CN102099486A

CN102099486A - 用于检测幽门螺旋杆菌的强毒株的分子诊断试剂盒

Info

Publication number: CN102099486A
Application number: CN2009801275738A
Authority: CN
Inventors: A·加西亚坎西诺; C·冈萨雷斯科雷亚; N·特拉巴尔费尔南德斯
Original assignee: Universidad de Concepcion
Current assignee: Universidad de Concepcion
Priority date: 2008-05-26
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2011-06-15
Also published as: JP2011522533A; WO2009145603A1; EP2333111A4; US20110165576A1; BRPI0913205A2; EP2333111A1; CL2008001520A1

Abstract

本发明公开了试剂盒，其形式为能够用于同时检测幽门螺旋杆菌的4种基因，即1种鉴定基因(rDNA16S Hpy)和3种毒力基因(cagA、vacAm1、dupA)的产品和方法。此外，该试剂盒涉及测定DNA提取物质量的引物组合(Eub基因)。

Description

用于检测幽门螺旋杆菌的强毒株的分子诊断试剂盒

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)引起的感染是大的公共健康问题，因为其控制非常昂贵。这种情况导致需要检测与该病症相关的风险因子的工具。但是，目前尚无商业上可获得的检测强毒株(virulentstrain)的微生物检测。

由于目前没有可信赖的检测幽门螺旋杆菌的实验室工具，所以该细菌的根除治疗仅基于定性方法，并且没有测定幽门螺旋杆菌的毒力的处理法或治疗法。

现有方法仅仅指示微生物的存在与否，但不揭示感染菌株的性质或特性。另一个重要方面是，儿童群体中仅进行了非常零星的内窥镜研究，所以关于该年龄组的感染数据非常少。

根据世界范围内的报告，由于各种原因，在20％至80％的病例中，根除治疗是失败的，所述原因包括对于抗细菌试剂具有抗性的菌株的出现以及在选择治疗法之前缺乏易感性研究。所述状况意味着对于患者和卫生系统的高健康成本。关于感染菌株的致病潜力的明确信息的缺乏会阻碍患者的康复。

已经通过脲酶的反应在遗传水平上常规地鉴定了该细菌，所述脲酶允许胃粘膜的定殖，这是因为，在存在脲、氢离子和水时，该酶催化铵和碳酸氢盐的形成，其中和细菌周围的氢离子并允许它在胃上皮中存活(Hazell等人，1986；Mobley等人，1988；Megraud等人，1989)。

幽门螺旋杆菌具有不同的毒力因子，这些因子允许它定殖于胃的胃粘膜并使其逃离宿主的防御机制。这些因子中有一些是物种特异性的，其它的则可变地存在。在所有菌株中都存在的常规毒力因子是脲酶、螺旋结构、鞭毛和粘附素，以及内毒素(LPS)；此外，精氨酸酶参与免疫系统的逃逸。该细菌表达的粘附素识别来自上皮细胞的特异性糖。研究得最广泛的是N-乙酰神经氨酰乳糖血凝素和蛋白BabA(血型抗原结合性粘附素)，后者允许细菌结合至胃粘膜中的LewisLe^B血型抗原。

特异性蛋白(例如脂酶(粘蛋白酶)，其降解改变上皮表面疏水性的粘液)辅助该细菌的定殖。这会使在胃粘膜中的运动成为可能，并且细菌蛋白酶水解宿主的免疫球蛋白(Smoot，1997)。同时，细菌回避了免疫应答，这是由于存在IgA分泌子的特异性蛋白酶，并且LPS具有低免疫原性效力，其抑制来自宿主的有效免疫应答(Muotiala等人，1992)。

在尝试确定哪种幽门螺旋杆菌的菌株具有更强的致病性以及在它们与感染的临床表现之间是否存在一定关系时，研究了不同的基因。本领域已知的是，毒力依赖于多种基因，其中多数基因位于毒力岛(pathogenicity island，PAI)。研究得最广泛的基因是vacA和cagA、iceA、babA2和dupA(Zambon等人，2003；Faúndez等人，2002；Censini等人，1996)。

