CN102138869B - 基于肽的用于毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于肽的用于毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂。已经确定，肽对毛发、皮肤和指甲具有很高的结合亲和力。本发明描述了基于肽的毛发调理剂、毛发着色剂、皮肤调理剂、皮肤着色剂、和指甲着色剂。基于肽的毛发调理剂和毛发着色剂由一种分别与毛发调理剂或着色剂偶联的毛发-结合肽组成。基于肽的皮肤调理剂和皮肤着色剂由一种分别与皮肤调理剂或着色剂偶联的皮肤-结合肽组成。基于肽的指甲着色剂由一种与着色剂偶联的指甲-结合肽组成。在所有的这些组合物中，肽可以直接与活性试剂偶联，或者可以通过一种间隔物来偶联。同时本发明还描述了包含这些基于肽的调理剂和着色剂的个人护理组合物。

Description

基于肽的用于毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂

本申请是申请日为2004年9月8日的中国专利申请200480001202.2“基于肽的用于毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂”的分案申请。

本专利申请要求享有2003年9月8日提交的美国临时专利申请60/501498和2004年4月15日提交的美国临时专利申请60/562645的利益。

技术领域

本发明涉及个人护理产品领域。更具体的，本发明涉及基于特异性皮肤结合肽、毛发结合肽、和指甲结合肽的皮肤调理剂、毛发调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂和皮肤着色剂。

背景技术

成膜物质作为调理剂和保湿剂，被广泛应用于进行皮肤和毛发护理的组合物中，以保护皮肤和毛发避免环境和化学品的伤害。这些物质吸附在皮肤或毛发上和/或被皮肤或毛发吸收，从而形成一种保护膜。常用的成膜物质包括合成的聚合物，如聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸聚合物、和多糖、和蛋白质，如胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、丝蛋白和豆蛋白。已知许多蛋白是非常有效的成膜试剂。因为在用于皮肤和毛发护理产品中的条件下，蛋白的溶解性较低，因此蛋白通常以蛋白水解后所形成的肽的形式使用。

在毛发护理和毛发着色组合物中，成膜物质用于在毛发表面形成一种保护膜，以保护毛发免受由修饰和定型、洗发和暴露于紫外线和通常应用于永久性卷发剂(wave agent)、毛发着色产品、漂白剂和毛发拉直剂(straightener)中的活性化学品所导致的损害，上述化学品能够使毛发角蛋白变性。此外，这些成膜物质能够增强毛发的弹性。应用于毛发护理产品中的成膜物质包括蛋白，如角蛋白、胶原蛋白、豆蛋白和丝蛋白、以及它们的水解产物，和聚合物材料，如聚丙烯酸酯、长链烷基季铵化胺、和硅氧烷聚合物。例如，在美国专利号6,013,250中，Cannell等描述了一种毛发护理组合物，其用于处理毛发，使之免受化学品和紫外线的损害。该组合物包含水解蛋白，具有丰富的阴离子氨基酸，尤其是含硫的氨基酸和二价的阳离子。该公开内容提示水解蛋白中的阴离子成分通过阳离子桥的方式结合到毛发上。氨基酸和它们的衍生物也已经被应用于毛发护理组合物中，以调节毛发并增强其强度。例如，在WO 0051556中，O’Toole等描述了包含四种或更多种氨基酸成分的毛发护理组合物，氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸、和半胱氨酸。

成膜物质还被应用于皮肤护理组合物中，使之在皮肤上形成一种保护膜。这些膜能够润滑皮肤并在皮肤上形成涂层以被动地防止皮肤水分的蒸发，并且能使皮肤光滑和柔软。在皮肤护理组合物中通常使用的成膜物质包括水解动物和植物蛋白(Puchalski等，美国专利号4,416,873，El-Menshawy等，美国专利号4,482,537，和Kojima等，JP02311412)和丝蛋白(Philippe等，美国专利号6,280,747和Fahnestock等，共同未决的美国专利申请号10/704337)。在皮肤护理组合物中也已经使用了氨基酸和衍生物作为调节剂。例如，JP06065049中，Kojima等描述了包含氨基酸和/或其衍生物和二十二碳六烯酸、其盐或其酯的皮肤护理组合物。

毛发着色剂可分为三类，具体地分为永久性、半永久性或直接的、和临时的。永久性毛发染料通常是氧化染料，其能够使毛发的色彩维持大约四到六周。这些氧化毛发染料由两部分组成，一部分除其它成分之外包含氧化染料，第二部分包含一种氧化剂，如过氧化氢。在使用前，将上述两种组分立即混合在一起。氧化剂氧化染料前体，氧化后的产物在毛干内结合在一起形成巨大的带有颜色的分子。虽然氧化毛发染料能够使色彩长时间维持，但是其中所包含的氧化剂却使毛发受到损害。半永久性或直接的毛发染料是预先形成的染料分子，然后施用到毛发上，其能够使毛发的色彩维持大约六到十二次洗发次数。这种类型的毛发染料因为不含过氧化物，因此对于毛发来说比较温和，但是毛发的色彩维持的时间不够长。通过使用纳米颗粒毛发着色材料能够提高色彩的耐久性，纳米颗粒的粒径在10-500纳米之间，在WO01045652中，Hensen等描述了上述内容。这些纳米颗粒毛发着色物质是常规的直接毛发染料，经处理，获得纳米大小的尺寸，并由此提高了毛发对其的吸收。临时毛发染料是一种施用到毛发表面上并经一次洗发就能去掉的着色剂。现在需要开发一种不使用损伤毛发的氧化剂就能够提供永久性毛发染料的耐久性的毛发着色剂。

在当前皮肤护理和毛发护理组合物、非氧化毛发染料、还有指甲着色剂中，存在的主要问题是它们缺乏维持长期效果所需的耐久性。因此，人们已经尝试着增强化妆品试剂对毛发、皮肤或指甲的结合能力。例如，Richardson等在美国专利号5,490,980中和Green等在美国专利号6,267,957中描述了化妆品试剂利用转谷氨酰胺酶在毛发、皮肤和指甲上的共价附着，化妆品试剂如皮肤调理剂、毛发调理剂、着色剂、防晒剂、和香水。该酶将化妆品试剂上的胺部分交联到皮肤、毛发和指甲里的谷氨酰胺残基上。类似的，Green等在WO0107009中描述了使用赖氨酸氧化酶将化妆品试剂共价附着到毛发、皮肤和指甲上。

在另外一类方法中，采用了将化妆品试剂共价附着到蛋白或蛋白水解产物上的方法。例如，Lang等在美国专利号5,192,332中描述了包含动物或植物蛋白、或其水解产物的临时着色组合物，其包含嫁接到蛋白链上的染料分子残基。在上述组合物中，蛋白是作为一种调理剂在使用，不能增强化妆品试剂结合到毛发、皮肤或指甲上的能力。Horikoshi等在JP 08104614中和Igarashi等在美国专利号5,597,386中描述了由共价附着到染料或色素上的抗-角蛋白抗体组成的毛发着色剂。抗体结合到毛发上，从而增强了毛发着色剂结合到毛发上的能力。类似的，Kizawa等在JP 09003100描述了一种能够识别毛发表层的抗体及其在处理毛发方面的应用。另外，还描述了一种由偶联到有色乳胶颗粒上的抗-毛发抗体组成的毛发着色剂。抗体的使用增强了染料与毛发的结合能力，能够有效提高毛发着色的耐久性，但是这些抗体在生产上难度较大，并且比较昂贵。Terada等在JP 2002363026中描述了缀合物在皮肤和毛发护理组合物中的应用，其由单链抗体，优选抗-角蛋白抗体组成，该抗体与染料、配体、和化妆品试剂相偶联。尽管可以使用基因工程技术来制备上述单链抗体，但是因为是大分子，所以在制备上仍然比较困难和昂贵。Findlay在WO 00048558中描述了萼状蛋白，如β-乳球蛋白，在调理剂、染料和香水中的应用，其包含一个与化妆品试剂结合的结构域，和另外一个与毛发纤维表面或皮肤表面的至少一部分结合的结构域。这些蛋白还是太大，而在制备上很困难和昂贵。

Linter在美国专利号6,620,419中描述了嫁接到脂肪酸链上的肽，并描述了它们在化妆品和皮肤药物方面的用途。在上述公开内容中，所选择的肽是能够刺激胶原蛋白的合成的肽，而不是能够增强毛发和皮肤调理剂和毛发、指甲和皮肤着色剂耐久性的特异性结合肽。

自从1985年引入以来，噬菌体展示被广泛应用，发现了多种用于药物靶的配体，包括肽、蛋白和小分子(Dixit，J.of Sci & Ind.Research，57：173-183(1998))。该用途随后被扩展到其它领域，如蛋白折叠研究、新的催化活性、新特异性的DNA-结合蛋白、和用于组织工程的基于新肽的生物材料支架(Hoess，Chem.Rev.101：3205-3218(2001)和Holmes，Trends Biotechnol.20：16-21(2002))。Whaley等(Nature 405：665-668(2000))公开了噬菌体展示筛选方法在鉴别肽序列中的用途，其中肽能够特异性结合到无机半导体基质的不同晶体形式上。

描述了一种修改的筛选方法，包括将肽文库与一种抗靶(anti-target)相接触，去掉结合到抗靶上的肽，然后将未结合的肽与靶相接触(Estell等WO 0179479，Murray等美国专利申请公开号2002/0098524，和Janssen等美国专利申请公开号2003/0152976)。使用上述方法，鉴别出了能够与毛发结合但不与皮肤结合的肽序列，如SEQ ID NO：1所示，和与皮肤结合但不与毛发结合的肽序列，如SEQ IDNO：2所示。使用相同的方法，Janssen等(WO 04048399)鉴别出了其它皮肤-结合和毛发-结合肽，以及几种结合基元。尽管在这些公开内容中已经提示了上述肽在个人护理用品方面的潜在应用，但是没有描述将这些肽与着色剂和调理剂共价偶联，来制备具有高度亲和力的毛发调理剂、皮肤调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂和皮肤着色剂。在这些公开内容中，还描述了一种鉴别高度亲和力噬菌体-肽克隆的方法。该方法中使用了PCR技术来鉴别经过酸洗脱仍然与靶保持结合的肽。

Reisch(Chem.Eng.News 80：16-21(2002))报道在个人护理用品中已开发了一族设计为靶向特定人组织成分的肽。然而，在该文献中没有描述基于肽的调理剂或着色剂。

本发明中的一种肽结合序列，SEQ ID NO：3，已经为了几个其他目的进行报道。例如，Hupp等，在WO 02065134中公开了肽序列SEQ IDNO：3作为一种肽用于调节p53多肽与p300多肽的结合，以调节哺乳动物细胞周期或诱导或防止细胞死亡。Liu等在美国专利号6,344,443公开了相同的肽序列在抑制肿瘤坏死因子α与它的受体结合方面的应用，以预防或逆转带有关节炎和其它炎性疾病的病人的炎性变化。本发明中的另外一个肽结合序列，SEQ ID NO：4，在WO 03102020中Jagota等已将其作为一种碳纳米管结合肽进行报道。

综上所述，需要提供一种能够延长效果耐久性，并且制备上简单和低廉的毛发和皮肤调理剂、和毛发、指甲、和皮肤着色剂。

申请人使用噬菌体展示筛选方法鉴别出了能以高度亲和力与毛发、皮肤和指甲特异性结合的肽序列，并应用这些肽序列设计出了基于肽的毛发调理剂、皮肤调理剂、毛发着色剂、指甲着色剂和皮肤着色剂，从而解决了上述所提出的问题。

发明内容

本发明提供了与毛发、皮肤和指甲具有高亲和力的肽序列。本发明还提供了基于肽的用于毛发、皮肤和指甲的调理剂和着色剂。在其中一个实施方案中，基于肽的调理剂和着色剂是二嵌段(diblock)组合物。

根据本发明，提供了一种毛发-结合肽，选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、64、66、69和70。

类似的，本发明提供了一种SEQ ID NO：60所示的指甲-结合肽。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种SEQ ID NO：61所示的皮肤-结合肽。

在其中优选实施方案中，本发明提供了一种二嵌段的、基于肽的毛发调理剂，其通式为(HBP)_n-HCA，其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)HCA是一种毛发调节剂；和

c)n从1到约1000。

类似的，本发明提供了一种二嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其通式为(SBP)_n-SCA，其中

a)SBP是一种皮肤-结合肽；

b)SCA是一种皮肤调节剂；和

c)n从1到约1000。

在一个可选择的实施方案中，本发明提供了一种二嵌段的、基于肽的毛发着色剂，其通式为(HBP)_n-C，其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)C是一种着色剂；和

c)n从1到约10,000。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种二嵌段的、基于肽的指甲着色剂，其通式为(NBP)_n-C，其中

a)NBP是一种指甲-结合肽；

b)C是一种着色剂；和

c)n从1到约10,000。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种二嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其通式为(SBP)_n-C，其中

a)SBP是一种皮肤-结合肽；

b)C是一种着色剂；和

c)n从1到约10,000。

在类似的实施方案中，本发明提供了一种三嵌段的、基于肽的毛发调理剂，其通式为[(HBP)_m-S]_n-HCA，其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)HCA是一种毛发调理剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到约50；和

e)n从1到约1000。

可选择的，本发明提供了一种三嵌段的、基于肽的皮肤调理剂，其通式为[(SBP)_m-S]_n-SCA，其中

a)SBP是一种毛发-结合肽；

b)SCA是一种皮肤调理剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到约50；和

e)n从1到约1000。

类似的，本发明提供了一种三嵌段的、基于肽的毛发着色剂，其通式为[(HBP)_m-S]_n-C，其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)C是一种着色剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到约50；和

e)n从1到约10,000。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种三嵌段的、基于肽的指甲着色剂，其通式为[(NBP)_m-S]_n-C，其中

a)NBP是一种毛发-结合肽；

b)C是一种着色剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到约50；和

e)n从1到约10,000。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种三嵌段的、基于肽的皮肤着色剂，其通式为[(SBP)_m-S]_n-C，其中

a)SBP是一种毛发-结合肽；

b)C是一种着色剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到约50，和

e)n从1到约10,000。

另外，本发明还提供了生产高度亲和力毛发、皮肤或指甲-结合肽的方法，包含如下步骤：

a)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

b)将(a)的文库与毛发、皮肤或指甲样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-毛发、噬菌体-肽-皮肤、或噬菌体-肽-指甲复合物；

(ii)未结合的毛发、皮肤或指甲，和

(iii)未形成复合物的肽；

c)分离(b)中的噬菌体-肽-毛发、噬菌体-肽-皮肤、或噬菌体-肽-指甲复合物；

d)从(b)的噬菌体-肽复合物中洗脱去结合能力弱的噬菌体-肽；

e)将经过步骤(d)后保留下来的噬菌体-肽-毛发、噬菌体-肽-皮肤、或噬菌体-肽-指甲复合物直接感染细菌宿主细胞；

f)在合适的生长培养基上生长步骤(e)感染的细胞；和

g)从步骤(f)的生长细胞中分离并鉴别噬菌体-肽，其中该噬菌体-肽对毛发、皮肤或指甲具有高度的结合亲和力。

在优选实施方案中，本发明提供了基于肽的调理剂在毛发上形成保护层的方法，包含将本发明的组合物施用到毛发上，并使之形成所述的保护层。

类似的，本发明提供了基于肽的调理剂在皮肤或唇上形成保护层的方法，包含将本发明的组合物施用到皮肤或唇上，并使之形成所述的保护层。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种对头发、眉毛、皮肤或指甲进行着色的方法，包含将本发明的头发、眉毛、皮肤或指甲着色组合物施用到头发、眉毛、皮肤或指甲上，并经过一段时间，该时间足以使头发、眉毛、皮肤或指甲着色。

