CN102137931B

CN102137931B - 提纯核酸的方法，特别是从固定组织中提纯核酸的方法

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Publication number: CN102137931B
Application number: CN200980123037.0A
Authority: CN
Inventors: 海克·奥伊延; 吉多·亨尼希; 科斯延·博曼
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Current assignee: Siemens Medical Diagnosis Co Ltd
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-18
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2029-06-18
Also published as: CN102137931A; WO2009153299A1; CA2728484A1; CA2728484C; US20110092691A1; EP2288701A1; US8846897B2; DE102008029356A1; EP2288701B1

Abstract

本发明涉及一种核酸提纯方法、一种用于实施本发明方法的试剂盒以及磁性粒子在生物样本提纯方面的一种新应用。本发明的方法包括以下步骤：a)将所述样本送入一种水溶液；b)裂解所述样本；c)去除细胞碎片；以及d)从所述溶液中分离出所述核酸，其中，步骤(a)至(c)在无离液条件下进行。

Description

提纯核酸的方法，特别是从固定组织中提纯核酸的方法

技术领域

本发明涉及一种核酸提纯方法、一种用于实施本发明方法的试剂盒以及磁性粒子在生物样本提纯方面的一种新应用。

背景技术

近年来，分子诊断学越来越重要。分子诊断学已进入疾病的临床诊断(例如检测传染病病原体、检测基因组突变、发现循环肿瘤细胞以及识别疾病易感体质的危险因素)。分子诊断学的方法目前也应用于兽医学、环境分析和食品检测等领域。此外还应用于病理学/细胞学研究所中的检查或法医课题。现今在健康检查中(例如检查库存血中是否存在传染病病原体)也采用基因诊断，而且立法部门计划在未来以立法的形式对这类检测予以相应规定。诸如杂交或扩增技术(例如PCR(聚合酶链反应)、TMA(转录介导的扩增)、LCR(连接酶链反应)、bDNA(分支DNA)或NASBA(基于核酸序列的扩增)技术)等同时应用于临床分子诊断的方法也属于学术性基本操作的常规方法。

核酸分析主要通过测定组织中的基因表达为肿瘤疾病的研究和诊断开辟了大有前途的新途径。举例而言，所谓的微阵列系统通过一种单一方法就可以确定成千上万种基因的表达。其中，将样本材料(即已提纯的核酸，例如RNA或cDNA)置于一个具有相应低(聚)核苷酸探针的芯片上，以便通过杂交来检测样本中的核酸。此外还存在其他用于检测样本中的核酸的常见方法，例如扩增法，如聚合酶链反应(PCR)。

核酸分析的主要问题在于样本制备。待检样本中的细胞或组织往往含有部分不溶性干扰成分(即所谓的碎片)，这些成分可能妨碍接下来的分离和分析工作。这类不溶性成分主要出现在粪便、血液、疣、钙化结构(骨骼)或严重坏死的组织样本的核酸分离过程中。但是，广义上的碎片也包括可溶性成分，例如从红细胞中释放出来的、需要在核酸分离过程中加以分离的超量血红蛋白。

这一问题在肿瘤诊断中影响特别严重，因为这个领域通常采用福尔马林固定的石蜡包埋切片(FFPE切片)作为样本材料。在患者身上采样时，例如进行活组织切片检查或对肿瘤物质(Tumormaterial)进行手术采样时，用福尔马林固定组织材料并将其包埋在石蜡中以加固样本材料。该固定物质可在培养过程中乃至数年之后在组织块内部形成生物分子的大量交联(核酸与蛋白之间以及蛋白之间或核酸之间的交联)。这些处于细胞内部和外部的交联结构促成了不溶性碎片或者说很难裂解或不可裂解的碎片的产生。石蜡包埋样本通常被制成切片以供病理学家鉴定，这些切片也可用作核酸分析的起始材料。进行核酸提纯时，必须在裂解后去除细胞碎片和石蜡。

此外，从粪便样本中提纯核酸的过程也会出现上述部分不溶性干扰成分(碎片)这一问题。一方面，粪便样本由食物中的难消化成分(粗纤维)以及未被上部大肠吸收的未消化残余物如脂肪、淀粉、结缔组织纤维、肌纤维和水构成。还有人体自身产生的物质：排出的肠细胞、残余的消化酶及粘液。另一方面，少量的胆汁酸、同样从胆囊中排出的对肠粘膜起保护作用的卵磷脂及其他磷脂也连同粪便一起排出体外。

为了降低成本并尽量缩短从采样到测定分析结果的处理时间，当务之急是尽量提高核酸提纯方法的效率和自动化程度。特别是诊断领域。适合自动化的是那些只需用少数几种反应容器及标准化规格(如96孔板规格)就可实施的方法，因为这类方法可以采用高效率的自动吸液(Pipetierroboter)装置。因此，现有技术需要一种简单、高效又能最大程度自动化的样本制备方法。

常见的核酸提纯方法包括在离液条件下的样本裂解、萃取式提纯以及从液相中进行沉淀及提纯等步骤，例如苯酚-氯仿提取(参阅Sambrook等人的“Molecular cloning-alaboratory manual(分子克隆实验手册)”第3版，冷泉港实验室，冷泉港出版社出版，2001年，ISBN-13：978-0879695774)，或者例如在WO 2003040364-A1中公开的所谓的柱提纯法(Aufreinigungsverfahren)。

Chomcznski在US 5,346,994中描述了一种常见的核酸分离方法，其中，使用苯酚和离液化合物(chaotropen Verbindung)异硫氰酸胍来从液相中分离核酸，在此基础上从组织材料中提纯核酸。为此须在水溶液中将样本均质化并在添加异硫氰酸胍(GTC)和苯酚/氯仿后进行离心处理。蛋白位于有机相中，DNA位于中间相中，RNA位于水相中。RNA可从水相中沉淀出来。但是，这个方法无法可靠地从FFPE组织样本中提纯RNA。

