CN102095869A

CN102095869A - 甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒

Info

Publication number: CN102095869A
Application number: CN2009102003836A
Authority: CN
Inventors: 穆海东; 汪宁梅; 穆宇豪; 王通
Original assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明公开了一种甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒，该试剂盒包括甲状腺功能检测蛋白芯片，芯片上包被有游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)抗体、游离甲状腺素(FT4)抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体(T3)、甲状腺素(T4)抗体、促甲状腺激素(TSH)抗体。本发明可以定量检测出病人血清FT3、FT4、T3、T4、TSH的含量，用于辅助诊断甲状腺功能紊乱疾病。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，采用的化学发光法能提高检测的灵敏度，并能够同时检测出多项指标，大大节约了时间和成本。

Description

甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于甲状腺功能检测蛋白芯片及其试剂盒。

背景技术

甲状腺是人体最大的内分泌腺，能分泌甲状腺素(T4)，三碘甲状腺原氨酸(T3)等激素。这些激素受由腺垂体分泌的促甲状腺素(TSH)的调节，对人体的蛋白质、脂肪、糖、维生素，水和盐的代谢以及人体的生长发育起着十分重要的作用。甲状腺功能紊乱为内分泌疾病中最常见者，并至今仍易被漏诊。据美国对11个城市4.6万人的普查中发现，有约11％的人存在未被诊断出的各种甲状腺功能紊乱。甲状腺功能紊乱可分为甲状腺功能亢进症(hyperthyroidism，简称甲亢)和甲状腺功能减退症(hypothyroidism，简称甲减)。

抗促甲状腺激素(TSH)是由腺垂体嗜碱细胞中的S细胞分泌的调节甲状腺功能的主要激素，半衰期60min。它是一种糖蛋白，分子量为28000。腺垂体TSH呈脉冲式释放，每2h～4h出现一次波动，日周期变化是清晨高而午后低。它能促进酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的缩合，促进细胞内RNA和蛋白质包括甲状腺球蛋白的合成等。过量的甲状腺素是TSH分泌最重要的生理抑制性因子，TSH浓度降低强烈提示甲状腺功能发生亢进。由于TSH检测技术灵敏度的提高使其不仅可区分甲状腺功能减低，诊断甲状腺功能亢进，亚临床型甲状腺功能减低或甲状腺功能亢进，甚至可以评价门诊和非甲状腺疾病住院病人甲状腺功能状况。

三碘甲状腺原氨酸(T3)分子量为651，大约65％由甲状腺直接产生，35％T4在外周组织脱碘形成。在外周血中，99.6％与甲状腺结合球蛋白(TBG)结合。T3是已知目前生物活性最强的甲状腺激素，其生物活性为T4的3倍～5倍，临床上一般将未与TBG结合的T3称为游离T3，即游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)，只有游离的T3具有代谢活性，而未结合的则没有。FT3可以通过细胞膜与受体结合发挥生理效应，因此它是甲状腺激素发生生理效应的的真正活性部分，能较确切地反映甲状腺的功能状态及其他对人体机能的影响。在多数甲状腺功能亢进病例中，血清T3和T4的升高相平行，而T3毒症时仅T3升高，T4在正常范围。甲状腺功能亢进病人在进行放射性或药物治疗过程中，血清T4降至正常，而T3仍高于正常，直至临床甲状腺功能恢复正常，血清T3才降至正常，故T3又可作为判断疗效的可靠指标。在某些疾病，如肝硬变时，T3可能降低，但只要甲状腺功能正常，T4则在正常范围。因此，作为评价甲状腺功能低下的指标，测定T3不如T4可靠。

甲状腺素(T4)是由甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌的甲状腺激素，半衰期为7d，其结构由一个酪氨酸残基和一个酚环组成，与T3的区别仅在于多一个碘原子。T4入血后约99.6％与结合蛋白结合，结合T4与游离甲状腺素(FT4)之间呈可逆的平衡状态，只有游离T4才能进入靶细胞与受体结合发挥其生理功能。甲状腺功能亢进，医源性或中毒性甲状腺功能亢进T4与FT4都升高；亚急性甲状腺炎或慢性淋巴细胞性甲状腺炎T4、FT4一过性升高；各种原因所致TBG升高，如雌激素，肝炎等，也使T4升高但FT4不升高；精神病及一些非甲状腺疾病病人，极少数人会出现T4升高，但并无甲状腺功能亢进症状，原发病缓解后T4恢复正常。甲状腺功能减低时，T4降低，且T4的降低先于T3的降低，甲状腺缺乏或先天性发育不良及甲状腺全切后，血清TT4降低。各种原因所致的甲低病例中，FT4均显著低于正常范围，但妊娠36周后，FT4呈正常生理性降低。

酶联免疫吸附法(ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是目前国内市场上检测甲状腺功能相关指标的主要手段。但由于ELISA方法操作繁琐、耗时较长，且检测范围以及灵敏度不如CLIA，目前已逐步处于被淘汰的阶段。虽然CLIA检测结果准确、灵敏度高，但由于国内目前技术不够成熟，主要还是应用国外的电化学发光(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)等自动化免疫检测仪，其操作体系封闭，必须配备昂贵的仪器以及专用的试剂盒，成本高且只能进行单指标检测(一般医院对甲状腺功能进行检测时会同时对多项指标进行检测)，在国内不易推广。