在优选实施方案中，本发明提供了一种对头发、眉毛或睫毛进行着色的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含毛发着色剂的毛发着色组合物，其中毛发着色剂选自：

i)(HBP)_n-C和

ii)[(HBP)_m-S]_k-C

其中

1)HBP是一种毛发-结合肽；

2)C是一种着色剂；

3)n从1到约10,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到约50；和

6)k从1到约10,000；

并且其中的毛发-结合肽是通过如下方法选择的，该方法包含如下步骤：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)的文库与毛发样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-毛发复合物；

(ii)未结合的毛发，和

(iii)未形成复合物的肽；

C)分离(B)中的噬菌体-肽-毛发复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，既可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物进行聚合酶链反应，也可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离、鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对于毛发的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的毛发着色剂施用到头发、眉毛或睫毛上，维持一段时间，该时间足以使基于肽的着色剂结合到头发、眉毛或睫毛上。

在另外一个实施方案中，本发明提供了一种基于肽的调理剂在

毛发上形成保护层的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含毛发调理剂的毛发护理组合物，其中毛发调理剂选自：

i)(HBP)_n-HCA和

ii)[(HBP)_m-S]_k-HCA

其中

1)HBP是一种毛发-结合肽；

2)HCA是一种毛发调理剂；

3)n从1到约1,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到约50；和

6)k从1到约1,000；

并且其中的毛发-结合肽是通过如下方法选择的，该方法包含如下步骤：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)文库与毛发样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-毛发复合物；

(ii)未结合的毛发，和

(iii)未形成复合物的肽；

C)分离(B)中的噬菌体-肽-毛发复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，既可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物进行聚合酶链反应，也可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离、鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对于毛发的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的毛发调理剂施用到毛发上，并使之形成所述的保护层。

可选择的，本发明提供了一种在皮肤或唇上形成保护层的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含皮肤调理剂的皮肤护理组合物，其中皮肤调理剂选自：

i)(SBP)_n-SCA和

ii)[(SBP)_m-S]_k-SCA

其中

1)SBP是一种皮肤-结合肽；

2)SCA是一种皮肤调理剂；

3)n从1到约1,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到约50；和

6)k从1到约1,000；

并且其中的皮肤-结合肽是通过如下方法选择的，该方法包含如下步骤：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)文库与皮肤样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；

(ii)未结合的皮肤，和

(iii)未形成复合物的肽；

C)分离(B)中的噬菌体-肽-皮肤复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，既可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物进行聚合酶链反应，也可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离、鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对于皮肤的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的皮肤调理剂施用到皮肤或唇上，并使之形成所述的保护层。

在另外一个实施方案中，本发明提供了对皮肤或唇进行着色的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含皮肤着色剂的化妆品组合物，其中皮肤着色剂选自：

i)(SBP)_n-C和

ii)[(SBP)_m-S]_k-C

其中

1)SBP是一种皮肤-结合肽；

2)C是一种着色剂；

3)n从1到约10,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到约50；和

6)k从1到约10,000；

并且其中的皮肤-结合肽是通过如下方法选择的，该方法包含如下步骤：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)文库与皮肤样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-皮肤复合物；

(ii)未结合的皮肤，和

(iii)未形成复合物的肽；

C)分离(B)中的噬菌体-肽-皮肤复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，既可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物进行聚合酶链反应，也可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-皮肤复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离、鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对于皮肤的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的皮肤着色剂施用到皮肤或唇上。

可选择的，本发明提供了一种对指甲进行着色的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含指甲着色剂的指甲油组合物，其中指甲着色剂选自下组：

i)(NBP)_n-C和

ii)[(NBP)_m-S]_k-C

其中

1)NBP是一种指甲-结合肽；

2)C是一种着色剂；

3)n从1到约10,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到约50；和

6)k从1到约10,000；

并且其中的指甲-结合肽是通过如下方法选择的，该方法包含如下步骤：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)文库与指甲样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-指甲复合物；

(ii)未结合的指甲，和

(iii)未形成复合物的肽

C)分离(B)中的噬菌体-肽-指甲复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，既可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-指甲复合物进行聚合酶链反应，也可以直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-指甲复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离、鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有约7-约25个氨基酸，并且对于指甲的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的指甲着色剂施用到指甲上。

序列描述的简要说明

通过以下的详细说明和所附的序列描述，可以更充分地理解本发明，其中序列描述也是本申请的一部分。

以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“包含核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请所必备的条件-序列条款”)规定，并符合世界知识产权组织(WIPO)ST.25(1998)的标准，以及EPO和PCT(5.2条和49.5(a-bis)条和使用说明208章节和C附件)所规定的序列表条件。在核苷酸和氨基酸序列数据中所使用的符号和形式均符合37C.F.R.§1.822的规定。

SEQ ID NO：1是毛发-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是皮肤-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3-52、54-59是本发明毛发-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53是本发明毛发-结合肽和指甲-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：60是本发明指甲-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是本发明皮肤结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：62是用于噬菌体DNA测序的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：63是在ELISA结合分析试验中作为对照的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：64是附着有半胱氨酸的毛发-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3切割位点的氨基酸序列。

SEQ ID NO：66、69和70是抗洗发水的毛发-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：67和68是实施例8中所描述的用于扩增抗洗发水的、毛发-结合噬菌体肽的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：71-74是实施例9中所使用的生物素化的毛发-结合肽和皮肤-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：75是实施例16中所使用的被完全保护的D21肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：76-98是毛发-结合肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：99-104是皮肤-结合肽的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供了对人毛发、皮肤和指甲以高度亲和力特异性结合的肽序列。另外，本发明还提供了提高了耐久性的基于肽的毛发和皮肤调理剂，和毛发、指甲、和皮肤着色剂。

本说明书中采用如下定义，其用于解释权利要求书和说明书。

“HBP”表示毛发-结合肽。

“SBP”表示皮肤-结合肽。

“NBP”表示指甲-结合肽。

“HCA”表示毛发调理剂。

“SCA”表示皮肤调理剂。

“C”表示毛发、皮肤或指甲着色剂。

“S”表示间隔物。

术语“肽”指的是两个或多个氨基酸通过肽键或修饰肽键彼此连接在一起。

在此所使用的术语“毛发”指的是人头发、眉毛和睫毛。

在此所使用的术语“皮肤”指的是人皮肤或猪皮肤、用作人皮肤替代品的Vitro-Skin

和EpiDerm^TM。

在此所使用的术语“指甲”指的是人手指甲和脚趾甲。

在选择本发明毛发-结合肽、皮肤-结合肽和指甲-结合肽时，所使用的术语“严格”指的是用于从毛发、皮肤或指甲上洗脱肽的洗脱试剂(通常为去污剂)的浓度。较高浓度的洗脱试剂提供更加严格的条件。

术语“肽-毛发复合物”是指一种结构，包含通过肽上的结合位点与毛发纤维结合的肽。

术语“肽-皮肤复合物”是指一种结构，包含通过肽上的结合位点与皮肤结合的肽。

术语“肽-指甲复合物”是指一种结构，包含通过肽上的结合位点与手指甲或脚趾甲结合的肽。

术语“肽-底物复合物”既指肽-毛发、肽-皮肤复合物，也指肽-指甲复合物。

术语“MB₅₀”是指在基于ELISA的结合分析试验中，当获得的信号是最大信号的50％时的结合肽的浓度，在实施例9中对此有所描述。MB₅₀指示出复合物各成分之间的结合相互作用强度或亲和力。MB₅₀值越低，则表明肽与它相应的底物之间的相互作用越强。

术语“结合亲和力”指的是结合肽与各自的底物之间的相互作用强度。在本申请中结合亲和力用在基于ELISA的结合分析试验中所测定出的MB₅₀值来表示。

术语“氨基酸”是指蛋白或多肽的基本化学结构单元。在本申请中使用如下的缩写，分别代表特定的氨基酸。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列之前的调控序列(5’非编码序列)和之后的序列(3’非编码序列)，“天然基因”是指在天然状态下发现的带有自有调控序列的基因。“嵌合基因”是指任一非天然基因，其包含在天然状态下不会同时在一起的调控序列和编码序列。相应的，嵌合基因可能包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源，但排列方式不同于天然状态的调控序列和编码序列。“外源基因”是指在宿主有机体中通常不存在，而是通过基因转移引入到宿主有机体的基因。外源基因包含插入到非天然有机体的天然基因，或嵌合基因。

“合成基因”是利用本领域中技术人员已知的方法，通过化学合成的方法将寡核苷酸结构单元装配在一起所形成的。将这些结构单元连接到一起，然后退火使之形成基因片段，然后再将这些片段用酶法装配到一起构成完整的基因。“化学合成”，当涉及DNA序列时，是指核苷酸成分是在体外装配到一起的。人工化学合成DNA可以采用充分确立的技术来完成，或自动化学合成可以使用许多市售仪器中的某一种来进行。相应的，可以根据反映宿主细胞密码子偏倚的核苷酸序列最优化，对基因进行裁剪，以利于基因的优化表达。本领域技术人员能够意识到如果密码子使用偏倚于宿主所偏爱的密码子，则更能使基因获得成功的表达。基于对来自序列信息已知的宿主细胞的基因的分析，就能够确定出优选的密码子。

“编码序列”是指编码一种特定氨基酸序列的DNA序列。“适当的调控序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA的加工或稳定性、或翻译。调控序列包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来说，编码序列位于与启动子序列的3’。启动子可以是来自天然基因的完整形式，或者是由不同天然启动子的不同元件组成的，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解，对于一种基因来说，在不同组织或细胞类型、或不同的发育阶段、或对不同环境或生理条件所作出的反应，基因的表达是由不同的启动子来指导的。在大多数细胞类型、在大多数时间导致一种基因表达的启动子一般被称为“组成型启动子”。进一步认识到，因为在大多数情况下不能完全确定调控序列的确切界限，因此不同长度的DNA片段有可能具有相同的启动子活性。

在此所使用的术语“表达”是指来自本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还指mRNA翻译成多肽。

术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主有机体的基因组中，形成稳定的基因遗传。包含转化的核酸片段的宿主有机体也被称作“转基因”或“重组”或“转化的”有机体。

术语“宿主细胞”是指被转化或转染的细胞，或者是能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指一种经常携带基因的染色体外元件，它不是细胞中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。上述元件可以是任意来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列结合或组合在一种独特的结构中，该结构能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入到细胞中。“转化盒”是指这样一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有能够促进特定宿主细胞转化的元件。“表达盒”是指这样一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有能够在外源宿主中增强该基因表达的元件。

术语“噬菌体(phage)”或“噬菌体(bacteriophage)”是指一种感染细菌的病毒。变化了形式的噬菌体也能用于本发明目的。优选的噬菌体是来自叫做M13的“野生”噬菌体。M13系统能够在细菌内生长，因此不会破坏它所转染的细胞，只是使细胞不断地制造新的噬菌体。M13是一种单链的DNA噬菌体。

术语“噬菌体展示”是指在噬菌体或噬菌粒颗粒表面所进行的功能性外源肽或小蛋白的展示。可以使用基因工程化的噬菌体用于展示本发明的肽，在展示时，本发明的肽作为噬菌体天然表面蛋白的一个片段。带有不同基因序列的噬菌体群可以产生肽文库。

“PCR”或“聚合酶链反应”是一种用于扩增特定DNA片段的技术(美国专利号4,683,195和4,800,159)。

本发明所使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域已知的技术，下列文献对此进行了描述，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称作”Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc，和Wiley-Interscience出版(1987)。

本发明包含特异性毛发-结合肽、皮肤-结合肽和指甲-结合肽，以及它们在毛发、皮肤和指甲调理剂和着色剂中的应用。

毛发、皮肤和指甲

人毛发样品是市售的，例如从International Hair Importers andProducts(Bellerose，NY)购得的，有不同的颜色，如棕色、黑色、红色和金色，有各种类型，如非裔美籍人的、高加索人的和亚洲人的。另外，毛发样品可以进行处理，例如使用过氧化氢进行处理，得到漂白后的毛发。猪皮可以在屠宰店和超市中买到，Vitro-Skin

购自IMSInc.(Milford，CT)，EpiDerm^TM购自MatTek Corp.(Ashland，MA)，上述产品均是人皮肤的很好的替代品。人手指甲和脚趾甲来自志愿者。

毛发-结合肽、皮肤-结合肽、和指甲-结合肽

在本申请中毛发-结合肽(HBPs)、皮肤-结合肽(SBPs)和指甲-结合-肽(NBPs)的定义是指分别对毛发、皮肤和指甲以高度亲和力特异性结合的肽序列。本发明中的毛发-结合肽、皮肤-结合肽和指甲-结合肽具有约7个到约45个氨基酸，更优选的，具有约7个到约20个氨基酸，最优选的，具有约7个到约12个氨基酸。本发明中的结合肽对它们各自的底物所具有的结合亲和力，以MB₅₀值来表示，小于或等于约10^-2M，小于或等于约10^-3M，小于或等于约10^-4M，小于或等于约10^-5M，优选小于或等于约10^-6M，更优选小于或等于约10^-7M。

可以使用本领域已知的方法来选择合适的毛发-结合肽、皮肤-结合肽和指甲-结合肽序列。随机产生本发明的肽，然后根据它们对目标底物的结合亲和力，来针对特定的毛发、皮肤或指甲样品进行选择。随机产生肽文库是公知技术，可以通过如下各种技术来完成，包括细菌展示(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7)：4520-4524(1981)，和Helfamn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1)：31-35，(1983))、酵母展示(Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(21)：9578-82(1991))、组合固相肽合成(美国专利号5,449,754、5,480,971、5,585,275、5,639,603)、和噬菌体展示技术(美国专利号5,223,409、5,403,484。5,571,698、5,837,500)。下列文献记载了生产上述生物肽文库的技术，Dani，M.，J.of Receptor & Signal Transduction Res.，21(4)：447-468(2001)。

随机生产肽的一个优选的方法是利用噬菌体展示。噬菌体展示是一种体外选择技术，其中肽或蛋白通过基因工程技术融合到噬菌体外壳蛋白上，从而在噬菌体病毒体的外部形成融合肽展示，同时编码融合残基的DNA在病毒体内。展示肽和其编码DNA的这种物理连接使得能够筛选大量肽变体，其中每个肽均与其相应的DNA序列连接，筛选方法是一种体外选择过程，称作“生物淘选(bioparming)”。生物淘选中最简单的形式是将不同的噬菌体-展示变体库与目标靶一起温育，其中靶固定在板上或珠子上，然后洗去未结合的噬菌体，并通过破坏噬菌体与靶之间的结合相互作用，洗脱得到特异性结合的噬菌体。然后将洗脱后的噬菌体在体内扩增，重复该过程，得到逐步浓缩的有利于最强结合序列的噬菌体库。经过3轮或更多轮的选择/扩增，对单个克隆通过DNA测序进行表征。

在生产出合适的肽文库后，将肽文库与适量的试验底物相接触，具体的是毛发、皮肤或指甲样品。试验底物与肽文库在悬浮溶液中相接触。优选的溶液是包含表面活性剂的盐水缓冲液。合适的溶液是含有0.5％Tween20的Tris缓冲的盐水(TBS)。可以通过任意方式进一步搅拌该溶液，目的是提高肽向毛发、皮肤或指甲表面的传质速度，从而缩短达到最大结合所需要的时间。

