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CN102083856A - 经修饰的因子ix多肽及其用途 - Google Patents

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CN102083856A
CN102083856A CN2009801227842A CN200980122784A CN102083856A CN 102083856 A CN102083856 A CN 102083856A CN 2009801227842 A CN2009801227842 A CN 2009801227842A CN 200980122784 A CN200980122784 A CN 200980122784A CN 102083856 A CN102083856 A CN 102083856A
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polypeptide
fix
amino acid
glycosylation sites
factor
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CN2009801227842A
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艾伦·布鲁克斯
约翰·E·墨菲
马里安·塞托
蒋晓乔
钱德拉·帕特尔
尤维·格里赞
科尼利亚·柯克纳
乌尔里克·豪普茨
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Bayer Pharma AG
Bayer Healthcare LLC
Original Assignee
Bayer Schering Pharma AG
Bayer Healthcare LLC
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Abstract

本发明涉及经修饰的因子IX多肽，诸如具有一个或多个引入的糖基化位点的因子IX多肽。经修饰的因子IX多肽可以展现出升高的体外或体内稳定性诸如较长的血浆半衰期。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血友病B的患者的方法。

Description

经修饰的因子IX多肽及其用途
本申请要求2008年4月16日提交的美国临时申请流水号61/124,567和2008年4月17日提交的美国临时申请流水号61/045,961的权益，通过提及而将其内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及经修饰的因子IX多肽，诸如具有一个或多个引入的糖基化位点的因子IX多肽。经修饰的因子IX多肽可以展现出升高的体外或体内稳定性诸如较长的血浆半衰期。本发明还涉及生成经修饰的因子IX多肽的方法，和使用经修饰的因子IX多肽例如来治疗罹患血友病B的患者的方法。
发明背景
血友病B影响着34,500名男性中的一名，并且是由编码因子IX(FIX)的基因的多种遗传缺陷引起的，所述遗传缺陷导致血液中低的或检测不到的FIX蛋白(Kurachi等，Hematol.Oncol.Clin.North Am.6：991-997，1992；Lillicrap，Haemophilia 4：350-357，1998)。不足水平的FIX导致有缺陷的凝固和源自不受控制的出血的症状。通过静脉内输注血浆衍生的或重组的FIX蛋白以停止已经启动的出血或阻止出血发生(预防)来有效地治疗血友病B(Dargaud等，Expert Opin.Biol.Ther.7：651-663；Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。有效的预防要求维持约1％正常水平的最低谷水平的FIX(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。由于约18至24小时的天然FIX(血浆衍生的或重组的)半衰期，FIX水平在推注后3至4天内下降至正常水平的小于1％，这使平均每三天重复注射成为必要以实现有效的预防(Giangrande，Expert Opin.Pharmacother.6：1517-1524，2005)。此类频繁的静脉内注射对于患者而言是成问题的，而且是实现有效预防的一项障碍(Petrini，Haemophilia 13 Suppl 2：16-22，2007)，尤其在儿童中。具有较长半衰期的FIX蛋白会实现较小频率的施用，并且如此是有显著医学益处的。
发明概述
本申请提供了FIX多肽(也称为经修饰的FIX多肽、FIX突变蛋白、或FIX变体)，其包含已经通过引入一个或多个糖基化位点来修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个糖基化位点可以是N-连接的糖基化位点。在一些实施方案中，所述多肽具有凝固活性。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以包含至少一处取代，诸如但不限于R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以包含R338A和V86A取代两者。
本申请还提供了包含已经通过引入一个或多个糖基化位点进行过修饰的氨基酸序列的FIX多肽。所述FIX多肽可以进一步包含附接于一个或多个引入的糖基化位点的碳水化合物链。在一些实施方案中，所述碳水化合物链可以是N-连接的碳水化合物链。在一些实施方案中，所述碳水化合物链可以具有哺乳动物碳水化合物链结构。在一些实施方案中，所述碳水化合物链可以具有人碳水化合物链结构。在一些实施方案中，相对于缺乏引入的糖基化位点的多肽，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链可以将多肽的血清半衰期增加例如至少30％。在一些实施方案中，相对于缺乏引入的糖基化位点的分泌性多肽的量，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链未将分泌性多肽的量降低例如超过50％。在一些实施方案中，相对于缺乏引入的糖基化位点处的碳水化合物链的多肽与FVIII、FXI、或FX的相互作用，在一个或多个引入的糖基化位点附着碳水化合物链未将多肽与因子VIII(FVIII)、因子XI(FIX)、或因子X(FX)中至少一种的相互作用抑制超过50％。在一些实施方案中，经修饰的多肽可以具有例如每mg多肽至少100个单位的比活。
