，PBS缓冲液中总是添加1mg/mL BSA；荧光素酶不接触任何溶液，除非向其添加1mg/mL BSA。

在全部实验中使用蔗糖∶棉子糖(糖混合物或“sm”)的固定比例，但此比例的终浓度可改变。此实验所用的糖和PEI(Sigma P3143，Mn 60,000)的终浓度显示如下。

蔗糖溶液通过在50ml falcon管中，向32ml PBS中加入32g蔗糖粉末(对应于61.54％的终浓度)来配制。将溶液在微波炉中轻微加热以促进最初的溶剂化，但随后在4℃存储。棉子糖溶液通过在50ml falcon管中，向8ml PBS中加入4g棉子糖来制备，以得到对应于39.2％终浓度的10.2ml的终体积。将溶液在微波炉中加热以完成溶剂化。一旦完全溶解，如果单独在室温或4℃下储存任何时长，棉子糖溶液将会沉淀。

为了制备最终的糖混合物，将上述蔗糖和棉子糖溶液以4∶1的比例混合。实际上，将32ml蔗糖溶液与8ml棉子糖溶液混合。一旦构成糖混合物，糖混合物长时间储存在4℃下且不发生沉淀。

荧光素酶试验包括将各种浓度的荧光素酶与未稀释的荧光素试剂等分试样在黑色不透光的96孔板中混合。随后，立即用光度计定量此发光反应的初(线性)相。按照生产商的推荐，荧光素酶样品为100μl体积，且通过加入100μl荧光素试剂引起发光。涉及荧光素试剂的全部步骤在近于黑暗下进行。

为了补偿不可避免的背景噪声和确保可信度，每个样品在多个预期产生线性响应的浓度点测试(一式三份)。由于快速的信号衰减，一次仅分析三个样品。这些对应于每个浓度点的一式三份的制剂。一旦读取，随后制备并测试对应于下个浓度点的三份样品。对于每个样品，测试以下五个浓度点：

6×10^-10M

5×10^-10M

4×10^-10M

3×10^-10M

2×10^-10M

方法的详细描述

荧光素酶具有试验前必须进行梯度稀释的极高的特异活性。因此荧光素酶极为脆弱，所以此稀释最好在试验前迅速完成。因此，在每次实验开始时，将2.21×10^-4M的未改变的储备物荧光素酶的一个4μl等分试样从-45℃储存中移出，并在用880μl冰冷PBS快速稀释前将其立即置于冰上，以得到1×10^-6M浓度。

为了达到所需的荧光素酶的工作浓度，随后如下所述准备进一步梯度稀释。将100μl新制的1×10^-6M荧光素酶溶液加入到900μl冰冷PBS中，以得到1×10^-7M的1ml溶液。将100μl此溶液随后加入到900μl冰冷PBS中，以得到1×10^-8M的1ml溶液。将20μl至60μl此溶液随后加入到1ml冰冷PBS中，以得到五种终储备液，所述五种终储备液将被稀释10倍以得到以上所示的五种工作浓度(即终储备液为2至6×10^-9M)。将10μl的这些储备液用含1mg/mL BSA的PBS稀释为100μl的终试验体积(包含或不含赋形剂)，以将体积补足为100μl。

试验前已重悬的，包括待冻干的等分试样和冻干等分试样在内的全部样品始终是100μl体积。与赋形剂含量或浓度无关，全部100μl等分试样包含1mg/ml的终BSA浓度。糖混合物和PEI以各种浓度(分别为0至67％和1×10^-0至1×10^-7％)单独或一起测试，并在冻干前或后加入。共计测试以下组合(除非“组”栏中另有说明，否则赋形剂在冻干前加入)：

样品总是由以下顺序组成：向10μl荧光素酶储备液(2至6×10^-9M)中加入PBS(1mg/ml BSA)，随后加入糖混合物，如果样品中指明有PEI，则随后加入PEI，否则不加入(参见上表)。在全部情况中，最终样品体积用含1mg/ml BSA的PBS调至100μl。

试验步骤

将三份100μl最高浓度(6×10^-10M荧光素酶)的等分试样吸移入预冷的黑色不透光的96孔板的相邻孔中。随后将96孔板置于光度计读数板内。随后用多通道移液管将100μl荧光素试剂的等分试样加入孔中并简单混合。随后立即开始读数。在每次读数后，立即将96孔板放回到冰上，以在下次读数前预冷。在制备并测试随后的三份样品前，存储数据。