在接触时，许多随机产生的肽结合到毛发、皮肤或指甲底物上，形成肽-毛发、肽-皮肤或肽-指甲复合物。可以通过洗涤的方法将未结合的肽洗去。在将所有未结合的材料去掉后，可以通过使用具有不同严格性的缓冲液进行选择性洗涤，从而将对试验底物具有不同程度结合亲和力的肽进行分级。提高所使用缓冲液的严格性能够提高肽-底物复合物中肽和底物的所需结合强度。

可以使用许多物质来改变缓冲溶液在肽选择中的严格性，包括，但不限于，酸性pH(1.5-3.0)；碱性pH(10-12.5)；高盐浓度，如MgCl₂(3-5M)和LiCl(5-10M)；水；乙二醇(25-50％)；二氧六环(5-20％)；硫氰酸盐(1-5M)；胍(2-5M)；脲(2-8M)；和各种不同浓度的表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、Nonidet P-40、Triton X-100、Tween

20，其中优选Tween

20。可以在下列缓冲溶液制备这些物质，缓冲液包括，但不限于Tris-HCl、Tris缓冲的盐水、Tris硼酸盐、Tris乙酸、三乙胺、磷酸盐缓冲液、和甘氨酸-HCl，其中优选Tris缓冲的盐水。

应当认识到，通过使用具有较高严格性的缓冲液重复上述选择过程，能够洗脱得到对毛发、皮肤和指甲底物具有较高结合亲和力的肽。洗脱后的肽用本领域已知的任意方法进行鉴别和测序。

因此，使用了如下的方法用于生产本发明的毛发-结合肽、皮肤-结合肽、或指甲-结合肽。将组合生成的噬菌体-肽文库与目标底物相接触，底物具体的是毛发、皮肤或指甲样品，形成噬菌体-肽-毛发、噬菌体-肽-皮肤、噬菌体-肽-指甲复合物。从未复合的肽和未结合的底物分离得到噬菌体-肽-底物复合物，并从噬菌体-肽-底物复合物上洗脱得到结合的噬菌体-肽，优选使用酸处理。然后，对洗脱后的肽进行鉴别和测序。为了鉴别出与一种底物结合而不与另一种底物结合的肽序列，例如与毛发结合但不与皮肤结合的肽、或与皮肤结合但不与毛发结合的肽，在该方法中加入了消减淘选步骤。具体的是，首选将组合生成的噬菌体-肽文库与非-靶相接触，去掉与非-靶结合的噬菌体-肽。然后，将未结合的噬菌体-肽与所需的底物相接触，之后继续进行上述方法。可选择的，可以将组合生成的噬菌体-肽文库同时与非-靶和所需底物相接触。然后，将噬菌体-肽-非-靶复合物与噬菌体-肽-底物复合物分离，之后对所需的噬菌体-肽-底物复合物实施上述方法。

本发明的一个实施方案提供了一种修改的噬菌体展示筛选方法，用于分离对毛发、皮肤或指甲具有较高亲和力的肽。在该修改型方法中，首先按照上述方法形成噬菌体-肽-底物复合物。然后，用洗脱缓冲液处理上述复合物。可以使用任意的上述洗脱缓冲液。优选的，洗脱缓冲液是一种酸性溶液。然后，将剩下的抗-洗脱的噬菌体-肽-底物复合物直接感染细菌宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)ER2738。在合适的生长培养基上培养感染的宿主细胞，培养基如LB(Luria-Bertani)培养基，然后将培养物涂布到琼脂上，琼脂包含适合的生长培养基，如含有IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-Gal^TM的LB培养基。生长后，挑取菌斑用于DNA分离和测序，以鉴别出对毛发、皮肤或指甲底物具有高度结合亲和力的肽序列。

在另外一个实施方案中，使用了PCR技术来鉴别由上述修改型噬菌体展示筛选方法得到的抗-洗脱的噬菌体-肽，该技术使用合适的引物将上述噬菌体-肽-底物复合物直接进行PCR，按照Janssen等在美国专利申请公开号2003/0152976中所记载的方法，该文献在本申请中引作参考。

使用上述方法，已经鉴别出了毛发-结合肽、皮肤-结合肽和指甲-结合肽。具体来说，所分离的对普通棕色毛发具有高度结合亲和力的结合肽是SEQ ID NO：3-18、28-38、40-56和64；对普通棕色毛发并抗洗发水的结合肽是SEQ ID NO：66、69和70；对漂白毛发的结合肽是SEQ ID NO：7、8、19-27、38-40、43、44、47、57、58和59；对手指甲的是SEQ ID NO：53和60；对皮肤的是SEQ ID NO：61。另外，发现手指甲-结合肽能够与漂白毛发结合，因此可以用于本发明基于肽的毛发调理剂和毛发着色剂中。能够与手指甲结合的漂白毛发-结合肽同样也可以应用于本发明的基于肽的指甲着色剂中。

结合肽的生产：

可以使用标准肽合成方法来制备本发明的结合肽，该方法是本领域公知的(参见如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，PierceChemical Co.，Rockford，IL，1984；Bodanszky，Priniciples of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，New York，1984；和Pennington等，PeptideSynthesis Protocols，Humana Press，Totowa，NJ，1994)。另外，许多公司能够提供定做合成肽的服务。

可选择的，可以使用重组DNA和分子克隆技术来制备本发明的肽。可以在异源宿主细胞，尤其是微生物宿主细胞中生成编码毛发-结合肽、皮肤-结合肽或指甲-结合肽的基因。

表达本发明结合肽的优选异源宿主细胞是微生物宿主，该细胞广泛发现于真菌或细菌家族中，并能够在很宽的温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长。因为转录、翻译和蛋白质生物合成装置均与细胞原料供给无关而是相同的，因此功能性基因的表达与用于生成细胞生物量的碳原料供给无关。宿主菌株的实例包括，但不限于，真菌或酵母物种，如曲霉属(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)，或细菌物种，如沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。

可以使用多种不同的表达系统来生产本发明的肽。这样的载体包括，但不限于，染色体型载体、附加型载体和病毒衍生型载体，如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、插入元件、酵母附加体、和病毒的载体，该病毒如杆状病毒、逆转录病毒，以及上述载体组合后得到的载体，如衍生自质粒和细菌噬菌体遗传因子的载体，如粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以包含调控区，其调节表达又促成表达。通常在这点上来说，任何适合在宿主细胞中维持、繁殖或表达多核苷酸或多肽的系统或载体都可以用于上述目的的表达。微生物表达系统和表达载体包含调控序列，该调控序列应当能够指导外源蛋白相对于宿主细胞的生长进行高水平的表达。这样的调控序列对于本领域技术人员来说是公知的，实例包括，但不限于，那些在对化学或物理刺激的反应中能够引起基因开启或关闭表达反应的调控序列，包括存在于载体中的调控元件，如增强子序列。可以使用上述任意调控序列构建嵌合基因，以用于生产本发明任意的结合肽。然后，将上述嵌合基因通过转化引入到合适的微生物中，从而使肽进行高水平的表达。

用于转化适当宿主细胞的载体或盒是本领域公知的。该载体或盒一般包含指导相应基因转录和翻译的序列、一个或多个选择标记、和能使自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含基因5’的转录起始控制区，和DNA片段3’的转录终止控制区。尽管本领域技术人员均清楚，上述控制区没有必要来自选作为生产宿主的特定物种的基因，但是上述两个控制区来自与所要转化的宿主细胞同源的基因却是本发明最优选的。选择标记基因为选择转化的宿主细胞提供了表型性状，如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

能够用于驱动嵌合基因在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有多种，并为本领域技术人员所熟知。实际上任意能够驱动基因的启动子都适合用于生产本发明的结合肽，启动子包括，但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤氏酵母属中的表达)；和lac、ara、tet、trp、IP_L、IP_R、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中的表达)；以及用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。

终止控制区也可以来自优选宿主的各种天然基因。任选的，没有必要必须包含终止位点，但是包含终止位点的终止控制区则是最优选的。

可以使用上述包含合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体，来转化合适的宿主，以使宿主表达本发明的肽。可以使用无细胞翻译系统来生产所述的肽，在该系统中使用来自本发明DNA构建体的RNAs。任选的，以转化宿主的分泌产物的形式来生产本发明的基因产物。将所需的蛋白分泌到培养基中，这有利于简化纯化过程并降低纯化成本。本领域技术人员均熟知，分泌信号序列常被用于促进表达蛋白穿过细胞膜的主动运输。通过将一段编码分泌信号的DNA序列整合到宿主中，从而构建出能够分泌的转化宿主，其中所使用的分泌信号要能够在生产宿主中起作用。选择合适的信号序列的方法在本领域中是已知的(参见如EP 546049和WO 9324631)。分泌信号DNA或促进子(facilitator)可以位于表达-控制DNA和本发明基因或基因片段之间，并且与后者处于相同的阅读框。

基于肽的毛发调理剂：

将毛发-结合肽(HBP)与毛发调理剂(HCA)相偶联，从而形成本发明基于肽的毛发调理剂。调理剂的毛发-结合肽部分能够很强地与毛发结合，从而使调理剂能够附着在毛发上，维持持久的调节效果。毛发-结合肽包括，但不限于，通过上述筛选方法选择出的毛发-结合肽，其中包括本发明给出的毛发-结合肽序列SEQ ID NO：3-59、64、66、69和70，最优选SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：66所示的肽，上述两种肽与毛发具备很强的结合能力，但与皮肤则不具备。另外，可以使用任意已知的毛发-结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：76-98，上述肽分别描述在下列文献中：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399，上述文献在本申请中引作参考。对于漂白毛发，可以使用SEQ ID NO：60所示的手指甲-结合肽。

在本申请中定义的毛发调理剂是指能够改善毛发外观、质地和光泽度，以及提高毛发体或柔度的试剂。在本发明的基于肽的毛发调理剂中，可以使用任何已知的毛发调理剂。毛发调理剂在本领域是公知的，参见如本申请引作参考的文献：Green等(WO 0107009)，其可以通过各种途径购买到。合适的毛发调理剂的例子包括，但不限于：阳离子聚合物，如阳离子化的瓜耳树胶、二烯丙基季铵盐/丙烯酰胺共聚物、季铵化的聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、和各种聚季铵化合物；阳离子表面活性剂，如硬脂基二甲基苄基氯化铵(steralkonium chloride)、centrimonium chloride、和Sapamin hydrochloride；脂肪族醇，如二十二醇；脂肪族胺，如硬脂族胺；蜡；酯；非离子聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、和聚乙二醇；聚硅氧烷；硅氧烷，如十甲基环戊硅氧烷；聚合物乳剂，如氨基封端二甲基聚硅氧烷(amodimethicone)；和膨胀(voluminizing)试剂，如脱乙酰壳多糖。本发明优选的毛发调理剂包含胺或羟基功能基团，以促进与毛发-结合肽的偶联，如在下面所述的。优选的调理剂的实例是辛胺(CAS No.111-86-4)、硬脂胺(CASNo.124-30-1)、二十二醇(CAS No.661-19-8，Cognis Corp.，Cincinnati，OH)、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的聚硅氧烷(CASNo.68083-19-2)、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基聚硅氧烷(CAS No.68951-99-5)、羟基封端的硅氧烷、羟基封端的聚硅氧烷(CAS No.80801-30-5)、氨基修饰的聚硅氧烷衍生物、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基聚硅氧烷、α-十三烷基-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)(CASNo.24938-91-8)。

本发明基于肽的毛发调理剂的制备，是将特异性毛发-结合肽与毛发调理剂共价附着，附着方式既可以直接附着也可以通过间隔物来附着。可以使用任意已知的肽或蛋白缀合化学方法，来形成本发明的基于肽的毛发调理剂。缀合化学在本领域是已知的(参见如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))。合适的偶联剂包括，但不限于，碳二亚胺偶联剂、二价(dicuid)氯化物、二异氰酸酯和其它双功能偶联剂，其中双功能偶联剂既能与肽的胺末端和/或羧酸末端基团反应，又能与毛发调理剂的胺、羧酸或醇基团反应。优选的偶联剂是碳二亚胺偶联剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N，N’-二环己基-碳二亚胺(DCC)，其可用于活化羧酸基团与醇和胺基团偶联。另外，需要对肽上的反应性胺或羧酸基团进行保护，以产生预期结构的基于肽的毛发调理剂。氨基酸的保护性基团，如叔丁氧羰基(t-Boc)的应用是本领域公知的(参见如上述Stewart等的文献；上述Bodanszky的文献；和上述Pennington等的文献)。在某些情况下需要在毛发调理剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之偶联到毛发-结合肽上。可以应用常规的化学方法，如氧化作用、还原作用等，完成上述修饰，这些方法在本领域中是公知的。

也可以通过间隔物使毛发-结合肽与毛发调理剂相偶联。间隔物将肽和调理剂分隔开来，以确保调理剂不干扰肽对毛发的结合。间隔物可以是任意类型的分子，如基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等。优选的间隔物是亲水性的，链长从1到约100个原子，更优选的，链长从2到约30个原子。优选的间隔物的实例包括，但不限于，乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、和乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、硬脂基烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链。可以使用任意上述的化学偶联方法，使间隔物共价附着到肽和毛发调理剂上。为了便于间隔物的整合，可以使用一种双功能交联剂，其包含间隔物和处于两末端的反应基团，以使肽与调理剂相偶联。合适的双功能交联剂在本领域中是公知的，包括但不限于：双胺，如1，6-二氨基己烷；二醛，如戊二醛；双N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、双琥珀酰亚胺基戊二酸酯、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯、和乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)；二异氰酸酯，如1，6-己二异氰酸酯；双环氧乙烷，如1，4亚丁基二环氧甘油醚；二羧酸，如琥珀酰双水杨酸酯等。也可以使用异双功能交联剂，该试剂各个末端的反应基团是不同的。异双功能交联剂的实例包括，但不限于具有如下结构的化合物：

其中：R₁是H或是取代基，如-SO₃Na、-NO₂、或-Br；R₂是间隔物，如-CH₂CH₂(乙基)、-(CH₂)₃(丙基)或-(CH₂)₃C₆H₅(丙基苯基)。上述异双功能交联剂的一个实例是3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。该试剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与调理剂上的胺或醇基反应，马来酰亚胺基团与肽上的硫羟反应。通过在结合肽序列的至少一个末端附加上半胱氨酸基团，从而在肽上掺入硫羟基团。可以在结合肽序列和末端半胱氨酸之间整合几种间隔物氨基酸残基，如甘氨酸，以将反应性硫羟基团与结合序列分隔开来。

另外，间隔物可以是由任意种类的氨基酸及其混合物组成的肽。优选的肽间隔物是由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸及其混合物组成的。另外，肽间隔物可以包含特异性酶切割位点，如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3位点(SEQ ID NO：65所示)，其用于将调理剂从毛发上通过酶促反应进行切除。肽间隔物可以是从1到约50个氨基酸，优选从1到约20个氨基酸。可以通过本领域已知的任何方法将上述肽间隔物连接到结合肽序列上。例如，可以使用前面所述的标准肽合成技术来制备完整的结合肽-肽间隔物二嵌段物。另外，还可以使用碳二亚胺偶联剂(参见如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，New York(1996))、二价氯化物、二异氰酸酯和其它双功能偶联剂将结合肽序列和肽间隔物连接起来，其中上述试剂能够与肽上的胺末端和/或羧酸末端反应。可选择的，可以使用前面所描述的重组DNA和分子克隆技术来制备完整的结合肽-肽间隔物二嵌段物。间隔物可以是肽间隔物和有机间隔物分子的组合，其可以通过上述方法制备。

