CN102106944A - 掌叶半夏蛋白治疗宫颈癌的用途及其制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及掌叶半夏蛋白治疗宫颈癌的用途及其制剂。该掌叶半夏蛋白为总蛋白，是通过提取掌叶半夏的块茎而得，具有抗宫颈癌活性，其活性明显强于5-氟尿嘧啶。本发明还涉及含有掌叶半夏蛋白的治疗宫颈癌的药物组合物。

Description

掌叶半夏蛋白治疗宫颈癌的用途及其制剂

技术领域

技术涉及中药制药领域，涉及掌叶半夏蛋白治疗宫颈癌的用途及其制剂。该掌叶半夏蛋白为总蛋白具有抗宫颈癌活性。本发明还涉及含有掌叶半夏蛋白的治疗宫颈癌的药物组合物。

背景技术

宫颈癌是通常发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，约占女性生殖系统恶性肿瘤50％以上，其病死率居妇女恶性肿瘤的首位，是女性最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织报道，世界每年新发现的宫颈癌45.9万例，仅次于乳腺癌，而我国每年新发现宫颈癌就有13.5万例，约占28.7％。调查发现，近年来宫颈癌发病有逐步年轻化趋势。

半夏为天南星科多年生草本植物，历版《中国药典》收载的半夏为(Pinelliaternata(Thunb)Briet)，半夏以干燥块茎入药，性温、味辛、有毒，是一种重要的中药材。据统计，在558种中药处方中，半夏使用频率居第22位。可用于燥热化痰，降逆止呕，消痞散结等。近年来的研究还发现，半夏具有抗肿瘤、抗生育、降血脂、护肝和治疗冠心病等多种重要的作用。半夏属植物全世界8种，我国产7种，其中6种为中国特有，我国半夏资源分布较广，除内蒙、新疆、青海、西藏未见野生外，其余各省均有分布，主产于四川、湖北、辽宁、河南、陕西、山西、安徽、江苏、浙江等地。其同科植物掌叶半夏(Pinelliapedatisec-ta Schott)，其块茎是全国多数省区习惯使用的中药天南星的主要来源，即虎掌南星，具有祛风定惊、化痰散结的功能。分为野生品种和家中品种。

掌叶半夏用于临床治疗“无名肿块”在我国已有上千年的历史，近代临床及药理研究均证实其确有一定的抗肿瘤作用。1970年上海医科大学附属妇产科医院曾用掌叶半夏汁等涂抹在患处，以治疗宫颈癌取得了良好的效果，故其一直被列为极有发展潜力的抗肿瘤中药之一。虽然其疗效较肯定，但其有效成分仍不明确，研究表明其主要成分含有淀粉，辣性物，掌叶半夏蛋白，苷类，酚类，甾醇类，脂肪酸类，无机元素，生物碱类等多种化学成分，早期的研究曾一度集中在脂溶性成分，认为β-谷甾醇是抗肿瘤主要有效成分，而其他药理作用和毒性作用则主要是各种生物碱所致。

1991年孙光星、丁声颂又发现掌叶半夏的总蛋白成份对小鼠肉瘤S-180瘤株具有明显的抑制作用。提示抗瘤部分可能是掌叶半夏蛋白。1999年朱铭伟、周抗美、丁声颂等研究中观察到掌叶半夏总蛋白对多种卵巢癌细胞株有明显抑制作用，证实了其抑瘤成分确实存在于总蛋白中。

目前以掌叶半夏为原料生产的制剂有，宫颈癌片、宫颈癌栓，其中宫颈癌片为掌叶半夏药材用75％乙醇提取、浓缩制得，宫颈癌栓为70％乙醇提取、浓缩后，加水沉淀，取沉淀物制得，从理化性质来看，二者都采用极性较小的脂溶性成分入药，近年的公开的专利披露了以掌叶半夏为原料或其提取物制备得到抗宫颈癌的药物，申请号CN2001100636.6的专利公开纳米宫颈癌制剂药物及其制备方法，申请号CN2001100636.6)公开宫颈癌滴丸及其制备方法，ZL200510056860.8公开纳米宫颈癌制剂药物及其制备方法，采用微波提取方法进行提取，对提取物采用超音速射流技术制成纳米微粒入药、而“宫颈癌滴丸及其制备方法”则采用与宫颈癌片相同的提取浓缩工艺制成滴丸，他们主要采用极性较小的成分进行入药，有效成分都不明确，但已有报道认为抗宫颈癌的活性成分是β-谷甾醇。目前未见掌叶半夏总蛋白用于治疗宫颈癌的报道。

对于宫颈癌目前没有疗效确切的治疗药物，而仍以放化疗、手术治疗为主，默沙东(Merck)药厂和葛兰素史克针对可能造成宫颈癌的HPV病毒，设计研制出加卫苗(Gardasil)和卉妍康疫苗两种预防宫颈癌的疫苗，但上述两种疫苗均有导致严重的副作用发生的报道。因此在对宫颈癌治疗方面，疗效可靠，安全性高的药物的出现显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的之一提供了一种掌叶半夏蛋白在制造治疗宫颈癌和胃癌药物中的运用。

本发明的目的之二提供了一种药物组合物，包含掌叶半夏蛋白，和药物上可接受的辅料或载体。

上述的药物组合物，其制剂形式可以是冻干粉针剂、外用凝胶剂、溶液剂。

上述的药物组合物，所说的外用凝胶剂、外用溶液剂，其给药途径为阴道给药。

上述的药物组合物，所说的外用凝胶剂，可以是普通凝胶剂，也可以是原位凝胶剂。

上述的药物组合物，所说的凝胶剂，其PH为3.5-5。

上述的药物组合物，所述的冻干粉针剂，其特征在于：其溶解后的PH值是5-8。

上述的药物组合物所说的溶液剂，其特征在于：其PH为3.5-5。

本发明的目的之三提供了含有掌叶半夏蛋白的药物组合物用于治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌的用途。