冻干样品的重悬

将用于冻干的样品配制为100μl等分试样。将含糖混合物的冻干样品以较少的体积重悬(由于糖混合物引起的体积)，以得到100μl终体积。先前显示为100μl中的23.4μl，这23.4μl是因为当以66.7％的浓度使用的糖混合物产生的体积(数据未显示)。因此，此样品通过加入74.6μl重悬。含较少糖混合物的样品中糖混合物导致的体积从以上值计算并调节，以得到100μl最终体积。

2.结果

结果显示在图10中。首先，最佳糖混合物(sm)浓度为20％(0.29M蔗糖，0.03M棉子糖)至30％(0.43M蔗糖，0.04M棉子糖)。在缺少和存在PEI下，其均保持如此(最初的两个数据组)。标准糖混合物浓度为66.7％(0.96M蔗糖，0.09M棉子糖)。在缺少糖混合物下(第四个数据组)，最佳PEI浓度为1.0×10^-3％PEI(167nM，以Mn计)，而在存在66.7％糖混合物下(第五个数据组)，其保持为1.0×10^-1％至1.0×10^-3％PEI(16.7μM至167nM，以Mn计)。因此，最低的最佳赋形剂浓度为20％糖混合物(0.29M蔗糖，0.03M棉子糖)和1.0×10^-3％PEI(167nM，以Mn计)。

糖混合物和PEI的冻干保护剂作用是协同的，当一起加入时达到峰值(第二和第五个数据组)。当将单独PEI提供的保护(第四个数据组)与糖混合物共存时观察到的保护(第五个数据组)相比较时，此作用最明显。最重要地，与单独使用糖混合物相比，PEI的存在提供了额外的冻干保护(分别为第一和第二数据组)。

然而，这种协同作用仅在两种组分均在冻干前加入时才观察到。在冻干后加入任一种组分，与不包括该组分时相比，整体上消除了它的作用：赋形剂能够保护，但不能使其复性。

实施例11-β-半乳糖苷酶的保存

样品的制备

含β-半乳糖苷酶的赋形剂根据下表制备并涡旋。每个瓶加入10个单位的β-半乳糖苷酶。将200μl的涡旋的混合物置于每个适当标记的5ml玻璃瓶中。PEI获自Sigma(P3143，Mn 60,000)。

瓶的标签	蔗糖	棉子糖	PEI
				PBS	-	-	-
糖对照	1M蔗糖	100mM棉子糖	-
				糖，PEI 13.3mM	1M蔗糖	100mM棉子糖	13.3μM PEI

在涡旋后，更具体地，将其中部分塞有橡皮塞的瓶在-80℃下在含30ml水的冻干器盘中冷冻。将冷冻的瓶转移至预冷冻干器的冻干器制动架(Thermo Fisher)并干燥16小时。冷凝室为-70℃。然而，冻干单元上没有架子对照(shelf control)。在从冻干器移出前，将橡皮塞在真空下完全塞入瓶中。

β-半乳糖苷酶试验

在冻干后，将瓶用1ml PBS重构。将100μl来自每个瓶的所得溶液一式两份(每种赋形剂类型共计6个读数)加入到平底96孔板的每个孔中。根据生产商的说明，加入底物x-gal。简单地说，20mg/ml储备液用DMSO配制，并以1mg/ml的工作浓度使用。每孔中加入100μl，且使溶液在10分钟内显色。在显色后，在synergy HT微板上在630nm下测量吸光度。随后，将空白孔的背景从全部读数中减去并使用Prism Graphpad评价结果。

结果

结果显示在图11中。此实验检验了存在糖/PEI赋形剂时冻干β-半乳糖苷酶的效果。在冻干后，与PBS相比，β-半乳糖苷酶的活性在蔗糖/棉子糖赋形剂中更高。在含PEI的蔗糖/棉子糖赋形剂中，其进一步增强。

实施例12-辣根过氧化物酶(HRP)的保存

IV型辣根过氧化物酶(HRP，Sigma-Aldrich)用以下物质稀释为1μg/ml：

1.仅用PBS

2.1M蔗糖/100mM棉子糖(Smix)

3.1M蔗糖/100mM棉子糖/16.6nM PEI(SmixP)

PEI获自Sigma(P3143，Mn 60,000)。PEI浓度以Mn计。10×100μl体积的每种以上溶液的在5ml冻干瓶中配制。将每种溶液的5个重复品用实施例6所述的方法在VirTis Advantage实验室冻干器上在-32℃冻干，周期为3天。

将液体和干燥样品的每个溶液的一个瓶置于4℃，将剩余冷冻至-20℃。来自每个液体和干溶液的样品经历了2、4和6个热-冷冻循环，所述热-冷冻循环是通过将它们从-20℃冷冻器中取出，在将它们在冷冻器中再放置20小时前，将它们置于37℃孵育器4小时，进行2、4或6次。每个样品有1瓶保持在-20℃作为对照。