可以将多个毛发-结合肽附着到毛发调理剂上，以增强基于肽的毛发调理剂和毛发之间的相互作用。可以使用相同毛发-结合肽的多个拷贝，或可以使用不同毛发-结合肽的组合。对于大型的调理剂颗粒(如乳剂颗粒)，可以在调理剂上附着上大量的毛发-结合肽，即直到约1,000个。对于较小的调理剂分子，则所附着的毛发-结合肽的数量较小，即直到约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的毛发调理剂是一种二嵌段组合物，其由毛发-结合肽(HBP)和毛发调理剂(HCA)组成，通式为(HBP)_n-HCA，其中n从1到约1,000，优选从1到约50。

在另外一个实施方案中，基于肽的毛发调理剂包含上述将毛发-结合肽与毛发调理剂分隔开来的间隔物(S)。可以将多个毛发-结合肽拷贝附着到一个间隔物分子上。在该实施方案中，基于肽的毛发调理剂是一种三嵌段组合物，其由毛发-结合肽、间隔物和毛发调理剂组成，通式为[(HBP)_m-S]_n-HCA，其中n从1到约1,000，优选n从1到约50，m从1到约50，优选m从1到约10。

可以将本发明的基于肽的毛发调理剂用于毛发护理的组合物中。还应当认识到，毛发-结合肽本身也能作为调理剂来处理毛发。在本发明中，毛发护理组合物是指用于毛发处理的组合物，包括但不限于：洗发水、调理剂、洗剂、气雾剂、凝胶、摩丝和毛发染料，其在化妆可接受的介质中包含有效量的基于肽的毛发调理剂或由不同的基于肽的毛发调理剂组成的混合物。在本发明中，用于毛发护理组合物的基于肽的毛发调理剂或毛发-结合肽的所谓的有效量是指：相对于组合物的总重量，所占的比例为从约0.01％到约10％，优选为约0.01％到约5％。毛发护理组合物中的化妆可接受介质成分在下列文献中有所描述，Philippe等，美国专利号6,280,747和Omura等，美国专利号6,139,851和Cannell等，美国专利号6,013,250，上述文献在本申请中引作参考。例如，这些毛发护理组合物可以是水溶液、醇溶液或水-醇溶液，对于水-醇溶液，优选的醇是乙醇或异丙醇，比例是总重量的约1到约75％。另外，毛发护理组合物还可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、湿润剂和阴离子、非离子或两性聚合物、和染料或色素。

基于肽的皮肤调理剂：

将皮肤-结合肽(SBP)与皮肤调理剂(SCA)相偶联，从而形成本发明基于肽的皮肤调理剂。调理剂的皮肤-结合肽部分能够强有力地结合到皮肤上，从而使调理剂在皮肤上保持附着，从而产生持久的调节效果。皮肤-结合肽包括，但不限于：通过上述筛选方法选择得到的皮肤-结合肽，包括本发明SEQ ID NO：61所示的皮肤-结合肽序列。另外，可以使用任意已知的皮肤-结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：99-104，上述肽分别描述在下列文献中：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO 04048399。

在本申请中，所定义的皮肤调理剂包括，但不限于：能够使皮肤变紧的收敛剂；能够去除皮肤死细胞的剥落剂(exfoliant)；能够保持光滑、柔软、柔韧表现的润肤剂；能够增加皮肤表层含水量的吸湿剂；能够减慢水分从皮肤表面蒸发的封闭剂(occlusive)；和能够增强干燥或损伤皮肤外观或减少脱皮和恢复柔度的混和化合物。在本发明的基于肽的皮肤调理剂中，可以使用任何已知的皮肤调理剂。皮肤调理剂在本领域中是已知的，参见如上述Green等的文献，并且是可以通过各种途径购买到的。合适的皮肤调理剂的实例包括，但不限于：α-羟基酸、β-羟基酸、多元醇、透明质酸、D，L-泛醇、聚水杨酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、聚硅氧烷、聚硅氧烷衍生物、羊毛脂、天然油和甘油三酯。本发明优选的皮肤调理剂是聚水杨酸酯、丙二醇(CAS No.57-55-6，Dow Chemical，Midland，MI)、甘油(CAS No.56-81-5，Proctor & Gamble Co.，Cincinnati，OH)、羟基乙酸(glycolic acid)(CAS No.79-14-1，DuPont Co.，Wilmington，DE)、乳酸(CAS No.50-21-5，Alfa Aesar，Ward Hill，MA)、苹果酸(CAS No.617-48-1，Alfa Aesar)、柠檬酸(CAS No.77-92-9，Alfa Aesar)、酒石酸(CAS No.133-37-9，Alfa Aesar)、葡糖二酸(CAS No.87-73-0)、半乳糖二酸(CAS No.526-99-8)、3-羟基戊酸(CAS No.10237-77-1)、水杨酸(CAS No.69-72-7，Alfa Aesar)和1，3丙二醇(CAS No.504-63-2，DuPont Co.，Wilmington，DE)。根据White等，美国专利号4,855,483所描述的方法制备了聚水杨酸酯，上述文献在本申请中引作参考。可以使用Merbouh等描述的方法合成葡糖二酸(Carbohydr.Res.336：75-78(2001)。3-羟基戊酸可以按照Bramucci在WO 02012530中所描述的方法来制备。

本发明的基于肽的皮肤调理剂的制备方法是，将特异性皮肤-结合肽与皮肤调理剂共价附着，附着方式既可以直接附着也可以通过间隔物来附着。可以使用任意已知的上述偶联方法。如上面所述，可以在皮肤调理剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之偶联到毛发-结合肽上。还可以将多个皮肤-结合肽附着到皮肤调理剂上，以增强基于肽的皮肤调理剂与皮肤之间的相互作用。可以使用相同皮肤-结合肽的多个拷贝，或可以使用不同皮肤-结合肽的组合。对于大型的调理剂颗粒，可以在调理剂上附着上大量的皮肤-结合肽，即直到约1,000个。对于较小的调理剂分子，则所附着的皮肤-结合肽的数量较小，即直到约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是一种二嵌段组合物，其由皮肤-结合肽(SBP)和皮肤调理剂(SCA)组成，通式为(SBP)_n-SCA，其中n从1到约1,000，优选从1到约50。

在另外一个实施方案中，基于肽的皮肤调理剂包含上述将皮肤-结合肽与皮肤调理剂分隔开来的间隔物(S)。可以将多个皮肤-结合肽拷贝附着到一个间隔物分子上。在该实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是一种三嵌段组合物，其由皮肤-结合肽、间隔物和皮肤调理剂组成，通式为[(SBP)_m-S]_n-SCA，其中n从1到约1,000，优选n从1到约50，m从1到约50，优选m从1到约10。

可以将本发明的基于肽的皮肤调理剂用于皮肤护理组合物中。还应当认识到，皮肤-结合肽本身也能作为皮肤的调理剂来使用。在本发明中，皮肤护理组合物是指在化妆可接受的介质中包含有效量的基于肽的皮肤调理剂或由不同的基于肽的皮肤调理剂组成的混合物的组合物。所使用的这些组合物包括，但不限于：皮肤护理、皮肤清洁、化妆和抗皱纹产品。在本发明中，用于皮肤护理组合物的基于肽的皮肤调理剂或皮肤-结合肽的所谓的有效量是指：相对于组合物的总重量，所占的比例为从约0.001％到约10％，优选为约0.01％到约5％。该比例可以作为皮肤护理组合物的不同类型的函数而加以改变。合适的化妆可接受介质组合物在上述Philippe等的文献中有所描述。例如，化妆可接受介质可以是一种无水的组合物，其包含占组合物总重量比例通常从约10％到90％的脂肪物质，其中脂相包含至少一种液体脂肪物质、固体脂肪物质或半固体脂肪物质。脂肪物质包括，但不限于：油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。可选择的，组合物可以是一种稳定的分散体，如油包水或水包油乳剂。另外组合物可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、湿润剂和阴离子、非离子或两性聚合物、和染料或色素。

基于肽的毛发着色剂：

通过将毛发-结合肽(HBP)与着色剂(C)相偶联，从而形成本发明基于肽的毛发着色剂。基于肽的毛发着色剂的毛发-结合肽部分可以与毛发强有力地结合，从而能够使着色剂在毛发上保持附着时间，从而能够产生持久的毛发着色效果。毛发-结合肽包括，但不限于通过上述筛选方法选择出的毛发-结合肽，其中包括本发明给出的毛发-结合肽序列SEQ ID NO：3-59、64、66、69和70，最优选SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：66所示的肽，上述两种肽与毛发具备很强的结合能力，但与皮肤则不具备。另外，可以使用任意已知的毛发-结合肽，包括但不限于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：76-98，上述肽分别描述在下列文献中：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399。对于漂白毛发，可以使用SEQ ID NO：60所示的手指甲-结合肽。

在本申请中，着色剂是指能够用于改变毛发、皮肤或指甲颜色的任何染料和色素等。在本发明的基于肽的毛发着色剂中，可以使用任何已知的着色剂。毛发着色剂在本领域是公知的(参见上述Green等的文献，CFTA International Color Handbook，2^nd ed.，Micelle Press，England(1992)和Cosmetic Handbook，US Food and DrugAdministration，FDA/IAS Booklet(1992))，并且是可以通过各种途径购买到的(例如Bayer，Pittsburgh，PA；Ciba-Geigy，Tarrytown，NY；ICI，Bridgewater，NJ；Sandoz，Vienna，奥地利；BASF，MountOlive，NJ；和Hoechst，Frankfurt，德国)。合适的毛发着色剂包括，但不限于：染料，如4-羟基丙氨基-3-硝基苯酚、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-6-氯代-4-硝基苯酚、2-硝基-对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚、指甲花、HC Blue 1、HC Blue 2、HC Yellow 4、HC Red 3、HC Red 5、Disperse Violet 4、Disperse Black 9、HC Blue 7、HC Blue 12、HC Yellow 2、HC Yellow 6、HC Yellow 8、HC Yellow 12、HC Brown 2、D&C Yellow 1、D&C Yellow 3、D&C Blue 1、Disperse Blue3、Disperse violet 1、伊红衍生物如D&C Red No.21和卤化荧光素衍生物如D&C Red No.27、与D&C Red No.21和D&C Orange No.10组合的D&C Red Orange No.5；和色素，如D&C Red No.36和D&C OrangeNo.17、D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&C Yellow No.5、FD&C YellowNo.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21、和FD&C Blue No.1的铝色淀、氧化铁、锰紫(manganese violet)、氧化铬、二氧化钛、氧化锌、氧化钡、群青色、柠檬酸铋和炭黑颗粒。本发明优选的毛发着色剂是D&C Yellow 1和3、HC Yellow 6和8、D&C Blue 1、HC Blue 1、HCBrown 2、HC Red 5、2-硝基对苯二胺、N，N-羟乙基-2-硝基-苯二胺、4-硝基-吲哚和炭黑。

金属和半导体纳米颗粒也可以被用作毛发着色剂，这是因为它们具有很强的发光作用(Vic等，美国专利申请公开号2004/0010864)。“纳米颗粒”是指平均粒径在1到100nm之间的金属或半导体颗粒。优选的，颗粒的平均粒径在约1到40nm之间。在本发明中所使用的“颗粒尺寸”和“粒径”含义是相同的。金属纳米颗粒包括，但不限于：金颗粒、银颗粒、铂颗粒、钯颗粒、铱颗粒、铑颗粒、锇颗粒、铁颗粒、铜颗粒、钴颗粒和由上述金属组成的合金。“合金”是指两种或更多种金属的均一混合物。“半导体纳米颗粒”包括，但不限于：硒化镉、硫化镉、硫化银、硫化镉、氧化锌、硫化锌、硒化锌、硫化铅、砷化镓、硅、氧化锡、氧化铁和磷化铟。使用合适的有机包衣或单层使纳米颗粒稳定并具备水溶性。在本申请中，单层-保护的纳米颗粒是一类稳定的纳米颗粒。制备稳定的、水溶性金属和半导体纳米颗粒的方法是本领域已知的，描述在下列文献中：Huang等，共同未决的美国专利申请号10/622889，在此引作参考。纳米颗粒的颜色与颗粒尺寸有关。因此，通过控制纳米颗粒的尺寸，可以获得不同的颜色。例如，ZnS-包衣的CdSe纳米颗粒在颗粒尺寸2到6nm内时，其颜色覆盖了整个可见光光谱。具体来说，CdSe纳米颗粒核心尺寸分别为2.3、4.2、4.8和5.5nm时，其发射光的波长分别集中为485、565、590和625nm。按照上述Huang的尺寸分级方法，从较宽尺寸分布的纳米颗粒中，可以获得不同尺寸的水溶性纳米颗粒。该方法包含在存在一种电解质的情况下，有调节地向纳米颗粒溶液中加入易溶于水的有机溶剂。易溶于水的有机溶剂所加入的量越高，所得到的纳米颗粒沉淀中纳米颗粒的尺寸就越小。

本发明的基于肽的毛发着色剂的制备方法是，将特异性毛发-结合肽与着色剂共价附着，附着方式既可以是直接附着，也可以是通过间隔物来附着。可以使用上述任意偶联方法。可能需要在着色剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺或醛基，以使之与毛发-结合肽相偶联。可以使用本领域公知的常规化学方法实现上述修饰。例如，使用硝酸、过氧化物，如过氧化氢，或无机起始物，如过硫酸铵，氧化炭黑颗粒的表面，从而产生功能化基团。优选的，按照Carrasco-Marin等(J.Chem.Soc.，Faraday Trans.93：2211-2215(1997))描述的方法，使用过硫酸铵氧化炭黑的表面。使用无机起始物，如2，2’-偶氮二(2-甲基丙酰胺)-二盐酸化物，能够在炭黑表面引入氨基功能团。无机色素和纳米颗粒也可以通过类似的方法进行衍生化以引入羧酸或氨基功能团。

根据需要，可以将多个毛发-结合肽附着到着色剂上，以增强基于肽的毛发着色剂与毛发之间的相互作用。可以使用相同毛发-结合肽的多个拷贝，或可以使用不同毛发-结合肽的组合。对于尺寸较大的色素颗粒，可以在色素上附着较多数量的毛发-结合肽，即直至约10,000个。对于尺寸较小的染料分子，则所附着的毛发-结合肽数量较少，即直至约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的毛发着色剂是一种二嵌段组合物，其由毛发-结合肽(HBP)和着色剂(C)组成，通式为(HBP)_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500。

在另外一个实施方案中，如上面所述，基于肽的毛发着色剂包含一种间隔物(S)，其将结合肽和毛发着色剂分隔开来。可以在一个间隔物分子上附着上多个拷贝的毛发-结合肽。在该实施方案中，基于肽的毛发着色剂是一种三嵌段的组合物，其由毛发-结合肽、间隔物和着色剂组成，通式为[(HBP)_m-S]_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500，并且m从1到约50，优选m从1到约10。

本发明的基于肽的毛发着色剂可以用于染发的毛发着色组合物中。在本申请中，毛发着色组合物是指用于毛发着色、染色或漂白的组合物，其在化妆可接受的介质中包含有效量的基于肽的毛发着色剂或不同基于肽的毛发着色剂的组合。在毛发着色组合物中所使用的基于肽的毛发着色剂的有效量是指占组合物总重量的从约0.001％到约20％。在毛发着色组合物中所使用的化妆可接受介质成分在下列文献中有所描述：Dias等，美国专利号6,398,821和Deutz等，美国专利号6,129,770，上述文献在此引作参考。例如，毛发着色组合物可以包含鳌合剂、稳定剂、增稠剂、缓冲液、载体、表面活性剂、溶剂、抗氧化剂、聚合物和调理剂。调理剂包括本发明基于肽的调理剂和毛发-结合肽，其在毛发着色组合物中占总重量的约0.01％到约10％，优选约0.01％到约5％。