其他用于分离DNA或RNA的已知方法通常采用离液盐或苯酚提取。

EP0819696揭示一种核酸提纯方法，这种方法的原理是在离液条件下将核酸结合在二氧化硅或其他二氧化硅衍生物上。其中，使样本在离液裂解缓冲液中裂解并将核酸结合在二氧化硅基质上。

从石蜡切片中提纯核酸的现有已知方法首先需要实施一个复杂的去石蜡步骤，通常是用二甲苯去除石蜡，而后需要用二甲苯/乙醇稀释系列进行复杂的再水化处理。

有鉴于此，WO 200146402 A1描述了一种从固定的石蜡切片中提纯核酸的方法，其中，先将石蜡切片放入一个艾本德(Eppendorf)反应容器并用二甲苯进行去石蜡处理。随后需要通过二甲苯/乙醇稀释系列来对该切片进行再水化处理。接下来将样本放在离液溶液中加热一段较长的时间(5至120分钟)，以便提纯RNA。这种方法虽然能够有效地去除石蜡，但其复杂程度高而且由于需实施多个离心步骤而难以实现自动化。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种相对于现有技术而言有所改进的核酸提纯方法，特别是适合自动化的方法。

定义：

“生物样本”这一概念指的是任何一种含有细胞或细胞物质的样本，特别是细胞、冷冻细胞团块、固定细胞、粪便、“白细胞层”(即血沉棕黄层)、腹水、涂片(特别是腮部或咽喉涂片，尤其是宫颈涂片)、唾液、器官抽出物(Organpunktat)、精液、组织样本、固定组织样本、固定或非固定组织样本的组织切片(特别是冷冻切片和石蜡切片，尤其是福尔马林固定的石蜡切片)、肿瘤物质、活检样本、血样(特别是全血或血块)、细胞悬液，广义上“生物样本”是指所有含有细胞成分的样本，这里的细胞成分既指完整细胞也指细胞组成部分。

此外，“生物样本”这个概念也包括其他含核酸的生物材料，例如血清或血浆(特别是带病毒的血清或血浆，尤其是感染HIV和HCV的血清样本)、分泌物、脑脊液、胆汁、淋巴液、尿液。也可以是产生于生化或生物技术处理过程且需加以提纯的含核酸材料。

“细胞”这个概念既指原核细胞也指真核细胞。

“样本裂解”指的是样本中细胞或细胞结构的破裂。这个概念主要包括机械裂解(例如利用超声波)、热解(例如通过冷冻-解冻循环，加热样本)和化学裂解(例如利用去垢剂)。然而，“样本裂解”这一概念的适用范围不仅限于细胞，也可以指利用上述方法从非细胞的生物结构或复合物中释放出核酸。

“核酸”这个概念包括寡聚及聚合的核糖核苷酸或者链长超过10个单体单元的2′-脱氧核糖核苷酸。核酸中的这些单体单元通过位于相邻单体单元的3′羟基和5′羟基之间的磷酸二酯键相连，且一种杂环碱基糖苷结合在相应碳水化合物组分的1′原子上。核酸可以通过形成分子间氢键来形成双链及三链核酸。

“核酸”这一概念还包括蛋白-核酸络合物以及含合成核苷酸的核酸，例如吗啉代、LNA或PNA。

“离液条件”这个概念指存在离液剂或离液化合物时的溶剂条件。离液剂或离液化合物指的是在蛋白、核酸和蛋白-核酸络合物的一级结构保持完整的情况下，改变或打破其二级结构、三级结构和四级结构的化合物。在离液条件下的溶液中，生物分子(特别是蛋白、蛋白-核酸络合物及核酸)的分子内相互作用遭到破坏，其原因在于，离液化合物会干扰生物分子中起稳定作用的分子内相互作用，例如氢键、范德瓦尔斯力和疏水效应。离液化合物通常具有大体积离子，这些离子的体积会干扰分子内相互作用，进而可能降低溶剂的极性。分子间及分子内氢键由此而断裂。并使大量蛋白沉淀，但双链核酸片段的螺旋结构保持不变。通过在细胞裂解物或细胞悬液中添加离液化合物可使蛋白沉淀，而核酸仍留在溶液中。在离液条件下可大大促进核酸在二氧化硅基基质上的结合。举例而言，离液化合物包括高分子尿素溶液(例如6mol/l至8mol/l尿素)、胍盐溶液(例如6mol/l盐酸胍)、高分子锂盐(例如4.5mol/l高氯酸锂)。离液阴离子包括F-、PO₄ ^3-、SO₄ ^2-、CH₃COO^-、Cl^-等阴离子，特别是Br^-、I^-、NO_x ^-、CLO₄ ^-、SCN^-以及CL₃CCOO^-。离液阳离子包括Li⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺等阳离子，特别是胍盐阳离子[CH₆N₃]⁺。优选采用异硫氰酸胍([CH₆N₃]⁺SCN^-)和盐酸胍作为离液化合物来分离核酸。

“无离液条件”这个概念指水性和/或乙醇溶液中不存在离液剂时的溶剂条件。

“核酸提纯”这个概念指的是从一份含有核酸的样本中完全或部分去除非核酸成分。这个概念并不仅限于达到一定纯度。

“自动化提纯”这个概念包括用来全部或部分取代人工手动操作的方法，特定而言所涉及的步骤是：用专用缓冲液溶解生物学人体样本；添加磁性粒子或替代的结合方法；在一定温度下进行培养；去除未被吸收的样本成分；清洗步骤；在一定温度下洗脱结合在粒子上的核酸；以及从粒子悬浮液中移除洗脱液。

“去除”这个概念指的是尽可能去除所有并非是核酸的分离目标(即，实质上不是核酸)的生物或化学的物质或成分。去除这些物质的主要作用是避免目标分子在真正意义上的结合、增强、提纯及检测过程受到干扰或不利影响。

