CN102105070A

CN102105070A - 用作味道调节剂的环脂肽

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Publication number: CN102105070A
Application number: CN2009801294245A
Authority: CN
Inventors: M·克罗恩; H·津克
Original assignee: Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Current assignee: Celanese Sales Germany GmbH
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2011-06-22
Also published as: EP2299848A1; KR20110036051A; BRPI0914247A2; US20110256291A1; AU2009262529A1; CA2728862A1; RU2011102132A; MX2010014495A; IL210157A0; WO2009156112A1; JP2011525362A

Abstract

本发明涉及一种或多种环脂肽(如枯草菌表面活素A、B1和C及其衍生物和混合物)作为味道调节剂和/或甜味增强剂用于含有至少一种天然或人造甜味剂的可食组合物的用途。可食组合物包括食品、饮料、药品和化妆品，并且优选含有单糖、双糖或寡糖作为甜味剂。本发明进一步涉及所述含有环脂肽作为味道调节剂的可食组合物。

Description

用作味道调节剂的环脂肽

发明领域

本发明涉及属于环脂肽组的分子作为味道调节剂的用途，优选用于含有至少一种甜味剂的可食组合物。在优选的实施方案中，将枯草菌表面活素(surfactin)用于本发明的目的。此外，本发明涉及调节所述可食组合物的味道和/或回味的方法以及这些含有至少一种环脂肽作为味道调节剂的组合物。

发明背景

由于其两性特性，枯草菌表面活素是作为生物表面活性剂的微生物来源的环脂肽。对于化学分类，它们可以被命名为环脂缩酚酸肽，这是缩酚酸肽的特别形式。常常通过真菌(例如，Metarhizium sp.或Cladobotryum sp.)和细菌(例如，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(US 5,830,855)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(EP 0761682 B1))以环状形式(环缩酚酸肽)来合成缩酚酸肽，并且其呈现出抗生素和致植物病的特性。在缩酚酸肽中，通过肽-以及酯-键合来连接氨基酸和羟基酸。因此，缩酚酸肽属于heterodet肽，其特征在于该分子的凝聚中涉及肽键以及非肽键。EP 0761682B1描述了从枯草芽孢杆菌制备环缩酚酸肽，并且其具有用于高脂血症的治疗用途。枯草菌表面活素和其他环脂肽是可购得的。

枯草菌表面活素由七个氨基酸的肽环和疏水性脂肪酸链组成，这使得该分子能透过细胞膜。其具有特征性的“马鞍”构象，其脂质尾使得可以透过膜。迄今为止已经知道了多种变体分子：分别为枯草菌表面活素A₁、A₂、A₃、B₁、B₂、C₁、C₂和D。变体形式在脂质尾的长度和分支因子上有所不同，而环肽保持基本不变，包括L-谷氨酸、L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺、D-亮氨酸和L-亮氨酸(枯草菌表面活素A)。仅仅对于后一个氨基酸位置(L-leu)，描述了一些变化：L-val(枯草菌表面活素B)或L-Ile(枯草菌表面活素C)(Stein，T.，Bacillus subtilis antibiotics：structures，syntheses and specific functions(枯草芽孢杆菌抗生素：结构、合成和特定功能)，Mol.Microbiol.(2005)，56(4)：845-857)。枯草芽孢杆菌产生枯草菌表面活素A、B和C，枯草菌表面活素C是得到最彻底研究的变体。已知枯草菌表面活素具有对抗细菌、真菌和病毒的抗微生物活性，并且还呈现出抗肿瘤和抗血栓形成(溶血纤维蛋白和抗凝血)活性。对于枯草菌表面活素潜在治疗应用的概述，参见：Seydlová，G.和Svobodová，J.，Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications(枯草菌表面活素化学特性和潜在生化应用的概述)，Cent Eur.J.Med.(2008)，3(2)：123-133。其抗炎特性是由于其对LPS-诱发的信号传导的抑制作用引起的(Takahashi等，Inhibition of lipopolysaccharide activity by a bacterial cyclic lipopeptide surfactin(通过细菌环脂肽枯草菌表面活素抑制脂多糖活性)，J.Antibiot.(2006)，59(1)：35-43)。由于其稳定性，将枯草菌表面活素钠用于化妆品工业中(Yoneda等，Surfactin sodium salt：an excellent biosurfactant for cosmetics(枯草菌表面活素钠盐：极好的用于化妆品的生物表面活性剂)，Cosmet.Sci.(2001)，52(2)：153-4)。