本发明基于肽的毛发着色剂还可以作为着色剂用于化妆组合物中，其中化妆组合物是施用到睫毛或眉毛上的，包括但不限于，睫毛膏和眉笔。它们可以是包含化妆可接受介质的无水化妆产品，该介质所包含的脂肪物质的含量通常占组合物总重量的从约10％到约90％，其脂相如上所述包含至少一种液体脂肪物质、固体脂肪物质或半固体脂肪物质。脂肪物质包括，但不限于，油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。可选择的，如上所述，上述组合物可以是一种稳定的分散体形式，如油包水或水包油乳剂。在上述组合物中，基于肽的毛发着色剂的比例通常占组合物总重量的从约0.001％到约20％。

基于肽的指甲着色剂：

通过将指甲-结合肽(NBP)与着色剂(C)相偶联，从而形成本发明基于肽的指甲着色剂。基于肽的指甲着色剂的指甲-结合肽部分可以与手指甲或脚趾甲强有力地结合，从而能够使着色剂在指甲上保持附着，从而产生持的着色效果。指甲-结合肽包括，但不限于通过上述筛选方法持选择出的指甲-结合肽，其中包括本发明给出的指甲-结合肽序列SEQ ID NO：53和60，最优选SEQ ID NO：60所示的肽。另外，还可以使用SEQ ID NO：7、8、19-27、38、39、40、43-45、47、57、58和59所示的漂白毛发-结合肽。

本发明基于肽的指甲着色剂的制备方法是，将特异性指甲-结合肽与着色剂共价附着，附着方式既可以是直接附着，也可以是通过间隔物来附着。在本发明基于肽的指甲着色剂中，可以使用前面所述的任意一种着色剂。在本发明基于肽的指甲着色剂中，优选使用的着色剂包括D&C Red No.8、10、30和36，D&C Red No.6、9、和12的钡色淀，D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀，D&C Red No.30、D&COrange No.17和D&C Blue No.6的锶色淀。

还可以将多个指甲-结合肽附着到着色剂上，以增强基于肽的指甲着色剂与指甲之间的相互作用。可以使用相同指甲-结合肽的多个拷贝，或可以使用不同指甲-结合肽的组合。对于尺寸较大的色素颗粒，可以在色素颗粒上附着较多数量的指甲-结合肽，即直至约10,000个。对于尺寸较小的染料分子，则所附着的指甲-结合肽数量较少，即直至约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的指甲着色剂是一种二嵌段组合物，其由指甲-结合肽(NBP)和着色剂(C)组成，通式为(NBP)_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500。

在另外一个实施方案中，如上面所述，基于肽的指甲着色剂包含一种间隔物(S)，其将结合肽和着色剂分隔开来。可以在一个间隔物分子上附着上多个拷贝的指甲-结合肽。在该实施方案中，基于肽的指甲着色剂是一种三嵌段的组合物，其由指甲-结合肽、间隔物和着色剂组成，通式为[(NBP)_m-S]_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500，并且m从1到约50，优选m从1到约10。

本发明基于肽的指甲着色剂可以用于将手指甲和脚趾甲着色的指甲油组合物中。在本申请中，指甲油组合物是指用于处理和将指甲着色的组合物，其在化妆可接受基质中包含有效量的基于肽的指甲着色剂或不同的基于肽的指甲着色剂组成的混合物。在本发明中，用于指甲油组合物的基于肽的指甲着色剂所谓的有效量是指：相对于组合物的总重量，所占的比例为从约0.001％到约20％。上述Philippe等的文献描述了用在指甲油组合物中的化妆可接受介质成分。一般的，指甲油组合物包含溶剂和成膜物质，如纤维素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸类聚合物或共聚物、乙烯类共聚物和聚酯类聚合物。另外，指甲油组合物中还可以包含增塑剂，如磷酸三甲苯酯、苯甲酸苄酯、磷酸三丁酯、乙酰蓖酸丁酯、柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或樟脑。

基于肽的皮肤着色剂

通过将皮肤-结合肽(SBP)与着色剂(C)相偶联，从而形成本发明基于肽的皮肤着色剂。基于肽的皮肤着色剂的皮肤-结合肽部分可以与皮肤强有力地结合，从而能够使着色剂在皮肤上保持附着，从而能够产生持久的皮肤着色效果。皮肤-结合肽包括，但不限于通过上述筛选方法选择出的皮肤-结合肽，其中包括本发明给出的皮肤-结合肽序列SEQ ID NO：61。另外，还可以使用任何已知的皮肤-结合肽，包括但不限于：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：99-104，上述肽分别描述在下列文献中：Janssen等，美国专利申请公开号2003/0152976和Janssen等，WO04048399。

本发明基于肽的皮肤着色剂的制备方法是，使用前面所述的任意偶联方法，将特异性皮肤-结合肽与着色剂共价附着，附着方式既可以是直接附着，也可以是通过间隔物来附着。可以使用前面所述的任意一种着色剂。在本发明基于肽的皮肤着色剂中，优选使用的着色剂包括如下的染料：伊红衍生物如D&C Red No.21和卤化荧光素衍生物如D&C Red No.27、与D&C Red No.21和D&C Orange No.10组合的D&CRed Orange No.5；和色素：二氧化钛、氧化锌、D&C Red No.36和D&COrange No.17、D&C Red No.7、11、31和34的钙色淀、D&C Red No.12的钡色淀、D&C Red No.13的锶色淀、FD&C Yellow No.5、FD&C YellowNo.6、D&C Red No.27、D&C Red No.21、和FD&C Blue No.1的铝色淀、氧化铁、锰紫、氧化铬、群青色和炭黑。着色剂还可以是一种不晒太阳的褐色化剂(tanning agent)，如二羟基丙酮，其能够使皮肤不经过日晒就能够获得褐色外表。

还可以将多个皮肤-结合肽附着到着色剂上，以增强基于肽的皮肤着色剂与皮肤之间的相互作用。可以使用相同皮肤-结合肽的多个拷贝，或可以使用不同皮肤-结合肽的组合。对于尺寸较大的色素颗粒，可以在色素颗粒上附着较多数量的皮肤-结合肽，即直至约10,000个。对于尺寸较小的染料分子，则所附着的皮肤-结合肽数量较少，即直至约50个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是一种二嵌段组合物，其由皮肤-结合肽(SBP)和着色剂(C)组成，通式为(SBP)_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500。

在另外一个实施方案中，如上面所述，基于肽的皮肤着色剂包含一种间隔物(S)，其将结合肽和着色剂分隔开来。可以在一个间隔物分子上附着上多个拷贝的皮肤-结合肽。在该实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是一种三嵌段组合物，其由皮肤-结合肽、间隔物和着色剂组成，通式为[(SBP)_m-S]_n-C，其中n从1到约10,000，优选n从1到约500，并且m从1到约50，优选m从1到约10。

本发明基于肽的皮肤着色剂可以作为着色剂用于化妆产品中，包括但不限于，粉底、腮红(bluoh)、唇膏、唇线笔(lip liner)、润唇膏、眼影和眼线膏。它们可以是包含化妆可接受介质的无水化妆产品，其中介质中包含了脂肪物质，或者它们是如上所述的稳定的分散体形式，如油包水或水包油乳剂。在上述组合物中，基于肽的皮肤着色剂的比例通常占组合物总重量的从约0.001％到约40％。

处理毛发、皮肤和指甲的方法：

在另外一个实施方案中，提供了使用本发明基于肽的调理剂和着色剂处理毛发、皮肤和指甲的方法。具体来说，本发明还包含在皮肤、毛发或唇上形成基于肽的调理剂保护膜的方法，具体步骤是将上述包含有效量的基于肽的皮肤调理剂或基于肽的毛发调理剂的组合物施用到皮肤、毛发或唇上，然后使之形成保护膜。可以通过各种方法将本发明的组合物施用到皮肤、毛发或唇上，包括但不限于，喷雾、用刷子涂抹和用手施用。使基于肽的调理剂组合物与皮肤、毛发或唇接触一段足够的时间，以形成保护膜，优选接触至少约0.1到60分钟。

本发明还提供了将毛发进行着色的方法，步骤是利用前面所述方法，将包含有效量基于肽的毛发着色剂的毛发着色组合物施用到毛发上。使毛发着色组合物与毛发接触一段足够的时间，以使毛发着色，优选在约5分钟到约50分钟之间，然后将毛发着色组合物从毛发上漂洗掉。

本发明还提供了对皮肤或唇进行着色的方法，步骤是利用前面所述的方法，将包含有效量基于肽的皮肤着色剂的皮肤着色组合物施用到皮肤或唇上。

本发明还提供了对手指甲或脚趾甲进行着色的方法，步骤是利用前面所述的方法，将包含有效量基于肽的指甲着色剂的指甲油组合物施用到手指甲或脚趾甲上。

本发明还提供了对眉毛和睫毛进行着色的方法，步骤是利用前面所述的方法，将包含有效量基于肽的毛发着色剂的化妆组合物施用到眉毛和睫毛上。

实施例

下面以实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解的是，这些实施例，是本发明优选的实施方案，仅用作实例。根据上述描述和这些实施例，本领域技术人员能够掌握本发明的基本特征，在不脱离本发明精神和范围内，能够对本发明作出各种改变和修改，以满足各种应用和需要。

在本发明中所使用的缩写的意思如下：“min”表示分钟、“sec”表示秒、“h”表示小时、“μL”微升、“mL”表示毫升、“L”表示升、“nm”表示纳米、“mm”表示毫米、“cm”表示厘米、“μm”表示微米、“mM”表示毫摩尔的、“M”表示摩尔的、“mmol”表示毫摩尔、“μmole”表示微摩尔、“g”表示克、“μg”表示微克、“mg”表示毫克、“g”表示万有引力常数、“rpm”表示每分钟的旋转次数、“pfu”表示蚀斑形成单位、“BSA”表示牛血清清蛋白、“ELISA”表示酶联免疫吸附测定法、“IPTG”表示异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷、“A”表示吸光度、“A₄₅₀”表示在450nm下测定的吸光率、“TBS”表示Tris缓冲盐水、“TBST-X”表示包含Tween

20的Tris缓冲盐水，其中“X”是Tween

20的重量百分比、“Xgal”表示5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷、“ESCA”表示光电子能谱、“eV”表示电子伏特、“TGA”表示热解重量分析法、“GPC”表示凝胶渗透色谱法、“MW”表示分子量、“M_W”表示重均分子量、“vol％”表示体积百分比。

常规方法：

实施例中所使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域中的公知技术，在下列文献中有所描述，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989；T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1984；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience，N.Y.，1987。

适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法也是本领域中公知的技术。下面实施例所使用的技术在下列文献中有所描述：Manual ofMethods for General Bacteriology，Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Kriey和G.Briggs Phillips，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994，或者Thomas D.Brock，Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，Second Edition，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，1989。除非另有说明，所有的试剂、限制性内切酶和用于生长和维持细菌细胞的材料均购自AldrichChemicals(Milwaukee，Wl)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。

实施例1

使用标准的生物淘选技术选择毛发-结合噬菌体肽

该实施例的目的是利用标准噬菌体展示生物淘选技术来鉴别能够与普通毛发和经漂白的毛发结合的毛发-结合噬菌体肽。

噬菌体展示肽文库：

本发明所使用的噬菌体文库，Ph.D.-12^TM噬菌体展示肽文库试剂盒和Ph.D.-7^TM噬菌体展示文库试剂盒，均购自New England BioLabs(Beverly，MA)。上述试剂盒是7或12聚的随机肽组合文库，其中随机肽融合到噬菌体M13的一个较小的外壳蛋白(pIII)上。所要展示的肽位于pIII的N-末端，因此在切除信号肽后，外壳蛋白的首位残基即是所要展示的肽的第一位残基。Ph.D.-7和Ph.D.-12文库分别由大约2.8×10⁹和2.7×10⁹个序列组成。对于每个肽序列来说，10μL的上述文库包含大约55个拷贝。每次试验的初始循环均使用制造商提供的起始文库，目的是为了避免给试验结果造成偏差。

毛发样品的制备：

所使用的普通毛发样品为6-英寸的中等棕色的人毛发，来自International Hair Importers and Products(Bellerose，NY)。将毛发放置在90％的异丙醇中，室温放置30分钟，然后用去离子水洗涤5次，每次10分钟。最后将处理后的毛发室温下风干过夜。

对于制备漂白的毛发样品，方法是将中等棕色的人毛发放置在6％的H₂O₂中，H₂O₂预先用氢氧化铵将pH值调到10.2，室温放置10分钟，然后用去离子水洗涤5次，每次10分钟。最后将处理后的毛发室温下风干过夜。

将普通毛发样品和漂白的毛发样品剪成0.5-1厘米的长度，然后将大约5-10mg的毛发样品放置于定做的24孔生物淘选装置的孔中，该装置的底部有一层猪皮。留出相同数量的带有猪皮底的空孔。该带有猪皮底的装置作为一种消减反应，可以去除对皮肤具有亲和力的噬菌体-肽。该装置是通过修改斑点印迹装置(来自Schleicher & Schuell，Keene，NH)而生成的，以适应生物淘选过程的需要。具体来说，是将斑点印迹装置上部的96孔板换成24孔板。在24孔板的底物放置一块4X6英寸的经处理的猪皮，然后将该装置绷紧，形成底部带有猪皮的淘选孔。猪皮购自当地的一家超市，储存温度为-80℃。在使用前，将猪皮放置在去离子水中解冻，然后用纸巾吸干。用90％的异丙醇擦拭猪皮表面，然后用去离子水漂洗。将24孔装置注满封闭缓冲液，缓冲液的组成为：1mg/mL BSA的TBST溶液，并含有0.5％的Tween

20(TBST-0.5％)，4℃下温育1小时。孔和毛发用TBST-0.5％洗涤5次。每个孔加入1毫升含有1mg/mL BSA的TBST-0.5％。然后，向带有猪皮底的孔中加入10μL的起始噬菌体文库(2×10¹¹pfu)(12聚的文库、或者7聚的文库)，其中孔中不含有毛发样品，噬菌体文库在室温下温育15分钟。然后将没有结合的噬菌体转移到含有毛发样品的带猪皮底的孔中，并在室温下温育15分钟。将毛发样品和孔用TBST-0.5％洗涤10次。然后将毛发转移到洁净的24孔板的塑料底孔中，每孔中加入1mL的非特异性洗脱缓冲液，该缓冲液组成为：1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH为2.2，然后温育10分钟以洗脱结合噬菌体。然后，每孔中加入160μL中和缓冲液，缓冲液组成为：1M Tris-HCl，pH为9.2。将每孔中洗脱后的噬菌体转移到新的试管中，用于滴度测定和测序。

为了测定结合噬菌体的滴度，将洗脱后的噬菌体用SM缓冲液(100mM NaCl，12.3mM MgSO₄-7H₂O，50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.01wt/vol％明胶)稀释，以制备10¹到10⁴的连续10倍稀释液。每种稀释液取10μL等分试样，与200μL对数中期的大肠杆菌ER2738(NewEngland BioLabs)一起温育，在LB培养基上生长20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl₂和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合。将混合物涂布到S-Gal^TM/LB琼脂板上(Sigma Chemical Co.)，在37℃培养过夜。S-Gal^TM/LB琼脂混和物包含5g的胰蛋白胨、2.5g的酵母提取物、5g的氯化钠、6g的琼脂、150mg的3，4-环乙烯七叶亭(cydohexeno-esculetin)-β-半乳吡喃糖苷(S-Gal^TM)、250mg的柠檬酸铁铵和15mg的异丙醇β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，溶解在500mL的蒸馏水中。在制备平板时，将上述S-Gal^TM/LB在121-124℃高压灭菌15-20分钟。随机挑选单个的黑色噬菌斑用于DNA分离和测序分析。

