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CN102124018A - 可维持从核苷酸模板酶促合成双链核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法 - Google Patents

可维持从核苷酸模板酶促合成双链核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法 Download PDF

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CN102124018A
CN102124018A CN2009801259260A CN200980125926A CN102124018A CN 102124018 A CN102124018 A CN 102124018A CN 2009801259260 A CN2009801259260 A CN 2009801259260A CN 200980125926 A CN200980125926 A CN 200980125926A CN 102124018 A CN102124018 A CN 102124018A
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CN
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CN2009801259260A
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S·M·门琴
B·罗森布卢姆
P·肯尼
S·I·罕
马兆春
J·陈
林英联
黄波立
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Life Technologies Corp
Original Assignee
Life Technologies Corp
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Publication date
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Abstract

本申请描述了可维持从核酸模板酶促合成双链核酸的核苷酸类似物。所述核苷酸类似物包含：(i)选自以下的碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他们的类似物；(ii)通过可裂解连接子连接于碱基或碱基类似物的标记；(iii)脱氧核糖；以及(iv)一个或多个磷酸基。所述连接子和/或标记抑制另一核苷酸底物向延伸的引物链的模板定向聚合酶掺入。此外，连接子的裂解留下连接于碱基的残基，所述残基不存在于在天然核苷酸中而且不抑制引物链的延伸。3’羟基未被封闭，因此，所述核苷酸类似物可在合成测序方法中用做可逆终止子。本申请也描述了利用所述底物的DNA测序方法。

Description

可维持从核苷酸模板酶促合成双链核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法
本申请要求2008年4月29号提交的临时美国专利申请号61/048,808及2008年9月29号提交的临时美国专利申请号61/136,732的权益。本申请通过引用上述每个申请引入他们的全部内容。
按照37C.F.R.§1.52(e)(5)的规定，创立于2009年1月16日、大小为7,129字节、名为68523_Seq_Listing.txt的序列表文本文件的全部内容通过引用引入本文。
本申请使用的各部分的标题仅用于组织用途，而不应解释为以任何方式限制本申请描述的主题。
领域
本申请一般而言涉及聚合酶底物及使用所述底物来测定诸如DNA或RNA的核酸序列的方法。
引言
核酸测序通常包括克隆感兴趣的核酸以便制备限定的核酸片段的大批样品(bulk samples)，随后分析所述大批核酸。业已提出合成测序(sequencing by synthesis)作为达到快速从头测序(de novosequencing)的方法。合成测序可包括所扩增核酸单分子集合的分析或核酸单分子的分析；并且理论上可用来检测天然基因组DNA，而无需细菌克隆或其它形式的扩增。
但是，仍然存在合成测序和单分子核酸测序改进方法的需求。
简述
本申请提供以以下式(I)代表的化合物：
Figure BPA00001287222000021
其中：B是选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或他们各自的类似物的碱基；L1是在碱基B和F间形成键的基团；F是在L1和L2间形成键的杂原子；L2就它与F的键合而言是化学上不稳定基团，并且其与R2形成化学键；L3是H或是包含与R2形成化学键的杂原子的化学上不稳定基团；每个R2独立地是包含报道分子的基团；R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应(template directed polymerase incorporation)速率的取代基(例如位于多磷酸末端的报道分子或猝灭剂)，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前。L2-R2防止向已掺入式(I)化合物的延伸中的寡核苷酸3’末端经模板定向聚合酶掺入反应掺入式(I)的化合物；l是整数，及m＝3l-1。
本申请也提供具有以下式(II)代表的结构的化合物：
Figure BPA00001287222000031
其中B、R1、L1、F、L2、R2、l和m与上文式(I)定义的一样。
本申请也提供测定核酸序列的方法，该方法包括：(a)将引物与靶多核苷酸杂交以形成引物-靶双链体，其中靶多核苷酸以其3’或5’末端连接于固相支持体；(b)将引物-靶双链体与聚合酶以及一种或多种核苷酸类似物接触以使核苷酸类似物掺入到引物的3’末端，从而形成延伸的引物链，其中所掺入的核苷酸类似物终止聚合酶反应，而其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种包含：(i)碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他们的类似物；(ii)标记，其通过可裂解连接子(cleavable linker)连接于所述碱基或其类似物；(iii)脱氧核糖；及(iv)一个或多个磷酸基；其中所述标记为所述碱基特有，以及其中所述多磷酸末端取代基、连接子和/或标记的组合抑制将另一核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中的模板定向聚合酶掺入反应；(c)洗涤固相支持体表面以移除未掺入的核苷酸类似物；(d)检测连接于刚掺入的核苷酸类似物的特有标记，藉此识别刚掺入的核苷酸类似物；(e)裂解在刚掺入的核苷酸类似物与所述特有标记之间的可裂解连接子，藉此允许另一核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中；(f)洗涤固相支持体表面以移除裂解的化合物片段；及(e)重复步骤(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
本申请的这些和其它特点在本文中有描述。
附图简述技术人员可理解以下描述的附图仅用于说明目的。附图并非意欲以任何方式限制本申请的范围。本专利或申请文件包括至少一张彩色处理的图。在要求及缴纳必要费用时，专利局可提供这个带有彩图的专利文件或专利申请文件公开文本的副本。
图1是描述在DNA合成测序期间二元报道分子系统(dual reporter system)连续释放报道分子(reporter)的方法的简图。
图2A和2B是描述两种具有光可裂解连接子的非天然DNA底物的化学结构的简图。
图3A和3B是描述将具有氨基末端残基(图3A)和羟乙酸末端残基(图3B)的核苷酸类似物掺入到模板上延伸中的DNA链的聚合酶掺入反应的简图。
图4图示可逆终止子的通式结构。
图5A-5D是描述4种具有游离3’羟基的可逆终止子碱基的例示性化学结构的简图。
图6是描述具有游离3’羟基的可逆终止子应用的简图；图中显示报道分子从已掺入链末端的可逆终止子上裂解，随后另一可逆终止子掺入到链末端，其中：
Figure BPA00001287222000041
F＝氧原子；
Figure BPA00001287222000042
R2＝染料。
图7是显示具有银离子可裂解连接子的第一可逆终止子的结构及描述涉及银离子化学裂解的化学反应的简图。
图8是显示具有银离子可裂解连接子的第二可逆终止子的结构及描述涉及银离子化学裂解的化学反应的简图。