因此市场上需要一种成本更低、检测范围广，能够节省检测时间、提高检测效率的甲状腺功能类检测产品。

发明内容

本发明要提供一种专门用于甲状腺功能检测的蛋白芯片及其试剂盒。解决目前市场上甲状腺功能检测产品检测能力单一、检测成本高，并且没有集成化的缺点。

本发明的技术方案如下：提供一种甲状腺功能检测蛋白芯片，包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体中两种或两种以上抗体的微点阵。

所述的反应孔由两类组成，一类反应孔包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体，另一类反应孔包被有三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体。

所述的两类反应孔按1∶1的数量排列于基板上。

所述的各类反应孔数量为4-30。

所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体在固相载体上各有2-8个点样点，在每一反应孔内还包被有一定位基准点。

所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

本发明还提供了一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，它包括权利要求1所述的甲状腺功能检测蛋白芯片。

还包括：酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照品。

所述的酶标工作液由HRP标记的抗体、抗原或抗原类似物组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。

所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

本发明将目前医院最常检测的甲状腺功能项目集中于一张芯片上，可同时对同一血清的5项指标进行检测。该发明可以大大节省时间和资源，提高检测效率、降低检测成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：一种甲状腺功能检测蛋白芯片的制备

其步骤主要是：(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，在奇数列反应孔中用FT3抗体和FT4抗体作为包被的抗体，在偶数列反应孔中用T3抗体、T4抗体和TSH抗体作为包被的抗体；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。

上述用于检测甲状腺功能的蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤：

1.甲状腺功能检测相关抗原抗体等的确定：

用于制备甲状腺功能检测蛋白芯片检测指标抗原的购买自Fitzgerald；

FT3、FT4类似物购买自Sigma-aldrich；

所采用的检测抗体买自Meridian life。

2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片

用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10×5矩形阵列，当点直径为0.1mm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mm×5mm；点样后贴膜，封闭；最后将芯片干燥、包装后于4℃保存。

3.蛋白芯片组装

用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。

实施例2：试剂盒的制备

一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，由甲状腺功能检测蛋白芯片，标准品，质控品，样本稀释液，酶标工作液，浓缩洗涤液，检测液组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法：

1.甲状腺功能检测蛋白芯片为6×8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。

2.标准品提供12管，每管0.2ml。

用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配置，其中T3、T4、FT3、FT4和TSH标准品的终浓度见下表：

3.质控品提供4瓶，每瓶0.2ml。

质控品分为4个浓度，分别是质控品I、质控品II、质控品III、质控品IV。这四个质控品为分别含有不同浓度的不同抗原混合液。

质控品是用含有3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制，下表显示T3、T4、FT3、FT4和TSH质控品的终浓度及质控界限。

上述质控品质控界限测定方法如下：

分别由2个实验人员按照标准实验操作检测质控品，重复4次/板，每天每人重复测2块芯片，重复检测10天，分别计算质控品的均值和标准差，质控界限为X±15％。

4.样本稀释液

由3％ BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀释血清样本(体积比1∶1)。

5.酶标工作液

由3％BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)配成溶液，酶标工作液I含有HRP标记的T3、T4抗原和TSH单克隆抗体；酶标工作液II含有HRP标记的FT3、FT4类似物，以上两种酶标工作液均含有检测抗体HRP-羊抗兔IgG。提供1.5ml，各1瓶。

6.浓缩洗涤液(10×)

为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成：磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.1g，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。提供50ml，1瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。

7.检测液

使用PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。

实施例3：蛋白芯片及试剂盒的应用及检测

本发明所述的用于检测甲状腺功能的蛋白芯片的应用，主要采用竞争法和双抗夹心法检测人血液中的相关指标。方法是将人血清加于芯片表面，再加入酶标工作液，直接进行反应；加入检测液后1分钟，扫描并收集信号，样本点的信号强度与血清中抗原的浓度成线性关系。

在上述用于检测甲状腺功能的蛋白芯片试剂盒的应用中，其抗原抗体反应及检测的具体使用方法如下：

(1)对喷点抗体、阳性对照、阴性对照的芯片用3％BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；

(2)甩干封闭液后，室温放置4小时，进行干燥；

(3)在芯片的反应区域，加入人血清样品、标准品，质控品；每孔加100ul；

(4)在基数列加入酶标工作液I，在偶数列加入酶标工作液II，50ul/每孔。置于恒温反应仪中37℃，振荡反应1小时，使充分反应；

(5)反应结束后，在反应仪上洗涤5次，洗液量设置为每孔350ul。

(6)将PIERCE公司的

ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的检测液A液和B液1∶1混合，加入芯片上各反应区域上，每阵列加60ul，进行化学发光；

(7)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。

Claims

1.一种甲状腺功能检测蛋白芯片，包括基板和位于基板上的反应孔，其特征在于：所述的反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体中两种或两种以上抗体的微点阵。

2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的反应孔由两类组成，一类反应孔包被有游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体，另一类反应孔包被有三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体。

3.如权利要求2所述的反应板，其特征在于，所述的两类反应孔按1∶1的数量排列于基板上。

4.如权利要求3所述的反应板，其特征在于，所述的各类反应孔数量为4-30。

5.如权利要求1或2所述的反应板，其特征在于，所述的游离三碘甲状腺原氨酸抗体、游甲状腺素抗体、三碘甲状腺原氨酸抗体、甲状腺素抗体、促甲状腺激素抗体在固相载体上各有2-8个点样点，在每一反应孔内还包被有一定位基准点。

6.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

7.一种甲状腺功能检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的甲状腺功能检测蛋白芯片。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括：酶标工作液和检测液、阴性对照、阳性对照品。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的抗体、抗原或抗原类似物组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。