CN102156115B - 超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明适用于激光检测领域，提供了一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法和系统，所述方法通过增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。因采用具有宽带的超连续谱激光作为泵浦光和斯托克斯光，从而获得分子的完整CARS谱信号，实现对整个分子成像。

Description

超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法和系统

技术领域

本发明属于激光检测领域，尤其涉及一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法和系统。

背景技术

光学显微镜的空间分辨率受衍射极限的限制，最终由光波的波长和显微镜的数值孔径决定。若用δ表示其极限分辨率，λ表示光波波长，NA表示光学系统的数值孔径，则δ＝0.61λ/NA。一般来说，δ≥200nm。

近年来，荧光显微镜的衍射极限分辨率由于采取了特殊措施获得了重大突破。主要采取了两种不同的措施，一种是基于单点扫描的成像方法，采用受激发射耗尽(Stimulated Emission Depletion，STED)的方法，利用环形光使激发光形成的点扩展函数周边的受激分子产生受激辐射而被耗尽，只有激发光点扩展函数的中心部位产生荧光，并随环形光强度的提高而产生荧光的中心部位就越小，从而可获得不受衍射极限限制的任意小的纳米乃至亚纳米的空间分辨率。另一种是基于荧光分子开关效应的宽场单分子定位(single molecule localization，SML)成像方法，该方法有不同的变种，如光敏定位显微(photoactivatedlocalization microscopy，PALM)、荧光光敏定位显微(fluorescence photoactivationlocalization microscopy，FPALM)和随机光学重构显微(stochastic opticalreconstruction microscopy，STORM)，但其基本工作原理是一样的，都是利用荧光分子的开关效应，通过调节激活光和去激活光的强度比例实现标记荧光分子的稀疏激发，再通过分时成像、单分子定位和图像合成等步骤，最后获得超衍射极限的空间分辨率图像。因为一般分子不发荧光或发很弱的荧光，因此，上述荧光显微镜方法都要用特殊制备的荧光分子对样品进行荧光标记。

至今利用非标记的方法获得突破衍射极限分辨率的方法也有两种，一种是利用场增强效应的相干反斯托克斯拉曼散射显微镜，但它要用到尖端场增强，只能对样品表面成像，应用受到很大的限制。另一种方法是受激拉曼显微成像，它使用两束斯托克斯光，一束呈高斯型，另一束呈环形，类似上述的荧光标记的STED方法。但这种方法只能获得分子某一化学键的拉曼谱，单靠此谱来判别样品中的分子种类是困难的。要获得分子的其它拉曼谱，就要求激光器具有宽的调谐范围。更严重的问题是需要很长的测试时间才能获得分子的完整拉曼谱。为获得样品的三维超衍射分辨图像，所需成像时间太长。

CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering)利用四波混频的三阶非线性效应而产生的信号，因此对于传统的CARS显微来说，分辨率仅仅为传统光学衍射极限分辨率的

在此激发体积中所研究的依然是大量分子的宏观现象。直到2009年，国际上才首次探讨了几种关于实现CARS超衍射极限分辨的可能技术途径。主要有三种方案，一种是利用一束环形光将点扩展函数范围内周边分子的振动能级实现粒子数反转，当泵浦光和斯托克斯光入射后则不再会通过共振增强产生所要的声子，从而使点扩展函数范围缩小。另一种方法是在点扩展函数范围的周边形成环形的局域振荡，使其与产生的反斯托克斯信号频率相同，通过干涉方法提高空间分辨率。第三种方法采用常用的结构光来提高空间分辨率，但这已不是严格意义上的纳米分辨显微成像，因为利用这种方法所获得的空间分辨率原理上已超过100nm。目前，国际上在CARS纳米分辨显微成像技术研究方面仍处于理论论证阶段，同时还可以看到上面介绍的方案即使能够实现纳米分辨，也仅限于对分子的单一化学键成像。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，旨在进一步提高现有CARS显微方法的分辨率。

本发明实施例是这样实现的，一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法包括以下步骤：

生成超短激光脉冲；

使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光，将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

本发明实施例的另一目的在于提供一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统，所述系统包括：

飞秒激光器，用于生成超短激光脉冲；

分光及非线性装置，用于使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

转化装置，用于将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光；

整形装置，用于将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

延迟装置，用于调节所述第二超短激光脉冲和附加探测光到达样品的时间，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光；