当完成循环，包括-20℃和4℃保持的非循环对照在内的全部样品平衡至室温。随后，将冻干样品在室温下用100μl/瓶的去离子水重构。

三份10μl样品从每个瓶移到平底ELISA板(Nunc Maxisorb)的孔中。随后向每个孔中加入含0.4mg/ml邻苯二胺(OPD)和0.4ul/ml 30％过氧化氢(H₂O₂)的50ul色原/底物溶液。在加入50μl/孔的1M硫酸(H₂SO₄)终止反应前，进行显色。

吸光度在BioTek Synergy HT分光光度计上在490nm下测量并绘制为光密度(OD)。

结果

结果显示在图12中。结果显示对于全部处理和储存条件，与仅有PBS相比，HRP活性在蔗糖/棉子糖和可选地PEI存在下保持更高。对于全部悬浮培养基，在连续热/冷冻循环后HRP降低的图类似。然而，在初始冻干阶段，糖的存在，特别是糖和PEI的存在显著降低HRP活性损失。即使在6个热/冷冻循环后，赋形剂处理的样品仍比PBS中未刺激的样品保持更高的HRP活性。

实施例13-醇氧化酶活性的保存

此实验的目的是比较使用WO 90/05182(Gibson et al.)实施例10的乳糖醇和PEI稳定剂与使用本发明对醇氧化酶活性保存的效力。

试剂

(全部试剂购自Sigma)

十二烷基硫酸钠；SDS-目录号L4390

2，2’-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸；ABTS-目录号A1888

甲醇-目录号65543

醇氧化酶；AoX-目录号A0438

辣根过氧化物酶-目录号P8250

糖混合物(参见试剂制备)

乳糖醇-目录号L3250

PEI-目录号P3143，Mn 60,000

储存和制备

除SDS外，全部试剂在每次实验前新配制。在每次实验期间，除2mMABTS和SDS外，全部试剂保持在冰中。2mM ABTS和SDS储存在室温下。

通过将5g SDS粉末加入到23.6ml PBS溶液至25ml终体积来制备20％的SDS工作溶液。通过涡旋和随后离心去除表面泡沫使粉末完全溶于溶液中。

将1g ABTS与18.2ml PBS混合以得到100mM溶液。将1ml此溶液加入到50ml PBS中，以得到2mM的工作浓度。

使用1％的甲醇工作溶液，其通过将500μl加入到50ml PBS来制备。

使用10U/ml醇氧化酶(AoX)的工作溶液，其通过将100U酶重悬于10mlPBS来制备。

使用250U/ml的辣根过氧化物酶，其通过将5kU酶重悬于20ml PBS来制备。

通过将5g乳糖醇溶解在25ml PBS中来制备20％的乳糖醇工作溶液。根据需要将PEI加入乳糖醇中。根据需要将乳糖醇和PEI混合物与醇氧化酶混合。

糖混合物由4∶1(以重量计)比例的蔗糖(Sigma，16104)和棉子糖五水合物(Sigma，R0250)组成，且在最终赋形剂混合物中以67％或20％的浓度使用。67％的糖混合物对应于终浓度0.96M的蔗糖和0.09M的棉子糖，而20％的糖混合物对应于终浓度0.29M的蔗糖和0.03M的棉子糖。

蔗糖溶液通过在50ml falcon管中，向32ml PBS中加入32g蔗糖粉末(对应于61.54％的终浓度)来配制。将溶液在微波炉中轻微加热以促进最初的溶剂化，但随后在4℃存储。棉子糖溶液通过在50ml falcon管中，向8ml PBS中加入4g棉子糖来制备，以得到对应于39.22％终浓度的10.2ml的终体积。将溶液在微波炉中加热以完成溶剂化。一旦完全溶解，如果单独在室温或4℃下储存任何时长，棉子糖溶液将会沉淀。

为了制备最终的糖混合物，将上述蔗糖和棉子糖溶液以4∶1的比例混合。实际上，将32ml蔗糖溶液与8ml棉子糖溶液混合。一旦构成糖混合物，糖混合物长时间储存在4℃下且不发生沉淀。根据需要将PEI加入糖混合物中。根据以下描述，将糖混合物和PEI的混合物与醇氧化酶混合。

用于干燥和冻干的样品制备

将全部样品一式两份地制备并分析。根据需要，将全部样品用PBS调至100μl。如果试剂存在于给定样品中，则其总是按以下顺序加入：向10U/ml的醇氧化酶中首先加入PBS，随后加入糖混合物或乳糖醇，随后加入PEI。加入到每种样品中的醇氧化酶的实际体积为10μl的10U/ml储备液。加入到每种样品中的糖混合物的实际体积为20μl(对于20％的样品)或67μl(对于67％的样品)的如上制备的纯储备液。加入到每种样品中的乳糖醇的实际体积为25μl的20％储备液。加入到每种样品中的PEI的实际体积总是10μl的给定储备液浓度：对于Gibson 1(G1)样品为1％(167μM)储备液、对于Gibson 2(G2)和Stabilitech 1(S1)样品为0.1％(16.7μM)储备液、或对于Stabilitech 2(S2)样品为0.01％(1.67μM)储备液。