一些研究者已经提出了对这些标志物组合的分析；例如，vacA和cagA一起的分析。在这个方面，具有s1型vacA的信号序列的幽门螺旋杆菌菌株与较强的胃炎症和胃溃疡病有关；是m1型中间区(middleregion)的vacA等位基因与更严重的上皮损伤有关(Pan等人，1999)。其它研究者提出，cagA和iceA基因型将是用于鉴定具有胃溃疡的患者的良好标志物组合(Faúndez等人，2002)。

涉及幽门螺旋杆菌的致病性的一种新基因是编码蛋白BabA1和BabA2的基因，其允许粘附素的合成的活化和去活化(Gerhard等人，1996)。

在世界上的主要数据库和专利局进行了检索。在以下部分讨论了与本发明最密切相关的文献。

在市场上可以获得一种设计用于检测幽门螺旋杆菌的基于MWGBiotech，Inc.的微阵列技术的产品。该产品由1877个识别幽门螺旋杆菌菌株J99和26695的寡核苷酸组成。这些寡核苷酸中的1307个在两种菌株中是重合的，有295个是幽门螺旋杆菌菌株26695特异性的寡核苷酸；有278个是幽门螺旋杆菌菌株J99特异性的寡核苷酸。没有相关的发明专利申请。

Invitek公司开发了一种用于检测粪便中的幽门螺旋杆菌的cagA基因型的试剂盒，其商品名为

其能够确定是否存在该细菌的活性感染。该设备没有相关的发明专利申请。该设备仅仅可能确定是否存在微生物，而不能确定其毒力。

Maxim Biotech，Inc公司的产品“用于检测幽门螺旋杆菌的MPCR试剂盒”和MP-70080是使用多重PCR技术开发的。该试剂盒设计为使用多重PCR迅速检测幽门螺旋杆菌。该试剂盒中包含的引物扩增基因cagA(358bp)、鞭毛蛋白(152bp)、脲C(315bp)和ARNr 16S(110bp)。该产品包括扩增所需的所有反应剂，聚合酶Taq和dNTP除外。该试剂盒包括工作缓冲液、各个阳性对照、分子量标志物、不含DNA酶的水和特异性引物。我们的发明中没有使用该试剂盒中的任何引物或基因。

有64项发明专利申请与本发明相关。以下叙述与幽门螺旋杆菌检测试剂盒最密切相关的申请和现有专利的详细信息：

与检测脲酶的试剂盒相关的发明

表1.与幽门螺旋杆菌检测试剂盒相关的发明

＊未给出信息

本发明与其它首创不同，因为本发明的试剂盒检测与毒力有关的普遍基因。商售试剂盒和其它相关发明一般是使用pH试纸通过可视阳性测试法来检测是否存在脲酶(螺旋杆菌属的特征)，这并不一定必然指示它是幽门螺旋杆菌菌株，更不一定能指示其为潜在致病性菌株。

此外，现有的试剂盒中多数是非特异性的，因为存在于活组织检查中的其它螺旋菌(例如海尔曼螺杆菌(H.helmannii))也产生阳性脲酶反应，这是与螺旋菌属相关的特征。使用的其它试剂盒是基于检测针对血清中的细菌的抗体。

我们的检索显示有如下7个密切相关的发明专利申请：JP2006284567、KR20030031243、WO2005108995、WO2004111265、WO0029618、WO9949890和WO9853082。这些发明专利申请中最重要的是专利KR20030031243和WO2005108995，它们与本发明直接相关，因为所述首创是在遗传水平上测定幽门螺旋杆菌的毒力。但是，这些专利中没有一个与2种以上的毒力基因相关，最多是一种鉴定序列，或者它们是难以运用的技术。

没有发现与本发明具有相似特征的首创，更重要的是，上述首创的特征是从那些基因序列与本发明要求保护的序列不相关的菌株开发而来的。

发明内容

这种分子试剂盒与现有首创之间的区别在于以下二者：其所识别的基因和其所需要的反应。现有首创花费更多的时间来寻找同时扩增上述测定它们的现有首创中的毒力相关基因的最佳条件。

其它的发明具有以下缺点：与本发明不同，一些活组织检查样品的DNA浓度不允许同时检测多个基因。目前没有已知的试剂盒检测多个毒力因子，因此本发明相对于现有试剂盒在设计和创新方面提供了优点。本发明能够产生与更严重的病症相关的幽门螺旋杆菌中的遗传样式，这是在任何以前的首创中未包括的方面。