为实现本发明的目的，本发明所说的掌叶半夏蛋白是通过下列方法获得：该方法包括：

a)掌叶半夏药材在PBS溶液(即磷酸盐缓冲溶液)中匀浆处理，然后在0-10℃下浸泡5-20小时；

b)离心分离，取上层棕色清液，加入硫酸铵至硫酸铵浓度达30-75％，产生沉淀，于0-5℃环境中静置16-24小时；

c)再次低温离心分离，弃上层清液，得固形物；

d)将固形物溶于PBS溶液中，以PBS溶液过层析柱进行脱盐，收集检测波长280nm、吸收度大于1000mAU时的洗脱液，得到掌叶半夏蛋白溶液；

e)随意地，将掌叶半夏蛋白溶液进行冷冻干燥，得到掌叶半夏蛋白冻干制品。

在上述方法中，步骤a)进一步包括：所说的掌叶半夏药材为100g，将其在300mL-800ml(优选400-600ml)PBS溶液(也称为磷酸盐缓冲溶液)中用组织匀浆机匀浆处理，再加入PBS溶液100-600mL(优选200-400ml)，在2-6℃(优先4℃)浸泡9-15小时(优选12h)。

在上述方法中，进一步包括：步骤b)所说的离心分离，

在上述方法中，进一步包括：步骤b)所说的硫酸铵，其浓度为50-65％，静置环境温度在1-4℃，优选4℃，16-22小时，更优选19小时。

在上述方法中，进一步包括：步骤c)所说的离心分离，其转速为3000-7000rpm/分，优选4000-6000rpm/分；离心时间为10-30分钟，优选为15-20分钟。

在上述方法中，进一步包括：d)所说的固形物适量和PBS溶液溶解，以PBS溶液为流动相，过柱的流速为10ml/min。

在一优选实施方案中，本发明所说的掌叶半夏蛋白是通过下列方法获得：

将100g掌叶半夏药材在PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)400-600ml中匀浆处理，再加入同样的PBS溶液200-400ml，在2-6℃，优选4℃下浸泡10-13h；4000-6000rpm/分转速离心15-20分钟，取棕色上层清液；在清液中加入硫酸铵至硫酸铵的浓度为50-65％，产生沉淀，于1-4℃(优选4℃)下静置16-22小时，优选19小时，在4000-6000rpm/分转速条件下低温(0-5℃)离心15-20分钟，弃去上清液，得到固形物；将硫酸铵沉淀得到的固形物溶于适量的PBS溶液中，以PBS溶液为流动相过层析柱进行脱盐，流速10ml/min，检测波长280nm，收集吸收度大于1000mAU时的洗脱液，得到掌叶半夏蛋白溶液；随意地，可将掌叶半夏蛋白溶液采用冷冻干燥获得掌叶半夏蛋白冻干制品。将掌叶半夏蛋白溶液进行冷冻干燥达到长期保存目的。每100g掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物(冻干制品)为0.68-2.03g。

上述方法中，按本领域的常规知识，掌叶半夏药材的用量与PBS溶液的用量可适当变化或成比例放大或缩小。

本发明所说的掌叶半夏药材是指掌叶半夏的块茎，干的或新鲜的均可，最好是新鲜的。本发明所说的PBS溶液指的是磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4。本发明所说的掌叶半夏蛋白实质上是掌叶半夏总蛋白。

为了进一步确定实验得到掌叶半夏蛋白脱盐样品的蛋白质浓度及含量和糖浓度及含量，以刀豆蛋白为标准品进行了掌叶半夏蛋白中蛋白浓度及含量和糖浓度及含量测定。

仪器与材料；

680型酶标仪(美国Bio-Rad)；水浴锅(上海精宏试验设备仪器厂)移液器(德国eppendorf)；刀豆蛋白标准品(SIGMA试剂，北京欣经科生物技术有限公司)；Bradford蛋白定量试剂盒(包括考马斯亮蓝染色剂和小牛血清蛋白溶液，Tian Gen Biotech)；96孔板(Costar美国)；葡萄糖(分析纯，重庆北碚化学试剂厂)；苯酚(分析纯，成都科龙化工试剂厂)；浓硫酸(分析纯，重庆无机化学试剂厂)。

1)蛋白质含量测定

考马斯亮蓝染色法，标准蛋白为小牛血清白蛋白。

样品的配制；分别精密称取冷冻干燥后的样品约8mg，PBS缓冲液定容至10ml，分别精密移取脱盐后的约1ml，精密称取刀豆蛋白标准品CONA5.3mg，PBS缓冲液定容至10ml。

精密移取0、2、4、6、8、10、15ul标准牛血清白蛋白(1mg/ml)，以PBS溶液补足至15ul，加入考马斯亮蓝染色285ul，放置5分钟，在570nm测定吸光度，标准曲线为Y＝8.58X-0.0302，相关系数r＝0.998。同样方法测定样品液的蛋白浓度，并根据标准曲线计算其蛋白浓度，并根据下公式计算，结果见表1。

2)糖含量的测定

以苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准，以不同浓度的硫酸铵沉淀蛋白为样品。

样品的配制；分别精密称取冷冻干燥后的样品约8mg，PBS缓冲液定容至10ml，分别精密移取脱盐后的约1ml，精密称取刀豆蛋白标准品CONA5.3mg，PBS缓冲液定容至10ml。

精密移取0、200、400、600、800ul葡萄糖标准溶液，加入5％的苯酚水溶液1ml，水补足至5ml，混匀后迅速加入浓硫酸4ml，100℃水浴1小时，在490nm测定吸光度，标准曲线为Y＝0.0911X+0.241，相关系数r＝0.990。同样方法测定样品液的糖溶液，并根据标准曲线计算其糖浓度，结果见表1。