根据例如US 7,011,969或US 5,227,294中所述的方法，可以从枯草芽孢杆菌获得枯草菌表面活素。

对于枯草菌表面活素C，由于其溶血作用引起的枯草菌表面活素的毒性得到了最彻底的研究。仅仅在40至60μM的高浓度下才看到了溶血活性(Dehghan-Noudeh，G.等，Isolation， characterization and investigation of surface and haemolytic antivities of a lipopeptide biosurfa

枯草菌表面活素作为可食组合物中的成分，尤其是作为调味剂或味道调节剂的用途迄今为止还没有描述或提出过。

在鉴定有用的天然调味剂衍生物(如，例如，是天然糖类甜味剂衍生物的甜味剂，如，例如，赤藓糖醇、异麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇)方面，最近已有重大进展。在鉴定作为潜在甜味剂的天然萜类、类黄酮或蛋白质方面，最近也有进展。参见，例如，Kinghorn等的题为“非致癌天然强甜味剂”的论文(Med.Res Rev(1998)，18(5)：347-360)，讨论了最近公开的天然材料比通常的天然甜味剂(如蔗糖、果糖、葡萄糖等)更甜。相似地，在鉴定和商业化新人造甜味剂(如阿斯巴甜、糖精、安赛蜜-K、环氨酸盐、三氯蔗糖和阿力甜等)方面，最近也有进展；对于综述，参见Ager等的论文，Commerical，Synthetic Nonnutritive Sweeteners(商业的合成非营养性甜味剂)(Angew.Chem.Int.编辑，(1998)，37(12)：1802-1817)。

近些年来，在普通生物技术和更好地理解味道感知的基础生物和生化现象方面已经获得了实质性的进展。例如，最近已经在哺乳动物中鉴定出参与味道感知的味觉感受器蛋白。特别地，已经鉴定出被认为参与味道感知的两个不同家族的G蛋白偶联感受器，T2R和T1R(参见，例如，Nelson等，Cell(2001)，106(3)：381-390；Adler等，Cell(2000)，100(6)：693-702；Chandrashekar等，Cell(2000)，100：703-711；Matsunami等，Nature(2000)，404：552-553；Li等，Proc Natl Acad Sci USA(2002)，99：4962-4966；Montmayeur等，Nature Neuroscience(2001)，4(S)：492-498；美国专利6,462,148；和PCT公开WO 02/06254，WO 00/63166，WO 02/064631和WO 03/001876，以及美国专利公开US 2003-0232407 A1)。

尽管T2R家族包括超过25个参与苦味感知的基因，但负责甜味感知的T1R家族只包括三个成员，T1R1、T1R2和T1R3(参见Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)，99，4962-4966)。最近，在WO 02/064631和WO 03/001876中公开了特定的T1R成员，在合适的哺乳动物细胞系中共同表达时，装配形成功能性味觉感受器。发现了T1R2和T1R3在合适的宿主细胞中的共同表达形成了功能性T1R2/T1R3“甜”味感受器，其应答不同的味道刺激物，包括天然产生和人造的甜味剂(参见，Li等，上文中所引用的)。提议将甜味剂感受器T1R2和T1R3作为同型或异型寡聚物在人肠内分泌细胞中的表达作为用于味道感知调节剂鉴定的模型测试系统(WO 08/014450 A2)。

食品、饮料、令人愉快的产品、甜食、宠物食品、药品或化妆品通常具有高含量的甜味剂，就甜味剂相关疾病的发展而言，通常认为这是不利的。在此尤其是如肥胖症、糖尿病、心血管疾病等这些疾病主要是由于高热量甜味剂引起的。存在很好的证据证明高热量甜味剂(例如，单糖、双糖和寡糖，尤其是蔗糖)与较高水平的血浆三酰甘油相关，这是公认的心血管疾病的风险因素。同样，提高的糖摄入与促进糖尿病、肥胖症或其他疾病的身体状况相关。在食品和饮料工业中，现有技术是用果糖替代那些引起麻烦的糖，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖等。