可以经由一个或多个氨基酸取代来引入一个或多个糖基化位点。取代可以在表面暴露的残基处和/或限于不引入已知与血友病B有关的突变的取代。例示性的实施方案包括包含一个或多个取代的FIX多肽，所述取代诸如但不限于：
(a)G4T；E33N；E36T；E36N；R37N；F75N；F77T；E83T；D85N；V86A；K91T；A103T；V107T；K122N；K122T；S138N；A146N；T148N；F150T；P151N；T159N；A161T；A161N；T169N；Q170N；T172N；D177N；D177E；F178T；K201N；K201T；K214T；V223N；G226N；Y226T；K228N；K228T；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；R338A；R338N；K341N；F353N；H354V；H354I；E355T；V370N；T371V；T371I；E372T；E374N；M391N；K392V；G393T；E410N；K413N；L414I；
(b)Y1N和S3T；S3N和K5T；G4N和L6T；K5N和E7T；L6N和E8T；E7N和F9T；F9N和Q11T；V10N和G12T；Q11N和N13T；G12N和L14T；N13(N13T)和E15T；L14N和R16T；E15N和E17T；M19N和E21T；E20N和K22T；S24N和E26T；F25N和E27T；E26N和A28T；E27N和R29T；A28N和E30T；R29N和V31T；E30N和F32T；V31N和E33T；F32N和N34T；T35N和R37T；T38N和E40T；T39N和F41T；E40N和W42T；F41N和K43T；W42N和Q44T；K43N和Y45T；Q44N和V46T；Y45N和D47T；V46N和G48T；E52N和N54T；S53N和P55T；G59N和S61T；K63N和D65T；I66N和S68T；S68N和E70T；G76N和E78T；E78N和K80T；E83N和D85T；L84N和V86T；I90N和N92T；K100N和S102T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；K106N和V108T；R116N和A118T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；A127N和P129T；V135N和V137T；S136N和S138T；V137N和Q139T；Q139N和S141T；T140N和K142T；S141N和L143T；E147N和V149T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；Y155N和N157T；V156N和S158T；S158N和E160T；T159N和A161T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；L165N和N167T；D166N和I168T；I168N和Q170T；T169N和S171T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；G184N和D186T；E185N和A187T；D186N和K188T；A187N和P189T；P189N和Q191T；G200N和V202T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；V227N和I229T；H236N和I238T；I238N和E240T；E240N和E242T；T241N和H243T；H243N和E245T；K247N和N249T；V250N和R252T；I251N和I253T；I253N和P255T；A261N和I263T；A262N和N264T；D276N和P278T；V280N和N282T；F302N和S304T；S304N和Y306T；R312N和F314T；V313N和H315T；F314N和K316T；H315N和G317T；K316N和R318T；G317N和S319T；S319N和L321T；A320N和V322T；R327N和P329T；P329N和V331T；D332N和A334T；L337N和S339T；S339N和K341T；T340N和F342T；T343N和Y345T；G352N和H354T；F353N和E355T；H354N和G356T；E355N和G357T；G356N和R358T；G357N和D359T；E372N和E374T；W385N和E387T；G386N和E388T；A390N和K392T；
(c)D85N、K122T、和I251T；D85N、K122T、和E242N；E125N、P126A、和A127T；P126N、V128T、和P129A；T148N、F150T、和P151A；F150N、P151A、和D152T；P151N、V153T、和A161N；P151N、V153T、和T172N；V153N、Y155T、和E294N；T172N、G226N、和K228T；F353N、H354V、和E355T；F353N、H354I、和E355T；V370N、T371V、和E372T；V370N、T371I、和E372T；M391N、K392V、和G393T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；T148N、F150T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、和R338A；P151N、V153T、D177E、和F178T；P151N、V153T、G226N、和K228T；T172N、G226N、K228T、和R338A；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；K122T、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；T148N、F150T、G226N、K228T、和R338A；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T；P151N、V153T、D177E、F178T、和R338A；P151N、V153T、G226N、K228T、和R338A；和P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和R338A；和其任意组合。