“细胞碎片”指所有并非是核酸提纯主要目标且需要通过纯化或阴性选择步骤从真正的目标分子中去除的生物成分。细胞样本裂解后，细胞碎片特别是指不溶于水溶液并且难以裂解的细胞成分，例如坏死的组织成分、骨骼结构或钙结构(特别是微钙化结构)，也指破裂或形态改变的红细胞、疣状和瘤状组织结构以及具有复杂且难以裂解的糖衣的特殊细菌(例如分枝杆菌)。细胞碎片此外还指蛋白、细胞膜成分，特别是经固定而交联的结构等等。个别情况下也可以是在前述裂解过程之后需要加以释放和去除的水溶性成分。例如，裂解(例如通过利用低渗缓冲液条件)后从红细胞中释放出大量相对于核酸而言摩尔过剩的血红蛋白，需要在进一步处理人体样本之前予以去除。

此外，“细胞碎片”尤指粪便中的非核酸成分。一方面，粪便由食物中的难消化成分(粗纤维)以及未被上部大肠吸收的未消化残余物如脂肪、淀粉、结缔组织纤维、肌纤维和水构成。还有人体自身产生的物质：含有待分离核酸的排出肠细胞、残余的消化酶及粘液。另一方面，少量的胆汁酸、同样从胆囊中排出的对肠粘膜起保护作用的卵磷脂及其他磷脂也连同粪便一起排出体外。

“磁性粒子”这个概念既包括有机磁性粒子也包括无机磁性粒子。

“二氧化硅”或这个概念包括二氧化硅和二氧化硅衍生物，特别是SiO₂晶体及SiO₂的其他形态，例如由SiO₂构成的硅藻、沸石、非晶二氧化硅、玻璃粉、硅酸、水玻璃以及硅酸铝和活化硅酸盐。

“疏水性基质”这个概念表示一种表面由疏水性材料构成的固相，特别是疏水性塑胶材料，例如聚烯烃(如PP(聚丙烯)、PE(聚乙烯))、卤化聚烯烃(例如PTFE(聚四氟乙烯))及其他等等。该基质可以任何一种合适的形态存在，如粒子、纤维、扁平面等等。特定而言，该基质的形式可以是容器内壁。

“裂解缓冲液系统”这个概念指一种含有至少一种物质且该物质能诱发或促进细胞、细胞系统、细胞组成部分或其他生物学络合物或结构发生分解的缓冲液系统。该物质通常选自去垢剂(Triton X-100、SDS或诸如此类的去垢剂)和酶试剂(特别是蛋白酶K)群组。也可使用选自水性缓冲溶液或非缓冲溶液(最简单情况下是水)群组的试剂。在裂解缓冲液系统中，可将选自一个或两个群组的一种或复数种成分加以结合。在本发明范围内，含有离液物质的试剂明确地不是指提纯的最初几个步骤所用的裂解缓冲液系统的成分。

除此之外，本申请所用的其他概念为本领域技术人员所熟知的一般含义。

发明概述：

本发明包括一种从生物样本中提纯核酸的方法，其特征在于，在将所述样本送入水溶液并裂解所述样本后，在无离液条件下从所述样本中去除碎片，之后从已去除碎片的裂解物中分离出所述核酸。

本发明涉及一种从一种生物样本中提纯核酸的方法，其步骤如下：

a)将所述样本送入一种水溶液；

b)裂解所述样本；

c)通过悬浮在所述溶液中的磁性粒子以去除细胞碎片，用磁场来保持这些磁性粒子并从所述溶液中去除这些磁性粒子；以及

d)从所述溶液中分离出核酸；

其中，步骤(a)至(c)在无离液条件下进行。

发明人发现，在无离液条件下去除细胞碎片可以有利地简化接下来的核酸分离，同时特别方便所述提纯方法的自动化。一般而言，本发明涉及一种从生物样本中提纯核酸的方法，其步骤如下：

a)将所述样本送入一种水溶液；

b)裂解所述样本；

c)去除细胞碎片；以及

d)从所述溶液中分离出核酸；

其中，步骤(a)至(c)在无离液条件下进行。

根据本发明的一个方面，步骤(c)特定而言包括在所述溶液中悬浮磁性粒子、用磁场保持这些磁性粒子并从所述溶液中去除这些磁性粒子等几个步骤。一般而言，添加一般的粒子(即用非磁性粒子(例如纤维粒子、陶瓷粒子、塑料粒子)代替磁性粒子)也是有利的，因为非磁性粒子可以促进碎片的聚集。

根据本发明的一个方面，所述磁性粒子的平均粒度＜50μm，优选＜10μm，特别优选＜0.5μm，也不排除＜0.1μm，其中，通过透射电子显微镜法来测定所述粒度。

根据本发明的一个方面，所述粒子具有一种含硅涂层，特别是一种含有二氧化硅的涂层。举例而言，这种类型的磁性粒子已由EP 1468430揭示。

所述磁性粒子优选具有一种二氧化硅涂层，也就是被SiO₂涂覆。“被SiO₂涂覆的磁性粒子”这个概念包括至少90％重量百分比的Fe₃O₄且表面涂有二氧化硅的磁铁矿芯。

所述磁性粒子是可悬浮粒子，可以通过使用外部磁场被固定在该磁场中。

在该磁场对粒子进行固定之后从所述溶液中去除这些磁性粒子，可通过任何一种合适的方式(如倾倒、吸取等等)来分离溶液和粒子。

可通过任何一种合适的方法来实施步骤(d)，即从所述样本中分离出核酸，这些方法例如为提取法、柱提取法、沉淀法等等。核酸分离步骤(d)并不限于达到一定纯度。

步骤(a)是将所述样本送入水溶液。可以通过搅拌、悬浮、乳化或溶解来实现。可以在将该样本送入水溶液之前或之后缩小其机械尺寸，例如通过机械作用(如切割、搅拌)、加热作用、超声波处理和其他类似方法。但也可以使完整的组织样本(例如组织切片)直接悬浮在水溶液中。

根据本发明的一个方面，所述样本是一种血样。在血液完全裂解的情况下，大量相对于核酸摩尔过剩的血红蛋白、红细胞膜成分及白细胞膜成分被释放出来，并可在步骤(c)中去除。接下来的步骤(d)是从水性残余相中有针对性地提纯核酸。