对于在不同天测试的相同样品，配制单独的母液混合物，并随后等分以得到最终的100μl样品。在干燥后，将干燥和冻干的样品储存在37℃下直至分析的时间。除非另有说明，对照仅在第0天测试。制备并分析以下样品。

干燥和冻干

干燥在50％大气压和30℃下进行10小时。冻干在VirTis Advantage冻干器上使用以下程序作为标准进行。

步骤	架子温度(℃)	时间(分钟)	Ramp/Hold	真空度(豪托)
					1	-32	120	H	80
2	-32	1250	H	80
					3	-32	380	H	80
4	25	600	R	80
					5	25	400	H	10
6	20	300	R	10

样品分析

对于湿的对照样品，将1μl醇氧化酶、赋形剂和最高为90μl PBS的加入到玻璃的干燥/冻干瓶中，以得到100μl的终体积。将干燥和冻干的样品重悬，至100μl PBS的终体积。随后向每个瓶中加入2.8ml 2mM ABTS。随后向每个瓶中加入10μl过氧化物酶。随后将瓶简单地涡旋。

随后通过将每个瓶中加入10μl 1％MeOH来启动。每隔5分钟取样至55分钟，并将样品加入到96孔板的孔中。板预先制备，并每孔包含75μl 20％SDS以终止反应。在最后时间点后，将板在405nm读数。酶活性通过以下反应速率(定义为吸光度随时间变化的系数)来评价。因为梯度是有效地自空白，所以不进行空白。

结果

结果显示在图13中。显示了在存在和不存在赋形剂时，湿、干和冻干的醇氧化酶的活性：

-D0至D16天：在37℃孵育(干燥和冻干的样品)；

-无MeOH：无甲醇加入(阴性对照)；

-湿：样品储存并测试而不干燥(即新制的)；

-FD：冻干；

-D：干燥的；

-G1&G2：分别根据WO 90/05182的实施例10的赋形剂混合物条件Gibson 1&2；和

-S1和S2：分别根据本发明的赋形剂混合物条件Stabilitech 1和2。

仅G1显示出对活性的显著负效应(独立于任何干燥且在任何干燥前)，而G1和G2在湿状态下显示出独立于任何干燥且在任何干燥前的最大活性降低。冻干的S1提供最大保护水平。G1和G2在冻干时比在干燥时提供显著地更好保护(但仍不如S1)。因此，本发明的方法的作用比所述WO 90/05182(Gibson et al.)的实施例10中含PEI的赋形剂混合物的方法更好。

对于至少最初2周，储存在37℃的冻干S1与在4℃下存储的湿的、未接触的储备液显示出基本相同的活性图。因此，相对于冷的、湿的存储，即使在37℃下存储的冻干S1也不降低活性。而且，活性损失速率在2周时间内降低，这表明大部分活性可持续长的储存期。从WO 90/05182(Gibson et al.)所述的最好结果，即(冻干G2)在第5天已降低至背景来看，缺少此特征。

干燥的G1以及冻干的G1和G2基本上提供0保护。发现G1引起预干燥湿状态下沉淀以及G1和G2均提供很少的冻干保护，此发现不支持WO90/05182(Gibson et al.)中赋形剂或方法提供良好保护水平的观点。

相对于冻干S1，冻干S2提供中间的保护，但与冻干G2不同，此保护在整个2周测试时间内是稳定的。

在缺少赋形剂下，干燥或冻干总体上排除可检测的活性。这与WO90/05182(Gibson et al.)的观察正相反。WO 90/05182(Gibson et al.)甚至提出了相对于干燥的、不含赋形剂状态的全部赋形剂保护效率。因为即使含或不含赋形剂的WO 90/05182(Gibson等)很可能在干燥时经历明显活性损失，所以对于此实验，合理的方法应提供相对于湿的、未接触的(即标准未掺杂的)酶比较的结果。

实施例14-G-CSF的保存

1.材料

人重组G-CSF(10μg)(MBL JM-4094-10)

37％甲醛(BDH 20910.294)

30％H₂O₂(Riedel-dehaen 31642)

磷酸化的ERK1/ERK2(T202/Y204)

基于细胞的ELISA试剂盒(R&D SYSTEMS KCB1018)