用于同时检测与毒力和物种相关的基因的分子试剂盒允许识别具有更强的定殖和人类感染能力的幽门螺旋杆菌菌株，所述能力与源自慢性幽门螺旋杆菌感染的严重病症相关。该试剂盒允许迅速且有效地检测具有更大的致病潜力的幽门螺旋杆菌菌株。

本发明的产品与现有的诊断方法相比具有明显的不同和优越性，因为目前没有检测来自特定菌株的幽门螺旋杆菌基因的商业产品，更重要的是，几种现有的产品包括至多仅一种与毒力相关的基因和另一种与特异性相关的基因。

发明描述

本发明涉及用于诊断幽门螺旋杆菌引起的感染的试剂盒，其需要人类样品。因此，所述试剂盒用于预先建立的程序中。

本发明的试剂盒是用于幽门螺旋杆菌的遗传检测。该首创测定这些微生物的与特定序列相关的多个不同的毒力基因的存在。此外，目前没有在诊断的同时涉及多个鉴定和毒力基因的首创。即使存在目标(即，检测该微生物)相似的其它技术，甚少有技术旨在确定这些微生物的多个不同毒力基因的存在。

目前没有在诊断的同时涉及鉴定和毒力基因(所述基因都与本发明揭示的特定序列有关)的首创。

该试剂盒的重要优点在于，它含有用于实现其最佳效果的所有元件，例如Taq聚合酶、dNTP、工作缓冲液、各个阳性对照、分子量标志物、特异性引物和不含DNA酶的水。此外，它具有提取DNA所需的步骤说明。这些是本首创中的无法超越的价值的创新方面，在类似发明中都没有考虑到这些。

在本领域中没有检测多种幽门螺旋杆菌毒力基因并同时识别幽门螺旋杆菌物种的特征基因的产品。此外，多个发明要求保护其应用仅仅旨在识别特异性菌株、识别该物种中存在的至多两种基因的试剂盒。本发明的令人惊奇和出人意料的方面在于，所选基因的组合。此外，该试剂盒设计为应用于世界的任何地方和多种类型的样品。

该试剂盒具有以下特征：它可以用于检测分布非常广泛的菌株，这使得可以就“在哪里测定毒力指标和它们的范围”延伸本发明的应用。在本发明中，以具有高发生率的一组幽门螺旋杆菌基因进行了研究，基于代表广阔地理区域的菌株的序列产生了试剂盒。因此，本首创对于多个种族具有非常重要的意义，并且解决诊断高度致病性幽门螺旋杆菌中长期存在的问题(直至目前该问题没有解决方案)。本技术克服了以前存在的壁垒以产生一种可以广泛应用的方案。

本技术的另一个优势方面是其可信赖性非常高；毫无疑问，获得一致性和确定结果的概率非常高。虽然这些是基于分子的任何测试或试剂盒都具有的性质，但是在本案中，意义在于，待复制的遗传序列的严格选择对于获得精确结果具有决定意义，而且，其使用大量的这些遗传序列，这使本技术相对于其它测试具有明显优势。

此外，本首创具有以下优点：这些结果具有出人意料的精确性，因为检测的是多个基因，当一起评估这些基因时，提供了幽门螺旋杆菌毒力的揭示性证据。因此，该分析诊断技术远远比现有的发明优越。

本发明的另一个区别特征是其临床有效性；即，该DNA试剂盒给出诊断、在临床实践中预测疾病风险的确定性。该试剂盒的临床有效性提供这样的测试，该测试包括提供异常敏感性的反应。阳性预测值(换句话说就是，对该测试呈现阳性结果的人员将产生相关病症的概率)，以及与该工具相关的阴性预测值(即，具有阴性结果的人员将不产生疾病的概率)，是该试剂盒考虑的方面，这个方面在相似发明中没有考虑到，这再次使本试剂盒相对于现有试剂盒具有明显的优越性。本试剂盒不仅可以检测是否存在幽门螺旋杆菌菌株，另外，令人惊奇的是，还可以检测细菌具有的毒力基因。基于同时检测与幽门螺旋杆菌的毒力相关的基因即cagA、vacAm1和dupA开发了具有所有上述优点的分子试剂盒，其允许识别具有更大的致病潜力的菌株。