本发明的掌叶半夏蛋白，经过细胞活性筛选试验发现，掌叶半夏蛋白对于各期宫颈癌细胞均显示了很好的药理活性。本发明的掌叶半夏蛋白可开发成治疗宫颈癌的各种制剂，优其是阴道用制剂，如阴道凝胶剂或溶液剂，和冻干粉针制剂等。

在一具体实施方案中，本发明提供了一种治疗宫颈癌的药物组合物，包含掌叶半夏蛋白，和药物上可接受的辅料或载体。

在上述实施方案中，所述的药物组合物，其制剂形式优选冻干粉针剂、外用凝胶剂或溶液剂。

其中外用外用凝胶剂为阴道用凝胶剂，可以是普通凝胶剂，也可以是原位凝胶剂。溶液剂为阴道用溶液剂。

掌叶半夏蛋白普通凝胶剂主要由掌叶半夏蛋白、高分子基质材料、润滑剂、防腐剂、促渗透剂、稳定剂、PH值调节剂组成，其中掌叶半夏蛋白在凝胶剂含量中不限定任何特定范围，只要在有效剂量范围即可，可选为占制剂总重的0.3％-30％，优选为0.5％-20％，更优选为1％至15％(以掌叶半夏总蛋白计)。羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶或他们的任意组合，高分子基质材料用量占制剂总重量的0.5％至10％，优选为1％-5％；润滑剂选自甘油、丙二醇、透明质酸钠或他们的任意组合，润滑剂用量占制剂总重量的2.5％至30％优选为5％-20％；防腐剂选自尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、苯扎溴铵或他们的任意组合，防腐剂用量占制剂总重量的0.02％至1％，优选为0.1％-0.5％；促渗透剂选自薄荷脑、氮酮、丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、油酸或他们的任意组合，促渗透剂用量占制剂总重量优选为0.2％至5％，优选为0.5％-15％；稳定剂可选自EDTA、EDTA-2Na、EDTA-4Na、EDTA-2NaCa或他们的任意组合，稳定剂用量占制剂总重量优选为0.02％至1％，优选为0.1％-0.5％；PH值调节剂选自氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸氢钾、海藻酸、山梨酸、富马酸、酒石酸、苹果酸、枸橼酸、枸橼酸钠、三乙醇胺等，PH值调节剂用量以调节PH至3.5-5的量为准，余量为水。

上述掌叶半夏蛋白普通凝胶剂的制备方法为：将防腐剂、稳定剂溶解分散于润滑剂和促渗透剂的混合液中，然后将高分子材料分散于润滑剂和促渗透剂的混合液中，再将掌叶半夏蛋白溶液倒入上述的混合体系中搅拌、溶胀，在搅匀后，加水至规定量，搅拌均匀，即成凝胶剂。

掌叶半夏蛋原位凝胶剂，主要由掌叶半夏蛋白、原位凝胶化物质、增粘成分、润滑剂、药物、PH值调节剂、水组成。其中掌叶半夏蛋白在凝胶含量中不限定任何特定范围，只要在有效剂量范围即可，优选掌叶半夏蛋白的含量为占制剂总重量的0.3％至30％，优选为0.5％至20％，更优选为1％至15％(以掌叶半夏总蛋白计)；原位凝胶化物质选自泊洛沙姆、卡波姆、甲基纤维素或他们的任意组合，泊洛沙姆的分子量为1000-16000，其中包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆388、泊洛沙姆188，卡波姆分子量为1×10⁵-4×10⁶、甲基纤维素分子量为2×10⁴-38×10⁴，原位凝胶化物质用量占制剂总重量的0.1％至50％，优选为1％至20％；增粘高分子化合物选自黄原胶、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、壳聚糖、聚卡波非、聚羧乙烯、透明质酸钠、聚乙烯醇、聚维酮、海藻酸钠、聚乙烯醇、玻璃酸钠、吉冷胶中或他们的任意组合，增粘高分子化合物用量占制剂总重量为0％至10％，优选为1％至5％，加入增粘高分子化合物目的是为人体腔道表面添加保护层、延长药物在阴道表面的滞留时间。PH值调节剂选自氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸氢钾、海藻酸、山梨酸、富马酸、抗坏血酸、酒石酸、苹果酸、枸橼酸、枸橼酸钠、三乙醇胺等，来提高较高的缓冲能力，PH值调节剂以调节PH至3.5-5的量为准；润滑剂选自甘油、丙二醇、山梨醇或他们的任意组合，润滑剂用量占制剂总重量为0％至10％，优选为1％至5％。防腐剂选自苯甲酸、苯甲酸钠、苯扎氯铵、苯扎溴铵、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯或他们的任意组合防腐剂用量占制剂总重量为0.02％至1％，优选为0.1％至0.5％。余量用水补齐。

掌叶半夏蛋白原位凝胶剂的制备方法，将原位凝胶物质、增粘高分子材料分散于润滑剂中，将药物溶解在水中，在搅拌状态下将掌叶半夏蛋白液加入到分散好的原位凝胶物质、增粘高分子材料混合体系中，搅拌至溶解，用PH缓冲调节物质调节溶液PH值为3.5-5，溶液通过微孔滤膜过滤，加水至总量，取样进行质量检查，合格后，在无菌条件下分装至规定容器中，包装即得。

掌叶半夏蛋白溶液剂，主要由活性成分掌叶半夏蛋白和可药用辅料组成，其中掌叶半夏蛋白在外用制剂含量中不限定任何特定范围，只要在有效剂量范围即可，优选为占制剂总重的0.3％至30％，优选为0.5％-20％，最优选1％-15％(以掌叶半夏总蛋白计)，药用辅料溶液占制剂总重量的70％至99.7％，优选为80％至99％。其中药用辅料溶液可以选择水、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、乙二醇或几种的任意组合。