作为替代方案，可在例如低渗缓冲液条件下进行红细胞的选择性裂解，上文已在技术上对此进行过描述。此过程会释放出大量可以在步骤(c)中去除的血红蛋白和红细胞膜。在此情况下，如果在实施步骤(d)时添加离液缓冲液及(视情况)蛋白酶K，则仍需进行的白细胞裂解将会与核酸释放同时进行。这种处理方式便于全自动地从血液(特别是白细胞)中提取核酸，而不必设置复杂的处理步骤，如离心操作、白细胞造粒及销毁上清液。

根据本发明的另一方面，所述样本是一种粪便样本。在粪便裂解过程中，核酸从析出的健康或病变的肠上皮细胞中被释放到由细胞碎片、粗纤维、未消化的食物残余(如脂肪、淀粉、结缔组织纤维和肌纤维)、残余的消化酶及粘液、胆汁酸、卵磷脂和其他磷脂构成的复合基质中。可以在步骤(c)中将所有这些非核酸成分全部或部分去除。接下来的步骤(d)是从水性残余相中有针对性地提纯核酸。

根据本发明的一个方面，所述生物样本是石蜡包埋样本(特别是石蜡切片)和/或固定样本(特别是福尔马林固定的石蜡切片)。

本发明的方法特别适合用来处理固定样本，因为固定样本由于蛋白交联及核酸交联碎片特别多。

根据本发明的一个优选方面，在实施步骤(d)之前将所述溶液加热到至少50℃，优选加热到50℃-95℃，优选加热到至少60℃，更优选加热到60℃-80℃。这种加热可以有利地促进生物样本在水溶液中的悬浮和裂解。优选添加蛋白酶(特别是蛋白酶K)以增强裂解效果。

根据本发明的一个方面，在实施步骤(c)之前重新将样本冷却至50℃以下。在样本中存在石蜡的情况下，这种做法可以额外带来的有利之处是，石蜡会重新凝固，例如呈环状凝固在容器内壁上。接下来就可以用(例如)吸头吸取样本或裂解物，整个过程非常方便而准确，且不会出现堵塞问题，而石蜡则以上述石蜡环状物的形式留在反应容器内。

根据本发明的另一方面，通过将所述样本或裂解物例如送入一个由疏水性塑胶材料制成的容器内来使所述样本或裂解物与疏水性基质发生接触。这样做对处理含石蜡的样本特别有利。举例而言，可以采用Eppendorf公司或Sarstedt公司提供的已知反应容器作为该疏水性基质，它们由聚烯烃(例如聚丙烯和聚乙烯)构成。根据特别优选的实施方案，在实施步骤(d)之前将与疏水性基质相接触的含石蜡样本加热至50℃以上，由此可使石蜡熔化并在冷却过程中有利地沿液体表面在该基质上(例如塑料反应容器的容器边缘上)沉积下来，形成环状物。这一点通过液化石蜡在疏水性基质上的吸收过程而实现。接下来就可以用吸头准确地吸取液态样本，整个过程不会发生堵塞情况，而石蜡环状物则留在反应容器内。

根据本发明的另一方面，所述方法的提纯效率非常高，以至于在大多数应用情况下，使用单个3μm-20μm(特别优选单个10μm)石蜡切片即可实现很高的核酸产量。由此可使得所用的石蜡量低于临界量，而所述临界量会阻碍或妨碍上述石蜡环状物的形成。

根据本发明的一个方面，在步骤(c)中通过吸取方式来分离溶液和磁性粒子。

根据本发明的一个方面，步骤(d)还包括在所述溶液中添加离液化合物。其中，不排除在步骤d)中(即添加离液溶液之前或之后)初次或再次(如已在步骤a)中使用过蛋白酶K)添加蛋白酶K。

根据本发明的一个方面，步骤(d)还包括在所述溶液中添加未经使用的(即新鲜的)带含硅涂层的磁性粒子。

为了分离RNA，在所述样本中添加生物有效量的DNase。由此可使DNA被“消化”并进入所述溶液，而未被消化的RNA则可以从溶液中分离出来。可以在提取过程的不同时间点上进行DNase消化，最早可在裂解之后，最迟可在提纯结束时的洗脱之后。

为了提纯DNA，优选在所述样本中添加生物有效量的RNase，由此可使RNA被消化并从样本中分离出完整的DNA。可以在提取过程的不同时间点上进行RNase消化，最早可在裂解之后，最迟可在提纯结束时的洗脱之后。

优选在存在一同被提纯的RNA的情况下进行DNA检测，也就是在删除RNase步骤或采用缓冲液条件的情况下进行DNA检测，通过所述缓冲液条件可以在排除RNA的情况下选择性分离DNA。

本发明还包括一种带有含硅涂层的磁性粒子的应用，即用于在无离液条件下从生物样本中去除细胞碎片。特定而言，所述带含硅涂层的磁性粒子可以是带有含二氧化硅涂层的磁性粒子。

附图说明

下文将联系附图借助详细实例对本发明进行说明，其中：

图1为本发明方法一种实施方式(手动或自动进行)的示意图；

图2为手动进行的本发明第一方法(a)、自动进行的本发明第二方法(b)以及一种已知方法(Qiagen RNeasy FFPE试剂盒)(c)的产量比较图，其中，本发明第一方法采用离心法去除碎片，本发明第二方法采用磁性粒子去除碎片，该已知方法未设预先去除碎片的步骤；

图3为手动进行的本发明第一方法(a)与一种已知方法(Qiagen RNeasyFFPE试剂盒)(c)的产量比较图(关联图)，其中，本发明第一方法采用离心法去除碎片，该已知方法未设预先去除碎片的步骤；