检测该生物的程序是在患者样品(其中发现存在该微生物或其部分遗传材料)中进行的。优选使用来自肠道、粪便、血液、血清、呼吸的活组织检查样品，其中具有最大致病潜力的幽门螺旋杆菌菌株被迅速且有效地检出。这种新工具使医生可以作出关于感染幽门螺旋杆菌的患者的治疗方案的决定。

传统的幽门螺旋杆菌微生物学和分子诊断一般具有以下缺点：人员必须经过超声内镜成像、内窥镜检查法和组织病理学中的诊断程序的培训。但是，使用本试剂盒则不存在这些技术难度，因为该试剂盒易于使用。将诊断试剂盒引入临床常规实践构成了健康保存(healthsaving)，因为其允许早期检测致病菌株的感染，尤其是儿童中的感染，这将防止感染向进一步损伤发展。

本发明的另一个方面在于多数现有试剂盒未解决的另一个问题，即测定菌株的毒力。多数相关发明设计用于临床用途而不是预防用途。本发明解决了本领域中一直存在的问题，即毒力菌株的检测。最重要的是，该试剂盒允许在即使个体没有显现出临床征候(与患有与毒性微生物直接相关的病症有关)时检测毒力菌株。

本发明可以在任何临床诊断实验室中应用，其仅需要基本的人员培训和简单设备。该试剂盒是微生物诊断实验室中的传统培养物的良好替代物，其优点在于节省了时间和材料。相对于市场上目前可获得的技术，其为医生提供了更多的信息，因为它允许迅速识别具有最大致病潜力的幽门螺旋杆菌菌株。

知晓某人正面临致病菌株还可以使其采取适当的行动以预防严重疾病的出现并恢复个体健康，这改善了具有与幽门螺旋杆菌相关的胃与十二指肠病症的人群的生活质量。

本试剂盒的另一个优点是它可以适用于实时PCR设备，这保证了其更高的敏感性，因为其检测少至3pg的DNA数量，即使该DNA稀释到极限值水平。此外，本技术显著缩短了获得结果所需的时间。

本发明的另一个操作优点是它通过多重PCR进行作业。仅有的使用多重PCR的相关现有发明需要加入某些新鲜的反应物；但是本发明只需要不含核酸酶的蒸馏水，或者它可以以这两种形式呈现。此外，本发明的试剂盒检测的毒力基因是具有高发生率的基因。

提出的分子检查缩短了获得结果的时间，因为传统的培养需要至少1周。因此本技术是目前诊断致病性幽门螺旋杆菌的最佳选择。本发明具有短期、中期和长期优势，所以它能够提高人们的生活质量，改善他们的健康并延缓慢性幽门螺旋杆菌感染向更严重的胃与十二指肠病症的进展，其对于幽门螺旋杆菌引起的病症的诊断和治疗具有重要影响。

用于同时检测人群中普遍的与幽门螺旋杆菌毒力相关的基因(cagA，vacAm1和dupA)的分子试剂盒的开发(其允许识别具有最大的定殖、慢性感染和产生对人类胃粘膜损伤的能力的菌株)，以前尚未要求保护过。

本发明现在使得可以测定存在于不同样品(优选具有不同的胃与十二指肠病症或不具有与该微生物相关的征候的胃活组织检查样品)中的幽门螺旋杆菌菌株的普遍性。此外，本发明测定极少量的DNA浓度(1ng/μl)，这足以检测幽门螺旋杆菌。提出的首创确定了同时扩增与存在于粪便、液体或胃活组织检查样品中的幽门螺旋杆菌菌株的毒力相关的两种或更多种基因的最佳条件。

直到目前为止，医生尚不具备可用的细菌学实验室测试以支持其关于“幽门螺旋杆菌的根除治疗的时机和选择最适当的治疗法以增加成功根除的概率”的决定。医生使用脲酶测试来检测细菌，例如，基于胃样品。但是，阳性反应仅仅指示螺旋杆菌属的存在；其不是物种特异性的，更不是致病潜力的指示。

