CN102128878A - 超灵敏磁减量测量系统以及使用其的超灵敏免洗检定 - Google Patents

Abstract

提供一种使用SQUID的磁减量测量系统，以用于执行超灵敏的定量生化检定，其中系统能够以高灵敏度来测量具有多活性抗原决定基的生物分子、具有单活性抗原决定基的生物分子或小生物分子于待测样品中的浓度。超灵敏磁减量测量系统的灵敏度依待测生物分子种类而不同，为多个ppt数量级或以下。

Description

超灵敏磁减量测量系统以及使用其的超灵敏免洗检定

本申请是申请号为200810083022.3的中国专利申请(申请日：2008年3月18日，发明名称：超灵敏磁减量测量系统以及使用其的超灵敏免洗检定)的分案申请。

技术领域

本发明是关于一种用于定量测量生物分子的浓度的系统，以及使用所述系统测量生物分子浓度的方法。更明确地说，本发明是关于一种超灵敏磁减量测量系统(magnetoreduction measurement system)，以及使用所述测量系统来进行的超灵敏免洗检定(wash-free assay)。

背景技术

为了测量在诸如血清或尿的试样(specimen)中生物分子的浓度，通常应用抗体的反应或对其抗原的抗体的反应的免疫检定(immunoassay)。常见的这类免疫检定法有如酵素连结免疫检定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。已知ELISA(或所谓的夹心型ELISA(sandwich ELISA))需要将一级抗体(primary antibody)附着至检测盘孔(plate well)的底部。接着添加具有未知数量的抗原的样本于盘孔内，待抗原与一级抗体结合后，再添加能与已和一级抗体结合的抗原相结合的二级抗体(secondary antibody)。该二级抗体上附有可经酵素反应而产生荧光或可见光的发光单元。透过光强度的测量，可检定出抗原的浓度。在上述每一步骤之间，通常冲洗培养盘以移除任何未结合的抗原、抗体、酵素、及其它化学药品等。大体上，夹心型ELISA需要两类抗体(一级抗体以及二级抗体)。另外，两类抗体必须结合于抗原上的不同两个抗原决定基(epitopes)。基本上，夹心型ELISA不适用于检测具有单活性抗原决定基的分子，例如小分子。另外，也可应用其它方法，诸如竞争ELISA、液相层析法/质谱法/质谱法(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，LC/MS/MS)、高效能液相层析法(high performance liquid chromatograph)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis)，来检定具有多或单活性抗原决定基的生物分子。然而，这些生物分子检测方法通常是非直接的检定方式、或高成本的检定，或涉及复杂的样本制备或检定过程。因此，一种能具有简便、快速、且高灵敏特性的检定方法，是非常值得被开发的。

近年来，检测生物分子的新方法，不断被提出；例如，使用具生化活性的磁性粒子(bio-functionalized magnetic particles)来标记特定生物分子的检定方法。此其中，磁性粒子的表面涂布有生物探针(bio-probes)。通过测量具生化活性的磁性粒子与待测的生物分子结合后的磁特性变化，可判定待测生物分子的浓度。这种使用具生化活性的磁性粒子作为标记物(labelings)来判定生物分子的数量，被称为磁性标记诊断(magnetically labeled diagnosis，MLD)。

若干组研究人员曾提出具有较高应用潜力的MLD方法，例如，磁松弛(magnetic relaxation)测量法、残磁量(magnetic remanence)测量法、混频磁化率(mixed-frequency magnetic susceptibility)测量法、饱和磁化(saturated magnetization)测量法等。根据这些研究结果，有一些MLD方法显示出高便利性的优点，而有些MLD方法则展示出高灵敏度的优点。

发明内容

本发明提供一种用于超灵敏的定量检定生物分子的磁减量测量系统，其中超灵敏磁减量测量系统的灵敏度依待检定生物分子而不同，为数个ppt(万亿分之一)或以下。

本发明亦提供一种能够定量测量具有多活性抗原决定基的生物分子、或具有单活性抗原决定基的生物分子浓度的超灵敏磁减量测量系统，其中具有单活性抗原决定基的生物分子包括小生物分子。