在2005年，全球甜味剂市场正处于每年170百万吨糖当量(为比较不同甜味剂量的测量单位，考虑了它们的不同的甜味效能)的规模。该市场包括热量甜味剂、高强度甜味剂和多元醇。最重要的热量甜味剂是精制糖或蔗糖；其他热量甜味剂是高果糖玉米糖浆、葡萄糖和右旋糖。高强度甜味剂是提供与糖相同的甜度但物质较少并因此热量较低的产品。它们提供35至10,000倍糖的甜度。也将它们称为低热量或节食甜味剂，或，如果它们不包括任何热量，也称为非热量甜味剂。除了安赛蜜-K以外，其他重要的高强度甜味剂是糖精、阿斯巴甜、环氨酸盐、甜菊苷和三氯蔗糖。最后，多元醇是糖醇，其提供糖的主要部分和结构，但可以标记为具有低于糖的热量。

例如，通常公认高果糖玉米糖浆(HFCS)作为甜味剂在焙烤制品(HFCS 90)、软饮料(HFCS 55)、运动饮料(HFCS 42)或在面包、谷类食品、调味品等中的使用。HFCS指的是一组通过酶加工以提高它们的果糖含量并随后与纯玉米糖浆(100％葡萄糖)混合来达到其最终形式的玉米糖浆。最常见类型的HFCS是HFCS 90(大约90％果糖和10％葡萄糖)；HFCS 55(大约55％果糖和45％葡萄糖)；和HFCS 42(大约42％果糖和58％葡萄糖)。

然而，从最近的研究可以得出的结论是：对血糖、胰岛素、瘦素和饥饿素的作用，果糖与蔗糖相比较，没有呈现出差异。总之，对于以下的假设，几乎不存在证据：其对食欲或参与脂肪贮存的代谢过程的作用，HFCS不同于蔗糖。

减少例如包装食品中的热量甜味剂的另一种策略是使用无-或低-热量人造甜味剂，如安赛蜜-K、糖精、环氨酸盐、阿斯巴甜、索马甜或新橙皮苷DC、三氯蔗糖、纽甜或甜菊糖苷。在此两个方面有着主要影响。首先，这些化合物与糖类相比，具有截然不同的余味，其次，长期讨论这些甜味剂是否致癌。

因此，理想的，并且本发明的目的是寻找具有如下特性的化合物：能调节甜味，或通过自身的甜味或基于其自身具有增强一种或多种本领域已知甜味剂的属性调节弱甜味剂或最可能是自身不具有甜味属性但具有能增强可食组合物中所用的一种或多种本领域已知甜味剂能力的增强剂来增强由本领域已知甜味剂产生的甜味。

在本领域中，对于显示出味道调节活性的化合物，已经制订了几个提案。WO 2006/138512公开了二-芳族酰胺及其作为甜味调节剂、促味剂和味道增强剂的用途。US 7,175,872涉及用作味道调节剂的吡啶盐-甜菜碱化合物。WO 2007/014879提出了用于增强甜味的橙皮素。

不过，本领域中仍然需要新的和改良的味道调节剂，作为调味剂，尤其是需要对于以上列出的原因没有或只有非常低的甜味剂潜能的化合物。本发明打算通过提供具有味道调节特性的化合物来解决这些问题。

发明概述

本发明涉及枯草菌表面活素和相关的环脂肽，优选来自微生物来源，令人惊讶地发现其具有味道调节特性。本发明的一个方面是一种或多种上述脂肽的用途，优选枯草菌表面活素C或不同枯草菌表面活素的混合物的用途，作为含有一种或多种天然或人造甜味剂的可食组合物中的味道调节剂，甜味剂实例如上所述。本发明的另一个方面是调节上述可食组合物的味道(包括余味)的方法，其包括将该组合物与味道调节量的一种或多种上述脂肽混合，脂肽优选枯草菌表面活素C或枯草菌表面活素的混合物。本发明的再另一个方面涉及含有一种或多种天然和/或人造甜味剂和一种或多种所述脂肽的可食组合物，脂肽优选枯草菌表面活素C或枯草菌表面活素的混合物。