剩余的洗脱后的噬菌体通过与稀释后的大肠杆菌ER2738一起培养来扩增，在37℃培养4.5小时，其中的大肠杆菌ER2738是以1∶100的比例稀释在LB培养基中过夜培养获得的。之后，将细胞培养物离心30秒，将上层80％的上清液转移到一个新试管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％的聚乙二醇-800、2.5M的氯化钠)，在4℃过夜，使噬菌体沉淀。在4℃、10,000x g下离心，收集沉淀物，将收集到的沉淀重悬浮在1mL的TBS中。这即为第一轮的扩增原液。然后根据与上述相同的方法测定第一轮噬菌体扩增原液的滴度。在第二轮的生物淘选中，使用多于2×10¹¹pfu的第一轮噬菌体原液。根据试验的需要，重复3-6次上述生物淘选过程。

根据制造商(New England Labs)的使用说明书来制备单噬菌斑裂解物，并使用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化噬菌体单链基因组DNA，并使用96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’)在DuPont测序仪上测序，其中引物的序列如SEQ ID NO：62所示。所要展示的肽直接定位于基因III信号肽的后面。

在第五轮生物淘选中分离到的来自12聚文库的洗脱的普通毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表1中。在第五轮生物淘选中分离到的来自12聚文库的洗脱的漂白毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表2中。在第三轮生物淘选中分离到的来自95个随机选择的克隆的7聚文库的洗脱的普通毛发-结合噬菌体肽的重复氨基酸序列，显示在表3中。

表1

来自12聚文库的洗脱的普通毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID NO：	频率1
				1	RVPNKTVTVDGA	5	5
2	DRHKSKYSSTKS	6	2
				3	KNFPQQKEFPLS	7	2
4	QRNSPPAMSRRD	8	2
				5	TRKPNMPHGQYL	9	2
6	KPPHLAKLPFTT	10	1
				7	NKRPPTAHRIHA	11	1
8	NLPRYQPPCKPL	12	1
				9	RPPWKKPIPPSE	13	1
10	RQRPKDHFFSRP	14	1
				11	SVPNKXVTVDGX	15	1
12	TTKWRHRAPVSP	16	1
				13	WLGKNRIKPRAS	17	1
14	SNFKTPLPLTQS	18	1
				15	SVSVGMKPSPRP	3	1

¹频率代表在23个测序的克隆中所出现的相同序列的数目。

表2

来自12聚文库的洗脱的漂白毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID No：	频率1
				1	KELQTRNVVQRE	19	8
2	QRNSPPAMSRRD	8	5
				3	TPTANQFTQSVP	20	2
4	AAGLSQKHERNR	21	2
				5	ETVHQTPLSDRP	22	1
6	KNFPQQKEFPLS	7	1
				7	LPALHIQRHPRM	23	1
8	QPSHSQSHNLRS	24	1
				9	RGSQKSKPPRPP	25	1
10	THTQKTPLLYYH	26	1
				11	TKGSSQAILKST	27	1

¹频率代表在24个测序的克隆中所出现的相同序列的数目。

表3

来自7聚文库的洗脱的普通毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

¹在这些克隆中插入了多重DNA片段。

实施例2

使用修改的方法选择具有高度亲和力的毛发-结合噬菌体肽。

本实施例的目的是鉴别具有较高结合亲和力的毛发-结合噬菌体肽。

按照实施例1中所描述的，用酸性洗脱缓冲液处理毛发，用洗脱缓冲液洗涤时，比实施例1多洗涤3次，然后用TBST-0.5％洗涤3次。将抗酸的噬菌体肽仍然附着在其上的这些毛发直接感染500μL对数中期的细菌宿主细胞大肠杆菌ER2738(New England BioLabs)，然后在LB培养基上培养20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl₂和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合。将混合物涂布到LB培养基/IPTG/S-Gal^TM板上(LB培养基中

含有15g/L的琼脂、0.05g/L的IPTG和0.04g/L的S-Gal^TM)，在37℃培养过夜。对单个黑色噬菌斑进行计数，以计算噬菌体滴度。按照实施例1所描述的，随机挑取单个黑色噬菌斑用于DNA分离和测序分析。按照实施例1中所描述的，对用7聚和12聚噬菌体展示文库筛选出的普通毛发样品和漂白毛发样品分别进行上述过程。这些具有高度亲和力的毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列，显示在表4-7中。

表4

从7聚文库中筛选到的具有高度亲和力的普通毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

¹在这些克隆中插入了多重DNA片段。

表5

从7聚文库中筛选到的具有高度亲和力的漂白毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID NO：
			D39	LGIPQNL	39
B1	TAATTSP	38

表6

从12聚文库中筛选到的具有高度亲和力的普通毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID NO：
			C2	AKPISQHLQRGS	40
A3	APPTPAAASATT	41
			F9	DPTEGARRTIMT	42
A19	EQISGSLVAAPW	43
			F4	LDTAFPPVPFHA	44
F35	LPRIANTWSPS	45
			D21	RTNAADHPAAVT	46
C10	SLNWVTIPGPKI	47
			C5	TDMWAPTKSYSN	48
D20	TIMTKSPSLSCG	49
			C18	TPALDGLRQPLR	50
A20	TYPASRLPLLAP	51
			C13	AKTHKHPAPSYS	52
G-D20	YPSFSPTYRPAF	53
			A23	TDPTPFSISPER	54
F67	SQNWQDSTSYSN	55
			F91	WHDKPQNSSKST	56
G-F1	LDVESYKGTSMP	4

表7

从12聚文库中筛选到的具有高度亲和力的漂白毛发-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID NO：
			A5	EQISGSLVAAPW	43
C4	NEVPARNAPWLV	57
			D30	NSPGYQADSVAIG	58
C44	AKPISQHLQRGS	40
			E66	LDTSFPPVPFHA	44
C45	ALNWVTIPGPKI	47
			E18	TQDSAQKSPSPL	59

实施例3

选择具有高度亲和力的手指甲-结合噬菌体肽

本实施例的目的是鉴别对手指甲具有高度结合亲和力的噬菌体肽。使用实施例2中所描述的修改的生物淘选方法，来鉴别具有高度亲和力的手指甲-结合噬菌体-肽克隆。

从受试者收集人手指甲。用肥皂溶液刷洗干净手指甲，用去离子水漂洗，然后在室温下风干。将手指甲在液氮中研成粉末，在96孔过滤板的每个孔中分别加入10mg的手指甲。用封闭缓冲液处理手指甲样品，时间为1小时，其中封闭缓冲液由1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液组成，然后用TBST-0.5％洗涤。将手指甲样品与噬菌体文库(Ph.D-12噬菌体展示肽文库试剂盒)一起温育，然后洗涤10次，条件与实施例1描述的相同。按照实施例1所描述的，在酸洗脱步骤后，用洗脱缓冲液对手指甲样品多洗涤3次，然后用TBST-0.5％再洗涤3次。经过上述酸处理的手指甲，抗酸的噬菌体肽仍然附着在手指甲上，按照实施例2所描述的，将上述手指甲直接感染大肠杆菌ER2738细胞。上述生物淘选过程重复进行3次。随机挑取总共75个单个黑色噬菌斑用于DNA分离和测序分析，其中经鉴别有两个重复克隆。这些噬菌体肽的氨基酸序列列于表8中。同时发现这些手指甲结合肽也能与漂白的毛发很好地结合。

表8

具有高度亲和力的手指甲-结合噬菌体肽的氨基酸序列

克隆序号	氨基酸序列	SEQ ID NO：	频率1
				F01	ALPRIANTWSPS	60	15
D05	YPSFSPTYRPAF	53	26

¹频率代表在75个测序的克隆中所出现的相同序列的数目。

实施例4

具有高度亲和力的皮肤-结合噬菌体肽的选择

本实施例的目的是鉴别对皮肤具有高度结合亲和力的噬菌体肽。使用实施例2和4所描述的修改的生物淘选方法，来鉴别具有高度亲和力的皮肤-结合噬菌体-肽克隆。在本方法中，猪皮作为人皮肤的一种模型。

按照实施例1所描述的方法制备猪皮。按照实施例4所描述的相同方法用定做的猪皮底的生物淘选装置筛选3轮。随机挑取总共28个单个黑色噬菌斑用于DNA分离和测序分析，其中经鉴别有1个重复克隆。该噬菌体肽的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：61，该序列在28个序列中出现了9次，序列为：TPFHSPENAPGS。

实施例5

定量表征毛发-结合噬菌体克隆的结合亲和力。

本实施例的目的是利用滴度测定法和ELISA来定量测定噬菌体克隆的结合亲和力。

毛发-结合噬菌体克隆的滴度测定：

将展示出特异性肽的噬菌体克隆用于比较不同肽序列的结合特性。利用基于滴度的测定试验来定量噬菌体的结合能力。该试验测定了10mg毛发表面所保留的输出量pfu，信噪比为10³到10⁴。所有噬菌体克隆的输入量为10¹⁴pfu。应当强调的是，该试验测定的是表达肽的噬菌体颗粒，而不是结合肽的噬菌体颗粒。

将普通毛发剪成0.5cm长的小段，取其中10mg至于96孔过滤板(Qiagen)的每个孔中。然后，给每孔注入封闭缓冲液，缓冲液包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，并在4℃温育1小时。毛发用TBST-0.5％洗涤5次。然后将孔中注入1mL包含1mg/mL BSA的的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入纯化的噬菌体克隆(10¹⁴pfu)。毛发样品在室温下温育15分钟，然后用TBST-0.5％溶液洗涤10次。将毛发转移到洁净的孔中，在每个孔中加入1.0mL的非特异性洗脱缓冲液，缓冲液组成为1mg/mL BSA的0.2M甘氨酸-HCl溶液，pH为2.2。样品温育10分钟，然后在每个孔中加入160μL的中和缓冲液(1MTris-HCl，pH 9.2)。将每孔中洗脱后的噬菌体转移到新的试管中，用于滴度测定和序列分析。

为了测定结合噬菌体的滴度，将洗脱后的噬菌体用SM缓冲液稀释，以制备10¹到10⁸的10倍连续稀释液。每种稀释液取10μL等分试样，与200μL对数中期的大肠杆菌ER2738(New England BioLabs)一起温育，在LB培养基上生长20分钟，然后在45℃下与3mL上层琼脂糖(含有5mM MgCl₂和0.7％琼脂糖的LB培养基)混合。将混合物涂布到LB培养基/IPTG/Xgal板上(含有15g/L琼脂、0.05g/LIPTG和0.04g/L Xgal的LB培养基)，在37℃培养过夜。对蓝色噬菌斑进行计数，以计算出噬菌体的滴度，上述试验结果显示在表9中。

表9

毛发-结合噬菌体克隆的滴度

克隆序号	SEQ ID NO：	噬菌体滴度
			A	28	7.50×104
B	29	1.12×105
			D	30	8.02×104
E	31	1.70×105
			F	32	1.11×106
G	33	1.67×108
			H	34	1.30×106
I	35	1.17×106
			J	36	1.24×106

利用ELISA分析毛发-结合噬菌体克隆的特性：

利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来评价所选择出的噬菌体-肽克隆对毛发结合的特异性。扩增实施例1和2中所鉴别出的噬菌体-肽克隆，还有随机抽取的对照G-F9，对照的序列为KHGPDLLRSAPR(SEQID NO：63)。向预先已经进行了封闭的毛发表面加入超过10¹⁴pfu的噬菌体。作为对照，向预先进行了封闭的猪皮表面也加入等量的噬菌体，以证明其对于毛发的结合特异性。

在Minifold I Dot-Blot System(Schleicher & Schuell，Inc.，Keene，NH)的上层96孔板的底部加上一层Parafilm，然后在该Parafilm

层的上面附着上毛发或一层无毛的猪皮，最后将该装置绷紧，从而形成了独特的以毛发或猪皮为底的96孔装置。对于每个试验克隆来说，覆盖毛发的孔用200μL封闭缓冲液在室温下温育1小时，其中缓冲液组成为2％脱脂奶粉(Schleicher & Schuell，Inc.)的TBS溶液。同时用封闭缓冲液处理第二种以猪皮为孔底的Minifole系统，以作为对照。通过翻转系统去除封闭缓冲液，并用纸巾将其吸干。上述系统用洗涤缓冲液洗涤6次，缓冲液组成为TBST-0.05％。向孔中注入200μL包含1mg/mL BSA的TBST-0.5％溶液，然后向每孔中加入10μL(超过10¹²拷贝)纯化的噬菌体原液。将上述样品在37℃温育15分钟，同时缓慢摇动。用TBST-0.5％洗涤孔10-20次，以除去未结合的噬菌体。然后，向每个孔中加入100μL的辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(Amersham USA，Piscataway，NJ)，其中上述缀合物是以1∶500的比例在封闭缓冲液中稀释的，在室温下温育1小时。去除缀合物溶液，并用TBST-0.05％溶液将孔洗涤6次。向每个孔中加入购自PierceBiotechnology(Rockford，IL)的TMB底物，室温下保持5-30分钟，一般为10分钟，以显示颜色。然后，向每个孔中加入终止溶液(200μL的2M H₂SO₄)，将溶液转移到96孔板上，并使用微量培养板分光光度计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测定溶液的A₄₅₀值。以至少三个重复测定平均值报道的结果所得吸收值和平均标准误差列于表10中。

表10

皮肤和毛发的ELISA测定结果

从表10的数据可以看出，所有的毛发-结合克隆对毛发的结合亲和力显著高于对照。另外，毛发-结合克隆对毛发和猪皮表现出不同程度的选择特性。克隆D21对毛发的选择性最高，对毛发具有非常强的亲和力，而对猪皮的亲和力非常低。

实施例6

肽结合特异性和亲和力的验证

本实施例的目的是使用竞争性ELISA，来测定毛发-结合肽D21的肽结合位点的特异性和亲和力。仅对保持与毛发表面结合的噬菌体颗粒进行ELISA测定。因此，如果合成肽与噬菌体颗粒竞争毛发表面的相同的结合位点，则向ELISA体系中加入合成肽将显著降低ELISA值，这是肽竞争所导致的结果。

SEQ ID NO：46所示的毛发-结合合成肽D21，是通过SynPep(Dublin，CA)合成的。作为对照，向该体系中引入了SEQ ID NO：61所示的不相关的皮肤-结合合成肽。试验条件类似于实施例5中所描述的ELISA方法所用的条件。首先，向96孔过滤板的每个孔中加入100μL的结合缓冲液(1×TBS，含有0.1％的Tween

20和1mg/mL的BSA)和10¹¹pfu的纯化的D21噬菌体颗粒，其中孔中含有普通毛发样品。然后向每个孔中加入合成肽(100μg，相应的浓度为0.8mM)。反应在室温下进行1小时，同时轻轻摇动，然后用TBST-0.5％洗涤5次。其它的步骤与实施例5所描述的ELISA方法相同。ELISA结果，以450nm下的吸收值(A₄₅₀)表示，列于表11中。每个单独的ELISA试验重复进行三次，表11的值是三次测定结果的平均值。