图4为本发明两种手动提纯方法与一种已知的手动方法的产量比较图，本发明这两种方法分别采用离心法和一个附加的磁珠结合步骤来去除碎片；

图5为本发明自动化方法与现有技术中一种已知的自动化方法的比较图；

图6为本发明自动化方法的全程吸液和放液监控(TADM)曲线；以及

图7为现有技术中一种已知自动化方法的吸放液全程实时监控(TADM)曲线。

具体实施方式

常见的核酸提纯方法是将样本材料送入离液缓冲液中并使其在该缓冲液中裂解。本发明出人意料地发现，从样本中分离出核酸之前先在无离液条件下去除细胞碎片，这样核酸提纯效果更好。例如可以通过离心或过滤来实现这一点。根据本发明的一种实施方式，在无离液条件下借助磁性粒子来去除碎片。这些粒子优选具有一种含硅涂层，特别是一种含二氧化硅的涂层。这种粒子已在EP 1468430中公开，该案通过本文的引用被纳入本申请。下文将对这种粒子的制造方法予以详述。

可以通过已知方法来从已去除碎片的裂解物中分离核酸。例如从离液溶液中提纯的提取方法就是一种合适的方法，这类方法例如在离液条件下进行核酸沉淀和/或由硅胶基质进行吸收。已知的柱提取法在存在高浓度离液盐的情况下从裂解物中将核酸结合到硅胶膜上，并在纯化步骤后将核酸从该硅胶膜上洗脱。相应的试剂盒可向德国希尔登QIAGEN有限公司购买。

根据本发明的一个优选方面，通过在离液条件下重新使用(新鲜的)带二氧化硅涂层的磁性粒子来分离核酸。

根据本发明的一个优选方面，去除碎片及干扰物质还能提高提纯效率、可重复性及耐用性，并能减少核酸分析中的异常值和不明确结果(结果“衰弱(Flagging)”，“衰弱的(geflagte)”结果)。在研究和实际应用并重的临床诊断领域，针对这类不明确结果需要进行所谓的重复试验或反射试验，这就会产生本可避免的附加成本。

实例：

材料和方法：

以下所有实例均采用下列材料和方法

采用来自临床病理学实验室的肿瘤样本作为起始材料，取样时就将该肿瘤样本固定在福尔马林中，再用石蜡包埋。本领域技术人员都了解这种固定包埋方法，因而在此不再详述。用切片机从样本上取下厚度例如为5μm至10μm的组织切片并转移到一个1.5ml的样本容器内，例如1.5ml聚丙烯样本容器。作为替代方案，也可以用刀片或其他合适方式(例如用乙醇/二甲苯进行去石蜡处理)将已被置于载玻片上的样本从该载玻片上取下或刮下，并转移到样本容器中。

实例中使用的是市场上有售的西门子医疗诊断有限公司(德国爱尔兰根)的“Versant kPCR样本制备试剂”，该样本制备试剂由蛋白酶K溶液、结合缓冲液(含有离液剂，例如59％的异硫氰酸胍和10％的辛基苯氧基聚乙氧乙醇)、带有二氧化硅涂层的磁性粒子(例如EP 1468430中公开的)、清洗缓冲液1(含有离液剂或36％的异硫氰酸胍和30％的乙醇)、清洗缓冲液2(含80％的乙醇)、清洗缓冲液3(含有5-氯-2-甲基异噻唑啉-3-酮和甲基异噻唑啉酮(3∶1))以及洗脱缓冲液(含叠氮化钠)构成，除此之外还使用了下列缓冲液：

1.FFPE裂解缓冲液

10mM Tris-HCl

0.1mM EDTA

2％SDS

pH值8.0

2.不含DNA的DNAse溶液(美国福斯特城Ambion公司(CA 94404)的Ambion，Cat#A1906)

也可选择本领域技术人员熟知的其他常见缓冲液组合物来代替市场上有售的西门子医疗诊断有限公司(德国爱尔兰根)的“Versant kPCR样本制备试剂”的缓冲液。FFPE裂解缓冲液主要考虑采用含去垢剂的缓冲液和/或低渗缓冲液。在清洗缓冲液方面，现有技术中同样存在公知且市场上有售的合适产品。接下来用带二氧化硅涂层的磁珠从裂解物中分离核酸时，可将离液缓冲液组合物(例如4.5M盐酸胍、6M异硫氰酸胍等等)用作结合缓冲液。只要满足能确保核酸不从硅胶基质上脱落这一要求的缓冲液就是合适的清洗缓冲液。一般而言，高酒精含量及视情况的弱碱性pH值即可防止DNA发生自体溶解。只要满足上述条件，也可采用含有离液化合物的清洗缓冲液。洗脱缓冲液也可采用本领域技术人员熟知的缓冲液组合物，例如TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH值8.0)。

需要指出的是，在本发明及类似的提纯方法中，RNA可能碎裂成100至500个碱基对长度的片段，但用常规方法(RT-PCR法、微阵列法等等)进行的表达分析也适合采用RNA片段。

通过一步式动态实时逆转录酶聚合酶链反应(One-Step kRT-PCR)并借助TaqMan探针来进行RNA产量的(相对)定量。为了分析RNA产量，对参照基因或管家基因RPL37A的RNA的CT值(循环阈值，即扩增循环值，这是第一个超过已定阈值的值)进行测定，即测定人类基因中用于核糖体蛋白L37a(基因库登录号：NM_000998)的mRNA。在使用德国卡尔斯鲁厄Invitrogen公司的“SuperScript^TM one-step with aTaq kits”以及德国科隆Eurogentec公司的引物和探针的情况下进行qRT-PCR。为了对RPL37A进行kRT-PCR表达分析，在9μl预混试剂中添加了1μl纯化RNA，该预混试剂由400nM正向引物、400nM反向引物、200nM Taqman探针(FAM/TAMRA标记)、分别含有0.2mM dNTP和1.2mM硫酸镁的反应混合物以及1μlTaq混合物构成。在德国达姆施塔特AppliedBiosystem，AppleraDeutschland有限公司的ABI7900设备上以如下温度分布进行反应：