在本说明书中，引用了许多文献，在此将这些参考文献(包括其中的科学论文、专利和专利申请)的全部公开内容引入作为参考，出于至少部分地描述本领域普通技术人员的知识的目的和出于公开例如化合物、结构(如T2R和T1R哺乳动物味觉感受器蛋白)和一些方法的目的，这些方法例如是在细胞系中表达这些感受器的方法和使用所得到的细胞系就味道调节活性来筛选化合物的方法。

发明详述

就本发明的目的而言，以下术语应当具有以下所述的意思：

“可食组合物”以其最广义来理解，包括但不限于食品、饮料、软饮料、令人愉快的产品、甜食、甜味剂、化妆品(如，例如，漱口水)、动物食品(如，宠物食品)和药物或药品。

“味道调节剂”或“味道调节”指的是调节含有一种或多种天然和/或人造甜味剂的可食组合物的味道(包括余味)的化合物/活性。味道调节剂可以在动物或人体内调节、增强、促进、形成或诱发味道印象，并且优选增强的甜味感。

“天然”和“人造甜味剂”是对于可食组合物本领域已知和/或使用的那些甜味剂；在之前的段落中已经给出其实例。

“味道调节量”指的是能够调节含有甜味剂的可食组合物味道的一种或多种化合物的量。调节或提高可食组合物味道需要的味道调节剂的浓度当然取决于许多变量，包括特定类型的可食组合物及其各种其他成分，尤其是其他天然和/或人造甜味剂的存在及其浓度，品尝组合物的人天然的遗传变异性和个人偏好和健康状况，特定化合物对这种甜味化合物味道的主观作用。

因此，不可能明确说明确切的“有效量”。然而，可以通过本领域普通技术人员只使用常规实验来确定合适的有效量(参见，例如，US 7,175,872的实施例9和WO 2006/138512 A2的实施例53)。

可以用于本发明中的环脂肽是式(I)的那些：

其中，

位置7的Leu可以由Val或Ile来替代，

R表示直链或支链烷基，

和

1-7表示环状分子内的氨基酸位置。

R优选是包含10、11、12或13个碳原子的直链或支链烷基，下文中也称为C₁₀烷基、C₁₁烷基、C₁₂烷基或C₁₃烷基。特别优选的基团R包括：(CH₂)₇-CH(CH₃)₂、(CH₂)₆-CH(CH₃)-CH₂-CH₃、(CH₂)₉-CH₃、(CH₂)₈-CH(CH₃)₂、(CH₂)₁₀-CH₃、(CH₂)₉-CH(CH₃)₂、(CH₂)₈-CH(CH₃)-CH₂-CH₃和(CH₂)₁₀-CH(CH₃)₂。

用于根据本发明用途中的优选式(I)环脂肽是其中氨基酸包含D-和L-氨基酸的那些。特别优选的是在序列LLDLLDL(在序列位置1→位置7中给出)中包含D-和L-氨基酸的环脂肽(I)。根据本发明的环脂肽还包括天然和工程化衍生物。因此，在位置7具有不同氨基酸(例如，Val，Ile)的天然产生变体分子在本发明的范围内。更多衍生物是其中式I中的位置1至6的一个或多个氨基酸由具有相似特性(疏水性、电荷)的氨基酸置换的那些。

在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的优选环脂肽(I)中，疏水性氨基酸残基位于位置2、3、4、6和7的一个或多个位置上，并且负电荷氨基酸残基位于位置1和5的一个或多个位置上。优选疏水性氨基酸的实例是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro，负电荷氨基酸的实例是Asp、Glu。

根据本发明，特别优选枯草菌表面活素A(氨基酸序列1→7：L-Glu、L-Leu、D-Leu、L-Val、L-Asp、D-Leu、L-Leu；R＝C₁₀烷基)、B(L-Val替代位置7的L-Leu；R＝C₁₁烷基)、C(位置7为L-Ile；R＝C₁₂烷基)和D(R＝C₁₃烷基)及其各自的混合物。最优选的是枯草菌表面活素C和/或枯草菌表面活素C与环脂肽(I)的混合。