缺少有效的和可利用的鉴定高危人群的方法以及用于早期诊断的有用的生物标志物是解决该问题时要有效考虑的问题，本文揭示的方案考虑到了这些问题。

多重PCR的使用允许基于样品迅速且有效地检测具有更大的致病潜力的幽门螺旋杆菌菌株。

具体实施方式

具体地，本发明考虑到可以使用多个分析步骤来鉴定存在于样品中的微生物并测定特定菌株的毒力的方法和产品。

处理顺序如下：

获得样品之后，根据试剂盒的具体说明提取DNA，这确保了提取的DNA的质量和数量具有良好结果。一般而言，来自胃活组织检查、纯培养物、体液或粪便的总DNA基于使用蛋白酶K处理样品，然后使用醇(乙醇-氯仿或异丙醇)沉淀。

通过多重PCR对幽门螺旋杆菌菌株进行基因分型，其在于同时扩增多个基因，所以冻干的PCR球包含扩增所需的所有反应物(dNTP、Taq聚合酶、特异性引物、反应缓冲液、MgCl₂)，这些必须以适量的水复原至15-30μL的终体积。所需的杂交温度范围是40至55℃，使用30至45个PCR循环。作为最初的条件，使用即用型PCR珠子(Amersham

)和0.1至10ng/μL DNA(之前提取的)。

最后，根据以下程序，在具有程序控制的热循环仪中进行扩增：

●最初变性程序的温度介于80至98℃，持续1至15分钟的时间，

●然后使用相同的温度范围进行软变性(soft denaturation)，持续0.1至3分钟的时间，

●然后，在45至60℃的温度范围进行杂交，持续1至70秒的时间，

●在65至75℃的温度进行最初延伸阶段，持续60秒，

●在与最初延伸相同的温度范围进行最终延伸阶段，持续3至10分钟。

试剂盒包含可用于所有阶段、尤其是扩增阶段的阴性对照(人类基因组DNA)。试剂盒还包含阳性对照(幽门螺旋杆菌DNA菌株ATCC 43504)，其是作为模板的DNA序列；这些对照平行运行。使用3％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳分析该扩增的产物并使用溴化乙啶(0.5μg/μL，或sybr green，图2)染色。使用的阳性对照是来自幽门螺旋杆菌ATCC43504对照菌株的基因组DNA的基因cagA和vacAm1的多重PCR扩增样式。使用3％的琼脂糖凝胶电泳分析扩增的片断，然后以溴化乙啶染色并使用紫外透射仪显示。

如果DNA含量不足以扩增所需的所有基因，本发明通过使用一式两份培养物样品来解决此问题，其是该具体程序中考虑到的方面。但是，本发明证明少量的DNA(1ng/μL)足以扩增多个基因，不论是同时或是分开地，没有任何问题。

本发明包括试剂盒，其是即用型产品，其能够同时检测5种基因：一种幽门螺旋杆菌鉴定基因、三种毒力基因：vacAm1、cagA和dupA；以及测定DNA提取物质量的一对引物(通用的真细菌基因16-23S)。

本发明还包括考虑到反应物和阶段的试剂盒和方法，因此具有以下元件：

I.从样品提取DNA的阶段。这个是可选的，根据处理的样品类型而定。

II.反应和PCR多重扩增阶段。经过处理的并且其结果是纯DNA的每个样品经历这个阶段。

试剂盒包括扩增反应物以进行多重PCR技术以及阳性和阴性对照。

PCR反应物

反应缓冲液，即Tris-HCl，pH介于8.5至9.5，KCl的浓度范围是480至560mM，MgCl₂的浓度范围是10至20mM，热稳定的酶Taq聚合酶介于400至6000U，MgCl²⁺，dNTP(2′-脱氧核苷5′-三磷酸酯，含有4种二核苷酸，dATP、dCTP、dGTP、dTTP，浓度范围是15至30mM)，和特异性引物(见表2)。

所有这些反应物以两种形式存在于试剂盒中：脱水、无菌且冻干的，或者是液体且无菌的。任选地，试剂盒可以包括分子生物学测试所需的质量级的水。试剂盒还包括阳性和阴性DNA对照，其分别获自保藏物ATCC43504的幽门螺旋杆菌菌株的纯培养物和人类基因组。