HL-60细胞(ECACC98070106)

RPMI 1640(Sigma R8758)

聚L-赖氨酸(0.01％溶液)(Sigma P4707)

台盼蓝(SigmaT6146-5G)

青霉素/链霉素(GIBCO 15070)

PEI(Sigma P3143，批号127K0110；Mn 60,000)

蔗糖(Sigma 16104，批号70040)

棉子糖(Sigma R0250，批号039K0016)

PBS(Sigma D8662，批号118K2339)

水(Sigma W3500，批号8M0411)

5ml玻璃瓶(Adelphi Tubes VCD005)

14mm冻干塞子(Adelphi Tubes FDIA14WG/B)

14mm盖(Adelphi Tubes CWPP14)

胎牛血清(Sigma F7524)

2.方法

配制以下溶液：

糖溶液的制备

蔗糖溶液通过在50ml falcon管中，向32ml PBS中加入32g蔗糖粉末至52ml终体积(对应于61.54％的终浓度)来制备。将溶液在微波炉中轻微加热以促进最初的溶剂化，但随后在4℃存储。

棉子糖溶液通过在50ml falcon管中，向8ml PBS中加入4g棉子糖来制备，以得到对应于39.2％终浓度的10.2ml的终体积。将溶液在微波炉中加热以完成溶剂化。

为了制备最终的糖混合物，将上述蔗糖和棉子糖溶液以4∶1的比例混合。实际上，将32ml蔗糖溶液与8ml棉子糖溶液混合。一旦构成糖混合物，糖混合物储存在4℃下且不发生沉淀。

PEI溶液的制备

将6g PEI(50％w/v)加入到500ml PBS中以制成6mg/ml，随后以1∶10稀释为600ug/ml。随后将600μg/ml稀释以得到100μg/ml的PEI溶液。用PBS进行1∶10梯度稀释至0.01μg/ml的浓度。PEI的终浓度参见下表2。浓度以Mn计。

G-CSF的制备以与赋形剂混合

将10μg 98％纯化的重组人G-CSF重构在1ml PBS并用PBS从10μg/ml起始浓度稀释为0.2ng/ml(1∶50,000稀释)。将G-CSF分装在15μl Eppendorf管中并储存在-20℃下备用。

第一次稀释：将10μl10μg/ml的G-CSF加入到990μl PBS(1∶100稀释)。第二次稀释：将10μl1∶100稀释的G-CSF加入到4.99ml PBS(1∶500稀释)。G-CSF的终浓度参见下表2。

赋形剂的制备

赋形剂根据表2制备。G-CSF的终浓度为每瓶0.2ng/ml。蔗糖、棉子糖和PEI的终浓度显示在表2中。将赋形剂涡旋混合，并将100μl置于每个适当标记的5ml玻璃瓶中将样品用VirTis Advantage冻干器冻干约3天。

表2

*FD＝冻干。HT＝热处理。

样品的重悬

将样品配制为100μl等分试样。将冻干样品重悬于100μl水中。

第一天

下述ELISA试验方法按照细胞型试验试剂盒(R&D Systems)的通用试验步骤。

组织培养

HL60细胞保存在添加有20％胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺和青霉素链霉素的含酚红的RPMI 1640中将HL-60细胞每周传代，并每隔2-3天更换培养基。

将HL-60(第三代)转移至离心管中，并在4℃下以1300rpm旋转5分钟。将上清液倒入T-75烧瓶中。将小球重悬在10ml冷培养基中。

使用5ml移液管将200μl细胞悬液转移入Eppendorf管中。将100μl细胞悬液加入到另一Eppendorf管内的100μl台盼蓝中并混合。

使用细胞计数器来对细胞计数，并将细胞浓度调节至5×10⁵细胞/10ml。

包被板

向微板中以每孔100μl加入10μg/ml聚L-赖氨酸。将板用密封板盖住，并在37℃下孵育30分钟。将聚L-赖氨酸从各个孔中除去，并用100μl 1×PBS清洗2次。

向板中以每孔100μl加入HL-60细胞系(5×10⁵细胞/10ml)。将板盖住并在37℃，5％CO₂下孵育过夜。

第二天

细胞刺激

将测试样品瓶在100μl无菌蒸馏水中重构。将板用100μl 1×PBS清洗3次；每个清洗步骤进行5分钟。以每孔90μl将完全培养基加入板中，随后以每孔10μl将重构的测试样品加入板中。将板盖住并在37℃，5％CO₂下孵育1小时。