加入了根据本发明的味道调节环脂肽的可食组合物优选是含有一种或多种单糖、双糖或寡糖作为甜味剂的组合物，最优选的是含有高果糖玉米糖浆或高果糖糖浆混合物作为甜味剂的组合物。对于本发明的目的，特别关注的可食组合物是糖果、谷类食品、冰淇淋、饮料、酸奶、甜点、涂抹酱和焙烤制品、美容营养品和药物组合物，优选碳酸化醇类和非醇类饮料，如碳酸化和非碳酸化的a)软饮料、b)全热量软饮料、c)运动和能量饮料、d)果汁饮料、e)即饮茶和其他即饮软饮料。最优选是其中含有液体甜味剂HFCS的那些不同食品，该甜味剂也构成了主要的膳食果糖来源，其已经变成了例如软饮料和许多其他加甜饮料以及碳酸饮料、焙烤制品、罐头水果、果酱和果冻以及乳制品中受欢迎的蔗糖替代品。

含有单糖、二糖或寡糖作为甜味剂和根据本发明的环脂肽的可食组合物呈现出与所述糖类自身的味道相同或至少接近的味道品质，尤其是明显增强的甜味。

根据本发明的环脂肽，尤其是枯草菌表面活素类型的那些，明显倍增或增强了已知的天然和/或人造甜味剂的甜味，即使是低浓度使用时，使得在可食组合物中需要较少的已知热量甜味剂，同时感知的天然甜味剂的味道得到维持或增强。鉴于不利的人体重增加的快速提高和/或相关疾病(如糖尿病、动脉粥样硬化等)的发生，这是非常高实用性和高价值的。

本发明可食组合物中的味道调节剂的含量取决于其中所含的天然或人造甜味剂的浓度以及更多辅助物质的存在，关于提及一些辅助剂，如二氧化碳、风味剂(例如，香辛料、天然提取物或油)、色素、酸味剂(例如，磷酸和柠檬酸)、防腐剂、钾、钠。所需的量通常为0.01mg至1g环脂肽/kg全部完成的可食组合物。含量特别地在0.01mg至500mg脂肽/kg完成的可食组合物之间，优选0.1mg至100mg脂肽/kg完成的可食组合物之间，并且尤其在0.1mg至50mg环脂肽/kg完成的可食组合物之间(＝ppm重量)。

本发明的环脂肽优选在水和/或极性有机物质及其混合物中具有充足的溶解性，用于通过简单溶解于合适的液体中来配制所需的浓度范围。可以通过将环脂肽和可溶性载体溶解或分散于水或极性溶剂中，然后通过公知方法，如喷雾干燥，将所得到的液体干燥，来制备包含固体水溶性物质(如，糖或多糖)和在此所述的环脂肽的浓缩组合物。

然而，本发明环脂肽的溶解性在极性较低或无极性液体载体(如，油或脂肪)中是有限的。在这些实施方案中，可以通过将环脂肽和液体载体的物理混合物碾磨、研磨或均质，理想地制备固体环脂肽在载体中非常细的分散体或乳液。因此，在一些情况中，可以将环脂肽配制成在前体物质中包含环脂肽固体微粒分散体的甜味剂浓缩组合物。例如，本发明的一些环脂肽可以在非极性物质(如，可食脂肪或油)中具有有限的溶解性，并因此可以通过将固体环脂肽研磨或碾磨成微粒大小并与可食脂肪或油混合，或通过将固体环脂肽和可食脂肪或油或其在食用上可接受的类似物(如Neobee^TM基于甘油三酯的油，由Stephan Corporation of Northfield Illinois，U.S.A.销售)的分散体均质，配制成甜味剂浓缩组合物。

还可以通过将环脂肽溶于水或极性溶剂中，然后将固体载体或组合物喷雾至固体可食载体或物质上，来制备充分分散的本发明的化合物固体覆盖的、挂霜或挂糖的。

通过上述方法，许多公知的和有价值的通常含有糖和/或等价糖类甜味剂的可食组合物可以得到重新配制，以包含一种或多种在此所述的环脂肽，并伴随显著降低糖和/或等价糖类甜味剂浓度的能力，例如，降低约10％至高达30至50％或更多，可食组合物的热量相应地降低。