如本文中实施以及广泛描述的，本发明的超灵敏磁减量测量系统包括样本单元(sample unit)以及传感器单元(sensor unit)，其中将含有磁性粒子的样本置于样本单元中，且经由耦合线圈(couple coil)将样本的磁化讯号传送至传感器单元中的磁性传感器(magnetic sensor)。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，磁性传感器在空间上远离样本以及提供给样本的激发磁场(excitation magnetic fields)。因此，磁性传感器未受到激发磁场干扰，因此可使用较强的激发磁场以增大样本的磁化讯号；故可增强测量的灵敏度。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，其中磁性传感器包括但不限于超导量子干涉元件(superconducting quantum interference device，SQUID)。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，其中磁性传感器包括但不限于高转变温度(high-T_c)射频(radio frequency，rf)SQUID磁量计(magnetometer)、高转变温度射频SQUID磁梯度计(gradiometer)、高转变温度直流(DC)SQUID磁量计、高转变温度直流SQUID磁梯度计、低转变温度(low-T_c)射频SQUID磁量计、低转变温度射频SQUID磁梯度计、低转变温度直流SQUID磁量计、或低转变温度直流SQUID磁梯度计。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，样本单元包括两个激磁线圈(excitation coils)，以向置于样本单元内的待测样本提供磁化磁场。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，样本单元更包括拾波线圈(pick-up coils)，其中将涂布有生物探针的磁性粒子的样本置于拾波线圈的一部分内。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，拾波线圈与耦合线圈连接。

根据本发明的超灵敏磁减量测量系统，其中所述系统是测量样本的交流磁化率(ac magnetic susceptibility)，其中样本在待测生物分子与磁性粒子结合之前与之后的交流磁化率的差异随着待测生物分子的浓度增加而增加。

本发明还提供一种用于定量地检测待测生物靶(biotarget)的浓度的超灵敏方法，其中方法的灵敏度依生物靶种类而不同，约为数个ppt或以下。

本发明亦提供一种用于定量地判定生物靶的浓度的超灵敏方法，其中具有高度的专一性(specificity)。

本发明提供一种用于定量地判定生物靶的浓度的超灵敏方法，其中所述方法能够定量地测量具有多活性抗原决定基的生物分子、或具有单活性抗原决定基的生物分子的浓度，其中具有单活性抗原决定基的生物分子更包括小分子。

本发明提供一种用于定量地判定生物靶的浓度的超灵敏方法，其中所述方法实质上免去在检测操作过程中，步骤之间的冲洗程序(wash processes)。

如本文中实施以及广泛描述的，本发明的超灵敏方法包括提供磁性试剂(magnetic reagent)，测量磁性试剂的交流磁化率(x_ac，o)，将磁性试剂与含有生物靶的样本溶液混合，测量磁性试剂在与样本溶液混合后的交流磁化率(x_ac，φ)，以及计算试剂在与生物分子混合之前与之后的交流磁化率的差异(Δx_ac，φ)，其中Δx_ac，φ≡(x_ac，o-x_ac，φ)。

根据本发明的方法，确立Δx_ac，φ与生物靶的各种已知浓度之间的特征曲线(characteristic curve)，且根据特征曲线判定样本溶液中生物靶的浓度。

根据本发明的方法，确立Δx_ac，φ/x_ac，o与生物靶的各种已知浓度之间的归一化(normalized)特征曲线，且根据特征曲线判定样本溶液中生物靶的浓度。

根据本发明的方法，其中将参数Δx_ac，φ/x_ac，o定义为生物靶的浓度的指标(indicator)，其中Δx_ac，φ/x_ac，o≡(x_ac，o-x_ac，φ)/x_ac，o。

根据本发明的方法，通过使披覆有介面活性剂及生物探针的磁性粒子悬浮于缓冲液(buffer solution)中来形成磁性试剂。

根据本发明的方法，在将磁性试剂与样本溶液混合后，生物探针能够与生物靶共轭结合。

根据本发明的方法，以亲水性表面活性剂(hydrophilic surfactant)来涂布磁性粒子且生物探针结合至亲水性表面活性剂。

根据本发明的方法，所述方法能够测量小生物分子，其中当小分子与生物探针共轭结合时，每一小分子实质上被生物探针所包裹。

根据本发明的方法，生物探针可包括但不限于抗体。

根据本发明的方法，抗体可为单株或多株的。

根据本发明的方法，可通过但不限于SQUID磁减量测量系统来测量交流磁化率。

根据本发明的方法，分别将与待测样本溶液混合前及混合后的磁性试剂置放于SQUID磁减量测量系统的样本单元中的拾波线圈的一部分内，且通过拾波线圈从磁性试剂侦测受激发的磁通量，再经由与样本单元中的拾波线圈连接的耦合线圈，将受激发的磁通量传送至SQUID磁减量测量系统的传感器单元中的SQUID磁性传感器。