图9A-9D描述在碱基和报道分子之间具有连接子的可逆终止子的结构的简图，其中所述报道分子可被碱性化合物如氨裂解。
图10A-10D是描述银离子可裂解连接子结构的简图，所述连接子可在一个银离子步骤中裂解或在包括银离子的多个步骤中裂解，从而在连接子残基末端产生羟基或氨基。
图11是描述在残基上留下磷酸末端基的银离子可裂解基团的应用的简图。
图12A和12B是电泳图，显示使用带有在碱基上具有甲基末端基的残基的dUTP类似物(图12A)、及带有在碱基上具有氨基末端基的残基的dUTP类似物(图12B)，在(AAG)14[SEQ ID NO：1]模板上进行的聚合酶延伸反应。
图13A、13B和13C是电泳图，显示使用天然dCTP/dTTP(图13A)、带有在碱基上具有甲基末端基的残基的dNTP类似物(图13B)、和带有在碱基上具有羟基末端基的残基的dNTP类似物(图13C)(其中N是U或C)，在(AAG)14[SEQ ID NO：1]模板上进行的聚合酶延伸反应。
图14是描述在模板上将核苷酸类似物添加到核酸3’末端的聚合酶定向添加反应的简图，所述核苷酸类似物具有γ-磷酸取代基(R1)和在碱基上具有取代基。
图15是描述γ-磷酸取代基(R1)变化的简图。当所述γ-磷酸取代基(R1)为烃基时，直到所述取代基通过裂解从碱基移除后，第二个核苷酸类似物才能被添加到核酸的3’末端；而当R1是H时，在核酸3’末端发生延伸。
图16A-16D是描述4种不同非可裂解核苷酸类似物的化学结构的简图；所述非可裂解核苷酸类似物分别是dATP-L-Cy5、dCTP-L-Cy3、Benz-dATP-L-Cy5和HC-dATP-L-Cy5，其中dATP-L-Cy5类似物和dCTP-L-Cy3类似物没有所述γ-磷酸取代基，其中图16C显示的Benz-dATP-L-Cy5类似物具有苯甲基作为γ-磷酸取代基，图16D显示的HC-dATP-L-Cy5类似物具有烃基(即HC)作为γ-磷酸取代基。
图17A和17B是电泳图，描述核苷酸类似物上的γ-磷酸苯甲基取代基的终止作用。
图18A和18B是电泳图，描述无γ-磷酸取代基的核苷酸类似物(例如图16A或16B的核苷酸类似物)可被掺入具有γ-磷酸苯甲基取代基的核苷酸类似物(例如图16C或16D)之后。
图19描述在染料和碱基间具有银离子可裂解连接子的可逆终止子的应用；其中通过γ-磷酸取代基(R)以及将染料连接到碱基的连接基(L)的存在，可选择性地控制终止子活性。
图20A和20B是电泳图，描述31p(dA)模板(即31个邻接dA的模板)的掺入数据，其中使用了Therminator II聚合酶与dTTP(图20A)以及在碱基上具有炔丙醇残基的dUTP核苷酸类似物(图20B)。
图21A-21D是描述γ-磷酸取代的dUTP类似物的终止性质的电泳图，所述的dUTP类似物在5位置上具有O-炔丙基-S-取代基。
图22A-22D是描述γ-磷酸取代的dUTP类似物错误掺入性质的电泳图，所述的dUTP类似物在5位置上具有O-炔丙基-S-取代基。
图23A-23C是描述再生供下个终止事件用的3’-羟基所需的裂解反应的电泳图和简图，其中图23A描述dU掺入到引物-靶双链体，图23B描述连接于磷酸的带有银离子的连接子几乎定量的裂解，而图23C显示通过牛小肠磷酸酶(Calf Intestine Phosphatase)处理，磷酸基从所述片段中丧失。
图24是描述合成硫代磷酸酯连接子(8)的炔丙酯的简图。
图25是描述dU 5’-单磷酸(10)合成的简图。
图26是描述dC 5’-单磷酸(12)合成的简图。
图27是描述dA 5’-单磷酸(14)合成的简图。
图28是描述dG 5’-单磷酸(16)合成的简图。
图29是描述焦磷酸甲酯(19)合成的简图。
图30是描述焦磷酸苯甲酯(21)合成的简图。
图31是描述焦磷酸2-(N-(3-甲基咪唑
Figure BPA00001287222000071
))-乙酯(25)合成的简图。
图32是描述γ-甲基-dUTP(26)合成的简图。
图33是描述γ-苯甲基-dATP(27)合成的简图。
图34是描述γ-(2-(N-(3-甲基咪唑))-乙基)-dCTP(28)合成的简图。
图35是描述γ-(2-(N-(3-甲基咪唑
Figure BPA00001287222000073
))-乙基)-dGTP(29)合成的简图。
图36是描述γ-苯甲基-dATP终止性质和错误掺入性质的电泳图。
图37是描述γ-咪唑
Figure BPA00001287222000074
-dCTP终止性质和错误掺入性质的电泳图。
图38是描述γ-咪唑
Figure BPA00001287222000075
-dCTP在各种底物浓度下终止性质的电泳图。
图39是描述γ-咪唑
Figure BPA00001287222000076
-dGTP终止性质和错误掺入性质的电泳图。
图40是描述γ-咪唑
Figure BPA00001287222000077
-dGTP在各种底物浓度下终止性质的电泳图。
各种实施方案的描述为了解释本说明书，采用以下定义，在任何情况下所用的单数术语都包括复数，反之亦然。在下述描述的定义与其它文献(包括任何通过引用引入本文的文献)中该词的用法冲突的情况下，除非明确意指相反的意思(例如在解释最初使用该术语的文献的时候)，否则在解释本说明书和其相关权利要求时以下文描述的定义为准。除非另有所指或使用“和/或”明显不合适，否则本文术语“或”意指“和/或”。除非另有所指或使用“一种或多种”明显不合适，否则本文术语“一种(a)”意指“一种或多种”。术语“包含”或“包括”(“comprise，”、“comprises，”、“comprising，”、“include，”、“includes，”、“including”)可互换使用，而非旨在限制性的。此外，在描述一个或多个实施方案使用术语“包含”或“包括”的情况下，本领域技术人员在某些具体情况下可以理解，所述一个或多个实施方案作为选择可采用表述“基本由........组成”和/或“由.........组成”来描述。也应该理解，在某些实施方案中实施某些动作的步骤顺序或实施某些动作的顺序并不重要，只要本申请保持可操作即可。此外，在某些实施方案中两个或两个以上的步骤或动作可同时实施。
本文所用的术语“核苷”包括2’-脱氧核苷和2’-羟基核苷。关于核苷的术语“类似物”包括具有经修饰碱基部分和/或经修饰糖部分的合成核苷。这些类似物包括为提高结合性、降低简并性、增加特异性等而设计的合成核苷。这些类似物也包括具有连接于碱基的、在天然核苷中不存在的残基的核苷。
本文所用的术语“杂原子”意指除H或C以外的原子。
本文所用的短语“末端基”意指位于某部分的末端位置的官能团。例如，连接报道分子(例如染料)和核苷酸类似物之碱基的连接子裂解后可留下具有连接于所述碱基的末端基的残基。裂解后留下的末端基取决于裂解反应的位置。所述末端基包括至少一种除H以外的原子。例示性及非限制性的末端基实例包括羟基和巯基。
本文所用的短语“核苷酸类似物”意指结构和功能类似于核苷酸且可作为底物被聚合酶识别的化合物。核苷酸类似物包括：含有标记的核苷酸，其中所述标记通过可裂解连接子连接于该核苷酸；和其脱氧核糖3’位的-OH基加帽的核苷酸(例如具有诸如-CH2OCH3或-CH2CH＝CH2的化学部分的核苷酸)。此类型的核苷酸类似物在美国专利号为6,664,079B2的专利中公开。
本文所用的短语“寡核苷酸”意指核苷或其类似物的线形寡聚体，所述核苷或其类似物包括脱氧核糖核苷、核糖核苷等。寡核苷酸的大小范围可在几个单体单位(例如3-4个单位)到几百个单体单位之间。
本文所用的术语“标记”和术语“报道分子”可互换使用，意指可检测的部分(即可发出可检测信号的部分)。所述部分可为荧光部分。
本文所用的术语“猝灭剂”意指以下部分，其在紧邻标记或报道分子的时候(例如当与标记连接于同一化合物时)，减低标记或报道分子发出的信号。若标记为荧光部分，则猝灭剂可为通过荧光能量转移(例如FRET)机制降低荧光发射的部分。当猝灭剂分子吸收光谱与供体荧光团发射光谱重叠时，或当这两个分子很靠近时，在供体荧光团[即荧光标记，例如FRET系统中的报道分子，后者当FRET不存在时(例如当猝灭剂被移除时)在FRET系统中提供可检测信号的报道分子，而当FRET存在时(例如在猝灭剂存在时)发挥能量转移供体的作用]与受体(例如在FRET中发挥非荧光能量转移受体的猝灭剂)之间发生FRET。其它同样已知的荧光猝灭机理包括但不限于碰撞猝灭和电荷转移猝灭。
本文所用的短语“特有标记”意指在样品中可区别于其它可检测部分的可检测部分。例如，T、G、A和C的核苷酸类似物中的每一种皆可具有特有标记。因此，指定标记相关的信号可指示该标记所连接的核苷酸类似物的存在。因此，特有标记的使用允许在合成测序期间测定被加入到延伸中核酸之末端的核苷酸类似物。
本文所用的短语“永久键”(permanent linkage)意指不可裂解的键。