掌叶半夏蛋白溶液剂制备方法：

首先称取配方量的原料药、辅料加入全量注射用水的约90％，搅拌，使溶解完全；然后测定溶液的pH值，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH3.5-5；再次补加辅料溶液至全量；最后，除菌过滤、灌装、封口既得溶液剂。

掌叶半夏蛋白冻干粉针，主要由掌叶半夏总蛋白粉针含有作为活性成分的掌叶半夏蛋白与可药用辅料组成，其中掌叶半夏总蛋白在冻干粉针剂中的重量百分比可以是0.3-50％，优选为10-40％，更有选为20-30％；可药用的辅料可以选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸、或氢氧化钠、甘露醇、葡萄糖或他们的任意组合。

掌叶半夏蛋白冻干粉针的制备方法：

首先称取配方量的掌叶半夏药材、辅料加入全量注射用水的约90％，搅拌，使溶解完全，测定溶液的pH值，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH4-8。然后补加注射用水至全量，在上述溶液中加入0.05％的针用活性炭，搅拌30min后，滤除活性炭和不溶性杂质。必要时，可以重复操作。再采用0.22μm微孔滤膜进行除菌过滤，将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积。最后在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得掌叶半夏蛋白冻干粉针制剂。

本发明的掌叶半夏蛋白用于治疗宫颈癌，其用量范围为：注射100mg-1000mg/次，最好在210-750mg/次，外用0.3％-30％制剂，1-2次/天，本发明的含有掌叶半夏蛋白的药物组合物用于治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌。

具体实施方式

实施例1  掌叶半夏蛋白制备

仪器：冰箱(容声BCD-271)；组织匀浆机；CP224S分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；5804R高速冷冻离心机(eppendorf德国).

取清洗后的掌叶半夏药材100g，用pH 7.4的PBS溶液400mL组织匀浆机，以同样的PBS溶液200mL在4℃浸泡12h，以6000rpm/分转速离心15分钟，得棕色上清液605mL，加入硫酸铵至硫酸铵浓度达30％，进行沉淀，于冰箱4℃静置19小时，6000rpm/分低温离心15min，弃去上清液，将上面30％硫酸铵得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通过脱盐层析柱，以PBS溶液进行脱盐，流速10ml/min，检测波长280nm，当吸收度大于1000mAU时收集洗脱液。收集得到的硫酸铵沉淀的蛋白溶液，此溶液即为所得蛋白溶液，或者采用冷冻干燥工艺将将所得蛋白溶液进行冷冻干燥，得到固形物(冻干制品)，便于长期保存。100g掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物为0.68g。

实施例2  掌叶半夏蛋白制备

仪器：冰箱(容声BCD-271)；组织匀浆机；CP224S分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；5804R高速冷冻离心机(eppendorf德国)。

取清洗后的掌叶半夏药材100g，用pH 7.4的PBS溶液800mL组织匀浆机，以同样的PBS溶液100mL在2℃浸泡9h，以3000rpm/分转速离心30分钟，得棕色上清液910mL，加入硫酸铵至硫酸铵浓度达65％，进行沉淀，于冰箱2℃静置16小时，3000rpm/分低温离心30min，弃去上清液，将上面65％硫酸铵得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通过脱盐层析柱，以PBS溶液进行脱盐，流速10ml/min，检测波长280nm，当吸收度大于1000mAU时收集洗脱液。收集得到的硫酸铵沉淀的蛋白溶液，此溶液即为所得蛋白溶液，或者采用冷冻干燥工艺将将所得蛋白溶液进行冷冻干燥，得到固形物，便于长期保存。100g野生掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物为2.03g。100g家种掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物为0.81g。

实施例3  掌叶半夏蛋白制备

仪器：冰箱(容声BCD-271)；组织匀浆机；CP224S分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；5804R高速冷冻离心机(eppendorf德国).

取清洗后的掌叶半夏药材100g，用pH 7.4的PBS溶液300mL组织匀浆机，以同样的PBS溶液600mL在5℃浸泡15h，以7000rpm/分转速离心10分钟，得棕色上清液907mL，加入硫酸铵至硫酸铵浓度达55％，进行沉淀，于冰箱5℃静置22小时，7000rpm/分低温离心10min，弃去上清液，将上面55％硫酸铵得到的固形物溶于2ml的PBS溶液，通过脱盐层析柱，以PBS溶液进行脱盐，流速10ml/min，检测波长280nm，当吸收度大于1000mAU时收集洗脱液。收集得到的硫酸铵沉淀的蛋白溶液，此溶液即为所得蛋白溶液，进一步采用冷冻干燥工艺将所得蛋白溶液进行冷冻干燥，得到固形物，便于长期保存。100g野生掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物为2.10g。100g家种掌叶半夏经硫酸铵沉淀、脱盐后得固形物为0.76g。

实施例4  含有掌叶半夏蛋白0.3％的原位凝胶

取掌叶半夏蛋白0.3g，泊洛沙姆407 30g，泊洛沙姆188 20g，海藻酸4.0g、乳酸2g、柠檬酸1g，酒石酸钾0.4g、苯甲酸1％，氢氧化钠(调节PH值约3.5-5)，无菌蒸馏水至100％。

制法：分别将泊洛沙姆、掌叶半夏蛋白液、海藻酸预混，将乳酸、柠檬酸、苯甲酸、酒石酸钾溶解在50g水中，一边搅拌，一边将泊洛沙姆、海藻酸预混物加入到乳酸、柠檬酸、苯甲酸、酒石酸钾溶液中，用氢氧化钠调节PH值约3.5-5，持续搅拌30分钟，确保混合均匀。然后加水至100％，短时间搅拌混合物，静止。然后继续搅拌直到获得均匀的凝胶稠度。检验PH，在3.5-5范围内。