然后将以上描述的浓缩组合物用于公知的方法中，来制备所需的本发明的可食组合物。

因此，本发明包括不同的方面，全部属于相同的发明构思：

a)本发明的环脂肽作为用于含有至少一种(已知)天然或人造甜味剂的可食组合物的味道调节剂的用途，

b)通过将一种或多种本发明的环脂肽加入到该组合物中来调节所述可食组合物的味道(包括余味)的方法，

c)通过将一种或多种本发明的环脂肽加入到所述组合物中来降低所述可食组合物中热量甜味剂的浓度的方法，和

d)含有至少一种已知的天然或人造甜味剂和至少一种根据本发明的环脂肽的可食组合物。

实施例

本发明的更多特征由以下的实施例产生。关于这一点，可以单独或结合地认识到本发明的单个特征。提供以下实施例来说明优选的实施方案，并且预期是说明性的而非对本发明范围的限制。

实验材料和方法

细胞培养物

稳定的HEK293细胞的瞬时转染/选择-可以根据手册用脂质复合物，如磷酸钙沉淀、Lipofectamine/PLUS试剂(Invitrogen)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)或MIRUS TransIT293(Mirus BioCorporation)进行瞬时且稳定的转染。电穿孔也是用于真核细胞稳定转染的可选方法。

将细胞以4×10⁵细胞/孔的密度接种于6-孔平板中。用用于目标基因稳定表达的线性化质粒转染HEK293细胞。在24小时后，用选择试剂，如zeocin、潮霉素、新霉素或杀稻瘟素，开始选择。将约50μl至300μl来自6-孔的胰蛋白酶化的转染细胞接种于100mm培养皿中，并且加入合适浓度的所需抗生素。培养细胞，直至100mm细胞培养平板上的菌落可见。选择这些菌落，用于进一步培养和钙成像。需要约四至八周来选择稳定表达目标基因的细胞克隆。

钙成像

使用稳定HEK293细胞的Fluo-4 AM试验-将稳定的细胞维持于补充了10％胎牛血清(Biochrom)和4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen)中。将用于钙沉淀的细胞维持于补充了10％FBS和1×Glutamax-1(Invitrogen)的DMEM低葡萄糖培养基中48小时，之后接种。在48小时后，将这些稳定的细胞胰蛋白酶化(用胰蛋白酶-EDTA，Accutase或TrypLE)，并在补充了10％FBS和1×Glutamax-1的DMEM低葡萄糖培养基中以45,000细胞/孔的密度接种于聚-D-赖氨酸覆盖的96-孔试验平板上(Corning)。

在24小时后，将细胞装载于100μl培养基中1小时，该培养基在Krebs-HEPES(KH)-缓冲液中含有另外的100μl 4μM Fluo-4(钙敏感染料，2μM终浓度；分子探针)。然后每孔用200μl KH-缓冲液替换装载试剂。Krebs-HEPES-缓冲液(KH-缓冲液)是包括1.2mMCaCl₂、4.2mM NaHCO₃和10mM HEPES的生理盐水溶液。

在加入了50μl补充了5×促味剂的KH-缓冲液后，将平板中装载染料的稳定细胞涂布于荧光微量滴定平板阅读器上，来监控荧光变化(激发488nm，发射520nm)。对于每个痕迹，在扫描开始后16秒加入了促味剂，并与缓冲液混合两次，扫描继续另外的90秒，并且每一秒收集数据。

数据分析/数据记录

作为超过基线水平(F₀)的峰值荧光变化(ΔF)来定量钙代谢。数据表示为重复独立样品的平均S.E.值(ΔF/F₀)。使用微量滴定平板阅读器软件进行了分析。

枯草菌表面活素

用于本发明试验中的来自枯草芽孢杆菌的枯草菌表面活素购自Sigma(目录号S3523)。这是不同的天然产生的枯草菌表面活素与作为主要成分的枯草菌表面活素C的混合物。分子式为C₅₃H₉₃N₇O₁₃，分子量为1036.34(CAS No：24730-31-2)。根据指令67/548/EEC，这不是危险的。储液可溶于乙醇中(10mg/ml)，并且可以在含水缓冲液中稀释成较低浓度。