可以将一个或多个糖基化位点引入FIX的催化域或激活肽中。例示性的实施方案包括包含一个或多个取代的FIX多肽，所述取代诸如但不限于：R37N；D85N；K122T；S138N；A146N；A161N；Q170N；T172N；D177N；F 178T；K201N；K228N；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；E374N；和E410N。其它实施方案可以包括包含一个或多个取代的下列FIX多肽，所述取代诸如：G59N和S61T；K63N和D65T；G76N和E78T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；S136N和S138T；Q139N和S141T；T140N和K142T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；V156N和S158T；S158N和E160T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；D166N和I168T；I168N和Q170T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；T241N和H243T；I251N和I253T；I253N和P255T；A262N和N264T；V280N和N282T；T343N和Y345T；和E372N和E374T；F150N、P151A、和D152T。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如例如R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。
可以通过将O-连接的糖基化位点转变为N-连接的糖基化位点来引入一个或多个糖基化位点。例示性的实施方案包括取代，诸如但不限于T169N；T172N；T148N和F150T；和T159N和A161T。在一些实施方案中，所述取代可以是T172N；T148N和F150T；和T159N和A161T。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如但不限于R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。
可以通过在氨基酸残基160-164之间插入1-12个氨基酸残基来引入一个或多个糖基化位点。可以在氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164之间引入糖基化位点。在一些实施方案中，可以在氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164之间引入SEQ ID NO：2。在其它实施方案中，可以通过将1-12个氨基酸残基添加至FIX多肽的C端来引入糖基化位点。在一些实施方案中，可以将SEQ ID NO：4、5、6、或7引入FIX多肽的C端。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代D177E和F178T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代P151N和V153T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代T172N。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代P151N、V153T、和T172N。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代T148N和F150T。在一些实施方案中，所述多肽可以进一步包含氨基酸取代G226N和K228T。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。
在例示性的实施方案中，提供了包含一个或多个取代的经修饰的FIX多肽，所述取代诸如：D85N；K122T；S138N；T172N；K201N；K228N；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；G59N和S61T；G76N和E78T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；S136N和S138T；Q139N和S141T；T140N和K142T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；S158N和E160T；E162N和I164T；T163N和L165T；T172N和S174T；Q173N和F175T；K201N和D203T；T225N和V227T；G226N和K228T；I253N和P255T；A262N和N264T；V280N和N282T；E372N和E374T；F150N、P151A、和D152T；A161和E162之间的SEQ ID NO：2插入；和G226N、K228T、和A161和E162之间的SEQ ID NO：2插入。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如例如R338A和V86A。在一些实施方案中，所述经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。
