CN102146126A - 一种与抗虫相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与抗虫相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)SEQ ID NO：2所示的蛋白质；2)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明培育转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗虫植物品种的培育与鉴定。

Description

一种与抗虫相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与抗虫相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

当前在世界范围内，由于昆虫侵害对农作物造成的产量损失是非常巨大的。传统上控制昆虫侵害最普遍采用的途径是大量施用化学杀虫剂。化学杀虫剂的使用在取得了一定经济效益的同时，也带来了农药残毒、环境污染、生态破坏、害虫抗药性和再猖獗等严重问题。为适应农业可持续发展、环境保护和人类安全的需要，大力加强农业生物性灾害的可持续控制研究，是人类共同面临的问题，也是该领域科学研究面临的严峻挑战。因此，研究和利用植物的自身抗性基因从而有效控制农业虫害成为人类孜孜以求的目标。

在长期的进化过程中，植物为了抵抗来自昆虫的捕食，建立起了复杂多样的抗性反应机制。而植物激素茉莉酸在调控植物对昆虫侵害、病原物入侵及机械伤害等生物性和非生物性胁迫的防御性反应中起重要作用。茉莉酸在调控植物对病虫抗性方面的作用发现于上世纪90年代初，此后人们经过十多年的努力，在模式植物拟南芥和番茄中研究茉莉酸的生物合成和信号转导方面都取得了重要进展。目前人们认识到的茉莉酸信号途径包括3个在拟南芥和番茄中都保守的重要信号转导元件：COI1，JAZ蛋白和转录因子MYC2。COI1编码一个F-box蛋白，在体内形成SCF^COI1泛素连接酶复合体，最近的研究表明COI1是活性茉莉酸(JA-Ile)的受体。遗传和生化证据表明JAZ家族蛋白是SCF^COI1泛素连接酶复合体的底物，在茉莉酸诱导的基因表达中起到抑制因子的作用。茉莉酸诱导的基因表达受到MYC2和其它转录因子的调控。在正常情况下，JAZ蛋白抑制MYC2的转录激活活性，茉莉酸信号途径处于关闭状态；而在病原菌或昆虫侵害的情况下，活性茉莉酸促进COI1和JAZ蛋白的相互作用并把后者降解，进而释放MYC2的功能而诱导相关基因的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗虫相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物抗虫相关的蛋白的编码基因，名称为SlNAC072，来源于番茄属番茄(Solanum lycopersicon)。

本发明所提供的与植物抗虫相关的蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

2)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。

本发明所提供的与植物抗虫相关的蛋白的编码基因是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO：1中第28-1077位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

所述严格条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1×SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

为了使蛋白SlNAC072便于纯化，可在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的SlNAC072基因可人工合成。上述2)中的SlNAC072的编码基因可通过将SEQ ID NO：1自5′末端第28-1077位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

含有上述与番茄抗虫相关蛋白编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为在pCAMBIA2300-35S-OCS的多克隆位点间插入上述编码基因得到的重组表达载体。

扩增与上述与抗虫相关基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种培育抗虫性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗虫性增强的转基因植物的方法，是将上述任一所述的编码基因转入出发植物中，得到抗虫性强于所述出发植物的转基因植物。

上述方法中，所述编码基因是通过上述任一所述的重组表达载体导入所述出发植物中。

所述出发植物可为双子叶植物，所述双子叶植物具体可为番茄。

所述虫为昆虫；所述昆虫具体可为棉铃虫。

实验证明，本发明的蛋白SlNAC072是一个转录因子，其通过调节一些下游抗性相关基因的表达来调控植物对昆虫的抗性。过量表达SlNAC072的转基因番茄在受到昆虫侵害时，会比野生型番茄积累更多的抗性相关蛋白PIs，使其对昆虫的抗性提高。利用SlNAC072过量表达的转基因材料可以获得对昆虫抗性较强的植物转基因品系或品种。因此，蛋白SlNAC072及其编码基因可用于农牧业和生态环境治理所需的抗虫植物品种的培育与鉴定，在植物抗虫育种领域中具有重要作用。

附图说明

图1为SlNAC072作为转录因子的转录激活活性检验。

图2为过量表达SlNAC072番茄的抗虫表型结果。

图3为过量表达SlNAC072番茄被虫咬后PI-II的mRNA表达量检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

番茄(Solanum lycopersicon)品种M82，公众可从美国番茄遗传资源中心(TGRC，http://tgrc.ucdavis.edu/)获得。

实施例1、目的基因的克隆与过量表达SlNAC072转基因番茄的获得

一、目的基因的克隆

提取番茄(Solanum lycopersicon)品种M82的总RNA，以其反转录产物为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增。