根据本发明的方法，在不必移除未与生物靶结合的磁性粒子的情况下，执行磁性试剂与样本溶液混合后与混合后的交流磁化率差异的测量步骤。

根据本发明的方法，亲水性表面活性剂包括但不限于葡萄聚糖(dextran)、蛋白质G(protein G)、蛋白质A(protein A)、脂质体(liposome)、以及有机酸等。

根据本发明的方法，其中每一磁性粒子的直径范围为但不限于5nm至700nm。

根据本发明的方法，磁性粒子的核心材料包括但不限于Fe₃O₄、MnFe₂O₄、Fe₂O₃、NiFe₂O₄或CoFe₂O₄。

根据本发明的方法，其中通过一个磁减量测量系统来测量试剂的交流磁化率。这个磁减量测量系统包括一个磁通量发源单元、一个磁通量读取单元，和一个磁通量传送单元。磁通量发源单元是用于具有或不具有样本溶液的试剂，将交流磁通量供应给试剂以及从试剂侦测受激发的磁通量。磁通量读取单元则置于有别于磁通量发源单元的位置处，其中磁通量读取单元包括至少一个SQUID，以感测前述受激发的磁通量。至于磁通量传送单元是用于将试剂的受激发的磁通量传送至在前述位置处的SQUID。

应理解，前面的大体描述以及以下的详细描述为示范性的，且意欲提供对如所主张的本发明的进一步解释。

附图说明

包括附图以提供对本发明的进一步理解且其并入于此说明书中且构成此说明书的一部分。诸图式说明本发明的实施例且，连同描述，用于解释本发明的原理。

图1为展示待检测生物分子与涂布有抗体的磁性粒子之间的关联的示意图，且磁性粒子因与待检测生物分子的结合(binding)而变为丛集(clustered)、抑或变大，如虚线所圈出的。

图2为展示待检测生物分子与涂布有抗体的磁性粒子之间的关联的示意图，且磁性粒子归因于与待检测生物分子的结合而变大，如虚线所圈出的。

图3为说明磁通量传送技术(flux-transfer technology)辅助的SQUIDMRA系统的示意图。

图4(a)为以磁力显微镜获取的涂布有葡萄聚糖的磁性粒子的影像。

图4(b)为涂布有葡聚糖的磁性粒子的直径分布的曲线。

图5(a)为SQUID MRA系统的x_ac噪声位准的频谱，图5(b)为100-μL以及0.32-emu/g磁性试剂的x_ac频谱，以及图5(c)为100-μL以及0.32-emu/g磁性试剂与20-μL以及10^-5-mg/L CRP溶液的混合物的x_ac频谱。

图6为展示作为自5×10^-7至10^-3mg/L的φ_CRP的Δx_ac，φ/x_ac，o图，在较低φ_CRP下的Δx_ac，φ/x_ac，o-φ_CRP曲线在插入图中放大。

图7为展示与CRP浓度φ_CRP相关的Δx_ac/x_ac(实线)以及OD₄₅₀(虚线)之图。

图8为展示与F9浓度φ_F9相关的Δx_ac/x_ac(实线)以及OD₄₅₀(虚线)之图。

图9为展示与LMG浓度φ_LMG相关的Δx_ac/x_ac(实线)以及OD₄₅₀(虚线)之图。

主要元件符号说明

100a：样本单元

100b：传感器单元

101、102：激磁线圈

103、104：函数产生器

105：磁性试剂

106：拾波线圈

107a：耦合线圈的延导部份

107b：耦合线圈的循环部份

108：海绵

109：SQUID磁性传感器

110：杜尔瓶

111：液态氮

112：磁屏蔽盒

113：rf屏蔽室

114：海棉

115：SQUID电子装置

116：读取电子装置

实施方式

本发明提供一种用于磁性标记诊断(MLD)的方法，其中透过测量磁性试剂中磁性粒子与生物靶结合后，磁性试剂的混频交流磁化率的减少量，以判定待测生物靶的浓度。本发明的方法因此被称为磁减量检定(magnetoreduction assay，MRA)，其基本上免去检定过程步骤之间的冲洗程序，且能够对具有多活性抗原决定基的分子、具有单活性抗原决定基的分子、或小分子进行定量检定。本发明还提供一种执行磁减量检定的超灵敏系统。本发明的超灵敏MRA系统采用诸如超导量子干涉装置(SQUID)的磁力计或梯度计(gradiometer)作为系统的传感器，且应用磁通量传送技术以便执行高灵敏度的检定，这样一来对于某些生物靶而言尤其必要，诸如细胞因子或血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、或肿瘤(tumors)生物靶、或荷尔蒙分子等。