细胞固定

如前述清洗ELISA板，并以每孔100μl将8％甲醛的1×PBS溶液加入到板中。将板盖住并在室温下孵育20分钟。

将甲醛溶液去除，并将板用200μl 1×PBS清洗缓冲液清洗3次，每个清洗步骤通过轻轻摇晃进行5分钟。

将清洗缓冲液去除，并以每孔100μl将终止缓冲液加入到板中。将板盖住并在室温下孵育20分钟。将终止缓冲液去除，如前述清洗板，并以每孔100μl将封闭缓冲液加入到板中。将板盖住并在室温下孵育1小时。

一抗和二抗的结合

将封闭缓冲液去除，如前述清洗板，并以每孔100μl将一抗混合物加入到板中。将板盖住并在4℃下孵育过夜。

第三天

将一抗混合物去除，如前述清洗板，并以每孔100μl将二抗混合物加入到板中。将板盖住并在室温下孵育2小时。

荧光检测

将二抗混合物去除，如前述清洗细胞，并随后用200μl 1×PBS清洗2次。每个清洗步骤通过轻轻摇晃进行5分钟。

将1×PBS去除，并以每孔75μl将底物(标记的底物F1，RnD Systems)加入板中，将板覆盖并用箔包裹，随后在室温下孵育1小时。以每孔75μl将第二底物(标记的底物F2，RnD Systems)加入板中，将板覆盖并用箔包裹，随后在室温下孵育40分钟。

ELISA板的显色

ELISA板读取两次，用540nm激发和600nm发射进行第一次读取。随后，将板用荧光读板器以360nm激发和450nm发射进行读取。

600nm处吸光度读数表示的结果代表细胞中磷酸化的ERK1/ERK2的量，而450nm处读数代表细胞中总ERK1/ERK2的量。

数据分析

对于每个样品，计算两个孔的平均OD_600nm。对于每个样品，计算两个孔的平均OD_450nm。计算600nm和450nm处的平均吸光度，并针对含重组人G-CSF的测试样品(含和不含赋形剂)作图。

3.结果

结果显示在图14中。结果表明将G-CSF与含1.6μM、0.16μM或0.016μMPEI以及蔗糖和棉子糖的赋形剂混合，随后冻干和热处理会导致更高的磷酸化的ERK1/ERK2水平。

结果证实冻干赋形剂显示出保护G-CSF免受热灭活。基于细胞的生物测试清楚地显示，当使用含PEI和糖的赋形剂时，G-CSF对磷酸化的ERK1/ERK2的活化水平最高。此试验的阳性结果也确认高水平PEI冻干的G-CSF具有更高的效力。这些结果提示糖与高水平PEI的组合在56℃下对G-CSF有更高的热保护。

实施例15-IgM抗体的稳定化

1.方法

测试样品的制备

从人血清(Sigma目录号18260)纯化的IgM储备物在缓冲的水溶液(0.05M Tris-HCl、0.2M氯化钠，pH 8.0，包含15mM叠氮化钠)中获得，并存储在4℃下。将10μm IgM的等分试样与由PBS组成的赋形剂、1M蔗糖和0.1M棉子糖的PBS溶液组成的赋形剂、和由1M蔗糖、0.1M棉子糖和16.7μM(1mg/ml)PEI(Sigma分类号18260)的PBS溶液组成的赋形剂混合，总体积为50μl。

每个制剂处理一式两份组成。样品使用实施例6所述的方法在VirTisAdvantage冻干器上冻干。此程序在将样品盖好后耗时3天。在实验的第3天，将样品置于环境室中，其循环温度方案为37℃下持续12小时，随后在-20℃下持续10小时，每个温度之间具有1小时的过渡。

在实验的第10天，在温度循环第7天后，将样品用1ml PBS重构并用体积排阻HPLC分析。

HPLC分析

将测试样品和标准品在硅胶类体积排阻柱(TSK-Gel Super SW3000SEC柱，4.6mm内径，3cm长度)和配套的保护柱(TSK-Gel PWXL保护柱，6.0mm内径，4cm长度)上过柱。移动相为PBS(pH 7.0)。对柱使用100μl注射体积，0.3ml/分钟的流速、环境温度以及25分钟运行时间。通过测定在195至290nm下的最大吸光度来初步检测IgM和降解物。

数据的转换

将已知IgM浓度(10-0.1μg/ml)的标准品用150μl PBS配制。这些标准品也用体积排阻HPLC分析，且测量主峰的高度(14.5至16.1分钟的滞留时间)，用得到的最小二乘法回归线来描述数据。此方程用于评估测试样品中中IgM浓度，且随后将浓度转换为相对于已知起始浓度(10μg/ml)的IgM的回收百分数。