本文所用的短语“瞬时键”(transient linkage)意指可裂解的键(例如化学不稳定键、光可裂解键)。
通过“合成测序”的DNA测序包括以分步方式通过靶标互补体的基于引物/聚合酶的合成，来测定靶标的每个碱基。这种技术包括连续掺入“可逆终止子”，所述“可逆终止子”包含报道分子，而且所述“可逆终止子”一旦被掺入则阻断合成。所述终止子包含报道分子，后者对于其所连接的碱基而言是特有的。所述报道分子可为荧光报道分子并且其是可检测的部分。反应的终止可通过移除封闭基团(例如在已掺入的可逆终止子3’羟基上)而逆转，然后进一步延伸反应可得以维持。可在测定之后及进一步延伸反应之前移除所述报道分子，或可同时移除报道分子和封闭基团。
预示掺入事件的报道分子可位于三磷酸γ-位，在此位置上所述报道分子可通过所得的焦磷酸自延伸产物的扩散而从测定容量(interrogation volume)中移除。或者，报道分子可连接于碱基。当报道分子连接于碱基时，在下一掺入事件之前所述报道分子必须以单独步骤从延伸产物中移除，以便避免报道分子染料之间彼此猝灭，从而确保每个信号可用正掺入的碱基毫无疑义地来鉴别。进一步信息提供于：Mitra，R.D.等人，“Fluorescent in situ sequencing onpolymerase colonies”Analytical Biochemistry，320(1)卷，第55-65页(2003)，本文通过引用引入其全部内容。已尝试若干不同方法进行单分子测序。例如，“纳米孔”(即绝缘膜上纳米等级的小孔)的应用公开于Nakane等人，Condens.Matter 15(2003)R1365-R1393中。此外，零级波导(zeromode wave guide)的应用公开于Levene等人，Science299(2003)，第682-686页中。此外，在平面上同时分步延伸具有染料标记的核苷酸的多个片段公开于Braslavsky等人，PNAS100(2003)，第3960-3964页中。另外的核酸测序和单分子检测方案描述于由McKernan等人2006年2月1号提交的申请序列号为11/345.979的美国专利申请中，以及由K.J.McKernan等人2007年4月19号提交的申请序列号为11/737,308的美国专利申请中；以上文件的全部内容通过引用引入本文用于所有方面。
图1显示核苷酸类似物的添加，所述核苷酸类似物具有连接于三磷酸γ-位的有机取代基(例如荧光报道分子)R1和连接碱基的荧光报道分子R2。如图1所示，核苷酸类似物被添加到延伸中的DNA链中，导致取代基R1被移除。在所述核苷酸添加到延伸中的DNA链之后，连接子L2和荧光报道分子R2可通过裂解连接R2和碱基的键而移除，从而允许另一掺入事件发生。
当报道分子连接碱基的时候，其在测序期间的移除可产生不同于天然脱氧核苷三磷酸(dNTP)底物结构的产物，这是例如由于需要能够使报道分子与碱基结合并能够使报道分子自碱基释放的连接子(例如图1中L2和L3)和官能团(例如图1中F)。此外，一旦所述部分被裂解，来自连接子的残基则可保持连接于碱基上，所述碱基然后被掺入到延伸中的双链DNA中。在报道分子裂解后碱基上具有末端氨基残基的可逆终止子公开于Ju等人，“Four Color DNASequencing by Sythesis Using Cleavable Fluorescent Nucleotidereversivle Terminators，”PNAS，35卷U.S.C.§103(a)，No.52，第19635-19640页(2006年12月26日)中。
如上所述，报道分子可通过可裂解连接子而连接于碱基。根据某些实施方案，连接报道分子和碱基的连接子可为光可裂解连接子。其中报道分子通过光可裂解连接子连接于碱基的聚合酶底物示于图2A和2B。在图2A和2B中，F是N或O，L1是炔丙基(即-C-C≡C-)，而L2是以下结构代表的光可裂解连接子部分：
Figure BPA00001287222000121
其中R2为荧光报道分子。
在图2A中，在报道分子与碱基之间的键裂解之后，留在残基上的末端官能团是氨基。当这种底物被掺入延伸中的DNA链(例如在合成测序方法中)时，如图3A所示，延伸中的DNA包括含有末端氨基的残基。由图3A可见，这个结构在延伸的核酸链的每个碱基上包含末端为氨基的残基。
基于以下详细描述的实验，发现裂解后留在碱基上的某些残基比起其它残基与在所得的双链DNA上的延伸反应更相容。特别是，已经发现，位于包含末端氨基的延伸链中的非天然碱基中的连接子残基可在8至10个掺入事件后严重延缓三磷酸底物的掺入。然而，当位于延伸链中的非天然碱基中的连接子残基以乙基或羟基为末端(如图3B的延伸中的DNA中所示)时，可持续掺入至少50个碱基。
在某些条件下(例如连接子结构和聚合酶的改变)，包含游离3’羟基和由碱基伸出的连接子-报道分子的三磷酸核苷可掺入一次，但其只有当由碱基伸出的键裂解导致报道分子移除后才能第二次掺入。例如，具有游离3’-羟基的可逆终止子公开于以下文献中：Wu等人，“Termination of DNA Synthesis by N6-alkylated，not 3′-O-alkylated，photo-cleavable 2′-Deoxyadenosine Triphosphates”，Nucleicacids Research(2007)，35(19)，6339-6349)和Wu等人，3′-O-modifiednucleotides as reversible terminators for pyrosequencing，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America(2007)，104(42)，16462-16467。这些可逆终止子在碱基上具有2-硝基苄基，该基团可通过紫外光移除从而恢复天然核苷酸并且允许掺入到延伸中的DNA链上。然而，未裂解的延伸底物对于下一个dNTP掺入能力的终止作用对碱基上的连接子的结构以及聚合酶非常敏感。
相应地，本申请提供以下式(I)代表的化合物：
Figure BPA00001287222000131
其中：B是选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶或他们相应的类似物的碱基；L1是与碱基B和F形成键的基团；F是在L1和L2之间形成键的杂原子；L2就与F的键合而言是化学上不稳定基团，并且其与报道分子R2形成键；L3是H，或是包含与报道分子R2形成化学键的杂原子的化学上不稳定基团；每个R2独立地是包含报道分子的基团，其中L2和R2的组合防止所述化合物掺入到延伸中的已掺入式(I)化合物的寡核苷酸的3’末端的模板定向聚合酶掺入反应；R1为中性取代基，其选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环取代基、或其阴离子或阳离子的形式，其中所述取代基抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入所述核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入速率，所述抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前；l是整数，及m＝3l-1。
根据某些实施方案，化学上不稳定基团L2的裂解留下连接子残基部分，所述残基部分具有连接于碱基的末端基团。根据某些实施方案，残基的末端基团不是氨基。根据某些实施方案，残基的末端基团是羟基。根据某些实施方案，l是2、3或4。
如上所述，L3可为H(即所述化合物可具有游离或未封闭的3’羟基)。与3’-羟基被封闭因而必须在下一掺入事件发生前移除的可逆终止子相反，具有未封闭3’-羟基的可逆终止子无需单独的解除封闭步骤。具有封闭3’-羟基的底物也可能是不佳的聚合酶底物，因而其掺入速率可能非常低，需要提高底物浓度和延长反应时间。
相应地，本申请也提供以下式(II)代表的化合物：
Figure BPA00001287222000141
其中B、R1、L1、F、L2、R2、l和m与上文所述式(I)的定义一样。
对于这些化合物，3’-羟基总是游离的，而且“终止”(即在连接子L2-R2裂解前对下一碱基掺入的抑制)的选择性可通过改变位于L2和R1的结构得到优化。
在上述式(I)和(II)的化合物中：F可为在其裂解后产生羟基末端残基的键；L2和L3可为化学可裂解基团，诸如硫缩醛、硫酯或酯；L2-R2为连接子-报道分子的组合，其中在延伸链中所掺入的碱基上存在连接子和/或报道分子，抑制包含类似L2-R2连接子-报道分子的下一碱基的聚合酶催化掺入；以及R1为结合于三磷酸的γ-磷酸或或四磷酸的δ-磷酸的基团，当先前掺入的核苷酸仍然包含L2-R2时，其起抑制下一个核苷酸掺入反应速率的作用。