磁减量检定(MRA)

在MRA中，首先提供磁性试剂，其为具有均匀分散于水溶液的磁性粒子。该磁性粒子表面涂布有亲水性表面活性剂，表面活性剂上再接有生物探针。试剂的制备主要包括：在含有表面活性剂的溶液将磁性粒子形成；移除未与磁性粒子结合的表面活性剂，继而添加生物探针，使生物探针与表面活性剂结合；最后，移除未结合的生物探针。生物探针包括(例如)抗体或抗原，其可为单株或多株的。在外部多个交流磁场下，试剂内磁性粒子经由磁交互作用(magnetic interaction)来振荡。磁性试剂在外部多个交流磁场作用下显现交流磁特性，被称为混频交流磁化率(mixed-frequency ac magnetic susceptibility)x_ac。

当将待检测生物分子的溶液与试剂混合时，待检测生物分子可经由生物探针结合至磁性粒子的最外层(outmost shell)。由于与待检测生物分子的结合(association)，如图1所示，涂布有表面活性剂以及生物探针的磁性粒子会变大或形成丛集。在待测生物分子仅具有一个有效单活性抗原决定基(effective single active eptiope)的情况下，每个生物分子至多仅与一个磁性粒子结合。因此，如图2所示，磁性粒子将变大而非形成丛集。

在与生物分子结合后，这种较大/丛集磁性粒子对外部多个交流磁场的回应(response)，将变得远低于原先未结合的个别磁性粒子对外部多个交流磁场的回应。因此，试剂的x_ac将减低。故，此种方法被称为磁减量检定。原则上，当将更多数量的待检测生物分子混合于试剂中时，更多磁性粒子变得较大或丛集化。最终，亦将测量到较大减少量的x_ac。

本发明的MRA至少存在以下优点。首先，不必移除未与待检测生物分子结合的磁性粒子。这种未结合生物分子的磁性粒子可保留于试剂中。因此，通过避免冗长的冲洗过程，而使本发明的检定过程更简单。第二，仅使用一类抗体。第三，MRA为直接式且均匀式的检定，这通常具有高可靠性(high reliability)以及灵敏度(sensitivity)。第四，因为可准确地测量x_ac的减少程度与待测生物分子浓度的关系，所以可定量地判定生物分子的浓度。另外，MRA能够测量小生物分子。由于小尺寸的关系，所以小分子在结合后几乎完全被生物探针所包裹。因此，一旦小分子与生物探针结合，小分子上的其它抗原决定基无法结合至其它生物探针。因此，小生物分子因其结构，实际上为单活性抗原决定基的生物分子。

简言之，不仅显示了本发明的MRA的便利性(因为可消除一连串冲洗过程)，且其为非常灵敏，并具有高度的专一性。

SQUID MRA系统

为增进MRA对样本交流磁信号的侦测灵敏度，可通过使用超灵敏磁传感器来探测交流磁信号，或通过增强待侦测的交流磁信号来达成。超导量子干涉元件(SQUID)是目前对磁讯号最灵敏的传感器，因此SQUID是作为MRA系统中传感器的最佳元件。

MRA法中，是在有两个交流激发磁场的作用下，测量磁性试剂在与生物靶溶液混合前与混合后的交流磁化率x_ac的差异。若磁性试剂的位置接近SQUID时，SQUID受到两个激发磁场的干扰。结果，需另有补偿线圈，此产生磁场来抵销激发磁场对SQUID的影响。技术上，不易正确地放置补偿线圈的位置，且噪声位准(noise level)通常随着补偿线圈的使用而增加。代替使用补偿线圈，并可防止SQUID受到激发场干扰的另一方法，可通过将样本及激发磁场置于远离SQUID传感器处。然而，此种方法将导致被SQUID侦测到的试剂受激发磁信号的强度，显著地降低。这样一来又减少灵敏度。为克服此缺点，可通过使用远距磁通量传送技术(distant magnetic flux transfer technology)来发展SQUID MRA系统，有效地将试剂受激发磁信号传送至SQUID传感器处，并有避免SQUID受到激发磁场的干扰。

