CN102140128A - 一种重组人干扰素β1a的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其包括以下步骤：1)对样品进行蓝胶层析，收集重组人干扰素β1a活性峰；2)对蓝胶层析产物进行超滤脱盐；3)对超滤脱盐产物进行Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用上述缓冲液洗脱至基线，再用pH8.3～8.7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰；4)对阴离子交换层析产物进行S-200分子筛层析，得到重组人干扰素β1a。采用该纯化方法目标蛋白不易失活，纯化得到的目的蛋白纯度和生物学比活性高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程重组蛋白纯化领域，尤其涉及一种采用阴离子交换层析技术对重组人干扰素β1a进行分离纯化的方法。
背景技术
人干扰素β(IFN-β)是具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要细胞因子，主要由成纤维细胞和某些上皮细胞产生，普通的干扰素诱生剂，例如病毒、双链RNA和一些微生物均能够诱导IFN-β的产生。自然IFN-β是一种糖蛋白(糖分约占20％)，相对分子质量约20000，由166个氨基酸组成，有21个氨基酸组成的信号肽，在S-M之间切开。在分子的第17位、31位、141位为Cys，在31位和141位之间形成的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。hIFN-β基因长777bp，位于染色体9p22，与IFN-α基因簇邻近。人白细胞干扰素与成纤维细胞干扰素之间在核苷酸水平上有45％的同源性，在氨基酸水平上有29％的同源性。IFN-α与IFN-β基因均无内含子。IFN-α与I FN-β结合于同一受体，但后者与受体的亲和力大于前者。
美国FDA已于1993批准IFN-β1b(大肠杆菌表达)和1996年批准IFN-β1a(CHO细胞表达)用于治疗多发性硬化症(MS)。目前，IFN-β是能够控制MS反复发作的唯一药物。据估计，我国MS患者至少有数十万人，迄今尚无特效药。CHO细胞与大肠杆菌表达的IFN-β1a相比，具有较高的抗病毒比活性，较小的副作用以及较长的半衰期。
目前报道的纯化方法使用CM阳离子层析，缓冲液pH在7.2～5.0之间变换，蛋白极易变形，活性损失大，操作繁琐，工艺放大难度大。
亟需建立一种适合大规模生产且生产成本低的重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)分离纯化方法，以满足大量患者的需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种工艺稳定、容易放大、适合大规模生产且生产成本低的重组人干扰素β1a分离纯化方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种重组人干扰素β1a的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)对样品进行蓝胶层析，收集重组人干扰素β1a活性峰；
2)对蓝胶层析产物进行超滤脱盐；
3)对超滤脱盐产物进行Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，用pH 8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用上述缓冲液洗脱至基线，再用pH8.3～8.7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰；
4)对阴离子交换层析产物进行S-200分子筛层析，得到重组人干扰素β1a。
所述的步骤1)中的样品为灌流培养细胞收集液，用Tris-HCl缓冲液超滤浓缩获得。所述的超滤浓缩的截留分子量为5K，用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HC l缓冲液浓缩至原体积的1/4～1/6。
所述的步骤1)具体为：用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6Fast Flow层析柱，上样后，先用上述缓冲液淋洗至基线，再用pH8.3～8.7、含2mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱至基线后，而后再用pH8.3～8.7、含2mol/L NaCl和60％乙二醇的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰。
所述的步骤2)具体为：用pH8.3～8.7的20mmo l/L Tris-HCl缓冲液进行超滤脱盐，其截留分子量为5K，超滤脱盐至电导率低于1μS/cm。
所述的步骤3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱缓冲液中NaCl终浓度为1mol/L。
所述的步骤4)具体为：用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Sephacryl S200柱，上样后，用上述缓冲液洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰。
所述的步骤4)收集得到重组人干扰素β1a活性峰用0.22μm过滤器过滤并无菌收集。
本发明中重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)的分离纯化方法特点是：①重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)产品纯度高，由已有工艺的95％以上提高到99％以上。②重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)产品活性回收率高，由已有工艺的30％提高至40％以上。③重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)产品生物学比活性由已有工艺的2×108IU/mg提高到2.5×108IU/mg以上。④纯化工艺中缓冲液pH始终保持一致，工艺过程不跨越目的蛋白等电点，有利于蛋白保持稳定。⑤工艺过程步骤少，操作简便，不需特殊试剂，易放大。
附图说明
图1是本发明分离纯化方法中蓝胶层析的色谱图；
图2是本发明分离纯化方法中QFF阴离子交换层析的色谱图；
图3是本发明分离纯化方法中S-200分子筛层析的色谱图；
图4是本发明分离纯化方法中各纯化步骤得到的产物的SDS电泳图。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按制造厂商建议的条件。
本发明所述的Q-Sepharose Fast Flow，简称QFF，其是一种强阴离子交换色谱柱，可从美国GE Healthcare公司购得。
实施例：
通过细胞培养罐连续灌流培养含重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)的无血清培养液，经以下纯化方法进行纯化：
1.超滤浓缩：
用截留分子量为5K的滤膜超滤，用pH8.5的20mmol/L Tris-HCl缓冲液浓缩至原体积的1/5。
2.Blue Sepharose 6Fast Flow层析(蓝胶层析)