引物1：5′-TCTGGTACCATGGGTGTTCAAGAAAAAGATCCAC-3′(上游引物，下划线部分碱基为Kpn I识别位点)

引物2：5′-CAGCTGCAGCTACTGCTTGAACCCGAGATTTAAC-3′(下游引物，下划线部分碱基为Pst I识别位点)

反应结束后对PCR产物进行纯化并连入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性质粒进行测序，结果在pMD18-T中插入了两端带有Kpn I识别位点和Pst I识别位点的SEQ ID NO：1中第28-1077位核苷酸所示基因，表明构建的重组载体正确，记作pMD18-SlNAC072。SEQ ID NO：1中第28-1077位核苷酸所示基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该蛋白质的分子量为39.47KD，等电点为8.43。

二、过量表达SlNAC072转基因番茄的获得

载体pCAMBIA2300-35S-OCS在文献“Wu S，Yu Z，Wang F.2007.Cloning，characterization，and transformation of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene(ZmPEAMT1)in maize(Zea mays L.).Mol Biotechnol36：102-112”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

根癌农杆菌AGL0在文献“Li C，Liu G，Xu C，Lee G，Bauer P，Ganal M，Ling H and Howe GA.(2003).The tomato Suppressor of prosystemin-mediated response2 gene encodes a fatty acid desaturase required for the biosynthesis of jasmonic acid and the production of a systemic wound signal for defense gene expression.The Plant Cell.15，1646-1661”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

用限制性内切酶Kpn I和Pst I双酶切pMD18-SlNAC072，回收基因SlNAC072片段；用限制性内切酶Kpn I和Pst I双酶切载体pCAMBIA2300-35S-OCS，回收载体大片段；将回收的基因SlNAC072片段和回收的载体大片段连接，得到重组表达载体。将该重组表达载体进行测序鉴定，结果，在载体pCAMBIA2300-35S-OCS的Kpn I和Pst I酶切位点间插入了SEQ ID NO：1中第28-1077位核苷酸所示基因，表明构建的重组表达载体正确，将该阳性重组表达载体记作pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS。

将重组表达载体pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS  和空载体pCAMBIA2300-35S-OCS分别转化根癌农杆菌AGL0，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上筛选，得到阳性重组子，分别记作AGL0-pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS和AGL0-pCAMBIA2300-35S-OCS。

分别用AGL0-pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS    和AGL0-pCAMBIA2300-35S-OCS转化番茄常规品种M82，具体步骤如下：

1、植物材料：番茄常规品种M82。

2、培养基成分：

液体MS培养基：将4.4g MS、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，得到液体MS培养基。

种子生长培养基(1/2MS培养基)：将2.2g MS、30g蔗糖和水混合，用水定容至1L，加0.8％的琼脂，得到1/2MS培养基。

预(共)培养培养基(D1)：将4.4g MS、1.0mg玉米素(Zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，加0.8％的琼脂；

筛选分化培养基(2Z)：将4.4g MS、2.0mg玉米素(Zeatin)、50mg卡那霉素(Kanamycin)、100mg肌醇(Inositol)、0.5mg叶酸(Folic acid)和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，加0.8％的琼脂；

生根培养基：将4.4g MS、50mg Kanamycin、0.5mg Folic acid、0.5mg吲哚丁酸(IBA)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1L，加0.8％的琼脂。

以上药品均购自Sigma公司，货号分别为MS(M0404)，Zeatin(Z3541)，Folic acid(F8758)，Inositol(I7508)。

3.植物材料的准备

取番茄常规品种M82，挑选饱满、粒大种子，用10％NaClO浸泡15-20min，再用无菌水冲洗5遍，播种于种子生长培养基上，于25℃光照培养。7-8d萌发后，在无菌条件下将子叶切成小方块，将子叶小方块接种于预培养培养基中，于25℃、16小时光照/8小时黑暗、光强70microeinsteins m^-2s^-2的条件下培养，1-2d后，可用于转化。

4.根癌农杆菌菌株及培养

农杆菌菌液的制备：挑取阳性单一重组菌落AGL0-pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS或AGL0-pCAMBIA2300-35S-OCS分别接种于LB液体培养基(附加50mg/L Kan)中并于28℃、200rpm过夜培养，至OD600＝0.6-0.7。菌液以5000r/min离心10min，弃上清，收集菌体。用液体MS培养基重新悬浮菌体，稀释至OD600＝0.3-0.4后，以备转化之用。