表11

肽竞争性ELISA的结果

样品	A450	SEM
			抗体-缀合物	0.199	0.031
噬菌体D21	1.878	0.104
			噬菌体D21和D21肽	1.022	0.204
噬菌体D21和对照肽	2.141	0.083

上述结果表明合成肽D21的确与噬菌体克隆D21竞争毛发表面的相同的结合位点。

实施例7

使用生物淘选来选择抗洗发水的毛发-结合噬菌体-肽

本实施例的目的是使用生物淘选来选择抗洗发水的毛发-结合噬菌体-肽，方法中使用洗发水洗涤。

为了选择抗洗发水的毛发-结合肽，按照实施例2所描述的方法，使用抗普通毛发和漂白毛发的12聚噬菌体肽文库淘选进行生物淘选试验。不同之处在于，不再使用普通的TBST缓冲液洗涤掉未结合的噬菌体，而是用10％、30％和50％的洗发水溶液(Pantene Pro-V shampoo，Sheer Volume，Proctor & Gamble，Cincinnati，OH)洗涤复合了噬菌体的毛发，每个反应管洗涤5分钟，之后用TBS缓冲液洗涤6次。按照实施例2所描述的修改的生物淘选方法，将洗涤后的毛发直接感染宿主细菌细胞。

在该方法中存在一个潜在的问题，也就是洗发水可能影响噬菌体感染细菌宿主细胞的能力。在对照试验中，将已知量的噬菌体颗粒加入到10％的洗发水溶液中，保持5分钟，然后取一部分溶液感染细菌细胞。洗发水处理后的噬菌体的滴度比未处理的噬菌体低90％。用30％和50％洗发水处理更加严重损害了噬菌体感染宿主细胞的能力。不过，还是鉴别出了两种抗洗发水的毛发-结合噬菌体-肽，结果显示在表12中。

表12

使用生物淘选方法鉴别出的抗洗发水毛发-结合噬菌体-肽的肽序列。

克隆	序列	靶	SEQ ID NO：
				I-B5	TPPELLHGDPRS	普通毛发和漂白毛发	66
H-B1	TPPTNVLMLATK	普通毛发	69

实施例8

使用PCR技术选择抗洗发水的毛发-结合噬菌体-肽

本实施例的目的是使用PCR方法选择抗洗发水的毛发-结合噬菌体-肽，以避免洗发水对噬菌体造成损害的问题。PCR方法的原理是噬菌体颗粒内的DNA片段能够使用PCR方法进行回收，而不需要考虑噬菌体的生存力，并且回收的DNA片段，对应于毛发-结合肽的序列，能够被克隆返回到噬菌体载体中，并包装成健康的噬菌体颗粒。

按照实施例1的方法，使用抗普通毛发和漂白毛发的7聚和12聚噬菌体-肽文库进行生物淘选试验。在最后一次洗涤后，用洗发水洗涤噬菌体处理后的毛发，洗涤5分钟，之后用TBS缓冲液洗涤6次。将洗发水洗涤后的毛发置于带有1mL水的新试管中，煮沸15分钟，以释放出DNA。煮沸的含有DNA的溶液用作PCR反应的DNA模板。PCR反应所使用的引物如下：M13KE-1412正向引物5’-CAAGCCTCAGCGACCGAATA-3’(SEQ ID NO：67)和M13KE-1794反向引物5’-CGTAACACTGAGTTTCGTCACCA-3’(SEQ ID NO：68)。PCR反应条件是：96℃变性3分钟，之后进行35个循环，每个循环为94℃30秒，50℃30秒和60℃2分钟。PCR产物(～400bp)和M13KE载体(New England BioLabs)用限制性内切酶Eag I和Acc65I消化。应用Ph.D.^TM Peptide Display Cloning System(New England Biolabs)所描述的连接和转化条件。所得到的抗洗发水毛发-结合噬菌体-肽的氨基酸序列是NTSQLST(SEQ ID NO：70)。

实施例9

毛发-结合肽和皮肤-结合肽亲和力的测定

本实施例的目的是测定毛发-结合肽和皮肤-结合肽分别对各自底物的测定亲和力，使用ELISA测定，以MB₅₀值来表示。

毛发-结合肽和皮肤-结合肽是利用Synpep Inc.(Dublin，CA)来合成的。为了利于检测，在肽氨基酸结合序列的C-末端附加了一个生物素化的赖氨酸残基，从而使肽生物素化，并且在序列的C-末端附加了酰胺化的半胱氨酸。接受试验的肽的氨基酸序列是SEQ IDNO：71-74，如表13所示。

对于毛发样品，所用方法如下。所使用的表面特异性96孔系统的设置与实施例5所述的相同。简言之，将带有毛发或猪皮表面的96孔用封闭缓冲液(SuperBlock^TM，购自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)进行封闭，在室温下进行1小时，之后用TBST-0.5％溶液室温下洗涤6次，每次2分钟。向每个孔中加入不同浓度的生物素化的结合肽，在37℃温育15分钟，然后用TBST-0.5％室温下洗涤6次，每次2分钟。然后，向每孔中加入链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Pierce Chemical Co.)(每孔1.0μg)，室温下温育1小时。温育后，用TBST-0.5％溶液室温下洗涤孔6次，每次2分钟。最后，按照实施例5所描述的那样产生颜色，并进行测定。

使用如下的方法检测肽-皮肤复合物的MB₅₀值。首先，处理猪皮，以封闭皮上的内源性生物素。该过程是通过向封闭缓冲液中加入链霉抗生物素来完成的。在完成猪皮样品的封闭后，将皮用D-生物素进行处理，以封闭过量的链霉抗生物素结合位点。其它的步骤与毛发样品相同。

使用GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)软件将结果以不同肽浓度下所对应的A₄₅₀值作图。从斯卡查德图计算出MB₅₀值，结果总结在表13中。该结果表明毛发-结合肽(D21，F35和I-B5)和皮肤-结合肽(SEQW ID NO：61)分别对各自的底物具有很高的结合亲和力，但是毛发-结合肽(D-21，和I-B5)对皮肤的结合亲和力则相对要低。

表13

毛发和皮肤-结合肽的MB₅₀值总结

^*用于试验的肽是在氨基酸结合序列的C-末端进行了生物素化的，并在结合序列的C-末端附加了酰胺化半胱氨酸的肽。

实施例10

基于肽的炭黑毛发着色剂的制备

本实施例的目的是制备基于肽的炭黑毛发着色剂，其是通过将毛发-结合肽D21(SEQ ID NO：46)与炭黑颗粒的表面共价连接来完成的。通过与2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二盐酸化物反应，引入游离的氨基，从而使炭黑颗粒的表面功能化。然后将功能化的炭黑颗粒共价连接到特定的毛发-结合肽上。

炭黑表面的功能化：

将炭黑(Nipex

160-IQ，购自Degussa，Allendale，NJ)，2.0g和1.0g的2，2’-偶氮二(2甲基丙酰胺)-二盐酸化物(Aldrich，Millwaukee，WI)加入到100mL的圆底烧瓶中，并加入30mL的二氧六环。用氮将烧瓶清洗5分钟。然后用橡胶隔膜将烧瓶密封，然后将反应混合物在65℃下搅拌14小时。之后，向反应混合物中加入50mL的去离子水，其中去离子水是用Nanopure纯化系统(Barnstead/Thermolyne，Dubuque，IA)制备的。将稀释后的溶液进行离心，收集功能化的炭黑颗粒，并去除有机溶剂和未反应的试剂。用去离子水洗涤炭黑颗粒，并离心。洗涤和离心步骤再重复2次。然后将功能化的炭黑颗粒进行冷冻干燥。

来自噬菌体克隆D21的t-Boc保护的毛发-结合肽的合成：

此反应的目的是保护毛发-结合肽的氨基末端基团。在25mL的圆底烧瓶中，将来自噬菌体克隆D21的毛发-结合肽(0.25g，SEQ IDNO：46，纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)与2.5mL的去离子水混合。然后，加入20mg的NaOH和0.25mL的叔丁醇。将混合物搅拌2分钟，之后逐滴加入0.12g的二叔丁基碳酸氢盐(t-Boc酐)(Aldrich)。烧瓶用橡胶隔膜密封，且反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物在反应开始时是澄清的，之后慢慢变浑浊，在1小时后出现沉淀。向反应混合物中加入水(10mL)后，反应混合物形成乳白色的乳剂，然后用5mL份的二氯甲烷提取三次。用5mL份的去离子水将有机层洗涤二次。将澄清的水层收集在一起并冷冻干燥，得到0.20g的白色疏松粉末(得率为80％)。使用液相层析-质谱分析法(LC-MS)分析所得到的产物，发现其分子量为1323g/mol，纯度为90重量％。

氨基-功能化的炭黑与t-Boc-D21-肽的偶联：

在3mL四氢呋喃(THF)中，加入氨基-功能化的炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二环己基碳二亚胺(22mg)。将二甲基氨基吡啶(17μL)溶解在几滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，边加入边搅拌。将所得到的黑色悬浮液在40℃加热6小时，同时进行搅拌，之后室温下搅拌过夜。向产物中加入三氟乙酸(0.6mL)，并将混合物继续搅拌6小时。然后，向反应混合物中加入5mL去离子水。混合物在3,500rpm下离心2分钟，并轻轻倾倒出上清液。用去离子水洗涤离心管中的固体残留物，并再次离心。重复进行洗涤步骤，直到上清液的pH值接近6.0。然后将黑色的残渣用冷冻干燥机干燥2天，得到黑色的粉末。

实施例11

使用基于肽的炭黑毛发着色剂对毛发进行染色

本实施例的目的是使用实施例10制备的基于肽的炭黑毛发着色剂对天然白色毛发样品进行染色。

将一束天然白色毛发(约100根)(购自International HairImporters and Products，Inc.，Bellerose，NY)通过与10mL的50％异丙醇混合30分钟来进行清洗，然后用去离子水至少洗涤5次。毛发变干后，将洗净的毛发浸入下列溶液中30分钟，该溶液是将50mg实施例10所述的毛发-结合D21肽-炭黑毛发染色剂溶解在10mL去离子水中所形成的溶液。染色完成后，将毛发用去离子水至少洗涤5次。开始时的天然白色毛发变得黑亮。将染后的毛发用30％的洗发水(Pantene Pro-V洗发水)洗涤三次，方法是将毛发浸入洗发水中并用玻璃移液管搅拌。然后将毛发用蒸馏水漂洗至少10次。天然白色毛发经过染色处理后的最终颜色非常黑亮。

实施例12

基于肽的毛发调理剂的制备

本实施例的目的是制备基于肽的毛发调理剂，其中使用碳二亚胺偶联将毛发-结合D21肽(SEQ ID NO：46)与二十二醇共价连接。

在25mL的圆底烧瓶中，将81.7mg的二十二醇(Aldrich)和62.0mg的二环己基碳二亚胺(DCC)溶解在2.0mL的THF中。向上述混合物中加入下列溶液，该溶液是将0.25g 9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)N-末端保护的SEQ ID NO：46(纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)溶解在2.0mL的二甲基甲酰胺(DMF)中所形成的溶液。然后，向反应混合物中加入50μL的二甲基氨基吡啶(DMAP)。将反应混合物在40℃保持3小时，并不断搅拌，然后置于室温下过夜。然后将溶剂在室温下真空蒸发4小时。之后，将混合物溶解在25mL的乙酸乙酯中，然后用水提取未反应的肽3次，每次提取使用10mL去离子水。分离乙酸乙酯相，并使用旋转式汽化器将乙酸乙酯蒸发掉。将所得到的固体产物溶解在下列溶剂中，该溶剂由2.5mL的THF和2.5mL的DMF组成，然后加入1.5mL的哌啶，以使D21肽的氨基基团去封闭。将混合物在室温下搅拌2小时，然后使用旋转式汽化器在真空下将溶剂蒸发掉。通过LC/MS表征所得到的最终产物。

实施例13

基于肽的毛发调理剂的制备

本实施例的目的是制备基于肽的毛发调理剂，其中使用双异官能团交联剂3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯将附着了半胱氨酸的毛发-结合D21肽(SEQ ID NO：64)与辛胺共价连接。

辛胺，购自Aldrich(Milwaukee，WI)，取其中11.6mg稀释到0.3mL的DMF中。将稀释后的溶液搅拌着加入到置于5mL圆底烧瓶中的下列溶液中，该溶液是将25mg的3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Aldrish)和5mg的二异丙基乙胺(Aldrish)溶解在0.2mL的DMF中所形成的溶液。反应混合物立即变浑浊，然后在几分钟之后变澄清。将溶液继续搅拌4小时。然后将溶液在高度真空下干燥。使用柱层析纯化附着了辛胺的马来酰亚胺丙酸酯，所使用的柱子是硅胶60(购自EMD Chemicals，以前叫做Science，Gibbstown，NJ)，洗脱液是DMF/醚。

将约12mg的上述产物置于5mL的圆底烧瓶中，加入50mg附着了半胱氨酸的D21肽(来自SynPep，Dublin，CA，SEQ ID NO：64)和0.5mL 0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲液。附着了半胱氨酸的D21肽具有3个甘氨酸残基，并在毛发-结合D21肽(SEQ ID NO：46)的肽结合序列的末端附着了半胱氨酸。将混合物在室温下继续搅拌6小时。使用水/醚提取纯化到最终产物，即C8-D21肽毛发调理剂。

实施例14

基于肽的炭黑毛发着色剂的制备

本实施例的目的是制备基于肽的炭黑毛发着色剂，其中所使用的炭黑是用乙醇胺进行了功能化的。使用化学分析方法估计出了附着到炭黑表面上的肽的数量。

酸功能化的炭黑颗粒的制备：

在1,000mL的烧杯中，加入25.5g的炭黑(Nipex-160-IQ，购自Degussa)、100g的过二硫酸铵[(NH₄)₂S₂O₈](纯度为98％，购自Aldrich)、333mL的1.0M的H₂SO₄(纯度为98％，GR级，购自EMDChemicals)。将混合物在室温下用磁力搅拌盘搅拌24小时。之后，将反应混合物转移到500mL的塑料离心管中，并在8,500rpm下离心20分钟。将澄清后的上清液去掉。产物用去离子水洗涤6次，每次洗涤后进行离心，收集产物。最终得到的产物是中性的(pH＝6.0)，然后进行冷冻干燥24小时。所得到的功能化炭黑颗粒的平均大小是100nm，是通过粒径分析仪测定的(Microtrac Ultrafine Particle Analyzer，Microtrac Inc.，Montgomeryvile，PA)。

使用乙醇胺制备氨基功能化的炭黑：

将2g干燥的酸功能化炭黑、25mL的乙醇胺(纯度为99％，购自Aldrich)，和1mL的浓硫酸(H₂SO₄，纯度为98％，GR级，购自EMDChemicals)在100mL的圆底烧瓶中混合。用磁力搅拌器快速搅拌上述混合物，并回流6小时。在混合物冷却到室温后，向混合物中加入足够量的氢氧化铵(NH₃含量为28.0-30.0％，购自EMD Chemicals)，以中和上述混合物。然后，按照实施例6所述的方法，将混合物离心，并用水洗涤。最终得到的产物是中性的(pH＝6.0)，并冷冻干燥24小时。该干燥的氨基功能化的炭黑易于在水中分散。