共线聚焦装置，用于使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

成像装置，用于获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

本发明实施例增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法的实现流程图；

图2是本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统的结构图；

图3是本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统的另一结构图；

图4是超连续谱激光、探测光和附加探测光在样品上的强度分布示意图；

图5是CARS纳米分辨显微镜分辨模拟结果，其中实线表示(附加探测光的峰值光强)为I_dep(泵浦光和斯托克斯光处于峰值光强时耗尽其产生的声子所需的附加探测光光强)50倍时得到点扩展函数，半高全宽为41纳米；虚线表示传统光学显微镜衍射限制下的点扩展函数。

图6是探测光频率、附加探测光频率、无用的CARS信号谱段和有用的CARS信号谱段的相对关系图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率，从而得到分子的完整CARS谱信号。

本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法包括以下步骤：

生成超短激光脉冲；

使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光，将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统包括：

飞秒激光器，用于生成超短激光脉冲；

分光及非线性装置，用于使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

转化装置，用于将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光；

整形装置，用于将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

延迟装置，用于调节所述第二超短激光脉冲和附加探测光到达样品的时间，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光；

共线聚焦装置，用于使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

成像装置，用于获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细描述。

图1示出了本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法的实现流程，详述如下。

在步骤S101中，生成超短激光脉冲；

本发明实施例采用飞秒激光器1生成超短激光脉冲10。

在步骤S102中，使上述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，该第二超短激光脉冲的波长与第三超短激光脉冲的波长不同；

本发明实施例具有多种途径使超短激光脉冲10产生第一超短激光脉冲11、第二超短激光脉冲12和第三超短激光脉冲13。

例如，第二超短激光脉冲12和第三超短激光脉冲13均由超短激光脉冲10经非线性效应产生。进一步地，第一超短激光脉冲11、第二超短激光脉冲12和第三超短激光脉冲13均可由超短激光脉冲10泵浦光参量振荡器2产生。具体地，飞秒激光器1生成的超短激光脉冲10泵浦光参量振荡器2(OpticalParameter Oscillator，OPO)，从而获得具有宽调谐范围的不同波长的超短激光脉冲输出，如图2所示。经光参量振荡器2输出的波长不变的超短激光脉冲作为第一超短激光脉冲11，经光参量振荡器2输出的闲频光作为第二超短激光脉冲12，经光参量振荡器2输出的信号光作为第三超短激光脉冲13，其中闲频光的中心波长较信号光的中心波长长至少300nm。

再如，仅第三超短激光脉冲13由超短激光脉冲10分光后经非线性效应产生。具体地，飞秒激光器1生成的超短激光脉冲10通过第一分光器BS1和第二分光器BS2分为三束，其中一束超短激光脉冲经倍频晶体3倍频后作为第三超短激光脉冲13，另外两束超短激光脉冲分别作为第一超短激光脉冲11和第二超短激光脉冲12，如图3所示。本实施例通过倍频使第二超短激光脉冲12的中心波长较第三超短激光脉冲13的中心波长长至少300nm。

在步骤S103中，将第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光，将第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

本发明实施例利用第一超短激光脉冲11泵浦光子晶体光纤(PCF)4获得超连续谱激光14，该超连续谱激光14包含用于产生声子的泵浦光和斯托克斯光，其中泵浦光和斯托克斯光的强度均呈高斯分布。同时，第三超短激光脉冲13通过相位波带片5整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光15，该附加探测光15(ω_P’2)的光强呈环形分布。此外，将延迟后的第二超短激光脉冲12作为探测光16，该探测光16(ω_P’1)的强度呈高斯分布。

作为优选，超连续谱激光14中各谱功率波动不大于50％，各光谱成分是连续的且光谱带宽为10～500纳米，且各光谱成分所在的时间范围不大于1皮秒。通过调节延迟装置61、62，使探测光16较附加探测光15延迟0.5～1皮秒到达样品7；附加探测光15的中心波长较探测光16的中心波长短，其间隔不小于有用的CARS信号的带宽；探测光16的带宽不大于5纳米。

在步骤S104中，使附加探测光与超连续谱激光同时共线聚焦于样品，该附加探测光与超连续谱激光产生的声子结合形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较附加探测光延迟到达样品的探测光与焦斑中心的声子结合形成有用的CARS信号；

