CN102106864B - 淫羊藿苷在制备拮抗髓系衍生抑制性细胞药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物制备领域。涉及淫羊藿苷在制备拮抗髓系衍生抑制性细胞，调节肿瘤免疫药物中的应用。本发明采用淫羊藿苷干预荷乳腺癌和黑色素瘤小鼠。结果表明：淫羊藿苷体外未显示细胞毒作用，体内则显示了较强的抗肿瘤作用；淫羊藿苷抗肿瘤作用与其抗髓系衍生抑制性细胞，提高IFN-r，调节肿瘤免疫有关。本发明为制备调节肿瘤免疫的药物，尤其为拮抗髓系衍生抑制性细胞提供了一种新的途径和手段。可进一步制备抗髓系衍生抑制性细胞的药物组合物，用于治疗和黑色素瘤，但不局限于上述两种肿瘤的治疗。
Description
技术领域
本发明属药物制备领域。涉及淫羊藿苷的医药新用途，具体涉及淫羊藿苷在制备调节肿瘤免疫药物中的应用，尤其涉及淫羊藿苷在制备拮抗髓系衍生抑制性细胞(MDSC)药物中的应用。
背景技术：
髓系衍生抑制性细胞(MDSC)是有关研究新近发现的一群细胞，研究结果显示其与肿瘤免疫逃逸密切相关。MDSC通常在鼠中表达髓系抗原CD11b和Gr1(CD11b+Gr1+)，在人体也同样表现为髓系来源，呈CD34+CD33+CD13+。研究显示，MDSC的免疫抑制作用与两种精氨酸代谢酶：1型精氨酸酶(ARN一1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)密切相关。前者可转换精氨酸成尿素和L-鸟氨酸，L-鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶作用形成多胺，它是细胞生长和分化的基本营养成分，可能被MDSC和肿瘤细胞生长消耗掉，而使得T细胞无法利用L-鸟氨酸以便完成自身的增殖和分化。所述的NO很可能通过抑制激活的T细胞进入细胞周期而抑制T细胞增殖。
慢性炎症与免疫抑制密切相关，环氧合酶2(COX2)通过其下游的PGE2经由MDSC的EP4受体促进1型精氨酸酶产生，iNOS通过其下游的NO释放促进MDSC精氨酸代谢。研究证实，抗炎药物COX2抑制剂和iNOS抑制剂通过阻断上述途径，降低MDSC的生物学效应。中国专利200510042326.1发现式(I)化学结构的淫羊藿苷可有效拮抗内毒素血症。因此，本发明拟观察天然抗炎药物淫羊藿苷对荷乳腺癌及黑色素瘤鼠脾脏MDSC及T淋巴细胞活化相关因子IFN-r的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供淫羊藿次苷的新的药用用途，具体涉及淫羊藿苷在制备调节肿瘤免疫药物中的应用，尤其涉及淫羊藿苷在制备拮抗髓系衍生抑制性细胞(MDSC)药物中的应用。
本发明采用式(I)的淫羊藿苷进行体内和体外干预乳腺癌4T1和黑色素瘤B16实验。实验结果显示，淫羊藿苷对4T1和B16细胞不显示细胞毒作用；体内结果显示，淫羊藿苷可显著减少荷4T1小鼠肿瘤体积；给予淫羊藿苷干预后，脾脏淋巴细胞分泌IFN-r明显增加，MDSC数量明显减少；结果表明，淫羊藿苷可通过抑制MDSC，促进IFN-r分泌，能调节肿瘤免疫，进而在体内显示抗肿瘤作用。
本发明所述的淫羊藿苷可进一步加以合适的药学上可接受的载体制备调节肿瘤免疫的药物。尤其制备拮抗髓系衍生抑制性细胞(MDSC)的药物。
本发明中，所采用的实验用细胞株为可市购生物材料。
本发明中，采用本领域已知的常规试验方法进行上述的小鼠黑色素瘤细胞株(B16)和乳腺癌4T1干预实验。
本发明的淫羊藿苷新的药用用途，为制备调节肿瘤免疫的药物，尤其为拮抗髓系衍生抑制性细胞(MDSC)提供了一种新的途径和手段。
本发明的研究也证实了淫羊藿苷的抗炎作用。
本发明的淫羊藿苷可进一步加以药物学上可接受的载体制备抗髓系衍生抑制性细胞的药物组合物，用于治疗和黑色素瘤，但不局限于上述两种肿瘤的治疗。
附图说明
图1是淫羊藿苷对4T1和B16细胞增殖的影响，其中，
A为4T1细胞，B为B16细胞，DMSO为空白对照组，ICA为淫羊藿苷缩写，淫羊藿苷浓度单位为μM。
图2为淫羊藿苷对荷4T1和B16肿瘤小鼠肿瘤体积的影响，其中，
A为荷4T1肿瘤小鼠，B为荷B16肿瘤小鼠，肿瘤体积计算公式：V＝0.5×a×b2，其中a和b分别为肿瘤体积最长径和最短径，肿瘤体积单位为mm3、D代表小鼠种瘤后天数，ICA为淫羊藿苷缩写，淫羊藿苷腹腔注射剂量为100mg/kg，每周3次。
图3为淫羊藿苷对荷4T1和B16肿瘤小鼠脾脏分泌IFN-r的影响，其中，A为荷4T1肿瘤小鼠，B为荷B16肿瘤小鼠，百分率是指IFN-r阳性细胞占脾脏淋巴细胞的百分比，
代表空白对照组，DMSO代表荷瘤对照组，ICA代表淫羊藿苷组，淫羊藿苷腹腔注射剂量为100mg/kg，每周3次。
图4为淫羊藿苷对荷4T1和B16肿瘤小鼠脾脏MDSC的影响，
其中，A为荷4T1肿瘤小鼠，B为荷B16肿瘤小鼠，百分率是指IFN-r阳性细胞占脾脏淋巴细胞的百分比，
代表空白对照组，DMSO代表荷瘤对照组，ICAH代表淫羊藿苷组，淫羊藿苷腹腔注射剂量为100mg/kg，每周3次。