-50℃时反应30分钟

-95℃时反应2分钟

-95℃时反应15秒

-60℃时反应30秒，40次循环

CT值的测定采用了Applied Biosystems公司的软件SDS2.0并依照使用指南实施了相应操作。CT值即扩增循环数，从该扩增循环数起，扩增信号超过一已定阈值，例如测量阈值。样本中的转录物越多，CT值就越小。为方便图示，附图中RPL37A的CT值部分显示为40-CT。通过这种方式进行值的反转，较高的40-CT值对应于较高的RPL37A表达水平。如未特别说明，指的是直接测得的CT值。

实例1：从石蜡切片样本中提纯核酸，其中在无离液条件下采用离心法去除碎片。

从FFPE组织切片中手动提纯RNA的步骤如下：

-在Eppendorf样本容器中以最大速度对FFPE组织切片进行1分钟离心处理

-将该石蜡切片送入150μl FFPE裂解缓冲液和50μl蛋白酶K溶液中；

-在65℃和持续振动的条件下培养2小时；

-在室温下进行离心处理(例如，10000g时操作5分钟)，小心地将上清液转移到一个未经使用的样本容器内(由此来去除碎片及石蜡残余)；

-添加800μl结合缓冲液并充分混匀该溶液

-在样本中添加50μl磁性粒子悬浮液并充分混匀该溶液

-在室温和持续振动的条件下培养15分钟；

-施加磁场，吸出并销毁上清液；

-消除磁场。将磁性粒子(连同结合在上面的核酸)送入850μl清洗缓冲液1并使其悬浮在其中；

-施加磁场，吸出并销毁上清液；

-消除磁场。将磁性粒子(连同结合在上面的核酸)送入450μl清洗缓冲液2中并使其悬浮在其中；

-施加磁场，吸出并销毁上清液；

-消除磁场。将磁性粒子(连同结合在上面的核酸)送入450μl清洗缓冲液3并使其悬浮在其中；

-用清洗缓冲液3反复清洗；

-施加磁场并移除上清液后，将样本送入100μl洗脱缓冲液中，在70℃下培养10分钟，其间用Thermomixer恒温混匀器持续振动混匀；

-施加磁场，将洗脱液转移到一个未经使用的样本容器内。

-添加10μl的10x DNAse缓冲液和1μl的DNAseI

-在37℃下培养30分钟

冷冻该样本和/或进一步分析该洗脱液。

实例2：从福尔马林固定的石蜡切片中分离RNA，其中在无离液条件下通过添加磁性粒子来去除碎片。

这个方法与图1所示的方法相符。

从FFPE组织切片中手动提纯RNA的步骤如下：

-添加150μl FFPE裂解缓冲液和50μl蛋白酶K

-在65℃和持续振动的条件下培养2小时

-添加50μl磁性粒子

-振动2分钟使其混匀

-将样本磁化

-将上清液小心地转移到一个新容器内(细胞碎片和石蜡残余留在原容器内)

-添加800μl结合缓冲液(离液剂)

-添加50μl磁性粒子

-在室温和持续振动的条件下培养15分钟；

-施加磁场，吸出并销毁上清液；

-消除磁场。将磁性粒子(连同结合在上面的核酸)送入450μl清洗缓冲液2并使其悬浮在其中；

-施加磁场，吸出并销毁上清液；

-用清洗缓冲液3反复清洗；

-施加磁场，将洗脱液转移到一个未经使用的样本容器内。

-添加10μl的10x DNAse缓冲液和1μl的DNAseI

-在37℃下培养30分钟

冷冻该样本和/或进一步分析该洗脱液。

图1是本发明的方法示意图。该方法既可手动实施也可以自动化方式进行。

实例3：从福尔马林固定的石蜡切片中自动提纯RNA。

在西门子VERSANT kPCR平台(提取单元)上用以下自动化方法从福尔马林固定的石蜡切片中提纯RNA。每个提纯过程最多可对48份组织切片进行提纯。

样本制备

通过在室温下进行离心处理将组织切片(5μl-10μl)粒化并在西门子VERSANTkPCR分子平台的样本架上定位，在该平台上，所有硬件模块(加热器/振动混匀器、磁体等等)、样本容器、缓冲液和吸头均放置在其规定位置上。

启动提纯程序：

-在样本中添加150μl裂解缓冲液；

-添加50μl蛋白酶K溶液；

-将样本容器移至加热振动器上并在65℃和持续振动的条件下培养2小时

-将液态裂解物转移至深孔板(DWP)

-添加600μl结合缓冲液(离液剂)；

-在DWP中添加50μl磁性粒子悬浮液；

-在室温和持续振动的条件下培养10分钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下在磁场中培养5分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加850μl清洗缓冲液1；

-在室温下振动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加450μl清洗缓冲液2；

-在室温下振动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加850μl清洗缓冲液3；

-在室温下振动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-添加100μl洗脱缓冲液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-在70℃和持续振动的条件下培养10分钟；

-将DWP转移至磁体；

-添加12μl的DNAse混合物(10μl的10x DNase缓冲液；2μl的DNase1)；

-将DWP从磁体转移至加热振动器(冷却至37℃)；

-在37℃下培养30分钟，其间不振动；

-将DWP转移至磁体；

-将经DNase消化的样本转移至1.5ml样本容器；

结束提纯程序

-冷冻该样本和/或进一步分析该洗脱液

实例4：采用一道附加结合步骤在无离液条件下用磁性粒子去除细胞碎片，以实现从福尔马林固定的组织切片中自动提纯RNA

图1为本发明方法的示意图。

样本制备

通过在室温下进行离心处理将组织切片(5μm-10μm)粒化并在西门子VERSANTkPCR分子平台的样本架上定位，在该平台上，所有硬件模块(加热器/振动混匀器、磁体等等)、样本容器、缓冲液和吸头均放置在其规定位置上。