本申请还提供了包含R338A取代和V86A取代的FIX多肽。在一些实施方案中，所述多肽可以具有每mg多肽至少700个单位的比活。
本申请还提供了药物制剂，其包含经修饰的FIX多肽和药学可接受载体。
本申请还提供了用于治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的本文中所描述的药物制剂。
本申请还提供了编码经修饰的多肽的DNA序列，以及用所述DNA序列转染的真核宿主细胞。
本申请还提供了用于生成经修饰的FIX多肽的方法，包括(i)通过引入一个或多个糖基化位点来修饰所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容许在所述一个或多个糖基化位点糖基化的方式表达所述多肽；并(iii)纯化所述多肽。
附图简述
图1描绘了来自8种物种的激活肽内的FIX序列的多序列比对。
图2描绘了对来自用FIX的糖基化位点突变蛋白转染的HKB11细胞的培养基的Western印迹分析。使用抗FIX-HRP抗体来检测FIX蛋白。
图3描绘了HKB11细胞中FIX糖基化位点突变蛋白的表达和活性的表。通过ELISA来测定表达，并通过aPTT测定法来测定活性。比活计算为每mg FIX蛋白的国际单位。将数值转变为相同转染实验中运行的FIX-R338A的百分比。(无)：迁移率没有变化，(+)：迁移率降低，其中+数目指明了程度，(-)：迁移率升高。
图4描绘了HKB11细胞中FIX糖基化位点突变蛋白的表达水平、凝固活性、和比活。数值表示为FIX-R338A突变蛋白的百分比。图3中描绘了构建体。
图5描绘了对来自用FIX的G226N、K228T糖基化位点突变蛋白转染的HKB11细胞的培养基的Western印迹分析。使用抗FIX-HRP抗体来检测FIX蛋白。
发明详述
本申请提供了包含一个或多个O-或N-连接的糖基化位点的FIX多肽。可以使用治疗性蛋白质的糖基化升高来实现1)降低的免疫原性；2)较小频率的蛋白质施用；3)升高的蛋白质稳定性，诸如增加的血清半衰期；和4)不利副作用诸如炎症的降低。
本申请提供了具有一个或多个别的糖基化位点的人FIX变体。经修饰的FIX多肽还可以具有延长的血浆半衰期，其在血友病B患者中会提供例如针对出血的保护时间延长。经修饰的FIX多肽会以比目前可用的野生型FIX蛋白疗法可能的注射更少的FXI注射使血友病B患者能够实现针对出血的保护。
本申请提供了许多例示性FIX变体，其中在催化域和激活肽两者中创建功能性糖基化位点。此外，本申请表明这些变体可以在哺乳动物细胞中表达，具有指明糖基化升高的表观分子量增加，而且在凝固测定法中维持50％-100％的活性。最后，这些修饰位点可以与增强FIX比活的改变(包括但不限于R338A取代和/或V86A取代)组合(Chang等，J.Biol.Chem.273：12089-12094，1998和Chang等，J.Biol.Chem.277：25393-25399，2002)。与R338A和V86A取代之一或两者的组合补偿源自糖基化位点添加的任何活性降低，使得经修饰的多肽的比活可以类似于或高于野生型FIX的。
一旦表达，野生型FIX是一条约55,000道尔顿的单链糖蛋白。可以认为它在结构上具有四种域：富含Gla或γ-羧基谷氨酸的域；EGF样区；激活肽；和含有活性位点的催化域(Thomson，Blood 67：565-572，1986)。FIX在肝中以461个氨基酸的单链多肽合成，并且在通过高尔基和内质网过程中经历广泛的翻译后修饰(Nemerson等，CRC Crit.Rev.Biochem.9：45-85，1980；Stenflo等，Annu.Rev.Biochem.46：157-172，1977)。除去信号序列和前肽两者，导致415个氨基酸(SEQ ID NO：1)的成熟蛋白(Choo等，Nature 299：178-180，1982；Kurachi等，Proc Natl Acad Sci USA 79：6461-6464，1982)。有效的γ-羧基化对于FIX的凝固活性是至关重要的，并且在人中，在N端Gla域内生成12个Gla残基，虽然对Gla36和Gla40的γ-羧基化是功能不需要的(DiScipio等，Biochemistry18：899-904，1979；Gillis等，Protein Sci.6：185-196，1997)。另外，FIX含有两个N-连接的糖基化位点(N157、N167)、六个O-连接的糖基化位点(S53、S61、T159、T169、T172、T179)、和各用于Ser磷酸化(S158)、酪氨酸硫酸化(Y155)和β-羟基化(D64)的一个位点(McMullen等，Biochem.Biophys.Res.Commun.115：8-14，1983)。
激活的因子VII(FVII)通过与由于对血管壁的损伤而暴露的组织因子(TF)形成复合物来启动正常的止血过程。随后，复合物激活FIX；活性形式称为FIXa。通过由因子XIa(FXIa)或组织因子(TF)/因子VIIa复合物在两个位点处进行的蛋白水解切割来除去FIX的激活肽以生成催化活性分子，即因子IXa(FIXa)。FIXa和因子VIIIa(FVIIIa)将FX转化成因子Xa(FXa)，其继而将凝血酶原转化成凝血酶。然后，凝血酶将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，导致血纤蛋白凝块的形成。
因为野生型FIX具有许多翻译后修饰(已经提示了其中一些在体内药动学概况(profile)中起作用)，可以在不影响这些其它修饰的位置处引入异位糖基化位点。一旦生成，FIX应当保持酶促活性，并与FVIII、FXI、和FX相互作用以有效治疗血友病B。引入的糖基化位点不应干扰这些相互作用和功能。本申请部分提供了对FIX的修饰，其可能在最小的功能干扰的情况中导致糖基化位点数目增加，并且如此具有提高FIX的生物利用度的效用。最后，这些修饰位点可以与增强FIX比活的改变(包括但不限于R338A突变和/或V86A突变)联合。增强FIX比活的改变可以补偿凝固活性的潜在损失，而且还通过在较低的蛋白质水平赋予功效来潜在地延长经修饰分子的功效。
经修饰的FIX多肽