请参照图3，图3为说明依照本发明的SQUID MRA系统的示意图。大体上，系统包含两个单元：样本单元100a以及传感器单元100b。样本单元100a包括通过函数产生器103、104驱动的至少两个激磁线圈101、102，以向含有或未含有待检测样本的磁性试剂105提供分别具有频率f₁以及f₂的两个交流激发磁场。将磁性试剂105置放于拾波线圈106的一部分内，拾波线圈106由两个绕线方向相反的线圈串接而成。通过拾波线圈106，可侦测在两个激发磁场作用下的磁性试剂105交流磁化量。为了避免机械振动以及周围噪声，将样本单元100a的线圈置放于海绵(sponge)108上以及磁屏蔽盒(magnetically shielded box)112内。传感器单元100b至少包括高转变温度(high-transition-temperature，high-T_c)rf SQUID磁力计109，其浸没于由杜尔瓶(dewar)110所装载的液态氮中。应了解，亦可使用其它类型的SQUID磁力计或梯度计作为本发明的系统中的传感器，甚至包括浸没于包含杜尔瓶中的液态氦中的低转变温度(low-transition-temperature)SQUID。将能够容纳液态氮111的杜尔瓶110组装于磁屏蔽盒以及rf屏蔽室113内部中，以使SQUID免受环境低频噪声或高频噪声干扰。在高频率下，屏蔽系数(shielded factor)接近90dB。使用海棉114来使SQUID免于受到机械振动(mechanical vibrations)的干扰。

为了将样本部分处的拾波线圈所感测的样本交流磁化讯号传送至传感器部分处的SQUID，本例中使用由铜(Cu)线制作的耦合线圈(couple coil)。耦合线圈可分为两部分：延导部份107a及循环部份107b。延导部份107a与拾波线圈相连接，而循环部份107b置于SQUID附近。由于通过拾波线圈106的交流磁通量，会引发感应交流电压，进而产生沿着拾波线圈106以及耦合线圈流动的交流电流。当交流电流流经耦合线圈的循环部份时，产生交流磁场。将SQUID置于耦合线圈的循环部份107b内部，使得SQUID探测由耦合线圈循环部份产生的交流磁场。依照本发明的SQUID MRA系统，经由以拾波线圈106以及耦合线圈107a及107b组成的磁通量传送设备，将原先在样本部分由样本产生的交流磁通量，有效地传送至SQUID MRA系统的传感器部分。如此的设置，因为激发场在空间上远离SQUID，所以SQUID不受两个激发场干扰。因此，系统可以非常稳定长时间地操作。使用SQUID电子装置115以及读出电子装置116，来判读由样本产生的交流磁通量。之后再使用频谱分析器(spectrum analyzer)来分析由电子装置所输出的讯号。

使用SQUID MRA系统的磁减量测量

以下揭露内容为将本发明的具有磁通量传送设置的高转变温度SQUID MRA系统应用于检定各类生物靶的实例。根据本发明范例之一，论述本发明的SQUID MRA系统检定“大”生物靶，诸如人C反应蛋白(c-reactive protein，CRP)(分子量＝1,400,000克)、人凝血因子(coagulation factor)IX(F9，分子量＝438,720克)等的示范性检定规范(specifications)。为了磁性标记CRP，将多株抗羊CRP(anti-goat-CRP)结合于磁性粒子表面的表面活性剂层上。另外，将单株抗鼠F9(anti-mouse-F9)结合于磁性粒子表面的表面活性剂层上，以磁性标记F9。因此，待检测CRP充当具多活性抗原决定基的分子，而F9充当具有单活性抗原决定基的分子。根据本发明的另一范例，论述本发明的SQUID MRA系统检定“小”生物靶，例如还原型孔雀绿(leucomalachite green，LMG)(分子量＝324克)的示范性检定规范。由于小尺寸，小分子在与抗体(生物探针)结合后，几乎完全被抗体包裹。因此，一旦每一小分子与抗体结合，则在小分子上的其它抗原决定基无法与其它抗体结合。因此，小分子因其结构的关系，实际上为具有单活性抗原决定基的分子。为了更好说明使用本发明的高转变温度SQUID MRA系统，经由本发明的免洗磁减量测量方法对具有多活性抗原决定基的分子、具有单活性抗原决定基的分子、以及小分子的超灵敏检定特征，MRA结果将与自ELISA获得的数据相比较。