实施例5  含有掌叶半夏蛋白1％的原位凝胶

取掌叶半夏蛋白1g、卡波姆0.1g，羟丙甲纤维素0.4g、尼泊金甲酯0.01g、尼泊金丙酯0.01g、EDTA 0.02g、氮酮0.2g，甘油30g，氢氧化钠(调节PH值约3.5-5用量)，无菌蒸馏水至100％。

制法：首先将尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、EDTA分散，溶解在氮酮和甘油混合体系中，其次将取氢氧化钠溶解在20g水中，再次分别将卡波姆、羟丙甲纤维素在搅拌下缓慢加入尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油、氮酮、EDTA混合体系中，再将掌叶半夏蛋白液混合、分散于卡波姆、羟丙甲纤维素、甘油、氮酮体系中，一边搅拌，一边将氢氧化钠溶液加入到上述甘油体系中，调节PH值约3.5-5，持续搅拌30分钟，确保混合均匀。然后加水至100％，短时间搅拌混合物，静止。然后继续搅拌直到获得均匀的凝胶稠度。检验PH，在3.5-5范围内。

实施例6  含有掌叶半夏蛋白2.5％的原位凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品2.5g，泊洛沙姆407 20g，泊洛沙姆188 10g，海藻酸4.0g、肉豆蔻酸异丙酯15g、EDTA 1g、黄原胶3g、甘油30g、乳酸2g、柠檬酸1g，酒石酸钾0.4g、氢氧化钠(调节PH值约3.5-5)，无菌蒸馏水至100％。

制法：分别将泊洛沙姆、海藻酸预混后，在搅拌下缓慢加入甘油、肉豆蔻酸异丙酯、EDTA中，将乳酸、柠檬酸、酒石酸钾、掌叶半夏总蛋白冻干品溶解在20g水中，一边搅拌，一边将乳酸、柠檬酸、酒石酸钾、掌叶半夏蛋白冻干品溶液加入到上述甘油体系中，用氢氧化钠调节PH值约3.5-5，持续搅拌30分钟，确保混合均匀。然后加水至100％，短时间搅拌混合物，静止。然后继续搅拌直到获得均匀的凝胶稠度。检验PH，应在3.5-5范围内。

实施例7  含有掌叶半夏蛋白10％的原位凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品10g、卡波姆5g，聚乙烯吡咯烷酮1g、尼泊金甲酯0.02g、EDTA 0.02g、氮酮0.2g，甘油30g，氢氧化钠(调节PH值约3.5-5用量)，无菌蒸馏水至100％。

制法：首先将尼泊金甲酯、EDTA分散，溶解在氮酮和甘油混合体系中，其次将取氢氧化钠和掌叶半夏蛋白冻干品分别溶解在20g水中，再次分别将卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下缓慢加入尼泊金甲酯、甘油、氮酮、EDTA混合体系中，然后将掌叶半夏蛋白液分散于卡波姆、羟丙甲纤维素、甘油、氮酮体系中，一边搅拌，一边将氢氧化钠溶液加入到上述甘油体系中，调节PH值约3.5-5，持续搅拌30分钟，确保混合均匀。然后加水至100％，短时间搅拌混合物，静止。然后继续搅拌直到获得均匀的凝胶稠度。检验PH，应在3.5-5范围内。

实施例8  含有掌叶半夏蛋白30％的原位凝胶

掌叶半夏总蛋白冻干品30g，泊洛沙姆4075g，泊洛沙姆5g，透明质酸钠0.4g、甘油8g、尼泊金乙酯1％，氢氧化钠(调节PH值约3.5-5)，无菌蒸馏水至100％。

制法：分别将泊洛沙姆、羟丙甲纤维素、尼泊金乙酯、透明质酸钠混后，在搅拌下缓慢加入甘油中，将掌叶半夏蛋白和氢氧化钠分别溶解在20g水中，一边搅拌，一边将掌叶半夏总蛋白溶液加入到上述甘油体系中，用氢氧化钠调节PH值约3.5-5，持续搅拌30分钟，确保混合均匀。然后加水至100％，短时间搅拌混合物，静止。然后继续搅拌直到获得均匀的凝胶稠度。检验PH，在3.5-5范围内。

实施例9  含有掌叶半夏蛋白0.3％的凝胶

掌叶半夏总蛋白0.3g、卡波姆2.0g、丙二醇10g、EDTA-2Na 0.05g、氮酮0.2g、尼泊金甲酯0.1g、三乙醇胺适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将尼泊金甲酯分散溶解到氮酮、丙二醇、EDTA-2Na体系中，将卡波姆分散到上述体系中，取处方量的掌叶半夏蛋白液混合到卡波姆分散液中，加三乙醇胺调pH至透明粘稠状，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例10  含有掌叶半夏蛋白1％的凝胶