如以上所述，R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应速率的基团，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前。根据某些实施方案，R1可为取代或未取代的烃基。取代或未取代的烃基的非限制性实例包括：(i)取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或(ii)(i)的中性、阴离子或阳离子形式。
图5A-5D显示4种例示性的具有游离3’羟基的可逆终止子碱基的结构。图5A-5D中的变量定义如下：L2为化学不稳定的连接基团，诸如C(O)S-、C(O)O-、CH(SMe)苯基-、[RO]2P(O)S-；R2为包含报道分子部分和L2的组合的基团，该基团当前面的核苷酸包含具有相同或类似结构的L2-R2基团时，在聚合酶依赖性模板定向DNA合成期间抑制所述核苷三磷酸的掺入速率；但当前面的核苷酸的所述基团已在L2位置裂解而产生裂解残基F时，允许掺入所述核苷三磷酸；而且R1为选自以下的有机取代基：(i)取代或未取代的烷基，诸如甲基、炔丙基或苯甲基；取代或未取代的芳族基，诸如苯基、甲氧基苯基或萘基；取代或未取代的杂环，诸如四氢吡咯或哌嗪；取代或未取代的芳族杂环，诸如喹啉基、甲基咪唑基、吡啶基、咪唑基或苯并咪唑基；或(ii)(i)的基团的中性、阴离子(例如苯磺酸盐)或阳离子(例如三甲基铵盐、苯基或咪唑
Figure BPA00001287222000151
)形式。
图6显示具有游离3’-羟基的可逆终止子应用的实例。在图6中，可裂解基团L2是硫缩醛，因裂解形成的连接子残基L1-F是-C≡C-CH2-NH-C(O)-CH2-OH，而抑制下一核苷酸掺入的部分是取代的芳族结构。图6所示的硫缩醛基可被银离子裂解。
图7显示具有游离3’羟基的可逆终止子的结构，其中连接报道分子和碱基的可裂解基是硫代碳酸酯基。所述硫代碳酸酯基也可被银离子裂解。图7也显示在底物掺入DNA链后银离子化学裂解底物所涉及的化学反应。
图8显示聚合酶底物的结构，其中可裂解基团L2是硫缩醛基。硫缩醛基也可被银离子裂解。图8也显示涉及在底物掺入DNA链后银离子化学裂解底物所涉及的化学反应。
图9A-9D显示聚合酶底物的结构；所述底物在碱基和报道分子之间具有不同的可裂解连接子，所述连接子可被碱性化合物(例如氨)裂解，其中F＝氧原子而L1＝炔丙基。
图10A-10D是显示银离子可裂解连接子的结构的简图，所述连接子具有染料标记能力，而且其可被裂解从而在连接子残基末端产生羟基或胺基。
图11是显示应用银离子可裂解基的简图，所述可裂解基在残基上留下磷酸末端基。在图11所示的结构中，“DYE”(染料)所连接的苯环可为未取代的苯环(如图所示)、或取代的苯环(没有显示)。
连接于核苷酸类似物的标记可为荧光部分。该荧光部分可为选自荧光素、罗丹明、花青和/或bodipy染料的部分。
根据某些实施方案，特有标记通过可裂解连接子连接到胞嘧啶或胸腺嘧啶的5-位、或连接到脱氮-腺嘌呤或脱氮-鸟嘌呤的7-位。特有标记也可通过可裂解连接子连接到核苷酸类似物的另一位置，只要在聚合酶反应期间所述标记的连接稳定并且该核苷酸类似物可作为底物被聚合酶识别即可。
本文公开的核苷酸类似物可用于单核苷酸多态性检测、遗传突变分析、甲基化检测、基因表达系列分析、基因表达分析、法医鉴定、遗传疾病相关研究、DNA测序、RNA测序、基因组测序、翻译分析及转录分析。
相应地，本申请也提供一种核酸测序方法，其包括以下步骤：(a)将引物与靶多核苷酸杂交以形成引物-靶双链体，其中靶多核苷酸以其3’或5’末端连接到固相支持体；(b)将引物-靶双链体与聚合酶以及一种或多种核苷酸类似物接触，以便向引物的3’末端掺入核苷酸类似物，从而形成延伸的引物链，其中所掺入的核苷酸类似物终止聚合酶反应，并且其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种包含：(i)碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他们的类似物；(ii)标记，其通过可裂解连接子连接于碱基或碱基类似物；(iii)脱氧核糖；(iv)3个或3个以上磷酸基，其中所述标记为碱基特有的，并且其中所述连接子和/或标记抑制另一核苷酸类似物模板定向聚合酶掺入到延伸的引物链；以及(v)位于多磷酸末端的有机部分，其中在有机部分的存在在该部分从先前(ii)的掺入中裂解之前抑制下一核苷酸类似物的掺入，但在有机部分从先前(ii)的掺入中裂解之后则允许下一核苷酸类似物掺入。(c)洗涤固相支持体表面，以移除未掺入的核苷酸类似物；(d)检测连接于刚掺入的核苷酸类似物的特有标记，藉此识别刚掺入的核苷酸类似物；(e)裂解刚掺入的核苷酸类似物与特有标记之间的可裂解连接子，藉此允许另一核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中；(f)洗涤固相支持体表面以移除裂解的化合物片段；及(e)重复步骤(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
所述一种或多种核苷酸类似物的每一种可具有上述式(I)或式(II)代表的结构。所述一种或多种核苷酸类似物可包含：第一核苷酸类似物，其中B是具有第一标记的腺嘌呤；第二核苷酸类似物，其中B是具有第二标记的鸟嘌呤；第三核苷酸类似物，其中B是具有第三标记的胞嘧啶；以及第四核苷酸类似物，其中B是具有第四标记的胸腺嘧啶。所述标记可为荧光标记。本领域技术人员可理解尿嘧啶可用作RNA测序和分析的第四标记。
DNA聚合酶非限制性实例包括Thermo Sequenase、Taq FS DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Therminator、Therminator II以及Vent(exo-)DNA聚合酶。核苷酸类似物的结构可根据延伸用的聚合酶而优化。结构优化可包括R1和L2取代基的结构和选择以及“染料(Dye)”(检测部分)的选择。
每一种特定染料的荧光发射可用荧光计检测，所述荧光计装备了检测固体表面发出的荧光的配件。对于大规模评价，可使用能够检测多种不同荧光染料(例如500nm-700nm、400nm-800nm等)的多色扫描系统。
本文描述的核苷酸类似物可用于DNA和RNA测序策略，所述策略运用单分子检测、实时DNA和RNA测序或任何其它技术，所述技术通过用碱基标记报道分子测定每个掺入事件、随后在下一掺入事件前通过化学、热、酶或其它物理方式裂解报道分子而连续测定DNA或RNA的序列。
本文描述的方法和化合物可用于测定扩增的靶以及单分子序列。实施例本申请的各方面可根据以下实施例进一步理解，所述实施例不应解释为以任何方式限制本申请范围。虽然实施例是关于DNA核苷酸，但是本领域技术人员可理解RNA核苷酸也在预想之内。
为了确定聚合酶是否会继续延伸包含具有氨基的残基的非天然DNA(即包括不存在于天然DNA的部分的DNA)，设计了利用氨基炔丙基-dUTP(脱氧尿苷三磷酸)和dCTP(脱氧胞啶三磷酸)的实验，所述氨基炔丙基-dUTP和dCTP产生在所掺入的dUTP部分上具有末端氨基官能团残基的延伸DNA。所用的dUTP由下式代表：
Figure BPA00001287222000181
所述实验在(AAG)14[SEQ ID NO：1]模板上利用FAM(即6-羧基荧光素)标记的引物实施。
如图12B所示，产物的电泳显示有弱延伸，图中电泳图描记线展示多个FAM峰(深色峰，浅色峰为大小标准)，这表明合成不能持续。这些结果表明，在42碱基靶模板上的延伸不超过大约14个碱基。
这与使用甲基丙炔基dUTP和dCTP在同一模板的延伸形成对比，如图12A的电泳图所示，甲基丙炔基dUTP和dCTP的使用显示延伸出单一产物。值得注意的是，图12A和图12B的电泳图中的大小差异起因于氨基片段的表观大小，这是带正电的氨基给予所述片段低移动性所致。
虽然不希望被理论束缚，但是连接于所掺入碱基的残基中的氨基看来干扰聚合酶的酶活性。因此，设计了具有下述和图2B所示的结构的中性底物：
Figure BPA00001287222000191
其中F是O，L1是炔丙基酰胺(即-C-C≡C-C-NH-C(O)-C-)，而L2是由下列结构代表的部分：
Figure BPA00001287222000192
其中R2是荧光报道分子。这个结构对应于图1的通式结构，其中L1-F是羟乙酸酯。因此这个结构在光化学裂解后产生羟乙酸酯键而不是氨基键。
为施行这些实验，合成了具有以下部分的dUTP底物，所述部分连接于碱基的5-位。这个实验所用的dUTP类似物的结构描述于图5D。这个核苷酸类似物因此具有连接于碱基的羟基末端部分。
使用图12A和12B显示的实验所使用的相同的模板/引物系统{即在(AAG)14[SEQ ID NO：1]模板上用克列诺酶(Klenowenzyme)在37℃反应1分钟}对这些底物进行测试。用于这个实验的核苷酸浓度为5μM。这个实验的结果在总结于图13C的电泳图中。