I.具有生物探针的磁性粒子的制备

透过化学反应，将诸如葡聚糖的亲水性表面活性剂结合在磁性粒子的表面，并使披覆有葡聚糖的磁性粒子分散于磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)中。亦可应用其它类的亲水性表面活性剂，例如，蛋白质G、蛋白质A、脂质体或有机酸。表面活性剂有助于磁性粒子在PBS溶液中的分散或增进生物探针与粒子的结合率。磁性粒子的核心(core)的材料包括(例如)Fe₃O₄。然而，应指出，包括MnFe₂O₄、Fe₂O₃、NiFe₂O₄或CoFe₂O₄的其它材料，亦适于用作磁性粒子的核心材料且包含于本发明的范畴内。通过使用磁力显微镜(magnetic force microscope，MFM)，研究磁性粒子的拓扑(topology)。通过MFM获取的磁性粒子的典型影像展示于图4(a)中。暗点(dark spots)对应于个别磁性纳米粒子。经由对大量磁性粒子(例如，两百个以上)的分析，获得磁性粒子的直径的分布，如图4(b)中标绘的。图4(b)中的引导线遵循高斯分布。根据图4(b)中的结果，磁性粒子的直径的平均值以及标准差分别为29.3nm以及1.4nm。用于随后检定中的磁性粒子的平均直径为约5nm至约700nm。

为了制备磁性试剂，首先氧化亲水性表面活性剂(例如葡聚糖)，以在表面活性剂上产生醛基(-CHO)，经由生物探针受体与表面活性剂的醛基间，透过形成“-CH＝N-”键来将生物探针结合至磁性粒子表面的表面活性剂上。之后通过磁性分离将未结合的生物探针自溶液中移除，即获得磁性试剂。为了制备用来标记CRP的磁性试剂，上述反应过程中的生物探针可采用多株抗羊CRP(Sigma)。为了制备用来标记F9，上述反应过程中的生物探针可采用单株抗鼠F9(Abnova)。为了制备用来标记LMG的磁性试剂，上述反应过程中的生物探针可采用抗兔LMG(GlycoNex Inc.)。

MRA测量

以检测人类CRP为例，使用SQUID MRA系统来测量100-μl磁性试剂的交流磁化率x_ac频谱。该磁性试剂含有涂布多株抗羊CRP的磁性粒子。接着，将磁性试剂与含有人类CRP(Sigma，C4063)的20-μl溶液混合。培育之后，在混合溶液中产生CRP-抗羊-CRP的免疫错合物(immune complexes)。其后，通过使用SQUID MRA系统来分析具有免疫错合物的混合溶液的x_ac频谱，并观测到在给定频率mf₁+nf₂下x_ac的减少。依上述程序，改用有单珠抗鼠F9涂布的磁性粒子的磁性试剂，使之与含有F9(Abnova)的溶液相混合，以进行对F9的MRA测量。亦依上述程序，改用有抗兔LMG涂布的磁性粒子的磁性试剂，使之与含有LMG(GlycoNex Inc.)的溶液相混合，以进行对LMG的MRA测量。

ELISA测量

使用夹心型ELISA的商用检定套组(Anogen，EL 10022)来定量地检测大分子，诸如人类CRP。在此处简要地描述检定程序。将100-μl人类CRP添加至ELISA培养盘，在培养盘的底部放有预先涂布有抗体的培养盘。以塑料覆盖物覆盖孔(well)，且等待30分钟以形成CRP抗体-CRP免疫错合物。使用缓冲液填充孔后，再将溶液自孔倒出。上述冲洗过程重复四次。在最后冲洗后，将培养盘倒置，并通过在吸水纸上轻拍培养盘直到没有明显水分残留为止。其后，将100-μl HRP(辣根过氧化物(horseradish peroxide))-标记溶液滴入孔中，等待30分钟以形成CRP抗体-CRP-HRP-标记物免疫错合物。接着将100-μl荧光基质溶液添加至孔，等待15分钟，以激发荧光，接着将100-μl停止溶液(stop solution)添加至孔。最后，通过ELISA读取器(Synergy HT)测量荧光的光密度。

夹心型ELISA亦用于检定F9。将抗人凝血因子IX(F9)(Abnova，H00002158-M01)与多株兔抗F9抗体的组合物用于定量地检测具F9标签的人类F9(H000002158-Q01)重组蛋白。人类F9抗体最初在4℃下以1μg/100μl/孔涂布于微量培养盘上一整夜。接着在室温下以PBS中的5％脱脂牛奶将孔封锁一个小时。接着将在100-μl含有人类F9的待测溶液添加至孔内，再于室温下将培养盘培育一个小时。将抗兔InG(H+L)、HRP二次抗体施加至孔，且在室温下将培养盘培育一个小时。接着将100-μl OPD基质溶液添加至孔内。之后，将停止溶液(stop solution)添加至孔。最后，通过ELISA读取器(BIO-TEK)来测量孔中溶液的光密度。