启动提纯程序：

-在样本中添加150μl裂解缓冲液；

-添加50μl蛋白酶K溶液；

-将样本容器移至加热振动器上并在65℃和持续振动的条件下培养2小时，

-添加50μl磁性粒子悬浮液；

-在65℃和持续振动的条件下培养10分钟；

-培养5分钟，其间不振动；

-将样本管从加热振动器转移至磁体

-将样本磁化3分钟；

-将样本裂解物转移至深孔板(DWP)；

-添加600μl结合缓冲液(离液剂)；

-在DWP中添加50μl磁性粒子悬浮液；

-在室温和持续振动的条件下培养10分钟；

-将DWP转移至磁体；

-于室温下在磁场中培养5分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加850μl清洗缓冲液1；

-在室温下振动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加450μl清洗缓冲液2；

-在室温下振动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-添加850μl清洗缓冲液3；

-在室温下摇动10秒钟；

-将DWP转移至磁体；

-在室温下磁化2分钟；

-吸出并销毁上清液；

-添加100μl洗脱缓冲液；

-将DWP从磁体转移至加热振动器；

-在70℃和持续振动的条件下培养10分钟；

-将DWP转移至磁体；

-添加12μl的DNase混合物(10μl的10x DNase缓冲液；2μl的DNase1)；

-将DWP从磁体转移至加热振动器(冷却至37℃)；

-在37℃下培养30分钟，其间不振动；

-将DWP转移至磁体；

-将经DNase消化的样本转移至1.5ml样本容器；

结束提纯程序

-冷冻该样本和/或进一步分析RNA产量。

图2为手动进行的本发明第一方法(a)、自动进行的本发明第二方法(b)以及现有技术中一种已知的手动方法(Qiagen RNeasy FFPE试剂盒，德国希尔登QIAGEN有限公司，方法的具体实施参照制造商提供的信息)(c)的产量(RPL37A的CT值越低，产量就越高)比较图，其中，本发明第一方法采用离心法去除碎片，本发明第二方法采用磁性粒子去除碎片。

图3为现有技术中一种已知方法(Qiagen RNeasy FFPE试剂盒)(c)与手动进行的本发明方法(a)的产量(RPL37A的CT值越低，基因表达水平就越高)关联图，其中，本发明方法采用离心法去除碎片。

实例5：分别用实例1和实例2所描述的方法提纯后进行产量比较

这个实例表明了通过一个附加纯化步骤用磁性粒子去除细胞碎片(实例2)或者通过离心处理去除细胞碎片(实例1)的效果。此外还对那些在添加离液缓冲液之前未去除细胞碎片的样本进行了提纯处理。接下来的步骤是按实例1所描述的方式实施在所有样本上。

图4为本发明手动提纯方法按实例1用离心法去除组织碎片(点状柱)、按实例2用附加的磁珠结合步骤去除组织碎片(白色柱)与现有技术中一种不去除细胞碎片的已知手动方法(斜线柱)的产量比较图。

图4示意了3个不同组织样本(“1”、“2”和“3”)的提纯结果。结果表明，使用本发明方法去除细胞碎片后的提纯产量大大高于不去除细胞碎片的样本。通过对管家基因RPL37A进行定量PCR来比较产量，其中，用40-CT表示转录水平(CT＝循环阈值，即扩增循环数，达到这个扩增循环数时，就会超过系统的测量阈值)。如果RPL37A的3到5个CT值之间存在差值，就表示完整RNA的产量损失为8至32个因子。由此得出结论：一方面，未裂解的组织或细胞碎片会影响核酸(特别是RNA)的有效及定量提纯并且可能妨碍核酸在离液条件下结合到带二氧化硅涂层的磁性粒子上。另一方面，最初在无离液条件下进行的、以去除细胞碎片为目的的离心步骤可以被一个附加提纯步骤所取代，所述附加提纯步骤为在无离液条件下用带有二氧化硅涂层的磁性粒子进行工作的步骤。这种情况非常有利，因为所述方法不需要设置进一步的离心步骤，因而非常便于实现自动化。

实例6：对上述实例3和实例4所描述的自动化提纯方法进行产量比较，实例4用带二氧化硅涂层的磁性粒子结合细胞碎片，实例3则无此步骤

这个试验示意了通过附加提纯步骤用带二氧化硅涂层的磁性粒子去除细胞碎片(实例4)的效果，与之形成对比的是没有在无离液条件下通过附加提纯步骤用磁性粒子去除细胞碎片的自动化提纯方法(实例3)。每种方法都采用了7个不同组织样本(“A”至“G”)的3个连续切片，并在RPL37A的表达方面对其进行了分析。

图5为应用两种方法的7个不同样本(A-G)的RNA产量比较图，白色柱表示的是本发明的自动化方法(实例4)，点状柱表示的是现有技术中的一种自动化方法(实例3)。结果显示，采用附加的磁性提纯步骤在7个样本中的5个样本上取得了更高的产量，且该步骤也在同一组织样本的3个连续切片之间取得了可重复性更好的结果(来自同一石蜡块的不同RNA制剂之间略有差异)。

实例7：组织结合对自动化提纯的效率及无干扰移液性的影响

西门子公司的VERSANT kPCR系统中包含有Hamilton公司的自动移液装置，这个系统可对每个移液步骤中的所有吸液和放液步骤进行监控。设置在各移液管中的压力传感器对液体运动进行记录。对每个移液步骤中压力状况的变化进行实时记录(＝TADM，全程吸液和放液监控)。可为每个移液步骤规定压力状况变化的公差范围。一旦TADM曲线超出该规定范围，就可直接得出该移液步骤在某个样本上的实施情况不正常的结论，原因可能是吸头堵塞、液体缺失、液体内部起泡或其他不利因素。而后可在该样本上做标记以供进一步分析用，或者视情况不再对该样本做进一步分析。在临床诊断领域，很多情况下会针对这一信息在同一系统上或采用替代方法来进行反射试验或重复试验。