2.结果

用于评估IgM含量的标准曲线

体积排阻HPLC和使用光电二极管阵列的组分检测能够检测至少为0.05μg(0.5μg/ml)的IgM。在10-0.5μg/ml IgM的范围内，在IgM浓度和主峰高度(R²＝0.993)之间观察到良好的线性相关性。使用最小二乘法回归分析来描述该拟合(y＝9136.7x+1659.2，其中y＝峰高度且x＝IgM浓度)，且使用得到的方程来评估测试样品中的IgM浓度。

IgM的热稳定性

体积排阻HPLC仅能评估天然IgM的回收百分数。在热循环条件下IgM的回收率很低，在7天后仅产生小于5％的起始IgM。加入糖(1M蔗糖和0.1M棉子糖)将此回收率(12.9％)增加一倍多。然而，回收率仍很低。加入16.67μMPEI显著提高赋形剂的热保护效力，因此IgM的回收率为35.6％(参见图15)。

实施例16-G-CSF的保存

材料如实施例14。赋形剂按表3设置，以在56℃和37℃下赋予1周，随后冻干。在热刺激后，ERK 1/2的磷酸化水平按实施例14分析。

表3

瓶的标签	蔗糖	棉子糖	PEI
				1-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/56℃/1周	1M	0.1M	1.6μM
2-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/56℃/1周	1M	0.1M	0.16μM
				3-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/56℃/1周	1M	0.1M	0.016μM
1-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/37℃/1周	1M	0.1M	1.6μM
				2-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/37℃/1周	1M	0.1M	0.16μM
3-G-CSF 0.2ng/mL/EXP/FD/37℃/1周	1M	0.1M	0.016μM

结果显示在图16中。结果表明在冻干和热激期间，具有含1.6μM、0.16μM或0.016μM PEI以及蔗糖和棉子糖的赋形剂的G-CSF保护并稳定G-CSF。当糖与1.6μM终浓度的PEI一起使用时，可见G-CSF保护的最高水平，这体现为较高水平的ERK 1/2磷酸化。这在37℃和56℃孵育时很明显。

Claims (48)

1.一种用于保存多肽的方法，包括：

(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述多肽的水溶液，其中所述聚乙烯亚胺的浓度以所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为25μM或更低，且所述糖的浓度或存在多于一种糖时的总糖的浓度大于0.1M；和

(ii)干燥所述溶液以形成包含所述多肽的无定形固体基质。

2.如权利要求1所述的方法，其中：

(a)所述聚乙烯亚胺的Mn在20和1000kDa之间，且所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.001和100nM之间；和/或

(b)所述聚乙烯亚胺的Mn在1和10000Da之间，且所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0001和10μM之间。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度为(a)20μM或更低，或小于500nM，和/或(b)0.025nM或更高，或0.1nM或更高。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度在0.1nM和5μM间，或0.1nM和200nM之间。

5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中：

(a)所述糖浓度或总糖浓度在0.5至2M之间；和/或

(b)所述糖为蔗糖、水苏糖、棉子糖或糖醇。

6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中两种或更多种糖存在于所述水溶液中。

7.如权利要求6所述的方法，其中蔗糖与其它糖一起存在；所述蔗糖相对于所述其它糖的浓度具有3∶7至9∶1的摩尔浓度比；且步骤(i)中所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0025nM至5μM间。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述糖为蔗糖和棉子糖。

9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述溶液在步骤(ii)中冻干。

10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述多肽为激素、生长因子、肽或细胞因子。

11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述多肽为速激肽、血管活性肠肽、胰多肽相关肽、阿片肽或降钙素肽。

12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述多肽为抗体或其抗原结合片段。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体或其片段。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段为嵌合抗体、人源化的抗体或人抗体，或它们的片段。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段为IgG1、IgG2或IgG4，或它们的抗原结合片段。

16.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段能够结合：

(a)肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、糖蛋白IIb/IIIa、CD33、CD52、CD20、CD11a、CD3、RSV F蛋白、HER2/neu(erbB2)受体、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、抗TRAILR2抗体(抗肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体2)、补体系统蛋白C5、α4整联蛋白或IgE，或

(b)上皮细胞粘附分子(EpCAM)、粘蛋白-1(MUC1/Can-Ag)、EGFR、CD20、癌胚抗原(CEA)、HER2、CD22、CD33、Lewis Y或前列腺特异性膜抗原(PMSA)。

17.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述多肽为酶。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、丝氨酸蛋白酶、内肽酶、半胱天冬酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、内肽酶、颗粒酶、木瓜蛋白酶、胰腺弹性蛋白酶、水稻素、胞浆素、肾素、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶、尿激酶、淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、转谷氨酰胺酶、细胞壁降解酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、凝固酶、乳蛋白水解产物、细胞壁降解酶、凝固酶、溶菌酶、纤维降解酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、甘露聚糖酶或葡糖淀粉酶。