本申请提供了包含一个或多个引入的糖基化位点的FIX多肽，即经修饰的FIX多肽。如本文中所使用的，“因子IX”指人血浆FIX糖蛋白，其是固有凝固途径的成员，而且对于血液凝固是至关重要的。要理解的是，此定义包括天然以及重组形式的人血浆FIX糖蛋白。除非另有规定或指明，如本文中所使用的，FIX指其在凝固中的正常作用中的任何功能性人FIX蛋白分子，包括任何其片段、类似物、变体、和衍生物。术语“片段”、“衍生物”、“类似物”、“突变蛋白质”、和“变体”在提及本申请的多肽时指保留基本上相同生物学功能或活性的多肽片段、衍生物、类似物、突变蛋白质、和变体。
FIX多肽的非限制性例子包括FIX、FIXa、和具有FIX活性的截短型式的FIX。任何维持至少某种程度的FIX活性的上述FIX多肽的生物学活性片段、删除变体、取代变体、或添加变体也可以充当FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可以包含与SEQ ID NO：1至少约70、80、90、或95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽是生物学活性的。可以通过例如本文中所描述的凝固测定法来测定生物学活性。
经修饰的FIX多肽还可以含有保守的氨基酸取代。保守取代在本领域中公认为用一种氨基酸替换另一种具有相似特性的氨基酸，并且包括例如丙氨酸变化为丝氨酸；精氨酸变化为赖氨酸；天冬酰胺变化为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变化为谷氨酸；半胱氨酸变化为丝氨酸；谷氨酰胺变化为天冬酰胺；谷氨酸变化为天冬氨酸；甘氨酸变化为脯氨酸；组氨酸变化为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变化为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变化为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变化为精氨酸；甲硫氨酸变化为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变化为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变化为苏氨酸；苏氨酸变化为丝氨酸；色氨酸变化为酪氨酸；酪氨酸变化为色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸变化为异亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，在引入一个或多个糖基化位点外，SEQID NO：1的FIX多肽还包含1-30、1-20、或1-10处保守的氨基酸取代。
特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸、和三字母缩写如下：A，丙氨酸(Ala)；C，半胱氨酸(Cys)；D，天冬氨酸(Asp)；E，谷氨酸(Glu)；F，苯丙氨酸(Phe)；G，甘氨酸(Gly)；H，组氨酸(His)；I，异亮氨酸(Ile)；K，赖氨酸(Lys)；L，亮氨酸(Leu)；M，甲硫氨酸(Met)；N，天冬酰胺(Asn)；P，脯氨酸(Pro)；Q，谷氨酰胺(Gln)；R，精氨酸(Arg)；S，丝氨酸(Ser)；T，苏氨酸(Thr)；V，缬氨酸(Val)；W，色氨酸(Trp)；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸(Nle)。
多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指将碳水化合物模块附接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物模块酶促附接于Asn侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列之任一的存在创建潜在的N-连接的糖基化位点。可用于本发明的例示性N-连接的糖基化位点也可以如下表示：X1-Asn-X2-X3-X4；其中X1任选地是Asp、Val、Glu、Gly、或Ile；X2是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr；而X4任选地是Val、Glu、Gly、Gln、或Ile。在一些实施方案中，X1任选地是Asp；X2是Ser；X3是Thr；而X4是Gln。在一些实施方案中，X1是Asp；X2是Ile；X3是Thr；而X4是Gln。通过改变氨基酸序列使得引入一种或多种上文所描述的三肽序列来实现N-连接的糖基化位点向FIX多肽的添加。
O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附接于羟基氨基酸，最通常至丝氨酸或苏氨酸，虽然附接于5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也是有可能的。可以通过改变氨基酸序列使得引入一个或多个Ser或Thr残基来实现O-连接的糖基化位点向FIX多肽的添加。
可以例如通过删除一个或多个氨基酸残基、用另一种氨基酸替换一个或多个内源FIX氨基酸残基、或者添加一个或多个氨基酸残基来引入糖基化位点。氨基酸残基的添加可以在两个现有的氨基酸残基之间或者在天然FIX分子的N-或C-端末端。
所使用的氨基酸取代的术语如下。第一个字母代表在人FIX的位置上天然存在的氨基酸残基。后面的数字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中的位置。第二个字母代表取代(替换/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。举例而言，R338A表示SEQ ID NO：1的第338位Arg残基已经用Ala残基替换。关于包含人FIX多肽的额外的5’氨基酸序列(46个氨基酸)的SEQ ID NO：26，SEQID NO：1的第338位对应于SEQ ID NO：26的第384位。