2.1平衡：以40ml/min的流速用20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡Blue Sepharose 6Fast Flow层析柱，直至流出液pH为8.5。
2.2上样：以40ml/min流速，将过滤后的细胞收集液上样。
2.3淋洗：用20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)缓冲液以30ml/min的流速淋洗至基线。
2.4第一步洗脱：用含2mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液以40ml/min的流速洗脱。
2.5第二步洗脱：用含2mol/L NaCl和60％乙二醇的20mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液以30ml/min的流速洗脱并收集重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)活性峰。蓝胶层析的色谱图如图1所示，峰4为重组人干扰素β1a的活性峰。
3.超滤脱盐
用截留分子量为5K的滤膜超滤，用pH8.5的20mmol/L Tris-HCl缓冲液超滤更换缓冲液至电导率为0.5μS/cm。
4.Q-Sepharose Fast Flow层析(QFF阴离子交换层析)
4.1平衡：20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡柱床平衡流速为30ml/min，淋洗5倍柱体积。
4.2上样：以30ml/min的流速将蓝胶层析得到的样品上样于QFF层析柱。
4.3淋洗：上样完毕后，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)缓冲液淋洗2倍柱体积至基线。
4.4洗脱：用含1mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl(pH8.5)梯度洗脱，收集重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)活性峰至250ml盐水瓶中。QFF阴离子交换层析的色谱图如图2所示，峰2为重组人干扰素β1a的活性峰。
5.S-200分子筛层析
5.1平衡：用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液以8ml/min的流速平衡2倍柱体积。
5.2上样：上样流速为8ml/min，上样量应不超过柱体积的5％。
5.3洗脱：用20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)缓冲液以8ml/min的流速洗脱。从活性峰开始出现收集至峰下行至基线时停止收集。用0.22μm的一次性过滤器，无菌过滤重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)产品至无菌盐水瓶中，即为最终纯化的重组人干扰素β1a(rhIFN-β1a)产品原液。S-200分子筛层析的色谱图如图3所示，峰1为重组人干扰素β1a的活性峰。
对各纯化步骤得到的产物测定比活力并计算回收率，结果如表1所示。
表1
由表1可知，采用本发明的分离纯化方法，纯化得到的重组人干扰素β1a的生物学比活性为2.8×108U/mg，活性回收率为45％。本发明中重组人干扰素β1a的生物学活力测定方法和蛋白质浓度测定方法分别采用现行版《中国药典》三部附录XC干扰素生物学活性测定法和附录VIB蛋白质测定法第二法Lowry法。生物学比活性值由生物学活性测定值除以蛋白质浓度测定值而得。
对各纯化步骤后得到的产物进行SDS-PAGE电泳并分析，如图4所示，第一道上样品为细胞收集液，第二道上样品为蓝胶层析的活性峰收集液，第三道为Marker(从上到下条带分别为97、66、45、30、20.1、14.4kDa)，第四道上样品为QFF阴离子交换层析的活性峰收集液，第五道上样品为S200分子筛层析的活性峰收集液。纯化得到的重组人干扰素β1a的纯度接近100％。
Claims (8)
1.一种重组人干扰素β1a的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)对样品进行蓝胶层析，收集重组人干扰素β1a活性峰；
2)对蓝胶层析产物进行超滤脱盐；
3)对超滤脱盐产物进行Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，用pH 8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡柱床，上样后先用上述缓冲液洗脱至基线，再用pH8.3～8.7含NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰；
4)对阴离子交换层析产物进行S-200分子筛层析，得到重组人干扰素β1a。
2.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中的所述样品为灌流培养细胞收集液，用Tris-HCl缓冲液超滤浓缩获得。
3.根据权利要求2所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，所述的超滤浓缩的截留分子量为5K，用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液浓缩至原体积的1/4～1/6。
4.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)具体为：用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Blue Sepharose 6Fast Flow层析柱，上样后，先用上述缓冲液淋洗至基线，再用pH8.3～8.7、含2mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱至基线后，而后再用pH8.3～8.7、含2mol/L NaCl和60％乙二醇的20mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰。
5.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)具体为：用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行超滤脱盐，截留分子量为5K，超滤脱盐至电导率低于1μS/cm。
6.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中的洗脱为梯度洗脱，洗脱缓冲液中NaCl终浓度为1mol/L。
7.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)具体为：用pH8.3～8.7的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Sephacryl S200柱，上样后，用上述缓冲液洗脱，收集重组人干扰素β1a活性峰。
8.根据权利要求1所述的重组人干扰素β1a的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)收集得到重组人干扰素β1a活性峰用0.22μm过滤器过滤并无菌收集。
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