对于如LMG的小分子检测来说，夹心型ELISA是不适用的。取而代之的是竞争ELISA(Competitive ELISA)。竞争ELISA的操作程序通常可在检定套组的手册中得到，且因此将不进一步重申。本发明范例中所采用的检定套组是GlycoNex Inc.101G002A。

SQUID MRA测量与ELISA测量结果比较

将关于通过相比于已知ELISA具有超高灵敏度的SQUID MRA系统测量的CRP的结果，总结如下。在人体受伤或感染时，人体会分泌CRP。因此，在临床上血清中的CRP浓度是用于诊断感染病情的典型指标。在以引用的方式并入本文中的先前美国专利申请案11/164,275中，论述了根据交流(x_ac)磁化率减少的磁性检测的详细机制。

经测量SQUID MRA的目标频率(target frequency)mf₁+nf₂周围的噪声频谱(noise spectrum)，如图5(a)所示，其中f₁以及f₂为几至几十kHz，且m以及n为非零整数。结果显示，对于x_ac频谱的噪声强度为1.7×10^-5(a.u.)。在图5(b)中显示当浓度为0.32emu/g的100-μl磁性试剂置于拾波线圈的一部分内时，磁性试剂的x_ac频谱。在mf₁+nf₂处观测到具有117×10^-5(a.u.)的峰值。此值被称为x_ac，o。在将给定浓度φ_CRP(例如，10^-5mg/L)的20-μl CRP溶液添加至磁性试剂中后，在图5(c)中展示其x_ac频谱。在mf₁+mf₂处峰值为84.4×10^-5(a.u.)，其被称为x_ac，φ。显然地，x_ac，φ小于x_ac，o。将参数Δx_ac，φ/x_ac，o定义为CRP的浓度指标，其中Δx_ac，φ/x_ax，o≡(x_ac，o-x_ac，φ)/x_ac，o。对于10^-5mg/L的CRP溶液而言，判定Δx_ac，φ/x_ac，o为27.9％。

对应于由5×10^-7至10^-3mg/L的φ_CRP的Δx_ac，φ/x_ac，o的关系经测量后绘于图6中。在图6的插入图中放大在较低φ_CRP处的Δx_ac，φ/x_ac，ovs.φ_CRP曲线。结果清楚地显示使用本发明的SQUID MRA系统检定CRP的浓度的灵敏度为约10^-6mg/L，亦即，1ppt。由于CRP溶液的体积为20μl，且CRP的分子量为1400000克，所以用莫耳(mole)单位计检定CRP的灵敏度为约1.4×10^-20莫耳(mole)。为了更好地说明本发明的SQUID MRA系统的超高灵敏度，将在图7中分别以实线以及虚线展示的Δx_ac，φ/x_ac，ovs.φ_CRP曲线与经由ELISA的检定特征曲线(OD₄₅₀-φ_CRP曲线)进行比较。显然经由ELISA检定CRP的灵敏度为约0.1mg/L，其在灵敏度上远低于SQUID MRA系统，低了10⁵倍。

将具有超高灵敏度的SQUID MRA系统相较于习知ELISA测量的人凝血因子IX(F9)的检定结果总结如下。F9作为非活性酵素原在血液中循环。通过因子XIa将F9转换为活性形式，而切除激活肽(activation peptide)，且因此产生通过一或多个二硫键(disulfide bonds)固持在一起的重链(heavy chain)以及轻链(light chain)。激活F9在凝血级联系统(blood coagulation cascade)中的作用为经由与Ca⁺²离子、膜磷脂(membrane phospholipids)以及因子VIII的交互作用，来将因子X激活至其活性形式。对F9的改变(包括点突变、插入以及缺失)引发F9缺乏，其为隐性X性联失调，且被称为B型血友病(hemophilia B)或克里斯马斯病(Christmas disease)。值得注意的是在本发明的此方面中涂布于磁性粒子上的抗鼠F9为单株的。此暗示在此种情况下，F9实际上为具有单活性抗原决定基的分子。经由根据SQUID的MRA测量的关于F9的Δx_ac，φ/x_ac，o曲线以实线标绘于图8中。SQUID MRA系统的灵敏度显示为4×10^-6mg/L，即4ppt。为达成比较目的，经由ELISA的OD₄₅₀-φ_F9曲线以虚线说明于图8中。ELISA结果显示10^-3mg/L(即1ppb)的灵敏度。因此，ELISA的关于F9的灵敏度仅为SQUID MRA系统的灵敏度的千分之一。简言之，以用于检定具有单活性抗原决定基的分子的SQUID MRA亦可达成超高灵敏度。