在相同的模板上对天然dCTP/dTTP(其结果显示在图13A的电泳图中)和这些底物的甲基丙炔基类似物(其实验结果显示于图13B的电泳图中)实施了类似的实验。
图13C的电泳图显示对于具有连接于碱基的羟基末端部分的核苷酸类似物而言延伸产物的合成极佳。此外，图13A、13B和13C的电泳图显示每种情况的延伸反应以类似效率进行至完成。因此，核苷酸类似物碱基上的羟基末端残基似乎不干扰模板上的聚合酶定向的核酸链延伸反应。
羟乙酸连接子的使用使光-化学裂解能够发生并且提供可行的上述化合物的合成途径。所述官能化底物对于光-化学裂解反应有活性，而所得的产物具有羟基末端残基，其不干扰延伸链上DNA的酶促合成。
进行了另外的实验以确定γ-磷酸取代基(即R1)和碱基上的取代基(即-L1-F-L2-R2)对于具有游离3’羟基的核苷酸类似物终止的影响。
图14和15图示在模板上将核苷酸类似物以聚合酶定向添加到核酸的3’末端，所述核苷酸类似物具有γ-磷酸取代基(R1)且在其碱基上具有-连接子-染料(L2-R2)取代基；其中-L2-代表连接子与染料之间的任何官能键的组合，所述官能键包括(但不限于)酯、酰胺和苯甲基醚；所述组合将键维持酶的活性并且在核苷酸酶促掺入后使染料从连接子分离的定向裂解能够发生。图14显示待掺入到所述核酸中的第一核苷酸类似物。如图15所示，当R1是H时，第二核苷酸类似物可被添加到所述核酸的3’末端从而导致引物延伸。然而，当R1是烃基(例如甲基、炔丙基或苯甲基)时，第二核苷酸类似物直到-L2-R2取代基从碱基裂解后才被添加到所述核酸的3’末端。如图15所示，R1可为H，或R1可为烃基或杂原子取代的烃基。
图16A-16D是4种不同的非可裂解核苷酸类似物的化学结构的简图，所述核苷酸类似物分别是dATP-L-Cy5、dCTP-L-Cy3、Benz-dATP-L-Cy5和HC-dATP-L-Cy5。dATP-L-Cy5(图16A)和dCTP-L-Cy3(图16B)的类似物不具有γ-磷酸取代基(即R1是H)，而图16C显示的Benz-dATP-L-Cy5类似物具有苯甲基作为γ-磷酸取代基，图16D显示的HC-dATP-L-Cy5类似物具有烃基(HC)作为γ-磷酸取代基。烃基可为取代或未取代的烷基或芳族基，而取代基可为导致形成中性、阳离子或阴离子基团的杂原子。苯环上的R取代基可为氢、烃基、阳离子基团或阴离子基团。
图17A和17B是描述核苷酸类似物上的γ-磷酸苯甲基取代基的终止作用的电泳图。该实验所用的模板包括以下序列：3’ACATTTGCTGCCGGTCAGTGT...5’[SEQ ID NO：2]其中序列中加下划线的部分表示染料标记的引物杂交的位置。图17A的电泳图显示在掺入dCTP-L-Cy3(图16B)之后掺入dATP-L-Cy5(图16A)。具体而言，在图17A的电泳图中可以观察到来自Cy-3和Cy-5两者的信号。在图17A中，可观察到第一dC掺入的峰相对较小，未取代的dA掺入峰高，而且可观察到另一dC掺入的第三个峰。图17B的电泳图显示，在dCTP-L-Cy3(图16B)掺入之后Benz-dATP-L-Cy5没有掺入(图16C)。具体而言，在图17B的电泳图中仅可看到Cy-3的信号。
图18A和18B为电泳图，显示在具有γ-磷酸苯甲基取代基的核苷酸类似物(即图16C的核苷酸类似物)掺入之后，无γ-磷酸取代基的核苷酸类似物也可掺入。这个实验所用的模板包括以下序列：3’ACATTTGCTGCCGGTCATGTC...5’[SEQ ID NO：3]其中序列中加下划线的部分表示染料标记的引物杂交的位置。与图17A和17B的实验所用的模板相比，对于该实验所用的模板而言，引物中位于模板5’的前两个碱基被转换，以验证Benz-dATP-L-Cy5确实是聚合酶的底物。图18A的电泳图显示，在dATP-L-Cy5(图16A)掺入之后掺入dCTP-L-Cy3(图16B)。具体而言，在图18A的电泳图中可以看到来自Cy-3和Cy-5两者的信号。图18B的电泳图显示在Benz-dATP-L-Cy5(图16C)掺入之后dCTP-L-Cy3掺入(图16B)。具体而言，在图18B的电泳图中可以看到来自Cy-3和Cy-5两者的信号。由图18B可以看出，Benz-dATP-L-Cy5易于掺入，随后dCTP-L-Cy3掺入。这里，由于在延伸药物中存在来自已掺入的dCTP-L-Cy3的连接子，其它核苷酸类似物的掺入停止。
图19是描述应用在连接子在染料和碱基之间具有银离子可裂解连接子的可逆终止子的简图，其中所述可逆终止子的终止活性由于存在γ-磷酸取代基(R1)和将染料连接到核苷酸类似物之碱基的连接基(L)而受到选择的控制。如图19所示，银离子裂解在碱基上产生具有磷酸末端基团的连接子残基，而磷酸酶裂解随后在所述碱基上产生炔丙醇残基。业已发现，在裂解后留在碱基上的炔丙基残基不干扰所述核酸的进一步延伸。
图20A和20B是电泳图，显示利用Therminator II聚合酶以及在碱基上具有炔丙醇残基的dTTP(图20A)和dUTP核苷酸类似物(图20B)的31p(dA)模板(即31个相邻dA的模板)的掺入数据。图20A和20B证明，聚合酶能够掺入在碱基上具有炔丙醇残基的核苷酸类似物。具体而言，在图20A(dTTP核苷酸类似物)和图20B(dUTP核苷酸类似物)中都观察到超过31个峰，其中所述核苷酸类似物在碱基上具有炔丙醇残基的核苷酸类似物；这表明在整个模板长度上都有掺入。
图21A-21D是电泳图，显示γ-磷酸被取代的dUTP类似物在p(dA)模板上的终止性质，其中所述dUTP类似物在5位置具有O-炔丙基-S-取代基。这些实验所用的核苷酸类似物具有以下描述的通式结构：
Figure BPA00001287222000231
其中R1是甲基。底物浓度为1μM。图21A是引物的电泳图。图21B-D分别是10、30和60分钟延伸后的电泳图。由图21A-21D可见，所述γ-磷酸取代基和5位的O-炔丙基-S-取代基阻止所述核苷酸类似物在p(dA)模板上的延伸。具体而言，由图21B可见，反应10分钟后第一p(dA)的延伸就几乎完成了。然而，甚至在一小时后(图21D)，都没有可观察到核苷酸类似物掺入到第二p(dA)上。
图22A-22D是电泳图，显示γ-磷酸被取代的dUTP类似物的错误掺入性质，其中所述dUTP类似物具有5位O-炔丙基-S-取代基以及具有苯甲基作为γ-磷酸取代基。这些实验所用的核苷酸类似物与上文描述的图21A-21D中的核苷酸类似物具有相同的通式结构。对于这些实验，所有反应都以1μM的底物浓度(使用了Mg2+)进行10分钟。所用的两个模板是：5’(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTAAACTGGCCGTCGTTTTAC A 3’[SEQ ID NO：4]该模板被称为AA模板，和5’(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTANACTGGCCGTCGTTTTAC A 3’[SEQ ID NO：5]其中N可为G、C或T，该模板被称为NA模板(即GA、CA或TA模板)。所用引物为：5’-(6-FAM)TGTAAAACGACGGCCAGT 3’[SEQ ID NO：6]。图22A是该引物的电泳图。由图22B-D可见，γ-磷酸被取代的dUTP类似物(具有5位O-炔丙基-S-取代基)掺入到AA模板中(图22B)，而不掺入GA模板(图22C)或TA模板(图22D)中。此外，γ-磷酸被取代的dUTP类似物在GA和TA模板上没有分别错误掺入到dG或dT上。
图23A-23C是电泳图和简图，显示核苷酸类似物的聚合酶掺入，以及Ag+裂解反应和磷酸酶裂解反应。图23A显示dU掺入到引物-靶双链体上。图23B显示银离子将所述连接子几乎定量裂解为磷酸基，其中可见由于延伸片段末端丧失大的连接基的影响所述峰已经左移。图23C显示，通过牛小肠磷酸酶处理引起磷酸基从所述片段丧失，其中可以观察到由于磷酸酶裂解后丧失带负电荷的磷酸基，所述峰已经右移。
附加实施例
实施例1：硫代磷酸连接子的炔丙基酯(8)的合成(图24)。在氩气中，将硫代磷酰三氯(4)(4.7mL)逐滴添加到冷却的(-15℃)磷酸三乙酯(40mL)和卢剔啶(8.7mL)的溶液中。然后逐滴添加炔丙醇(1.7mL)并在-5℃搅拌1小时。在冷却到-15℃后，该反应以0.5M四乙基碳酸氢铵(TEAB)(100mL)猝灭，然后在室温搅拌6小时。所述溶液用二氯甲烷(DCM)洗涤两次，将水相浓缩产生(5)，所述产物无需进一步纯化来使用。向甲醇(10mL)和水(1mL)中的0.76g(5)中加入3-(溴甲基)苯甲酸甲基酯(methyl-3-bromomethyl)benzoate)(6)(0.23g)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物浓缩，残余物加入DCM中并用水萃取。将DCM层浓缩并通过硅胶柱层析法将其纯化，从而提供所需的纯化合物(7)。将1∶1乙醇∶乙二胺(5mL)的溶液加入到0.1g的(7)中，在干燥氩气中在90℃下搅拌反应物过夜，然后在高真空中蒸发至干。残余物溶解在5mL甲醇中，然后用0.5mL三氟乙酸乙酯处理。在室温3小时后，将反应混合物蒸发至干并通过柱层析法纯化。包含(8)的级分(fraction)通过质谱分析鉴定、合并并蒸发至干。