本文中所使用的FIX残基数目系统指成熟人FIX蛋白的，其中残基1代表除去信号序列和前肽两者后的成熟FIX多肽的第一个氨基酸。天然的或野生型FIX是全长成熟人FIX分子，如SEQ ID NO：1中所显示的。
在一些实施方案中，在FIX中在不会消除蛋白质功能或其在细胞中表达的位置处工程化改造糖基化位点。为了设计包含一个或多个引入的糖基化位点的FIX多肽，可以应用数项标准。在一些实施方案中，引入的糖基化位点是表面暴露的。可以基于溶剂可接近表面积来测定表面暴露，如Autin等(J.Thromb.Haemost.3：2044-56，2005)中所测定的。在一些实施方案中，引入的糖基化位点没有引入已知与血友病B有关的突变。已知的突变可以参见环球网于kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html和表1。
表1
Figure BPA00001277735800101
Figure BPA00001277735800111
Figure BPA00001277735800121
Figure BPA00001277735800131
比较具有一个或多个引入的糖基化位点的经修饰的FIX多肽与对照多肽的特性可以为想要的。进行比较的特性包括例如溶解度、活性、血浆半衰期、糖基化位点、和结合特性。在一些实施方案中，可将经修饰的FIX多肽糖基化。选择最适合于比较的对照多肽是在本领域技术人员的范围内的。在一些实施方案中，对照多肽与经修饰的多肽可以是相同的，只是一个或多个引入的糖基化位点。例示性多肽包括野生型FIX多肽和包含一个或多个激活取代诸如R338A和/或V86A的FIX多肽。
本申请的一方面提供了经修饰的FIX多肽，其具有超过对照多肽的升高的体外或体内稳定性。延长的血清半衰期和体内稳定性对于降低实现治疗效率所要求的剂量给药频率可以为想要的。因而，在某些实施方案中，相对于对照蛋白质，糖基化的FIX多肽具有升高约20、30、40、60、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000％的血清半衰期。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、或至少20天或更多的血清半衰期。
如本文中所使用的，术语“半衰期”在对患者施用多肽药物的上下文中定义为患者中药物的血浆浓度降低一半所需要的时间。用于药动学分析和测定半衰期和体内稳定性的方法会是本领域技术人员熟悉的。详情可以参见Kenneth等，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。也可参考“Pharmacokinetics，”M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2次修订版(1982)，其描述了药动学参数诸如t-α和t-β半衰期和曲线下面积(AUC)。
经修饰的FIX多肽的活性可以描述为绝对值，诸如按单位计，或者为对照多肽活性的百分比。在一些实施方案中，相对于对照蛋白质，经修饰的FIX多肽可以具有没有降低超过约10、20、30、40、50、60、70、或80％的比活。例如，相对于对照FIX多肽，经修饰的FIX多肽可以具有没有降低超过约80％的比活，若与对照的比活相比，经修饰的多肽维持至少约20％的比活。FIX比活可以定义为在凝固级联中发挥功能，经由与激活的血小板上的FVIIIa的相互作用来诱导FXa形成、或支持血液凝块的形成的能力。可以通过诸如如记载于例如McCarthy等(Thromb Haemost.87：824-830，2002)的凝块分析和本领域技术人员已知的其它技术等技术在体外评估活性。也可以使用数种动物系之一来体内评估活性，所述数种动物系已经有意地用血友病B的遗传突变育种，使得自此类品系生成的动物是FIX缺陷的。此类品系可获自多种来源，诸如(不限于)实验室和研究处(Division of Laboratories and Research)，纽约公共健康部(New York Department of Public Health)，奥尔巴尼(Albany)，N.Y.和病理学系(Department of Pathology)，北卡罗来纳大学(University of NorthCarolina)，查布尔希尔(Chapel Hill)，N.C。例如，这些来源的这两者提供了患有犬血友病B的犬。或者，FIX缺陷的小鼠也是可用的(Sabatino等，Blood104：2767-2774，2005)。为了测试FIX活性，将测试多肽注射入患病的动物中，产生小的切口，并比健康对照比较出血时间。
人野生型FIX具有每mg 200个单位左右的比活。一个单位的FIX已经定义为1毫升正常的(合并的(pooled))人血浆中存在的FIX量(对应于100％的FIX水平)。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽可以具有每mg FIX多肽至少约100个单位的比活。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽具有每mg FIX多肽至少约120、140、160、180、200、220、240、260个单位或更多的比活。在一些实施方案中，可以使用APTT或激活的部分促凝血酶原激酶时间测定法(由例如Proctor等，Am.J.Clin.Pathol.36：212，1961所描述的和参见实施例)来测量FIX的比活。
在细胞诸如肝或肾细胞中表达时，FIX多肽可以由细胞机器(cellularmachinery)合成，经历翻译后修饰，然后由细胞分泌入胞外环境中。因此，自细胞分泌的FIX多肽量依赖于蛋白质翻译和胞外分泌这两个过程。在一些实施方案中，可以以相对于对照蛋白质的分泌量没有降低超过约10、20、30、40、50、60、70、或80％的量分泌经修饰的FIX多肽。例如，可以以相对于对照FIX多肽没有降低超过约80％的量分泌经修饰的FIX多肽，若与对照相比，以至少约20％的量分泌经修饰的多肽。可以例如使用任何本领域已知的方法来测定胞外培养基中的蛋白质水平，从而测量分泌的FIX多肽量。用于蛋白质量化的传统方法包括2-D凝胶电泳、质谱术、和抗体结合。用于测定生物学样品中的蛋白质水平的例示性方法包括基于抗体的技术，诸如免疫印迹(Western印迹)、免疫组织学测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、或放射性免疫测定法(RIA)。