表2.用于检测幽门螺旋杆菌毒力和识别基因的引物的序列表

III.检测的基因的显示和数据分析阶段

该阶段包括制备3％的琼脂糖凝胶，凝胶以及特异性分子量标志物可以作为一个选项包括在试剂盒中。

通过产生DNA差别染色的反应进行样品显示，例如，使用溴化乙啶染色，然后暴露于紫外光。试剂盒指明了DNA染色方法并且可以包括其它的使用溴化乙啶或替代物例如sybr green等的DNA染色方法，因为对于本发明而言染色方法不是限制性的。此外，试剂盒还有简单的使用者手册。

实施例

程序

本试剂盒可以同时检测至少4种基因：1种幽门螺旋杆菌鉴定基因和3种毒力基因vacAm1、cagA和dupA。此外，试剂盒包括测定DNA提取物质量的引物组合。试剂盒具有用于从幽门螺旋杆菌样品和/或纯培养物中正确提取DNA所需的步骤说明。

试剂盒提供了多重PCR分析所需的反应物，使用无菌冻干的球体或无菌液体，以及分子量标志物，任选地可以包括用于制备凝胶的琼脂糖和用于基因显示的指示剂，例如溴化乙啶或sybr green。

一般性程序见图1，其显示了使用本发明的试剂盒的一般方案，其中的变量为：

●当使用必须从中提取DNA的样品时，例如GB(胃活组织检查样品)，按照步骤A列进行，

●E是DNA提取阶段，

●当已经分离了纯的幽门螺旋杆菌菌株时，按照B列进行相同的程序，

●DNA是从含有幽门螺旋杆菌样品提取的DNA，

●多重PCR是样品进行多重PCR的阶段。对于那些通过从胃活组织检查样品、粪便分离DNA获得的样品或那些从直接分离的细菌获取DNA的样品，该阶段是相同的。该阶段的目标是鉴定并检测幽门螺旋杆菌毒力基因，

●显示是该过程的最后一个阶段，其中使用琼脂糖凝胶电泳获得结果，然后染色并分析结果。

实施例1：试剂盒应用于胃活组织检查样品

这不是本技术的限制性实施例，仅是开发的试剂盒的特定应用。

样品：

从26位患者(他们就胃与十二指肠问题看过医生)的胃窦和胃体分析56例活组织检查。幽门螺旋杆菌菌株ATCC 43504、ATCC 25695和96.978的样品用作阳性对照，人类基因组DNA的样品用作阴性对照。

1-第一个DNA提取阶段和次级阶段：

使用如下描述的反应物(可在提出的试剂盒中获得)提取DNA：裂解缓冲液(TrisHCl 10mM，EDTA 1mM，SDS 10％)；蛋白酶K(20mg/mL)；CTAB/NaCl溶液；氯仿∶异戊醇(24∶1)；苯∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1；乙醇和TE缓冲液。试验中包括分析的50例活组织检查样品；其它样品用作对照，使用Mazurier等人，(1992)的方法从幽门螺旋杆菌培养物的纯分离体中提取DNA。人类基因组DNA用作阴性对照。

2-第二个阶段：使用多重PCR扩增幽门螺旋杆菌

在本发明的基因分型的情况下，使用多重PCR进行幽门螺旋杆菌菌株的DNA扩增，使用冻干的PCR球体(冻干的纯的Taq即用型PCR珠子，Lyophilised Pure Taq ready-to-go PCR Beads，Amersham，Pharmacia Biotech)，其包含10X的PCR缓冲液(Tris-HCl 100mM，pH 8.3，KCl 500mM和MgCl₂ 15mM)、Taq聚合酶和浓度为2.5U/μL的dNTP(2′-脱氧核苷5′-三磷酸酯，包含4种二核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，10mM)，MgCl₂(100mM)和特异性引物(10pmol/L)，以扩增幽门螺旋杆菌鉴定基因16S DNAr、DNAr16S EUB的质量和毒力基因vacAm1、dupA和cagA。将所有这些反应物复原在不含核酸酶的水中，终体积为15μL；向混合物中加入5μL之前提取的DNA。杂交温度介于50至74℃，使用39个扩增循环。