实施例2：dU-5’-单磷酸(10)的合成(图25)。在氩气环境下向在DMF(0.6mL)中(8)(55μmol)的溶液添加22mg CuI(115μmol)，随后加入44μL三乙胺(TEA)(322μmol)。在所有CuI溶解后，加入80μL在DMF中的250mM Iodo dUMP(1)(20μmol)溶液，随后加入23mg Pd(PPh3)4(20μmol)。在氩气中于室温搅拌过夜后，反应物用14mL 100mM的TEAA缓冲液稀释，过滤该悬浮液并浓缩上层清液。残余物通过反相HPLC用三乙基乙酸铵(TEAA)/乙腈梯度纯化。包含(10)的级分通过阴离子交换HPLC用TEAB/乙腈梯度纯化。M/S：(M-H)-729.2
实施例3：dC 5’-单磷酸(12)的合成(图26)。以与实施例2中(10)的合成类似的方式从(11)和(8)制备(12)。
实施例4：dA 5’-单磷酸(14)的合成(图27)。以与实施例2中(10)的合成类似的方式从(13)和(8)制备(14)。
实施例5：dG 5’-单磷酸(16)的合成(图28)。以与实施例2中(10)的合成类似的方式从(15)和(8)制备(16)。
实施例6：焦磷酸甲酯(19)的合成(图29)。9.1g(10mmol)焦磷酸三(四丁胺)(18)溶解在4.5mL乙腈中，然后用1.86g(10mmol)甲苯磺酸甲酯(17)处理。30分钟后反应物用水稀释到100mL，然后在用300mmol四乙基碳酸氢铵(TEAB)平衡的Dowex 1X8200柱上纯化，用TEAB梯度洗脱。用每一种级分的20μL部分来分析级分的磷酸，将每一级分加入到13mmX100mm试管(teat tube)中的300μL 0.5N HCl中，然后加热至沸腾；将600μL的1N H2SO4中的0.42％四水钼酸铵溶液及100μL 10％抗坏血酸溶液加到每支试管中，加热至沸腾然后放置在40℃的加热块中。显蓝色的试管指示包含磷酸的级分。每一个这些级分的2mL样品经汽提(strip)然后通过31PNMR检测单取代的焦磷酸酯(31P NMR D2O(无参比)-8.06ppm，2H，dd，J1＝63.19，J2＝24.6)。
实施例7：焦磷酸苯甲酯(21)的合成(图30)。9.1g(10mmol)焦磷酸三(四丁胺)(18)溶解于4.5mL乙腈中，然后用1.71苯甲基溴(20)处理。30分钟后，反应物用水稀释至100mL，并在用300mmol四乙基碳酸氢铵(TEAB)平衡的Dowex 1X8 200柱上纯化，用TEAB梯度洗脱。利用实施例6所示的程序来分析级分的磷酸。这些级分的每一种的样品经过汽提，然后通过31 PNMR检测单-取代的焦磷酸酯(31P NMR D2O(无参比)1HNMR(D2O)δ7.3(m，5H)，4.8(d，2H)。
实施例8：焦磷酸2-(N-(3-甲基咪唑))-乙酯(25)的合成(图31)。4.1g、50mmol甲基咪唑(22)和18.5g、50mmol乙二醇二(对甲苯磺酸)酯(23)一起在50mL干燥乙腈中于70℃加热24小时，产生白色沉淀物。将悬浮液过滤，在减压下将滤液干燥。残余物用大约30mL甲醇研磨，收集甲醇溶液、蒸发至干然后从30mL乙酸乙酯中结晶。过滤和真空干燥后，分离出6.4g白色固体(24)。1H NMR(DMSOd6)δ9.06(s，1H)，7.68(d，2H)，7.61(t，2H)，7.48(d，2H)，7.46(d，2H)，7.11(d，2H)，4.47(t，2H)，4.41(t，2H)，3.81(s，3H)，2.42(s，3H)，2.18(s，3H)。
将14.4g的焦磷酸三(四丁铵)(18)于5mL乙腈中溶解，然后加入全部6.4g固体(24)。30分钟后，反应物用水稀释至100mL并且加入到用TEAB平衡的Dowex 1X8 200柱上，然后用TEAB梯度洗脱。利用实施例6所示的程序来分析级分的磷酸。这些级分的每一种的样品经过汽提然后通过31 PNMR检测单-取代的焦磷酸酯。1HNMR(D2O)
Figure BPA00001287222000271
8.7(s，1H)，7.38(t，1H)，7.27(t，1H)，4.3(t，2H)，4.09(m，2H)，3.74(s，3H)，3.1(q，6H)，1.2(t，9H)。
实施例9：γ-甲基-dUTP(26)的合成(图32)。将三(正丁胺)(2.2μL，9.3μmol)加入到焦磷酸甲酯(19)(1.2mg，5μmol，得自实施例2)的二甲基酰胺(DMF)溶液(0.2mL)中，所述焦磷酸甲酯先前与无水DMF(0.2mL)一起蒸发了两次。加入羰基二咪唑(CDI，4mg，25μmol)，然后在室温搅拌混合物过夜。通过添加MeOH(2.2μL)并搅拌30分钟破坏过量的CDI。向所得的混合物中加入来自实施例6的(19)(0.5μmol，在0.1mL DMF中)，将其在室温搅拌3天。在减压真空下浓缩后，残余物用乙腈/TEAB梯度在阴离子交换HPLC中纯化。将包含(26)的级分合并，然后通过反相HPLC进一步纯化：M/S：M-1＝779.2(计算值779.0)
实施例10：γ-苯甲基-dATP(27)的合成(图33)。使用来自实施例7的焦磷酸酯(27)和来自实施例4的dAMP(14)，以与实施例9类似的方式制备以及纯化该化合物。
实施例11：γ-(2-(N-(3-甲基咪唑
Figure BPA00001287222000272
))-乙基)-dCTP(28)的合成(图34)。使用来自实施例8的焦磷酸酯(25)和来自实施例3的dCMP(12)，以与实施例9类似的方式制备以及纯化该化合物。
实施例12：γ-(2-(N-(3-甲基咪唑))-乙基)-dGTP(29)的合成(图35)。使用来自实施例8的焦磷酸酯(25)和来自实施例5的dGMP(16)，以与实施例9类似的方式制备以及纯化该化合物。
实施例13：用于评价γ-取代的dNTP的终止性质的通用步骤，其中所述γ-取代的dNTP包含连接于碱基的银离子可裂解连接臂。用Therminator(NEB)DNA聚合酶进行的所有评价都呈3’→5’外切核酸酶阴性。使用3种类型的模板测试每种底物，其中N表示待评价终止性质的碱基的互补体，而靶标加下划线部分为引发位置：1)引发位置后紧接着一个正确碱基随后接不正确的碱基；2)引发位置后紧接着两个正确碱基随后接不正确的碱基；3)每个不正确碱基随后接正确的碱基然后接另外不正确的碱基。前两种引物用于显示掺入和终止，而第三组模板用于研究错误掺入。所有底物都通过毛细管电泳以及分析从荧光素标记的21M13引物延伸的0、1或2个碱基(引物的结合位置对应于以下所示的模板加下划线的部分)进行评价。1.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTNACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：7]2.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTNNACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：8]3.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTNTACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：9](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTNCACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：10](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTNGACTGGCCGTCGTTTTACA：[SEQ ID NO：11](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTNAACTGGCCGTCGTTTTACA：[SEQ ID NO：12]
模板以2μM终浓度预先与引物杂交。引物/模板杂交体的测定终浓度为40nM。
除非另外指出，否则底物以1μM终浓度和1μL适合的商用酶来测试，所述酶以制造商提供的浓度(通常是2-5U/μL，在由40mM Tris，pH 7.6，10mM DTT，10mM Mg2SO4和30mM异柠檬酸盐组成的2X缓冲液中)使用。每种缓冲液在最终测定中以1X使用。