只要泵浦光和斯托克斯光之间的频谱差与焦斑处的分子振动谱一致，并满足能量和相位匹配条件，就会发生相干共振，产生相应的声子。由于环形附加探测光对泵浦光和斯托克斯光在焦斑周边产生的声子具有耗尽作用，最终使泵浦光、斯托克斯光和探测光于焦斑中心共同作用产生的有用CARS信号远小于衍射极限，并随着附加探测光的增强，空间分辨率还可进一步获得改善。

本发明实施例中，超连续谱激光、附加探测光和探测光三者的焦斑中心重叠。图4示出了超连续谱激光、探测光和附加探测光沿焦斑径向(r)的强度(I)变化。利用量子光学理论所导出的空间分辨率(点扩散函数半高全宽)为

$\mathrm{\Δr}=\sqrt{2}\frac{\mathrm{\λ}}{\mathrm{\π}n\sin \mathrm{\α}\sqrt{3+\frac{I_{P1}^{\max }}{I_{\mathrm{dep}}}}}\≈\frac{0.9}{\sqrt{3+\frac{I_{P1}^{\max }}{I_{\mathrm{dep}}}}}\·\frac{\mathrm{\λ}}{2n\sin \mathrm{\α}}$

其中

和I_dep分别表示附加探测光的峰值光强以及泵浦光和斯托克斯光处于峰值光强时耗尽其产生的声子所需的附加探测光光强。从中可以看出，当不加附加探测光时，上面的表达式则给出非线性光学效应下衍射限制的极限空间分辨率，它比不考虑非线性光学效应时衍射极限所确定的值要改善倍，这和通常的非线性光学显微镜得到的结果是一致的。当附加探测光

加大时，则空间分辨率会获得进一步改善，例如

是I_dep的50倍时，则空间分辨率可达41纳米，如图5所示，远超过衍射极限所能达到的空间分辨率。原理上讲，只要

不断增加，空间分辨率就可不断获得改善。

本发明实施例通过调节第一延迟装置61和合束镜8使附加探测光15和超连续谱激光14经由显微物镜9同时共线聚焦于样品7，此时超连续谱激光14经聚焦形成一个焦斑，该焦斑作用于样品7产生声子。由于附加探测光15的光强呈环形分布，因此同时共线聚焦于样品7的附加探测光15的光子与声子碰撞形成无用的CARS信号并耗尽焦斑周边的声子。接着，调节第二延迟装置62使探测光16较附加探测光15延迟0.5～1皮秒到达，但共线聚焦于样品7。该探测光16的光子与焦斑中心区域的声子碰撞形成有用的CARS信号，如图6所示。

因本发明实施例采用的四束激光(泵浦光、斯托克斯光、探测光和附加探测光)均为超短激光脉冲，它们的持续时间远小于分子振动的退相时间，完全可以用时间分辨的方法(即强度为环形分布的附加探测光与超连续谱激光同时到达样品，而强度为高斯分布的探测光相对于附加探测光延迟)，消除非共振背景噪声。因此，只要超连续谱激光的时谱结构更适合CARS显微镜的要求，通过扫描不仅可获得远超过衍射极限的空间分辨率，而且可获得高信噪比的宽带、超宽带甚至分子完整CARS谱信号。因此，本发明实施例可测量纳米分辨范围内含有的分子种类，并可估计各种分子所占的比例。

在步骤S105中，获取有用的CARS信号，进行显微成像。

本发明实施例通过带通滤波片21将非共振背景噪声和无用的CARS信号滤除，再经由带EMCCD(Electron-Multiplying CCD)探测器的光谱仪22成像。

由于焦斑周边产生的无用CARS信号与焦斑中心区域产生的有用CARS信号具有完全分离的光谱波段，可以通过带通滤波片将二者分离。通过上述附加探测光压缩了产生有用CARS信号的体积，不仅能够获得纳米级的空间分辨本领，而且由于探测光相对于超连续谱激光具有小于1皮秒的时间延迟，从而还同时抑制了非共振背景噪声，以高的光谱分辨率获得分子的完整CARS谱信号。在此基础上，通过纳米微位移台移动样品或高精度振镜扫描，则可获得待测生物样品不同分子的CARS三维纳米分辨显微图像。

例如，通过上述四束激光(泵浦光、斯托克斯光、探测光和附加探测光)聚焦焦斑的扫描或样品的纳米位移获得样品任意深度的三维超衍射极限的空间分辨率图像。

图2和图3示出了本发明实施例提供的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统的结构原理，为了便于描述，仅示出了与本发明实施例相关的部分。