掌叶半夏蛋白1g、卡波姆5.0g、丙二醇10g、EDTA-2Na 0.02g、氮酮15g、尼泊金丙酯0.02g、三乙醇胺适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、丙二醇、EDTA-2Na体系中，将卡波姆分散到上述体系中，取处方量的掌叶半夏蛋白液混合到卡波姆分散液中，加三乙醇胺调pH至透明粘稠状，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例11  含有掌叶半夏蛋白2.5％的凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品2.5g、卡波姆10g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、甘油30g、EDTA-2Na0.05g、氮酮15g、尼泊金丙酯0.2g、三乙醇胺适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、甘油、EDTA-2Na体系中，将卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮分散到上述体系中，取处方量掌叶半夏总蛋白冻干品用20g水溶解，将掌叶半夏蛋白液混合到卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮分散液中，然后加入三乙醇胺，调pH至3.5-5之间，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例12  含有掌叶半夏蛋白10％的凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品10g、羧甲基纤维素钠5g、甘油2.5g、EDTA-2Na 0.05g、氮酮5尼泊金丙酯0.2g、酒石酸适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将尼泊金丙酯分散溶解到氮酮、EDTA-2Na、甘油体系中，将羧甲基纤维素钠分散到上述体系中，取将酒石酸用20g水溶解，取处方量掌叶半夏蛋白冻干品用20g水溶解，将掌叶半夏总蛋白液混合到羧甲基纤维素钠分散液中，然后加入酒石酸液，调pH至3.5-5之间，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例13  含有掌叶半夏总蛋白30％的凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品30g、羧甲基纤维素钠2g、羟丙基纤维素1.5g、甘油15g、EDTA-2Na 0.05g、氮酮5g、苯扎溴铵0.5ml、酒石酸适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素分散到氮酮、甘油、EDTA-2Na体系中，取将酒石酸用20g水溶解，取处方量掌叶半夏总蛋白冻干品用20g水溶解，将掌叶半夏蛋白液混合到羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素分散液中，然后加入酒石酸液，调pH至3.5-5之间，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例14  含有掌叶半夏蛋白15％的凝胶

掌叶半夏蛋白冻干品15g、羧甲基纤维素钠0.5g、甘油2.5g、EDTA 1g、氮酮5g、尼泊金甲酯1g、柠檬酸适量(调PH至3.5-5的量)蒸馏水加至100g。

制法：将尼泊金甲酯分散溶解到氮酮、甘油、EDTA体系中，将羧甲基纤维素钠分散到上述体系中，取将柠檬酸用20g水溶解，取处方量掌叶半夏蛋白冻干品用20g水溶解，将掌叶半夏总蛋白液混合到羧甲基纤维素钠分散液中，然后加入柠檬酸液，调pH至3.5-5之间，最后加蒸馏水至足量，分装即可。

实施例15  含有掌叶半夏蛋白0.3％的冻干粉针剂

处方：

掌叶半夏蛋白        0.3g

氯化钠              0.5g

枸橼酸              0.15g

枸橼酸钠            0.15g

甘露醇              8g

HCl或NaOH溶液       适量

                                               

                    加入注射用水至100ml

制法：将西林瓶用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，180℃的烘箱内干热灭菌2小时，避菌保存，备用；将注射用局部覆聚四氟乙烯膜卤化丁基橡胶塞用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，湿热灭菌，避菌晾干；称取配方量的掌叶半夏蛋白、氯化钠、甘露醇、枸橼酸钠、枸橼酸加入全量注射用水的约90％，搅拌，使溶解完全；测定溶液的pH值，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH4-8；补加注射用水至全量；在上述溶液中加入0.05％的针用活性炭，搅拌30min；滤除活性炭和不溶性杂质。必要时，可以重复操作；除菌过滤。必要时，可以重复操作；将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积；在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得掌叶半夏蛋白冻干粉针制剂。

实施例16  含有掌叶半夏蛋白20％的冻干粉针剂

处方：

掌叶半夏蛋白        20g

氯化钠              0.5g

磷酸二氢钾          0.25g

HCl或NaOH溶液       适量

                                                   

                    加入注射用水至100ml

                                                         

制法：将西林瓶用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，180℃的烘箱内干热灭菌2小时，避菌保存，备用；将注射用局部覆聚四氟乙烯膜卤化丁基橡胶塞用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，湿热灭菌，避菌晾干；称取配方量的掌叶半夏蛋白、氯化钠、磷酸二氢钾加入全量注射用水的约90％，搅拌，使溶解完全；测定溶液的pH值，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH4-8；补加注射用水至全量；在上述溶液中加入0.05％的针用活性炭，搅拌30min滤除活性炭和不溶性杂质。必要时，可以重复操作；除菌过滤。必要时，可以重复操作；将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积；在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得掌叶半夏蛋白冻干粉针制剂。

实施例17  含有掌叶半夏蛋白50％的冻干粉针剂

处方：

掌叶半夏蛋白        50g

氯化钠              0.5g

磷酸二氢钠          0.2g

HCl或NaOH溶液       适量

                                                  

                    加入注射用水至100ml

                                                          

制法：将西林瓶用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，180℃的烘箱内干热灭菌2小时，避菌保存，备用；将注射用局部覆聚四氟乙烯膜卤化丁基橡胶塞用纯化水清洗，再用注射用水冲洗干净，湿热灭菌，避菌晾干；称取配方量的掌叶半夏蛋白、氯化钠、磷酸二氢钠加入全量注射用水的约90％，搅拌，使溶解完全；测定溶液的pH值，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH4-8；补加注射用水至全量；在上述溶液中加入0.05％的针用活性炭，搅拌30min；滤除活性炭和不溶性杂质。必要时，可以重复操作；除菌过滤。必要时，可以重复操作；将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积；在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得掌叶半夏蛋白冻干粉针制剂。

实施例18  含有掌叶半夏蛋白0.3％的溶液剂

掌叶半夏蛋白        0.3g

药用乙醇            10g

无菌注射用水        加至l00ml

制法：将药用乙醇和注射用水混合成注射溶媒，取80ml溶媒将处方量的掌叶半夏蛋白溶解，测定PH，调节PH至3.5-8，加混合溶媒至100ml，用0.22微米微孔滤膜过滤除菌，在局部百级以下灌封、灯检、包装、成品检验、入库。

实施例19  含有掌叶半夏蛋白20％的溶液剂

处方：

掌叶半夏总蛋白        20g

无菌注射用水          加至100ml

制法：取80ml注射用水将处方量的掌叶半夏蛋白溶解，测定PH，调节PH至3.5-8，加混合溶媒至100ml，用0.22微米微孔滤膜过滤除菌，在局部百级以下灌封、灯检、包装、成品检验、入库。