将具有超高灵敏度的SQUID MRA系统与已知竞争ELISA判定的小分子LMG的检定结果总结如下。具有324克的分子量的LMG通常被接受为小分子。LMG为在水中生物(aquatic beings)中孔雀绿(malachite green)的主要代谢物(metabolite)。孔雀绿在医药上用于稀释溶液中作为局部消毒剂或用于为水生卵(aquatic eggs)以及鱼苗(young fry)治疗寄生虫、真菌感染。然而，过量的LMG可致使人罹患肝癌。因此，LMG对于人而言，是一种致癌物。

参看图9，实线表示经由SQUID MRA测量的Δx_ac，φ/x_ac，o与LMG浓度φ_LMG之间的特征曲线。灵敏度显示约10^-7mg/L，约0.1ppt。OD₄₅₀与LMG浓度φ_LMG之间的特征曲线以虚线而呈现于图9中。竞争ELISA的灵敏度为具有5×10^-5mg/L(即50ppt)的灵敏度。图9所示的结果显示事实：对于检定小分子(诸如LMG)，SQUID MRA在灵敏度上远大于ELISA，大了约500倍。

根据本发明，已开发出SQUID MRA系统以用于以超高灵敏度来检定包括小生物分子的生物靶。通过使用磁通量传送技术，可防止SQUID传感器受交流激发磁场干扰；因此，SQUID传感器可长时间稳定地被操作。另外，传送线圈的循环处可非常接近地置放在SQUID旁，此意味SQUID可有效地侦测到待测磁信号，以达成超高灵敏度的测量。本发明亦显示超高灵敏的SQUID MRA系统适用于对具有多活性抗原决定基的分子、具有单活性抗原决定基的分子或小分子的检定。检定结果展示本发明的SQUID MRA系统的灵敏度为数个ppt或更小。成信，在将对所检测分子具有较高结合率的抗体涂布于磁性粒子上时，可进一步改良灵敏度。因此，SQUID MRA为在超低浓度位准下检测蛋白质、毒性分子、细菌、病毒、DNA、或甚至RNA诊断工具。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

Claims (9)

1.一种超灵敏磁减量测量系统，适于测量试样中生物靶的浓度，其中该生物靶包括具有多活性抗原决定基的生物分子或具有单活性抗原决定基的生物分子，该超灵敏磁减量测量系统包括：

样本单元，包括：

多个激磁线圈，通过多个函数产生器驱动；以及

拾波线圈，其中该拾波线圈可置放包括至少涂布有生物探针的磁性粒子的样本，且该拾波线圈感测该样本受激发的磁通量；以及

传感器单元，包括：

磁性传感器；以及

耦合线圈，其与该拾波线圈连接，其中通过在该样本单元处的该拾波线圈所感测的该样本的受激发磁通量，经由该耦合线圈而传送至在该传感器单元处的该磁性传感器。

2.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中该磁性粒子涂布有亲水性表面活性剂且该生物探针结合至该亲水性表面活性剂。

3.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中该生物探针包含抗体、抗原、酵素或核酸。

4.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中当该样本更包括其中含有该生物靶的试样时，该生物靶与该生物探针共轭。

5.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中具有单活性抗原决定基的该生物分子更包括小生物分子。

6.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中测量磁性的该样本的交流磁化率(x_ac，φ)且判定磁性的该样本的交流磁化率减少量(Δx_ac，φ)，其中将磁性的该样本的交流磁化率减少量定义为Δx_ac，φ≡(x_ac，o-x_ac，φ)，即磁性的该样本与含生物靶样本混合前(x_ac，o)与混合后(x_ac，φ)的交流磁化率差异。

7.如权利要求6所述的超灵敏磁减量测量系统，其中将参数Δx_ac，φ/x_ac，o定义为该生物靶的浓度的指标，其中将参数Δx_ac，φ/x_ac，o定义为Δx_ac，φ/x_ac，o≡(x_ac，o-x_ac，φ)/x_ac，o。

8.如权利要求7所述的超灵敏磁减量测量系统，其中确立该磁性试剂的交流磁化率减少Δx_ac，φ与在对照溶液中该生物靶的各种已知浓度之间的特征曲线，且根据该特征曲线来判定该试样中该生物靶的浓度。

9.如权利要求1所述的超灵敏磁减量测量系统，其中该磁性传感器包括超导量子干涉元件(SQUID)磁量计或梯度计。

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