图6和图7为对固定石蜡切片的裂解物进行吸液的TADM曲线图，其中，将该裂解物移入一个新容器以便在离液条件下进行核酸结合。这些TADM曲线表示的是在该移液步骤中用于各样本的吸管中的压力分布。各曲线间距离越小，采用某种方法时所产生的压力分布就越稳定，也就是更便于控制。这个实例涉及两种样本，一种是此前已添加过用于去除细胞碎片的磁性粒子的样本(实例4，图6)，一种是未添加粒子或者说未去除过碎片的样本(实例3，图7)。与图6不同，图7所示的TADM曲线极不均匀。特定而言，这一点可解释为这些样本的裂解物中仍含有细胞碎片，该细胞碎片可能会堵塞吸头，从而导致产生极高的压力。不预先去除细胞碎片的自动化方法，有时甚至会发生处理过程中断的情况。本发明的方法可有效避免这种现象。本发明方法采用磁性粒子来去除细胞碎片还具有这样一个额外优势：可使用在离液条件下用磁性粒子来分离核酸的硬件来实施碎片去除步骤。

这个实例表明，通过去除细胞碎片可以提高自动化提纯过程的移液性能(例如吸取裂解液)和效率，因为TADM曲线不理想而使样本不能使用的情况很少发生。由此可在临床诊断中大幅减少反射试验(重新进行试验并得出结论)的次数，进而降低成本。

实例8：从血样中提纯核酸

本发明方法还特别适合用来从血样中提纯核酸，因为该方法可以更好地从血液中去除血红蛋白或红细胞碎片。根据本发明，首先在无离液条件下有效地从样本中去除红细胞、红细胞碎片和被释放出来的血红蛋白，以免影响接下来的处理步骤。

根据本发明第一实施方案，在血样(例如100μl EDTA全血)中添加400μl裂解缓冲液(例如10mM TRIS-HCL，0.1mM EDTA，2％SDS，pH值8.0)。随后在样本中添加50μl磁性粒子悬浮液(例如无涂层或带二氧化硅涂层的磁性粒子)，在室温下培养10分钟并通过施加磁场来去除粒子。接下来就可以前述方式在离液条件下从取出的样本中分离核酸。

根据本发明第二实施方案，将血样送入低渗裂解缓冲液(例如25mMTRIS HCl，pH值7.5，10mM KCl.5mM MgCl₂)，培养一小段时间以使红细胞裂解，然后在样本中添加磁性粒子悬浮液(例如无涂层或带二氧化硅涂层的磁性粒子)，在室温下培养10分钟并通过施加磁场将粒子连同红细胞碎片及血红蛋白一起去除。接下来在离液条件下对白细胞进行裂解，即释放核酸并将其结合到新添加的带二氧化硅涂层的磁性粒子上。视情况可预先或与离液剂同时添加蛋白酶K。

实例9：制造带二氧化硅涂层的磁性粒子。

举例而言，可以通过为磁性粒子涂覆二氧化硅来制造带二氧化硅涂层的磁性粒子。所采用的磁铁矿优选是市场上有售的亲水性氧化铁(Fe₃O₄)，这类氧化铁优选窄粒度分布且具有球形形态。磁性粒子是市场上有售的，此类产品的制造商例如有Bayer股份公司，其产品名称为BAYOXIDE E。BAYOXIDE E8706、E8707、E8709和E8710都是合适的产品。BASF公司也销售类似产品，名称是“Magnetic Pigment 340”和“Magnetic Pigment345”。虽然采用这些产品都能获得良好结果，但优选BAYOXIDE E 8707或E 8706。这种磁粉具有球形形态、0.2um的平均粒径和窄粒度分布(约0.1um至0.7um)。用于引入硅酸盐基团的起始材料既可采用碱金属硅酸盐(钠水玻璃或硅酸钾)也可采用硅溶胶。合适的水玻璃pH值通常都极高(13-14)，有多家公司(例如Merck或Cognis)提供这些产品。可以边搅拌边将待涂层材料(例如Bayoxide E 8707)添加到经稀释的、浓度例如为1％的水玻璃溶液中。培养30分钟后进行过滤，用水清洗并做干燥处理。根据一份示范性试验记录，边搅拌边在1000ml浓度为0.25％的水玻璃水溶液(HK30；Cognis)中添加50g Bayoxide E 8707，随后在室温下继续搅拌30分钟。将粒子滤出，用水清洗5次，用乙醇清洗一次，接下来在80℃下干燥5小时。

Claims

1.一种从一种生物样本中提纯核酸的方法，包括下列步骤：

a)将所述样本送入一种水溶液；

b)裂解所述样本；

c)通过悬浮在所述溶液中的磁性粒子来去除细胞碎片，用磁场保持这些磁性粒子并从所述溶液中去除这些磁性粒子，其中所述细胞碎片包括蛋白和细胞膜成分；以及

d)从所述溶液中分离出所述核酸；

其中，步骤(a)至(c)在无离液条件下进行；

在实施步骤(d)之前将所述溶液加热到至少50℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磁性粒子的平均粒度<50μm。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述磁性粒子具有一种含硅涂层。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述磁性粒子具有一种含二氧化硅的涂层。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本是一种血样。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样本是一种石蜡包埋样本和/或一种固定样本。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在实施步骤(d)之前将所述溶液加热到至少60℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在实施步骤(d)之前将所述溶液加热到60℃-95℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，在实施步骤(d)之前，在所述加热样本之后将该样本冷却至50℃以下。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤a)、b)和c)中的至少一个步骤中使所述样本接触一种疏水性基质。

11.根据权利要求2至7中任一项权利要求所述的方法，其中，在步骤(c)中通过吸取方式来分离所述溶液和所述磁性粒子。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)包括在所述样本中添加一种离液化合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤(d)还包括在所述溶液中添加复数个未经使用的、带有一种含硅涂层的磁性粒子。

14.一种磁性粒子的应用，用于在无离液条件下从一种水溶液中的生物样本中去除细胞碎片，包括：

使这些磁性粒子悬浮在所述溶液中，用磁场保持所述磁性粒子以及从所述溶液中去除这些磁性粒子。

15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述磁性粒子具有一种含硅涂层。

16.根据权利要求15所述的应用，其中，所述磁性粒子具有一种含二氧化硅的涂层。

17.一种磁性粒子的应用，用于实施根据权利要求2至12中任一项权利要求所述的方法，其中这些磁性粒子具有根据权利要求15或者16所述的一种含硅涂层。