20.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述多肽为疫苗免疫原。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述疫苗免疫原为全长病毒或细菌蛋白、糖蛋白或脂蛋白；或它们的片段。

22.一种用于保存多肽的方法，包括：

(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述多肽的水溶液；和

(ii)干燥所述溶液以形成包含所述多肽的无定形固体基质。

23.如前述任一项权利要求所述的方法，进一步包括在密封瓶、安瓿或注射器中以粉末形式提供所得干燥的所述无定形固体基质。

24.一种干粉，包含由权利要求1至22中任一项所定义的方法获得的保存的多肽。

25.一种保存的制品，包含多肽、一种或多种糖和聚乙烯亚胺，其中所述制品为无定形固体形式。

26.一种密封瓶、安瓿或注射器，包含权利要求24所述的干粉或权利要求25所述的保存的制品。

27.一种赋形剂在多肽保存中的应用，所述赋形剂包括：

(a)蔗糖、水苏糖或棉子糖或它们的任何组合；和

(b)以M_n计浓度为25μM或更低的聚乙烯亚胺。

28.如权利要求27所述的应用，其中所述聚乙烯亚胺的浓度为5μM或更低。

29.一种用于保存疫苗免疫原的方法，包括：

(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述疫苗免疫原的水溶液，其中所述聚乙烯亚胺的浓度以所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为25μM或更低，且所述糖的浓度或存在多于一种糖时的总糖的浓度大于0.1M；和

(ii)干燥所述溶液以形成包含所述疫苗免疫原的无定形固体基质。

30.如权利要求29所述的方法，其中：

(a)所述聚乙烯亚胺的Mn在20至1000kDa之间，且所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.001至100nM之间；和/或

(b)所述聚乙烯亚胺的Mn在1至10000Da间，且所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0001至10μM之间。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度为(a)20μM或更低，或小于500nM，和/或(b)0.025nM或更高，或0.1nM或更高。

32.如权利要求29所述的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度在0.1nM至5μM之间，或0.1nM至200nM之间。

33.如权利要求29至32中任一项所述的方法，其中：

(a)所述糖浓度或总糖浓度在0.5至2M之间，和/或

(b)所述糖为蔗糖、水苏糖、棉子糖或糖醇。

34.如权利要求29至33中任一项所述的方法，其中两种或更多种糖存在于所述水溶液中。

35.如权利要求34所述的方法，其中蔗糖与其它糖一起存在；所述蔗糖相对于所述其它糖的浓度为3∶7至9∶1之间的摩尔浓度比；且步骤(i)中所述聚乙烯亚胺的浓度以Mn计在0.0025nM至5μM之间。

36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述糖为蔗糖和棉子糖。

37.如权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述溶液在步骤(ii)中冻干。

38.如权利要求29至37中任一项所述的方法，其中所述疫苗免疫原为亚单位疫苗、缀合物疫苗或类毒素。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述亚单位疫苗免疫原源自病毒表面蛋白或病毒衣壳蛋白。

40.一种用于保存疫苗免疫原的方法，包括：

(i)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述疫苗免疫原的水溶液；和

(ii)干燥所述溶液以形成包含所述疫苗免疫原的无定形固体基质。

41.如权利要求29至40中任一项所述的方法，进一步包括在密封瓶、安瓿或注射器中以粉末形式提供所得干燥的所述无定形固体基质。

42.一种包含保存的疫苗免疫原的干粉，由权利要求29至40中任一项所述的方法获得。

43.一种保存的制品，包含疫苗免疫原、一种或多种糖和聚乙烯亚胺，其中所述制品为无定形固体形式。

44.一种密封瓶、安瓿或注射器，包含权利要求42所述的干粉或权利要求43所述的保存的制品。

45.一种疫苗，包含权利要求42所述的保存的制品和可选的佐剂。

46.一种赋形剂在疫苗免疫原保存中的应用，所述赋形剂包括：

(a)蔗糖、水苏糖或棉子糖或它们的任何组合；和

(b)以M_n计浓度为25μM或更低的聚乙烯亚胺。

47.如权利要求46所述的应用，其中所述聚乙烯亚胺的浓度为5μM或更低。

48.一种制备包含疫苗免疫原的疫苗的方法，所述方法包括：

(a)提供一种或多种糖、聚乙烯亚胺和所述疫苗免疫原的水溶液，其中所述聚乙烯亚胺的浓度以所述聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)计为15μM或更低，且所述糖的浓度或存在多于一种糖时的总糖的浓度大于0.1M；和

(b)可选地将辅料、缓冲剂、抗生素和/或添加剂加入到所述混合物中；和

(c)干燥所述溶液以形成包含所述疫苗免疫原的无定形固体基质。

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