5.外植体的转化、筛选与生根

采用“叶盘法”。将步骤3得到的子叶块分别浸入制备好的农杆菌菌液AGL0-pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS和AGL0-pCAMBIA2300-35S-OCS 10分钟。然后接种于D1培养基上(培养基上放滤纸)共培养2d，转入到筛选分化培养基(2Z)中筛选培养，每2周继代一次，培养5-8周后产生抗性芽。当不定芽伸长至2-3cm时，用解剖刀将抗性芽切下，并转接至生根培养基上，进行生根培养。将生根的T0代转基因植株移入土中常规管理，收获T0代转基因植株的种子。

共培养、筛选培养、生根培养的条件均为：温度为25℃、16小时光照/8小时黑暗、光强50-60microeinsteins m^-2s^-2。

根据pCAMBIA2300-35S-OCS载体多克隆位点前的35S启动子序列和SlNAC072编码序列设计引物用于转基因植物的鉴定，引物序列如下：

引物3：5′-AAGACTGGCGAACAGTTCATACAGA-3′

引物4：5′-GTTGTCGCTGTGAATGTGGT-3′

利用PCR的方法，在引物3和引物4的引导下对获得的转基因植株进行鉴定，得到PCR鉴定正确的转pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS植株7株，经荧光定量RT-PCR检测，转基因植物中SlNAC072的mRNA丰度显著提高，确证得到了过量表达SlNAC072的转基因番茄。

三、SlNAC072对昆虫抗性的遗传调控

种植T0代转基因植株的种子，得到T1代转基因植株，从中鉴定出转基因纯合体并繁种，用于后续的昆虫饲喂实验。纯合体鉴定方法：T1代转基因植株单株收种后，分别将30-40粒种子消毒后播在含100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选(野生型M82在这种培养基上生长会受到严重抑制，表现为主根较短，侧根基本不发生，而转基因材料由于具有卡那霉素抗性生长基本不受抑制，主根和侧根的发生都很正常)，若某一个T1代转基因植株收获的种子都表现为对卡那霉素抗性，则该T1代转基因植株为纯合体，其收获的种子也都是纯合体，可以用于后续的昆虫饲喂实验。

昆虫饲喂实验：

棉铃虫(Helicoverpa armigera)在文献“Wu K.，Y.Lu，H.Feng，Y.Jiang，and J.Zhao.2008.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areas with Bt toxin-containing cotton.Science.321(5896)：1676-1678.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

昆虫饲喂前，转基因纯合植物在常规条件下培养：光照16小时，黑暗8小时，光照强度70microeinsteins m^-2s^-2，温度25℃。待植物长至4-6片真叶完全展开(大约需30天)时，取长势一致的2龄期棉铃虫小心放到植物上，任其自由取食。各取20株转入pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植株和转入pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS的转基因植株进行试验，每棵植物放3头棉铃虫。待到饲喂第9天，对植物进行拍照记录，并采集叶片提取RNA用于后续分析。同时以相同条件下培养的但未接虫的转pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS植物和以相同条件下培养的但未接虫的转pCAMBIA2300-35S-OCS植物作为对照。

结果表明，纯合的转基因番茄在受到机械损伤或昆虫嚼食后会积累更多的抗性相关蛋白PIs，与转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的M82相比，过量表达SlNAC072的转基因番茄(35S::SlNAC072)对昆虫的抗性显著提高，具体表现为：

1)在绝大部分转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植物叶片被昆虫嚼食尽时，转基因植物的叶片基本保持完整；野生型番茄与转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植物表现相同。

2)饲喂9天后，转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植物的生长点基本被嚼食干净，而转基因植物的生长点基本没受到破坏，(图2，A为饲喂前；B为饲喂9天后)；野生型番茄与转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植物表现相同。

3)PI-II作为番茄茉莉酸信号转导途径中的一个重要的标记基因，长期以来一直被用来衡量对昆虫的抗性。检测饲喂第9天后的转基因植株和转入空载体pCAMBIA2300-35S-OCS的对照植株中PI-II的mRNA表达量。

检测PI-II的RT-PCR引物为

引物F：5′-AATTATCCATCATGGCTGTTCAC-3′

引物R：5′-CCTTTTTGGATCAGATTCTCCTT-3′

结果如图3所示(图3中，A为未接虫的转pCAMBIA2300-35S-OCS植物，B为接虫后的转pCAMBIA2300-35S-OCS  植物，C  为未接虫的转pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS  植物，D  为接虫后的转pCAMBIA2300-35S-SlNAC072-OCS植物)。与转pCAMBIA2300-35S-OCS对照植物相比，过量表达SlNAC072的转基因番茄在受到昆虫嚼食后积累了更多的PI-II，表明过量表达SlNAC072的转基因番茄对昆虫的抗性显著提高。