具体实施方式
实施例1：淫羊藿苷拮抗小鼠乳腺癌及黑色素瘤MDSC实验
一、材料与方法：
1.细胞株：小鼠乳腺癌细胞株(4T1)和黑色素瘤细胞株(B16)购自ATCC。用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、体积分数为5％C02、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化传代，2～3d传代1次，实验选用对数生长期细胞。
2.实验动物：BALB/c小鼠，雌性，8周龄，分笼饲养，每笼4只。4T1和B16荷瘤小鼠2，雌性。饲养环境室温20℃～25℃，相对湿度为50％～70％，光暗周期为12h。
3.药品与主要试剂：淫羊藿苷(购自上海融禾医药公司，HPLC纯度大于98％)；CD11b、Grl、IFN-r流式抗体(美国ebioscience公司产品)
4.4T1和B16细胞活性的检测：
分别调整4T1和B16细胞悬液浓度为1×105/mL，加入96孔培养板内，每孔100μL，置37℃5％CO2孵箱培养24h。吸除旧培养液，分别加入含淫羊藿苷的RPMI1640培养基(药物浓度为1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L 3个剂量组)，空白组加含0.1％DMSO的培养基，每组均设6复孔，继续培养22h。加入10μL CCK-8溶液，培养2h。在490nm处检测各孔的吸光值(OD值)。实验重复3遍以上。
5.动物模型制备与分组给药：
将2只4T1和2只B16荷瘤小鼠分别脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，剪碎、研磨、过筛，制备肿瘤单细胞悬液，调整细胞浓度为2×106/ml。将BALB/c小鼠于背部皮下接种肿瘤单细胞悬液，每只0.2mL(约含4×105个肿瘤细胞，空白组注射生理盐水)。待肿瘤长至肉眼可见时，即将荷瘤鼠随机分为2组：荷瘤对照组和淫羊藿苷组，另设空白对照组，每组8只。淫羊藿苷组给予淫羊藿苷100mg/kg腹腔注射，每周3次。荷瘤对照组和空白对照组给予相同生理盐水腹腔注射，每周3次测量肿瘤的最长径a与最短径b，根据公式计算肿瘤体积：V＝0.5×a×b2，荷黑色素瘤鼠第21天处死，荷乳腺癌鼠第28天处死，并分离小鼠脾脏。
6.脾脏髓系抑制细胞(MDSC)的流式检测
将小鼠脾脏按组别堆放在一起，用冰预冷的PBS冲洗，剪碎、研磨、过筛后获得单细胞悬液，离心后取沉淀，按照体积比1∶10加入红细胞裂解液，室温静置5分钟，PBS洗一次，含5％胎牛血清的PBS重悬，调整细胞浓度为1×107/mL，取100u l加入0.25μL APC标记的CD11b抗体和0.02μLPE标记的Gr1抗体，混匀，室温，避光20min，加PBS 2mL，离心，1000rpm，5mi n，弃上清，300μL PBS重悬，采用流式细胞仪检测。每个样本分析20000个细胞，计算CD11b+Gr1+细胞百分比(即MDSC百分比)。
7.脾脏IFN-r阳性细胞的流式检测
小鼠脾脏单细胞悬液制备方法如上，调整细胞浓度为1×107/mL，取100ul加入无菌流式管内，每管加入Her2peptide，37℃培养箱内培养2h后，加入BFA并调整培养基体积为1mL，继续培养14h后，加入冰预冷的PBS终止反应，经固定和破膜后加入APC标记的IFN-r，置冰上避光30min，PBS洗两遍后上机检测。
实验结果显示：
与空白组相比，淫羊藿苷各个浓度对4T1和B16细胞增殖无明显影响(P＞0.05)(图1)。表明淫羊藿苷对4T1和B16细胞不显示细胞毒作用。
体内结果显示，与荷瘤对照组相比，淫羊藿苷可显著减少荷4T1小鼠肿瘤体积(图2)。
淫羊藿苷在体外对肿瘤细胞未显示出细胞毒作用，而体内显示出较好的抗肿瘤作用。推测淫羊藿苷的抗肿瘤作用与提高免疫有关。研究显示，荷4T1肿瘤小鼠与空白对照组相比，脾脏淋巴细胞分泌IFN-r明显减少(图3)。给予淫羊藿苷干预后，与荷瘤对照组相比，脾脏淋巴细胞分泌IFN-r明显增加。该结果提示淫羊藿苷具有提高免疫的作用。
研究发现，淫羊藿苷体内具有抗肿瘤作用，该作用与升高IFN-r水平提高免疫有关。淫羊藿苷升高IFN-r水平的具体机制不清。MDSC是新近发现的一群细胞，通过分泌精氨酸代谢酶等途径抑制T淋巴细胞的活化，降低IFN-r的分泌。因此本发明通过对淫羊藿苷对荷瘤鼠脾脏MDSC的影响观察，结果显示，空白对照组脾脏MDSC数量较少，荷瘤对照鼠MDSC数量明显增加，给予淫羊藿苷干预后，MDSC数量明显减少(图4)。结果表明，淫羊藿苷可通过抑制MDSC，促进IFN-r分泌，进而在体内显示了抗肿瘤作用。
Claims (1)
1.淫羊藿苷作为唯一活性成分在制备抗髓系衍生抑制性细胞药物中的用途，所述的淫羊藿苷具有式（Ⅰ）的结构，
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