一般而言，测定设定为10μL终容量并在65℃进行。终止性质在10分钟、30分钟及1小时时间点评价。每个反应结束时，吸取4mL反应混合物加入抗生蛋白链菌素包被的微量滴定板孔(Applied Biosystems产品号为4357279)中的25μL 0.5M EDTA以猝灭反应，从而捕获生物素标记的模板，以便纯化引物。微量滴定板在室温振摇10分钟。弃去过量液体，用包含0.1％Tween 20的4XSSC将微量滴定各孔洗涤3次。将微量滴定板短暂离心然后倒置以移除过量的缓冲液。为了从模板分离引物，20μL HiDi Formamide(Applied Biosystems产品号为4311320)与分子量大小梯(size ladder)(
Figure BPA00001287222000281
染料标记的SNPlexTM internal size standard(内部分子量大小标准))加入到各孔中。微量滴定板于50℃振摇下保温10分钟。将10mL HiDi Formamide溶液转移到96孔板(Applied Biosystems产品号为N8010560)，然后用96孔板隔片(Applied Biosystems Part No.4315933)覆盖。样品在带有36cm毛细管和POP6TM聚合物分离介质的AB3100XL上电泳分离。用
Figure BPA00001287222000291
软件或Peak ScannerTM软件分析峰，这两个软件都来自Applied Biosystems。
实施例14：γ-甲基-dUTP(26)的终止性质和错误掺入性质。按照实施例13的程序、利用以下模板来评价来自实施例9的底物：1.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTAACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：13]2.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTAAACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：4]3.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTATACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：14](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTAGACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：15]
终止性质显示于图21中，而错误掺入性质显示于图22中。图21显示10分钟后引物几乎完全消耗。在60分钟后没有观察到模板2的第二个A上有掺入，这表明γ-甲基-dUTP(26)的终止性质极佳。
实施例15：γ-苯甲基-dATP(27)的终止性质和错误掺入性质。按照实施例13的程序、利用以下模板来评价来自实施例10的底物。1.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTATACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：14]2.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTTACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：16]3.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTAACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：13](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTGACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：17](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTTCACTGGCCGTCGTTTTACAZ[SEQ ID NO：18]
终止性质和错误掺入性质显示于图36中。图36显示10分钟后引物几乎完全消耗，在60分钟后没有观察到模板2的第二个T上有掺入，这表明γ-甲基-dATP(27)的终止性质极佳。
实施例16：γ-咪唑
Figure BPA00001287222000301
-dCTP(28)的终止性质和错误掺入性质。按照实施例13的程序、利用以下模板来评价来自实施例11的底物。1.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTCGACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：19]2.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTGGACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：20]3.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTGAACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：21](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTGTACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：22](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTGCACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：23]
1μM[(28)]的终止性质和错误掺入性质显示于图37。由图37可见，(28)的活性相当低，一小时后观察到显著的(28)掺入，而在一小时后没有观察到(28)错误掺入。更高浓度的(28)的终止性质显示于图38中。由图38可见，在5μM[(28)]时引物在30分钟后完全耗尽，仅有一条延伸迹线超过GG模板上的第一个碱基。
实施例17：γ-咪唑
Figure BPA00001287222000302
-dGTP(29)的终止性质和错误掺入性质。按照实施例13的程序、利用以下模板来评价来自实施例12的底物。1.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTGCACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：23]2.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTCCACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：24]3.(BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTCAACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：25](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTCGACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：19](BIO-TEG)(C18)(C18)CCCCCCGTGTGTGCTCTACTGGCCGTCGTTTTACA[SEQ ID NO：26]
1μM[(29)]的终止性质和错误掺入性质显示于图39中。由图39可见，(29)的活性相当低，仅一小时后观察到(29)的显著掺入，而在一小时后没有观察到(29)错误掺入。更高浓度的(29)的终止性质显示于图40中。由图40可见，在4μM[(29)]时引物在1小时后完全耗尽，仅有一条延伸迹线超过CC模板上的第一个碱基。
虽然前述的说明书用提供用于说明的实施例讲述了本发明的原理，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可理解，在不偏离本发明的实际范围的情况下，可以进行各种形式上和细节上的改变。
Figure IPA00001287221600011
Figure IPA00001287221600041