3-第三个阶段：扩增产物的显示和数据分析

在3％的琼脂糖凝胶中分析结果，70伏/秒，45分钟；将结果与分子量标志物对比，所述分子量标志物由HindIII消化酶消化的λ噬菌体DNA组成，其提供12个带的式样，每个100pb。溴化乙啶用于染色(0.5μg/mL)，通过暴露于紫外光来显示。最后，获取照片。获得的结果显示于图2。

如图2所示，在所有病例中，试剂盒所要检测的基因同时获得了阳性扩增。在患者的组织病理学诊断更加严重的病例中，本发明的试剂盒检出了所涉及的至少两个基因。在应用本试剂盒之后得出结论：具有某些胃与十二指肠病症的患者是在其胃与十二指肠样品中显示出毒力基因的患者；本试验中未显示这些基因的其它样品则不显示该病症。

实施例2：本发明和商售试剂盒的比较

将我们的技术与替代性商售试剂盒MPCR幽门螺旋杆菌试剂盒Cat N°.MP-700081进行对比。就结果而言后者显示出显著差异，如下所述：

1)后者不含有从胃活组织检查样品和/或幽门螺旋杆菌培养物中提取DNA所需的反应物或步骤。

2)后者没有提供反应物Taq聚合酶和dNTP，这意味着试剂盒使用者必须事先准备好这些物质。此外，它包括的反应物是无菌液体的形式，在温度变化时易于发生活性损失(它们必须储存在-20℃并在-20℃运输)。我们的发明包括两种形式可供选择：无菌冻干珠子(完全稳定，可在环境温度储存和运输)或无菌液体。

3)MPCR幽门螺旋杆菌试剂盒Cat N°.MP-700081检测基因ureA，根据国际文献中的报道，该基因并不是幽门螺旋杆菌专有的，这意味着上述试剂盒仅仅检测一种毒力基因(cagA)，而我们提出的发明包括至少3种毒力基因。

4)与我们的发明不同，后者未提供阴性对照。

5)我们的技术包括用于显示和分析结果(作为一种选择)的反应物和程序。

Claims

1.用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中所述方法包括以下步骤：

(a)DNA提取步骤，

(b)使用表1所示的引物通过多重PCR进行序列扩增的步骤，

(c)显示和数据分析步骤。

2.根据权利要求1的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中所述DNA提取步骤由下列阶段组成：

i.细胞裂解阶段，

ii.DNA制备阶段，

iii.DNA回收阶段。

3.根据权利要求1和2的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中在所述DNA提取步骤中，具体而言在细胞裂解阶段，使用棉球、蛋白酶K和CTAB/NaCl溶液。

4.根据权利要求1和2的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中在所述DNA提取步骤中，具体而言DNA制备阶段是通过氯仿、异戊醇的混合物或苯酚、氯仿和异戊醇的混合物进行的。

5.根据权利要求1和2的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中在所述DNA提取步骤中，具体而言在DNA回收阶段，使用下列引物进行目标序列的扩增：

a.幽门螺旋杆菌鉴定基因，幽门螺旋杆菌的16DNAr：

正向5′CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3′

反向5′CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3′，

b.毒力基因：

cag4：

正向5′TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3′；

反向：5′GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3′

vacAm等位基因1：

正向5′ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3′，

反向5′GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3′

基因dupA：

正向5′ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3′

反向5’TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3’，

c.DNA质量测定基因16S DNAr Eub：

正向5′GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3’，

反向5’GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3’。

6.根据权利要求1的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中该方法使用阳性和阴性DNA提取物对照。

7.根据权利要求1的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中所述阳性DNA提取物对照是幽门螺旋杆菌ATCC43504，并且所述阴性DNA提取物对照是人类基因组。