对照物质

作为对照物质，使用了各自浓度为40mM的安赛蜜K(购自Fluka)和环磺酸钠(购自Applichem)。

实施例1

基于重组人味觉感受器依赖性T1R2/T1R3依赖性细胞的试验中枯草菌表面活素甜味增强剂活性的检测

在野生型味细胞中-例如，在人味蕾中-推测信号传导是通过G-蛋白gustducin和/或通过Galpha-i型G-蛋白来传导的。遇到甜味配体，杂二聚的人味觉感受器T1R2/T1R3反应，伴随第二信使分子的诱发；诱发应答大多数糖的cAMP水平或诱发应答大多数人造甜味剂的钙水平(Margolskee J.Biol Chem.(2002)277，1-4)。

为了分析枯草菌表面活素的功能和活性，已经在基于钙依赖性细胞的试验中利用了杂二聚T1R2/T1R3甜味感受器。已经在稳定表达混杂小鼠G-α-15G-蛋白的HEK293细胞系中用多顺反子质粒载体pTrix-Eb-R2R3感染了T1R型味觉感受器。

对于稳定细胞系的产生，使用了使用人味觉感受器序列的多顺反子表达单位。如图1中所示，表达载体pTrix-Eb-R2R3的三顺反子表达单位处于人延伸因子1α启动子的控制下。使用标准克隆技术，已经克隆了感受器ht1R2和ht1R3的cDNA和杀稻瘟素S脱氢酶基因的cDNA。为了使该三顺反子单位的每个基因的翻译能够启动，插入了两个EMC-病毒衍生的内部核糖体进入位点(IRES-也称为Cap依赖性翻译增强子(CITE))。(Jackson等，Trends Biochem Sci(1990)15，477-83；Jang等，J Virol(1988)62，2636-43)。

通过猿病毒40聚腺苷酸化信号序列来终止该三顺反子表达单位。这种组合使得可以在只有一个启动子的控制下同时表达所有三个基因。与在稳定细胞系发展的过程中彼此独立地整合至不同的染色体位置中的多顺反子转录单位相反，三顺反子转录单位将所含的全部基因整合在一个并且相同的染色体基因座中。由于基因的排列，杀稻瘟素S脱氢酶基因只在发生全长转录的情况中得到转录。此外，多顺反子转录单位的极性(Moser，S.等，Biotechnol Prog(2000)16，724-35)可能导致平衡的感受器基因化学计算，并且对于头两个位置的表达率在1∶0.7至高达1∶1的范围内，而杀稻瘟素S脱氢酶基因与第三个位置的感受器基因相比较，表达至较低的程度。假定对于功能性杂二聚感受器ht1R2/ht1R3，需要1∶1的化学计量，感受器基因较低的极化效应促进所需的化学剂量，而脱氢酶降低的表达促进整合基因座具有增强的转录活性。通过在杀稻瘟素的存在下培养转染细胞进行了稳定的T1R2/T1R3表达细胞的产生。

对于人T1R2/T1R3味觉感受器依赖性活性的测量，将稳定表达G-α-15的HEK293细胞、人T1R2和人T1R3以4×10⁴接种于96-孔平板中，并用DMEM培养基中的钙敏感性荧光染料Fluo4-AM(2μM)在37℃下标记一小时。为了荧光平板阅读器中的测量，将培养基交换成KH-缓冲液，并在37℃再培养20分钟。在Flex Station II荧光平板阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，加利福尼亚)中进行了标记细胞的荧光测量。在30mM果糖存在下，对不同浓度的枯草菌表面活素的应答记录为通过第二信使钙的T1R2/T1R3依赖性增加启动的Fluo4-AM荧光增加。从预检测的结果选择了所用的果糖浓度，该预检测显示出30mM果糖(5.4g/l)是几乎没有激活该基于细胞的试验内的甜味感受器的浓度(见图2)。因此，在甜味剂果糖的存在下，测试化合物的甜味增强特性是可检测的。在获得每个样品的钙信号后，作为从其自身基线荧光水平(定为F₀)的相对变化来定量应答促味剂的钙动员(峰值荧光F1-基线荧光F₀水平，定为ΔF)。尽管rel.RFU是ΔF/F₀。峰值荧光强度在加入促味剂后大约20-30秒时产生。所示数据获自至少两个独立的实验并且重复进行三次。枯草菌表面活素的果糖增强能力作为主要荧光增强曲线描绘于图2中，并且以g/l由所用枯草菌表面活素浓度促进的果糖增加来给出果糖增强。