在一些实施方案中，相对于对照蛋白质与FVIII、FXI、或FX中至少一种的相互作用，经修饰的FIX多肽以没有降低超过约40、50、60、70、或80％的水平与FVIII、FXI、或FX中至少一种相互作用。例如，相对于对照FIX多肽，经修饰的FIX多肽可以以没有降低超过约80％的水平与FVIII、FXI、或FX中至少一种相互作用，若与对照相比，经修饰的多肽以至少约20％的水平与FVIII、FXI、或FX中至少一种相互作用。可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括例如记载于Chang等，(J.Biol.Chem.273：12089-12094，1998)中的方法)来测定FIX对凝固级联的其它成员的结合。
如先前所描述的，FIX由具有不同生物学功能的四个结构域组成。本发明的一方面提供了在特定域中，诸如在激活肽中和催化域中进行修饰的FIX多肽。本申请部分提供了包含一个或多个引入FIX的激活肽中的糖基化位点的FIX多肽。FIX中的天然糖基化位点位于EGF1域(Ser53和Ser61上的两个O-连接的位点)和激活肽(在Thr159、Thr169、Thr172、和Thr179处的4个O-连接的位点和在Asn157和Asn 167处的2个N-连接的位点)。如此，8个天然糖基化位点之6个位于激活肽中。引入的糖基化位点在引入具有天然糖基化位点的FIX区域诸如激活肽中时对活性或表达可以具有较小的消极影响。另外，在激活FIX时切割激活肽，因此不是FIXa的催化活性所要求的。然而，激活肽存在于酶原中，使激活肽成为引入糖基化位点以改善酶原的循环半衰期的有吸引力的区域。
本申请还部分提供了包含一个或多个糖基化位点的FIX多肽。在一些实施方案中，提供了包含一个或多个选自下组的取代的FIX多肽：G4T；E33N；E36T；E36N；R37N；F75N；F77T；E83T；D85N；V86A；K91T；A103T；V107T；K122N；K122T；S138N；A146N；T148N；F150T；P151N；T159N；A161T；A161N；T169N；Q170N；T172N；D177N；D177E；F178T；K201N；K201T；K214T；V223N；G226N；Y226T；K228N；K228T；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；R338A；R338N；K341N；F353N；H354V；H354I；E355T；V370N；T371V；T371I；E372T；E374N；M391N；K392V；G393T；E410N；K413N；L414I；或其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含一个或多个选自下组的取代的FIX多肽：Y1N和S3T；S3N和K5T；G4N和L6T；K5N和E7T；L6N和E8T；E7N和F9T；F9N和Q11T；V10N和G12T；Q11N和N13T；G12N和L14T；N13和E15T；L14N和R16T；E 15N和E 17T；M19N和E21T；E20N和K22T；S24N和E26T；F25N和E27T；E26N和A28T；E27N和R29T；A28N和E30T；R29N和V31T；E30N和F32T；V31N和E33T；F32N和N34T；T35N和R37T；T38N和E40T；T39N和F41T；E40N和W42T；F41N和K43T；W42N和Q44T；K43N和Y45T；Q44N和V46T；Y45N和D47T；V46N和G48T；E52N和N54T；S53N和P55T；G59N和S61T；K63N和D65T；I66N和S68T；S68N和E70T；G76N和E78T；E78N和K80T；E83N和D85T；L84N和V86T；I90N和N92T；K100N和S 102T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；K106N和V108T；R116N和A118T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；A127N和P129T；V135N和V137T；S136N和S138T；V137N和Q139T；Q139N和S141T；T140N和K142T；S141N和L143T；E147N和V149T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；Y155N和N157T；V156N和S158T；S158N和E160T；T159N和A161T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；L165N和N167T；D166N和I168T；I168N和Q170T；T169N和S171T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；G184N和D186T；E185N和A187T；D186N和K188T；A187N和P189T；P189N和Q191T；G200N和V202T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；V227N和I229T；H236N和I238T；I238N和E240T；E240N和E242T；T241N和H243T；H243N和E245T；K247N和N249T；V250N和R252T；I251N和I253T；I253N和P255T；A261N和I263T；A262N和N264T；D276N和P278T；V280N和N282T；F302N和S304T；S304N和Y306T；R312N和F314T；V313N和H315T；F314N和K316T；H315N和G317T；K316N和R318T；G317N和S319T；S319N和L321T；A320N和V322T；R327N和P329T；P329N和V331T；D332N和A334T；L337N和S