飞秒激光器1用于生成超短激光脉冲10。

分光及非线性装置用于使超短激光脉冲10产生第一超短激光脉冲11、第二超短激光脉冲12和第三超短激光脉冲13，其中第二超短激光脉冲12的波长与第三超短激光脉冲13的波长不同。

转化装置用于将第一超短激光脉冲11转化为超连续谱激光14。该转化装置具有一供第一超短激光脉冲11泵浦的光子晶体光纤(PCF)4。

整形装置5用于将第三超短激光脉冲13整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光15。

延迟装置61、62用于调节第二超短激光脉冲12和附加探测光15到达样品7的时间，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光16。

共线聚焦装置用于使附加探测光15与超连续谱激光14同时共线聚焦于样品7，超连续谱激光14产生的声子与附加探测光15的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较附加探测光15延迟到达样品7的探测光16的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号。

成像装置用于获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

本发明实施例中，分光及非线性装置可为光参量振荡器2或由分光器BS和倍频晶体3构成。共线聚焦装置主要由合束镜8和显微物镜9构成。成像装置包括带通滤波片21和带EMCCD(Electron-Multiplying CCD)探测器的光谱仪22。

本发明实施例增加一与泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹配条件的光子则与焦斑中心的声子碰撞后形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。因采用具有宽带的超连续谱激光作为泵浦光和斯托克斯光，从而获得分子的完整CARS谱信号，实现分子成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

生成超短激光脉冲；

使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光，将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

2.如权利要求1所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述第三超短激光脉冲由所述超短激光脉冲经非线性效应产生，或者所述第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲均由所述超短激光脉冲经非线性效应产生。

3.如权利要求2所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲均由所述超短激光脉冲泵浦光参量振荡器产生；

经所述光参量振荡器输出的波长不变的超短激光脉冲作为所述第一超短激光脉冲，经所述光参量振荡器输出的闲频光作为所述第二超短激光脉冲，经所述光参量振荡器输出的信号光作为所述第三超短激光脉冲。

4.如权利要求1所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述第三超短激光脉冲由所述超短激光脉冲分光后经非线性效应产生。

5.如权利要求4所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述超短激光脉冲分为三束，其中一束超短激光脉冲经倍频作为所述第三超短激光脉冲，另外两束超短激光脉冲分别作为所述第一超短激光脉冲和第二超短激光脉冲。

6.如权利要求1～5中任一项所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述超连续谱激光包含用于产生声子的泵浦光和斯托克斯光，所述泵浦光、斯托克斯光和探测光的强度均呈高斯分布，所述附加探测光的强度呈环形分布。

7.如权利要求6所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述超连续谱激光由所述超短激光脉冲泵浦光子晶体光纤产生。

8.如权利要求6所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述超连续谱激光中各谱功率波动不大于50％，各光谱成分是连续的且光谱带宽为10～500纳米，且各光谱成分所在的时间范围不大于1皮秒。

9.如权利要求1～5中任一项所述的超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微方法，其特征在于，所述探测光较所述附加探测光延迟0.5～1皮秒；所述附加探测光的中心波长较所述探测光的中心波长短，所述附加探测光的中心波长与所述探测光的中心波长的间隔不小于所述有用的CARS信号的带宽；所述探测光的带宽不大于5纳米。

10.一种超衍射极限相干反斯托克斯拉曼散射显微系统，其特征在于，所述系统包括：

飞秒激光器，用于生成超短激光脉冲；

分光及非线性装置，用于使所述超短激光脉冲产生第一超短激光脉冲、第二超短激光脉冲和第三超短激光脉冲，所述第二超短激光脉冲的波长与所述第三超短激光脉冲的波长不同；

转化装置，用于将所述第一超短激光脉冲转化为超连续谱激光；

整形装置，用于将所述第三超短激光脉冲整形为中心光强小、周边光强大的附加探测光；

延迟装置，用于调节所述第二超短激光脉冲和附加探测光到达样品的时间，将延迟后的第二超短激光脉冲作为探测光；

共线聚焦装置，用于使所述附加探测光与所述超连续谱激光同时共线聚焦于样品，所述超连续谱激光产生的声子与所述附加探测光的光子碰撞后形成无用的CARS信号，并将焦斑周边的声子耗尽，较所述附加探测光延迟到达样品的探测光的光子与焦斑中心区域的声子碰撞后形成有用的CARS信号；

成像装置，用于获取所述有用的CARS信号，进行显微成像。

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