在DuPont Corporate Center for Analytical Science，使用ESCA法对功能化炭黑颗粒表面的成分进行了分析。在ESCA方法中，单能X-射线聚焦到材料的表面，激发表面原子。具有表面上部10nm内的元素能量特性的核和价层电子被喷射出来，分析它们的能量特性，从而获得表面成分的定性或定量信息。激发电子的动能提供了有关功能基团和表面种类氧化状态的信息。在该实施例中，所使用的X-射线源是镁阳极，能量为1253.6eV。样品在45度的出口角进行分析(样品厚度大约5-10nm)。ESCA分析结果显示在表14中。乙醇胺功能化的炭黑表面主要组成为未反应的-COOH基团和-C(＝O)-OCH₂CH₂NH₂基团。为了计算胺(y)与羧酸基团(x)的比例，对乙醇胺使用了一个简单的方程式，具体来说是y/(x+y)＝(N％/14)/(O％/32)。结果列于表14中。

表14

功能化炭黑的ESCA分析结果

样品	C％	O％	N％	S％	-NH2/-COOH
						酸功能化炭黑	89	10	ND*	0.1	0
乙醇胺功能化炭黑	87	10	2.6	ND	1.47

^*ND表示未检测出

氨基功能化的炭黑与t-Boc-D21-肽的偶联：

然后将氨基功能化的炭黑与特定的毛发-结合肽D21(SEQ IDNO：46)进行共价连接。按照实施例10所述的方法合成t-Boc保护的D21肽。然后，将氨基功能化炭黑(87mg)、t-Boc-D21-肽(80mg)和二环己基碳二亚胺(DCC)(22mg)加入到3mL的四氢呋喃(THF)中。将二甲基氨基吡啶(DMAP)(17μL)溶解在几滴THF中的溶液逐滴加入到上述混合物中，同时进行搅拌。将所得到的黑色悬浮液加热到40℃，保持6小时，并伴随着搅拌，然后在室温下继续搅拌过夜。为了去除D21肽上的t-Boc保护基团，向上述产物中加入三氟乙酸(TFA)(0.6mL)，然后将混合物继续搅拌6小时。然后，向反应混合物中加入5mL去离子水。混合物在3,500rpm下离心2分钟，并将上清液轻轻倒出。用去离子水洗涤离心管中的固体残留物，并再次离心。重复进行洗涤步骤，直至上清液的pH值接近6.0。将黑色的残渣用冷冻干燥仪干燥2天，得到黑色粉末。

使用ESCA、元素分析、和TGA(热解重量分析法)分析了氨基功能化的炭黑颗粒和连接了肽的炭黑颗粒。分析结果表明用乙醇胺修饰的炭黑的有机层占总重量的大约12％。在D21肽与炭黑颗粒附着后，肽的重量百分比为18％-30％。因此，对于粒径为100nm的炭黑颗粒来说，在与乙醇胺反应后，在颗粒表面附着上了总量为9.5×10⁴的分子，在与肽反应后，在颗粒表面附着上了总量为7,700的D21肽分子。计算在炭黑表面的肽密度，结果表明每个D21肽占4nm²的空间，这与附着于噬菌体的肽密度形成对比，后者约为12nm²。

实施例15

基于肽的炭黑毛发着色剂的特异性

本实施例的目的是验证D21肽-炭黑毛发着色剂的特异性。

按照实施例14所述的方法制备D21肽-炭黑着色剂。

将一块猪皮(10cm×10cm，购自当地超市)通过与30mL 30％的异丙醇混合10分钟进行清洗，然后用蒸馏水洗涤至少5次。风干后，将干净的猪皮浸入带有多个孔的平板固定器中，该容器中盛有下列溶液，50mg的D21肽-炭黑着色剂溶解在10mL的蒸馏水中。应用着色剂15分钟后，将猪皮用30％的洗发水溶液(Pantene Pro-V洗发水)洗涤3次，方法是将洗发水溶液滴入孔中，然后再将其倒出。最后将猪皮用蒸馏水漂洗5次。

按照上述处理猪皮的方法对一束普通白色毛发样品(购自International Hair Importers and Products，Bellerose，NY)，进行了相同的处理。

在进行完洗涤步骤后，猪皮的黑色非常轻，可以忽略不计，而毛发则是非常黑亮。上述结果表明D21肽-炭黑着色剂对毛发具有结合特异性，对皮肤则没有。

实施例16

肽-聚硅氧烷毛发调理剂的制备

本实施例的目的是合成D21肽-聚硅氧烷毛发调理剂。将D21肽(SEQ ID NO：46)的侧链反应功能团完全保护，以使得聚硅氧烷仅与肽的C-末端基团反应。另外，在结合序列的C-末端加上了一个三肽间隔物，该三肽间隔物由甘氨酸残基组成。

在5mL的圆底烧瓶中，将50mg完全被保护的D21肽：Fmoc-R(Pbf)T(tBu)N(Trt)AAD(OtBu)H(Trt)PAAVT(tBu)GGG(其中Fmoc表示9-芴基甲氧基羰基；Pbf表示2，2，6，4，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；tBu表示叔丁基；Trt表示三苯甲基；Otbu表示叔丁氧基)(分子量为2522，0.02mmol，纯度为95％，来自SynPep，Dublin，CA)(SEQ ID NO：78)溶解在1mL的二甲基甲酰胺(DMF，购自E.Merck，Darmstadt，德国)。在样品小瓶中，将聚硅氧烷流体2-8566(77mg)(N％＝0.875％，0.024mmol-NH₂，购自Dow Corning，Midland，MI)溶解在2mL的THF(购自E.Merck)中，然后转移到含有肽溶液的圆底烧瓶中。然后，向烧瓶中加入5mg的二环己基碳二亚胺(DCC，0.024mmol)和5μL的二甲基氨基吡啶(DMAP)。用橡胶塞将烧瓶密封，然后在50℃将反应混合物搅拌5小时，之后在室温下过夜。在反应完成后，将溶剂在真空下抽空。干燥后，得到122mg的固体产物。得率大约是90％。

将固体产物溶解在N，N-二甲基乙酰胺(DMAC，购自EMDChemicals)中，制得产物为5mg/mL的DMAC溶液，用于GPC(凝胶渗透色谱法)分析，进行折射率检测，从而确定分子量。最初的聚硅氧烷(Dow Corning 2-8566)是不溶于DMCA的，因此在层析谱的分离区内不能发现聚硅氧烷。D21肽是一个尖的低分子量峰，产物样品包含2个峰，一个是没有连接D21肽的峰，另一个是宽的峰，是聚硅氧烷嫁接上了D21肽的结果。以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为标准计算了重均分子量(M_W)。D21肽和肽-聚硅氧烷调理剂的M_W分别是4.7×10³和4.4×10⁴。

使用了一种切割试剂来切割D21肽侧链功能团的保护性基团，切割试剂(称作试剂K，购自SynPep)具有如下组成：三氟乙酸/H₂O/苯硫基甲烷/乙二硫醇/酚(85∶5∶5∶2.5∶2.5体积比)。首先将试剂K(1mL)预冷到-20℃，然后加入100mg的D21肽-聚硅氧烷调理剂。将混合物室温下搅拌3-4小时，然后在高度真空下去掉试剂K。向混合物中加入61.2mg占DMF体积20％的哌啶DMF溶液，并搅拌30分钟，去除肽N-末端的Fmoc保护基团，之后在高真空下抽空。最终的产物在THF、DMF或DMAC中不能完全溶解。因为溶解性较低，因此不能对最终产物进行GPC分析。

实施例17

基于肽的毛发调理剂的效力

本实施例的目的是验证基于肽的毛发调理剂在降低人毛发纤维摩擦力方面的效力，并与市售的调理剂进行比较。对于毛发纤维集合(即多根纤维)来说，其梳理的性能在很大程度上取决于毛发纤维的摩擦。单根毛发纤维的摩擦力特性与毛发集合的梳理特性相关。纤维之间的摩擦研究表明施用调理剂能够改善毛发表面。纤维间的摩擦越小，则毛发看上去越光滑，感觉上也越光滑，并且在梳理时更加容易。在本实施例中所使用的测定纤维间摩擦的方法是几种毛发纤维试验的一种，该方法能够给出确定的定量数据，是工业上常用的一种方法。

将实施例12所述的由毛发-结合肽(SEQ ID NO：46)与二十二醇共价连接组成的基于肽的毛发调节剂用于如下制剂中，该制剂由溶于蒸馏水中的0.25％的基于肽的调节剂和重量百分比为1.5％的Performix^TM卵磷脂(ADM Lecithin，Decatur，IL)组成。将上述水溶液在7000rpm下混合4分钟，使用的仪器是Silverson L4RT-A HighShear Laboratory Mixer(Silverson Machines，Inc.，East Longmeadow，MA)，混合时使用一个常规用途的裂解头(disintegrating uead)和一个0.95cm的微型管形支架。制备含量为0.5％的Dow Dow Corning 

929阳离子乳剂(Dow Corning Corp.，Midland，MI)(一种市售的调理剂)蒸馏水溶液，混合条件与上述方法相同。

在试验前将一种欧洲人黑棕色毛发假发(International HairImporters and Products)进行清洗，方法为将毛发浸入异丙醇中30分钟，然后用蒸馏水洗涤10次。将这些假发的单根毛发纤维送到TextileResearch Institute(TRI)，Princeton，NJ作摩擦测试。在TRI，将毛发纤维浸入调理剂溶液中5分钟，温度大约为35℃，不要搅拌。之后，在微温的水中漂洗1分钟，然后在21℃、65％相对湿度下过夜干燥。

按照Kamath等(J.Appl.Polymer Sci.，85：394-414(2002))的方法，使用单根纤维摩擦仪通过纤维间摩擦试验，对经过处理的毛发纤维作摩擦力测量。使用Instron拉伸测试仪(Tensile Testing machine)，在高正交力(高负荷)(0.74g)下估计了毛发纤维对镀铬钢丝的摩擦力，十字头速度是1mm/分钟。使用TRI/Scan^TM Surface Force Analyzer(Textile Research Institute)在低正交力(低负荷)(8.5mg)下，测量对另外一根毛发纤维的摩擦力。该仪器能够用Cahn

微量天平测量出很小的力(质量分辨率为0.1mg)并且有一个计算机控制平台。测试结果显示在表15中。

表15

摩擦力测量结果

两种情况下的结果表明，使用基于肽的调理剂处理后的毛发，其平均摩擦力小于用Dow Corning929阳离子乳剂调理剂处理的毛发。随后，对用1.5％卵磷脂调理后的样品进行了纤维摩擦力测试(低负荷)，平均摩擦力为3.366mg，这表明基于肽的调理剂所具有的调理效果不是因为在制剂中存在卵磷脂的原故。该结果验证了本发明基于肽的毛发调理剂所具有的效果。

Claims (12)

1.一种二嵌段、基于肽的毛发调理剂，其通式为(HBP)_n-HCA，

其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)HCA是一种毛发调理剂；并且

c)n从1到1,000，

其中所述毛发结合肽具有7到25个氨基酸，并且其对毛发的结合亲和力，以MB₅₀计，等于或小于10^-5M，并且

其中所述毛发结合肽是通过包含如下步骤的方法分离的：

(i)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

(ii)将(i)的文库与毛发样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(A)噬菌体-肽-毛发复合物；

(B)未结合的毛发，和

(C)未形成复合物的肽；

(iii)分离(ii)的噬菌体-肽-毛发复合物；

(iv)从(ii)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

(v)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，所述鉴别是通过直接将经过步骤(iv)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物进行聚合酶链反应，或通过直接将经过步骤(iv)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴定噬菌体-肽。

2.一种三嵌段、基于肽的毛发调理剂，其通式为[(HBP)_m-S]_n-HCA，其中

a)HBP是一种毛发-结合肽；

b)HCA是一种毛发调理剂；

c)S是一种间隔物；

d)m从1到50；并且

e)n从1到1,000，

其中所述毛发-结合肽具有7到25个氨基酸，并且其对毛发的结合亲和力，以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；

其中所述毛发结合肽是通过包含如下步骤的方法分离的：

(i)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

(ii)将(i)的文库与毛发样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(A)噬菌体-肽-毛发复合物；

(B)未结合的毛发，和

(C)未形成复合物的肽；

(iii)分离(ii)的噬菌体-肽-毛发复合物；

(iv)从(ii)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

(v)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，所述鉴别是通过直接将经过步骤(iv)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物进行聚合酶链反应，或通过直接将经过步骤(iv)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴定噬菌体-肽；并且

其中所述间隔物选自：乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、硬脂基烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链或其中所述间隔物是一种包含氨基酸的肽，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和它们的混合物。

3.权利要求1或2所述的基于肽的调理剂，其中毛发-结合肽在肽的至少一个末端进一步包含半胱氨酸残基。

4.权利要求1或2所述的基于肽的毛发调理剂，其中毛发-结合肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1、3-59、64、66、69、70、76-97和98。

5.权利要求1或2所述的基于肽的毛发调理剂，其中毛发调理剂选自：辛胺、硬脂胺、二十二醇、乙烯基封端的硅氧烷、乙烯基封端的聚硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基硅氧烷、乙烯基封端的甲基乙烯基聚硅氧烷、羟基封端的硅氧烷、羟基封端的聚硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基硅氧烷、[(氨乙基)氨基]丙基羟基二甲基聚硅氧烷、α-十三烷基-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙烷二基)、氨基封端二甲基聚硅氧烷和脱乙酰壳多糖。

6.权利要求2所述的基于肽的调理剂，其中所述间隔物是一种包含SEQ ID NO：65所示氨基酸序列的肽。

7.一种毛发护理组合物，其包含有效量的权利要求1或2所述的基于肽的毛发调理剂。

8.一种毛发调理组合物，其包含有效量的权利要求1或2所述的基于肽的毛发调理剂。

9.基于肽的调理剂在毛发上形成保护层的方法，包含将权利要求8所述的组合物施用到毛发上，并使之形成所述的保护层。

10.权利要求9所述的方法，其中将组合物施用到毛发上所保持的时间为0.1到60分钟。

11.基于肽的调理剂在毛发上形成保护层的方法，包含如下步骤：

a)提供一种包含毛发调理剂的毛发护理组合物，其中毛发调理剂选自：

i)(HBP)_n-HCA；和

ii)[(HBP)_m-S]_k-HCA

其中

1)HBP是一种毛发-结合肽；

2)HCA是一种毛发调理剂；

3)n从1到1,000；

4)S是一种间隔物；

5)m从1到50；并且

6)k从1到1,000；

并且其中的毛发-结合肽是通过包含如下步骤的方法选择的：

A)提供一种组合生成的噬菌体-肽文库；

B)将(A)的文库与毛发样品进行接触，形成一种反应溶液，其包含：

(i)噬菌体-肽-毛发复合物；

(ii)未结合的毛发，和

(iii)未形成复合物的肽；

C)分离(B)的噬菌体-肽-毛发复合物；

D)从(B)的肽复合物中洗脱去结合能力弱的肽；

E)鉴别仍然结合的噬菌体-肽，所述鉴别是通过直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物进行聚合酶链反应，或通过直接将经过步骤(D)后所保留下来的噬菌体-肽-毛发复合物感染细菌宿主细胞，在合适的生长培养基上生长感染的细胞，并从生长细胞中分离和鉴定噬菌体-肽，其中噬菌体-肽具有7-25个氨基酸，并且对于毛发的结合亲和力以MB₅₀计，等于或小于10^-5M；和

b)将(a)的毛发调理剂施用到毛发上，并使之形成所述的保护层，

其中所述间隔物选自：乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、硬脂基烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链或其中所述间隔物是一种包含氨基酸的肽，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和它们的混合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中组合生成的噬菌体-肽文库选自：Ph.D.-12噬菌体展示文库和Ph.D.-7噬菌体展示文库。