Figure IPA00001287221600051
Figure IPA00001287221600061
Figure IPA00001287221600071
Figure IPA00001287221600081

Claims (34)

1.一种由以下式(I)代表的化合物：
Figure FPA00001287221900011
其中：
B是选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或他们各自的类似物的碱基；
L1是在碱基B和F间形成键的基团；
F是在L1和L2间形成键的杂原子；
L2就它与F的键合而言是化学上不稳定基团，且与R2成键；
L3就它与F的键合而言是化学上不稳定基团，且与R2成键；
R2是包含报道分子的基团；
R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应速率的基团，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前；
L2-R2防止向已掺入式(I)化合物的延伸中的寡核苷酸3’末端经模板定向聚合酶掺入反应掺入式(I)的化合物；
l是整数，及
m＝3l-1。
2.权利要求1的化合物，其中R1是选自以下基团的中性形式的有机取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或其阴离子或阳离子形式。
3.权利要求2的化合物，其中化学上不稳定基团L2的裂解留下连接于碱基的具有末端基团F的连接子残基部分。
4.权利要求3的化合物，其中末端基团F不是氨基。
5.权利要求3的化合物，其中末端基团F是羟基。
6.权利要求1的化合物，其中1是2或3。
7.权利要求1的化合物，其中该化合物具有下式(II)代表的结构：
Figure FPA00001287221900021
8.权利要求1的化合物，其中L2包含选自以下的化学上不稳定基团：-C(O)-S-；-C(O)O-；-CH-(SCH3)-Ph-和[RO]2P(O)S-；其中Ph是取代的苯基或取代的芳环；而其中R1是选自以下基团的中性形式的有机取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或其阴离子或阳离子形式。
9.权利要求2的化合物，其中L1在碱基与杂原子F之间形成永久键合，而L2在杂原子F和R2之间形成短暂键合。
10.权利要求9的化合物，其中杂原子是O、S或N。
11.权利要求9的化合物，其中L1包含下式代表的部分：
Figure FPA00001287221900022
12.权利要求9的化合物，其中L1包含下式代表的部分：
Figure FPA00001287221900023
13.权利要求9的化合物，其中L2-R2包含下式代表的部分：
Figure FPA00001287221900031
14.权利要求1的化合物，其中该化合物具有以下式(VI)代表的结构：
Figure FPA00001287221900032
其中“染料”代表报道分子。
15.权利要求1的化合物，其中化学上不稳定基团L2经Ag+活化从而裂解F-L2。
16.权利要求1的化合物，其中L2包含选自以下的部分：
Figure FPA00001287221900033
17.权利要求1的化合物，其中L2包含下式的部分：
Figure FPA00001287221900041
18.一种核酸测序方法，其包括以下步骤：
(a)将引物与靶多核苷酸杂交以形成引物-靶双链体，其中靶多核苷酸的3’或5’端连接于固相支持体；
(b)将引物-靶双链体与聚合酶以及一种或多种核苷酸类似物接触，从而掺入核苷酸类似物到引物的3’末端，由此形成延伸的引物链，其中所掺入的核苷酸类似物终止聚合酶反应，并且其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种包含：(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他们的类似物的碱基；(ii)通过可裂解连接子连接于碱基或其类似物的标记；(iii)脱氧核糖；和(iv)一个或多个磷酸基；其中所述标记为碱基特有的，并且其中多磷酸末端取代基、连接子和/或所述标记的组合抑制另一核苷酸类似物掺入到延伸的引物链的模板定向聚合酶掺入反应；
(c)洗涤固相支持体表面以移除未掺入的核苷酸类似物；
(d)检测连接于刚掺入的核苷酸类似物的特有标记，藉此识别刚掺入的核苷酸类似物；
(e)裂解刚掺入的核苷酸类似物与特有标记之间的可裂解连接子，从而允许另一核苷酸类似物掺入到延伸的引物链中；
(f)洗涤固相支持体表面以移除裂解的化合物片段；及
(e)重复步骤(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
19.权利要求18的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种具有以下式(I)代表的结构：
Figure FPA00001287221900051
其中：
B是选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或他们各自的类似物的碱基；
L1是在碱基B和F间形成键的基团；
F是在L1和L2间形成键的杂原子；
L2就它与F的键合而言是化学上不稳定基团，并且其与R2形成键；
L3就它与F的键合而言是化学上不稳定基团，并且其与R2形成键；
R2是包含报道分子的基团；
R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应速率的基团，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前；
L2-R2防止向已掺入式(I)化合物的延伸中的寡核苷酸3’末端经模板定向聚合酶掺入反应掺入式(I)的化合物；
l是整数，及
m＝3l-1。
20.权利要求19的方法，其中R1是选自以下基团的中性形式的有机取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或其阴离子或阳离子形式；L3是H，l是2，而m是5。
21.权利要求19的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物包含：第一核苷酸类似物，其中B是具有第一标记的腺嘌呤；第二核苷酸类似物，其中B是具有第二标记的鸟嘌呤；第三核苷酸类似物，其中B是具有第三标记的胞嘧啶；以及第四核苷酸类似物，其中B是具有第四标记的胸腺嘧啶。
22.权利要求21的方法，其中第一、第二、第三和第四标记的每一种都是荧光标记。
23.权利要求19的方法，其中R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应速率的基团，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前。
24.权利要求23的方法，其中R1是报道分子或猝灭剂。
25.权利要求1的化合物，其中R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端掺入核苷三磷酸的模板定向聚合酶掺入反应速率的基团，这种抑制发生在L2-R2从先前掺入事件裂解之前。
26.权利要求25的化合物，其中R1是报道分子或猝灭剂。
27.权利要求1的化合物，其中所述的化合物具有以下式(VI)代表的结构：
Figure FPA00001287221900061
其中R1不是H。
28.权利要求27的化合物，其中R1是选自以下基团的中性形式的有机取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或其阴离子或阳离子形式。
29.权利要求7的化合物，其中R1不是H。
30.权利要求29的化合物，其中R1是选自以下基团的中性形式的有机取代基：取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的芳族杂环、或其阴离子或阳离子形式。
31.权利要求18的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种具有以下式(II)代表的结构：
Figure FPA00001287221900071
其中R1不是H。
32.权利要求31的方法，其中R1是取代或未取代的烃基。
33.权利要求32的方法，其中R1是取代或未取代的甲基、炔丙基或苯甲基。
34.权利要求31的方法，其中所述一种或多种核苷酸类似物的每一种具有以下式(VI)代表的结构：
Figure FPA00001287221900072
其中R1不是H。
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