实验重复3次，结果一致。

实施例2、SlNAC072的转录激活活性验证

一、目的基因的克隆

载体pGBKT7购自美国Clontech公司，产品目录号为630442。pGADT7购自美国Clontech公司，产品目录号为630443。

根据SlNAC072的cDNA序列及载体pGBKT7适宜的酶切位点设计引物扩增SlNAC072的全长编码序列，N末端编码序列和C末端编码序列，引物序列如下：

引物5：5′-CATATGGGTGTTCAAGAAAAAGA-3′(全长编码序列上游引物，下划线部分碱基为Nde I识别位点)

引物6：5′-CTGCAGCTACTGCTTGAACCCGAGAT-3′(全长编码序列下游引物，下划线部分碱基为Pst I识别位点)

引物7：5′-CATATGGGTGTTCAAGAAAAAGA-3′(N末端编码序列上游引物，下划线部分碱基为Nde I识别位点)

引物8：5′-CTGCAGCTATGGTCCACTTGAATTCTTCT-3′(N末端编码序列下游引物，下划线部分碱基为Pst I识别位点)

引物9：5′-CATATGAAACCTCTGATGTCTGGTTT-3′(C末端编码序列上游引物，下划线部分碱基为Nde I识别位点)

引物10：5′-CTGCAGCTACTGCTTGAACCCGAGAT-3′(C末端编码序列下游引物，下划线部分碱基为Pst I识别位点)

以实施例1中获得的pMD18-SlNAC072为模板，分别在引物5和引物6，引物7和引物8，引物9和引物10的引导下，进行PCR扩增，分别得到1050bp，504bp和546bp大小的片段。对PCR产物纯化后测序，表明三条片段分别具有序列表中SEQ IDNO：1自5′端第28-1077，第28-531和第532-1077位的核苷酸序列。

二、重组载体的构建

将上述步骤一中扩增得到的3个DNA片段用限制性内切酶Nde I和Pst I进行双酶切，然后将经纯化的酶切产物与经Nde I和PstI双酶切后的载体pGBKT7连接，将连接产物进行酶切和测序鉴定，分别将鉴定表明含有SlNAC072的全长编码序列(SEQID NO：1自5′端第28-1077)，N末端编码序列(SEQ ID NO：1自5′端第28-531)和C末端编码序列(SEQ ID NO：1自5′端第532-1077)的正确的重组表达载体命名为pGBKT7-F，pGBKT7-N和pGBKT7-C。

三、转录激活活性检验

酵母AH109购自美国Clontech公司。pGADT7载体上含有AD，pGBKT7载体上含有BD。

将步骤二中得到的三个重组表达载体pGBKT7-F，pGBKT7-N和pGBKT7-C分别和pGADT7共转化进新鲜制备的酵母AH109感受态，然后分别涂布在二缺(SD/Trp-Leu-)和四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade-)平板培养基上，30℃倒置培养4～6天。结果表明(图1)，分别含有三个重组表达载体和阴性对照(BD，pGBKT7)的酵母都能在二缺(SD/Trp-Leu-)平板上长出菌落，表明转化成功；但只有转化进pGBKT7-F和pGBKT7-C的酵母能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade-)平板上长出菌落。四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade-)平板上长出的菌落经X-GAL(购自美国Amresco公司，货号0428)染色可以染成蓝色，进一步表明转化进pGBKT7-F和pGBKT7-C的酵母都成功激活了β-半乳糖甘酶活性(β-gal activity)，而这种激活必然是因为SlNAC072的全长和C-末端具有转录激活活性所造成的。

上述实验结果表明SlNAC072具有转录激活活性，并且这种转录激活活性依赖于它的C末端序列。

图1中，1表示AD+BD-SlNAC072，2表示AD+BD-SlNAC072-N，3表示AD+BD-SlNAC072-C，4表示AD+BD。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗虫性相关的由1)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)-4)中任一所述：

1)SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO：1中第28-1077位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pCAMBIA2300-35S-OCS的多克隆位点间插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。

6.扩增权利要求2或3所述编码基因中任一片段或其全长的引物。

7.一种培育抗虫性增强的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入出发植物中，得到抗虫性强于所述出发植物的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述出发植物中。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述出发植物为双子叶植物；所述双子叶植物为番茄。

10.根据权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于：所述虫为昆虫；所述昆虫为棉铃虫。

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