8.根据权利要求1的用于检测幽门螺旋杆菌菌株毒力的方法和试剂盒，其中所述显示步骤必须使用浓度介于1.2％至4％的琼脂糖凝胶。

9.根据权利要求1的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒除了对照之外还包含扩增反应物和适当的引物，任选地：

a.检测反应物和数据分析，

b.细胞裂解反应物，

c.沉淀反应物。

10.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述扩增反应物包括以下物质：

a.具有针对幽门螺旋杆菌的特异性引物的多重PCR反应物，

b.目标序列的扩增对照。

11.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述扩增反应物，具体而言用于多重PCR的反应物是：

a.反应缓冲液

b.热稳定酶Taq聚合酶，

c.核苷酸，

d.特异性引物，其针对幽门螺旋杆菌鉴定基因，幽门螺旋杆菌的16DNAr：

正向5′CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3′

反向5′CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3′，

e.毒力基因：

i.cagA：

正向5′TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3′；

反向：5′GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3′

ii.vacAm等位基因1：

正向5′ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3′，

反向5′GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3′

iii.基因dupA：

正向5′ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3′

反向5’TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3′，

任选的：

cagA：

正向：5′ACG ATA GGG ATA ACA GGC AAG C 3′；

反向：5′GAT CCG TTC GGAT TTG ATT CCC 3′；

cagA：

正向：5′TCAGAAATTTGGGGATCAGC 3′；

反向：5′ACATGGGGAACTGGTTCTTG 3′；

任选的：

vacAm1：

正向：5′GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3′；

反向：5′GCG CTC TTT GAA TTG CTC TT 3′；

iv.vacAm1：

正向：5′GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3′；

反向：5′TAG GCG CTC TTT GAA TTG CT 3′

f.DNA质量测定基因16S DNAr Eub：

正向5′GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3′，

反向5’GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3′。

12.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述扩增反应物的反应缓冲液由下列组成：Tris-HCl 100mM，pH介于8.5至9.5范围内，浓度介于480至560mM范围内的KCl，和浓度介于10至20mM范围内的MgCl₂。

13.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中用于序列扩增的Taq聚合酶的浓度介于400至6000U范围内。

14.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中二核苷酸的浓度介于15至30mM范围内。

15.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中使用的引物具有以下特征：

a.幽门螺旋杆菌鉴定基因，幽门螺旋杆菌的16DNAr：

正向5′CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3′

反向5′CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3′，

b.毒力基因：

i.cagA：

正向5′TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3′；

反向：5′GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3′

ii.vacAm等位基因1：

正向5′ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3′，

反向5′GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3′

iii.基因dupA：

正向5′ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3′

反向5’TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3’，

c.DNA质量测定基因16S DNAr Eub：

正向5′GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3’，

反向5’GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3’。

16.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中使用的引物的浓度介于1至20pmol/l范围内。

17.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中试剂盒中所有反应物以两种物理形式存在：

a.脱水、无菌且冻干的，或者

b.液体且无菌的。

18.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中目标序列的扩增对照是：

a.阳性对照：来自幽门螺旋杆菌菌株ATCC43504的DNA，

b.阴性对照：人类DNA。

19.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述引物是预先标准化的：

a.幽门螺旋杆菌鉴定基因，幽门螺旋杆菌的16DNAr：

正向5′CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3′

反向5′CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3′，

b.毒力基因：

i.cagA：

正向5′TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3′；

反向：5′GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3′

ii.vacAm等位基因1：

正向5′ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3′，

反向5′GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3′

iii.基因dupA：

正向5′ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3′

反向5’TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3’，

c.DNA质量测定基因16S DNAr Eub：

正向5′GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3’，

反向5’GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3’。

20.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述毒力基因、物种鉴定基因和DNA提取物质量基因一齐扩增。

21.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中由于扩增以25μl的体积、介于58至65℃的温度、35至45个循环进行，使用扩增珠子载体。

22.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中可以以浓度为1ng的DNA使用所述试剂盒。

23.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒包括允许测定所提取的DNA的质量的引物。

24.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒测定不同样品包括体液、组织或粪便中不同幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力。

25.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒允许鉴定毒力基因cagA，vacAm等位基因1和dupA基因。

26.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒允许使用基因16S DNAr鉴定幽门螺旋杆菌。

27.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒允许使用基因16S DNArEub的显示来测定DNA质量。

28.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒可以包括不含核酸酶的超纯水。

29.根据权利要求9的用于检测不同类型样品中幽门螺旋杆菌菌株的存在和毒力的试剂盒，其中所述试剂盒含有使用者手册。