附图说明

图1显示了多顺反子真核表达载体pTrix-Eb-R2R3。人味觉感受器基因T1R2、T1R3和杀稻瘟素S脱氢酶(bsd)基因的表达是在人延伸因子1α启动子(P-ef1α)的控制下。为了给予翻译水平上的多顺反子表达，插入了两个内部核糖体进入位点(cite-I和cite-II)。多顺反子单位通过猿病毒40多核苷酸化位点(polyA)来终止，并用实心黑色箭头描绘“顺反子”。原核复制起点(ori)和卡那霉素抗性基因(kan)用于质粒载体在大肠杆菌中的传播、扩增和选择。

图2显示了在30mM果糖不存在或存在下，在所述的基于细胞的试验中，枯草菌表面活素对甜味感受器的活性(作为甜味剂以及甜味增强剂的活性)。将感受器应答描绘为随着时间(秒/x-轴)的主要荧光增强(y-轴)。对枯草菌表面活素的感受器-应答是浓度依赖性的，并且在果糖的存在下得到增强。

图3说明了在30mM果糖不存在或存在下，在所述的基于细胞的试验中，枯草菌表面活素作为甜味增强剂对甜味感受器的活性。结果表明在高达2μM枯草菌表面活素的相关浓度范围下，并且在果糖不存在下，观察到没有增强作用，而在果糖存在下，在感受器阳性细胞中获得了信号。在所述浓度范围中，在感受器阴性细胞中没有观察到信号。总之，结果表明枯草菌表面活素自身没有加甜作用，只有在甜味剂的存在下才具有调节作用。

Claims

1.一种或多种根据式(I)的环脂肽作为甜味增强剂的用途，

其中，

R表示包含10至13个碳原子的直链或支链烷基，

和

1-7表示环状分子内的氨基酸位置。

2.如权利要求1中所要求的用途，其中在式(I)中，氨基酸是D-和L-氨基酸，特别地，在序列LLDLLDL中(从位置1至7)。

3.如权利要求1或2中所要求的用途，其中使用至少一种另外的环脂肽，其不同于根据式(1)的脂肽。

4.如权利要求1至3的一项或多项权利要求中所要求的用途，其中在式(I)中，位置7的氨基酸由Val或Ile替换。

5.如权利要求1至4的一项或多项权利要求中所要求的用途，其中在式(I)中，位置2、3、4、6和7的一个或多个氨基酸由来自包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp和Pro的组的疏水性氨基酸替换和/或位置1和5的一个或多个氨基酸由来自包括Asp和Glu的组的带负电氨基酸替换。

6.如权利要求1至5的一项或多项权利要求中所要求的用途，用于可食组合物中。

7.如权利要求6中所要求的用途，其中可食组合物含有至少一种天然或人造甜味剂。

8.如权利要求6或7中所要求的用途，其中以0.01mg至10g环脂肽/kg可食组合物的量来使用一种或多种环脂肽。

9.如权利要求6至8的一项或多项权利要求中所要求的用途，其中可食组合物进一步包含单糖、双糖或寡糖作为甜味剂。

10.如权利要求6至9的一项或多项权利要求中所要求的用途，其中可食组合物含有高果糖玉米糖浆(HFCS)作为甜味剂。

11.如权利要求6至10的一项或多项权利要求中所要求的用途，其中可食组合物选自冰淇淋、饮料、酸奶、甜点、涂抹酱和药物组合物，优选碳酸化醇和非醇饮料。

12.调节味道的方法，包括将权利要求1中所要求的环脂肽加入到可食组合物中的步骤。

13.降低热量甜味剂浓度的方法，包括将权利要求1中所要求的环脂肽加入到可食组合物中的步骤。

14.包含权利要求1中所要求的环脂肽的可食组合物。