实施例20  含有掌叶半夏蛋白30％的溶液剂

处方：

掌叶半夏蛋白        30g

丙二醇              25g

无菌注射用水        加至100ml

制法：将药用丙二醇和注射用水混合成注射溶媒，取80ml溶媒将处方量的掌叶半夏蛋白溶解，测定PH，调节PH至3.5-8，加混合溶媒至100ml，用0.22微米微孔滤膜过滤除菌，在局部百级以下灌封、灯检、包装、成品检验、入库。

实施例21  掌叶半夏蛋白中蛋白浓度及含量和糖浓度及含量测定

680型酶标仪(美国Bio-Rad)；水浴锅(上海精宏试验设备仪器厂)移液器(德国eppendorf)；刀豆蛋白标准品(SIGMA试剂，北京欣经科生物技术有限公司)；Bradford蛋白定量试剂盒(包括考马斯亮蓝染色剂和小牛血清蛋白溶液，Tian Gen Biotech)；96孔板(Costar美国)；葡萄糖(分析纯，重庆北碚化学试剂厂)；苯酚(分析纯，成都科龙化工试剂厂)；浓硫酸(分析纯，重庆无机化学试剂厂)。

1)蛋白质含量测定

考马斯亮蓝染色法，标准蛋白为小牛血清白蛋白。

样品的配制；分别精密称取冷冻干燥后的样品约8mg，PBS缓冲液定容至10ml，分别精密移取脱盐后的约1ml，精密称取刀豆蛋白标准品CONA5.3mg，PBS缓冲液定容至10ml。

精密移取0、2、4、6、8、10、15ul标准牛血清白蛋白(1mg/ml)，以PBS溶液补足至15ul，加入考马斯亮蓝染色285ul，放置5分钟，在570nm测定吸光度，标准曲线为Y＝8.58X-0.0302，相关系数r＝0.998。同样方法测定样品液的蛋白浓度，并根据标准曲线计算其蛋白浓度，并根据公式结果见表2。

2)糖含量的测定

以苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准，以不同浓度的硫酸铵沉淀蛋白为样品。

样品的配制；分别精密称取冷冻干燥后的样品约8mg，PBS缓冲液定容至10ml，分别精密移取脱盐后的约1ml，精密称取刀豆蛋白标准品CONA5.3mg，PBS缓冲液定容至10ml。

精密移取0、200、400、600、800ul葡萄糖标准溶液，加入5％的苯酚水溶液1ml，水补足至5ml，混匀后迅速加入浓硫酸4ml，100℃水浴1小时，在490nm测定吸光度，标准曲线为Y＝0.0911X+0.241，相关系数r＝0.990。同样方法测定样品液的糖溶液，并根据标准曲线计算其糖浓度，结果见表2。

表1  掌叶半夏蛋白中蛋白浓度及含量、糖浓度及含量测定结果

样品来源	蛋白浓度(mg/ml)	糖浓度(mg/ml)	蛋白含量(％)	糖含量(％)	蛋白/糖	备注
							实施例2	5.023	0.184	21.74	1.64	13.3	家种掌叶半夏65％硫酸铵沉淀
实施例3	6.377	0.237	24.92	1.83	13.6	家种掌叶半夏55％硫酸铵沉淀
							实施例2	11.972	0.927	31.89	5.02	6.35	野生掌叶半夏65％硫酸铵沉淀
实施例3	13.460	0.734	31.84	5.03	6.33	野生掌叶半夏55％硫酸铵沉淀
							ConA	0.0717		15			SIGMA试剂，国内分装
实施例2	4.211	0.0183	18.23	1.19	15.3	家种掌叶半夏65％硫酸铵沉淀，冻干后
							实施例3	2.904	0.0393	22.78	4.62	4.93	家种掌叶半夏55％硫酸铵沉淀，冻干后
实施例2	2.849	0.037	22.61	4.41	5.13	野生掌叶半夏65％硫酸铵沉淀，冻干后
							实施例3	2.944	0.0367	22.56	4.22	5.35	野生掌叶半夏55％硫酸铵沉淀，过滤后冻干

实施例22  掌叶半夏蛋白的体外抗宫颈癌细胞、胃癌细胞活性测试。

实验材料与试剂

肿瘤细胞：人子宫颈癌细胞Hela、人胃癌细胞SGC-7901均购自上海中科院细胞所。

试剂：Dulbecoo’s Modified Eagle’s Medium(DMEM，高糖)：Gibco公司，

Cat No.12800-017，Lot No.432481；胎牛血清(FBS)：四季青公司，批号：081030；

非必需氨基酸(NEAA)：Hyclone公司，Cat No.SH30238.01，Lot No.ATG32414；

胰酶：Gibco公司；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(3-(4，5-Dimethythiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)：sigma公司；二甲基亚砜(DimethylSulphoxide)：Sigma公司；台盘蓝：Sigma公司，Lot No.200907；5-氟尿嘧啶注射液：规格：10ml：0.25g，批号：080815。

样品配制：

S₁(样品来源于实施例2，家种品掌叶半夏提取蛋白)，S₂(样品来源于实施例2，野生品掌叶半夏提取蛋白)，S₃(样品来源于实施例2，野生品掌叶半夏提取蛋白的冻品)，三个样品。

实验步骤

样品配制：

S1和S2的原始浓度分别为13mg/ml和11mg/ml。S3为粉针剂，加10mlPBS溶解后的浓度为11.97mg/ml。以上三种样品均用PBS稀释成浓度为10mg/ml的储备液，0.22μm过滤后分装备用。根据预实验结果确定三种样品的试验终浓度均为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，10μg/ml和2.5μg/ml。

细胞株的培养、复苏及传代：

人胃癌细胞SGC-7901培养于含有10％FBS的DMEM中，在37℃饱和湿度，5％CO₂培养箱中培养。

Hela细胞培养于含有10％FBS的DMEM中，另含1％NEAA，在37℃饱和湿度，5％CO₂培养箱中培养。

细胞复苏培养：从液氮中取出冻存保种的细胞，迅速置于37℃水浴复温融化，在超净工作台内用培养基洗涤2次。然后用完全培养基于37℃饱和湿度，5％CO₂培养箱中。

贴壁生长细胞的传代：从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基后，用磷酸盐缓冲液(PBS0.01M，pH7.2)洗2次，加入0.25％的胰酶消化，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，1000prm，离心5min，细胞沉淀用PBS洗涤一次后再用完全培养基重悬，吹打均匀后分瓶培养。一般3-4天传代1次。

MTT试验

取对数生长期的人宫颈癌hela细胞、人胃癌细胞SGC-7901以1×10⁵个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。试验设空白对照组、实验对照组、阳性对照组为5-氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶的终浓度分为为1000μg/ml，100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml)及不同浓度给药组，每组设6个平行孔，37℃、5％CO₂培养箱内培养24h后，加入配制好的各剂量药物100μl/孔，各给药组的药物终浓度分别为160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，10μg/ml和2.5μg/ml。实验对照组只加培养液，与实验对照组平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。连续培养48h后，加入MTT液20μl(5mg/ml)，孵育4h，吸弃上清，每孔加入二甲亚砜150μl，振荡使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在多功能酶标仪上测定各孔吸光度OD值，记录实验结果。实验重复3-4次，取其平均值作为实验结果。按下式计算抑制率，并采用SPSS 13.0统计分析软件应用Logit法计算半数抑制浓度IC₅₀值。

肿瘤细胞生长抑制率(CI)＝[1-(给药组OD值-空白对照组OD值)/(实验对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％

实验结果

S₁，S₂和S₃三个样品在体外对Hela细胞的生长抑制作用通过MTT实验验证。每个样品抑制Hela细胞的MTT实验均重复3-4次以上。实验结果显示，掌叶半夏蛋白3种样品均有一定体外抗肿瘤活性，其中S₂样品抗肿瘤活性相对较强。在MTT实验中，加入几个受试样品或5-FU，培养48小时后，对Hela细胞产生明显的细胞毒性作用，表现为细胞形态凝缩成团，失去正常细胞结构，并逐渐脱落死亡。加入MTT培养并以DMSO溶解形成的甲臜，受试药物(尤其S₂样品)组明显颜色更浅。S₂样品对人胃癌细胞SGC-7901的IC₅₀平均约为132.17μg/ml，说明该样品对胃癌细胞也具有一定的抑制作用。

各实验组实验结果：

几次MTT试验结果汇总及IC₅₀(表2)

表2：S₂对hela细胞的生长抑制作用

表3：S₁对hela细胞的生长抑制作用

表4：S₃对hela细胞的生长抑制作用

表5：氟尿嘧啶对hela细胞的生长抑制作用

表6S₂对人胃癌细胞SGC-7901的生长抑制作用

上述MTT实验结果(图2、3、4、5、6)表明，40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml的掌叶半夏蛋白提取物S₂样品对Hela宫颈癌细胞具有抑制活性(抑制率＞50％)，80μg/ml、160μg/ml的掌叶半夏蛋白提取物S₁、S₃样品对Hela宫颈癌细胞具有抑制活性。S₂，S₁和S₃3个样品抑制Hela细胞的IC₅₀分别为26.056μg/ml，74.423和69.987μg/ml。5-FU抑制Hela细胞的IC₅₀为61.940μg/ml。表明S₂样品对Hela细胞的抑制作用明显强于样品S₁和S₃。S₁和S₃抑制Hela细胞的作用与5-FU相当，而S₂明显强于5-FU。S₂样品对人胃癌细胞SGC-7901的IC₅₀平均约为132.17μg/ml，说明掌叶半夏蛋白对胃癌细胞也具有一定的抑制活性。

从实施例22的结果可知，掌叶半夏蛋白具有较高的抗宫颈癌活性，且强于5-氟尿嘧啶，可用于治疗宫颈癌。

Claims (10)

1.掌叶半夏蛋白在制造治疗宫颈癌和胃癌药物中的运用。

2.如权利要求1所述的运用，所说的掌叶半夏蛋白由下述方法制得，该方法包括：

a)掌叶半夏药材在PBS溶液中匀浆处理，然后在温度为0-10℃下浸泡5-20小时；

b)离心分离，取上层棕色清液，加入硫酸铵至硫酸铵浓度达30-75％，进行沉淀，于0-5℃环境中静置12-24小时；

c)再次低温离心分离，弃上层清液，得固形物；

d)将固形物溶于PBS溶液中，以PBS溶液过层析柱进行脱盐，收集检测波长280nm，

吸收度大于1000mAU时的洗脱液，得到掌叶半夏蛋白溶液；

e)随意地，将掌叶半夏蛋白溶液进行冷冻干燥，得到掌叶半夏蛋白冻干制品。

3.一种药物组合物，包含掌叶半夏蛋白，和药物上可接受的辅料或载体。

4.根据权利要求3所述的组合物，其制剂形式可以是冻干粉针剂、外用凝胶剂、溶液剂；

5.根据权利要求4所述的组合物，所说的外用凝胶剂、外用溶液剂，其给药途径为阴道给药；

6.根据权利要求4所述的组合物，所说的外用凝胶剂，可以是普通凝胶剂，也可以是原位凝胶剂。

7.根据权利要求4所述的组合物，所说的凝胶剂，其PH为3.5-5。

8.根据权利要求4所述的组合物，所述的冻干粉针剂，其特征在于：其溶解后的PH值是5-8。

9.根据权利要求4所述的组合物，所说的溶液剂，其特征在于：其PH为3.5-5。

10.权利要求3-9中任一所述的组合物，用于治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌的用途。