339T；S339N和K341T；T340N和F342T；T343N和Y345T；G352N和H354T；F353N和E355T；H354N和G356T；E355N和G357T；G356N和R358T；G357N和D359T；E372N和E374T；W385N和E387T；G386N和E388T；A390N和K392T；或其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含一个或多个选自下组的取代的FIX多肽：D85N、K122T、和I251T；D85N、K122T、和E242N；E125N、P126A、和A127T；P126N、V128T、和P129A；T148N、F150T、和P151A；F150N、P151A、和D152T；P151N、V153T、和A161N；P151N、V153T、和T172N；V153N、Y155T、和E294N；T172N、G226N、和K228T；F353N、H354V、和E355T；F353N、H354I、和E355T；V370N、T371V、和E372T；V370N、T371I、和E372T；M391N、K392V、和G393T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；T148N、F150T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、和R338A；P151N、V153T、D177E、和F178T；P151N、V153T、G226N、和K228T；T172N、G226N、K228T、和R338A；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；K122T、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；T148N、F150T、G226N、K228T、和R338A；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T；P151N、V153T、D177E、F178T、和R338A；P151N、V153T、G226N、K228T、和R338A；和P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和R338A；或其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含一个或多个选自下组的取代的FIX多肽：
(a)G4T；E33N；E36T；E36N；R37N；F75N；F77T；E83T；D85N；V86A；K91T；A103T；V107T；K122N；K122T；S138N；A146N；T148N；F150T；P151N；T159N；A161T；A161N；T169N；Q170N；T172N；D177N；D177E；F178T；K201N；K201T；K214T；V223N；G226N；Y226T；K228N；K228T；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；R338A；R338N；K341N；F353N；H354V；H354I；E355T；V370N；T371V；T371I；E372T；E374N；M391N；K392V；G393T；E410N；K413N；L414I；
(b)Y1N和S3T；S3N和K5T；G4N和L6T；K5N和E7T；L6N和E8T；E7N和F9T；F9N和Q11T；V10N和G12T；Q11N和N13T；G12N和L14T；N13和E15T；L14N和R16T；E15N和E17T；M19N和E21T；E20N和K22T；S24N和E26T；F25N和E27T；E26N和A28T；E27N和R29T；A28N和E30T；R29N和V31T；E30N和F32T；V31N和E33T；F32N和N34T；T35N和R37T；T38N和E40T；T39N和F41T；E40N和W42T；F41N和K43T；W42N和Q44T；K43N和Y45T；Q44N和V46T；Y45N和D47T；V46N和G48T；E52N和N54T；S53N和P55T；G59N和S61T；K63N和D65T；I66N和S68T；S68N和E70T；G76N和E78T；E78N和K80T；E83N和D85T；L84N和V86T；I90N和N92T；K100N和S102T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；K106N和V108T；R116N和A118T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；A127N和P129T；V135N和V137T；S136N和S138T；V137N和Q139T；Q139N和S141T；T140N和K142T；S141N和L143T；E147N和V149T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；Y155N和N157T；V156N和S158T；S158N和E160T；T159N和A161T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；L165N和N167T；D166N和I168T；I168N和Q170T；T169N和S171T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；G184N和D186T；E185N和A187T；D186N和K188T；A187N和P189T；P189N和Q191T；G200N和V202T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；V227N和I229T；H236N和I238T；I238N和E240T；E240N和E242T；T241N和H243T；H243N和E245T；K247N和N249T；V250N和R252T；I251N和I253T；I253N和P255T；A261N和I263T；A262N和N264T；D276N和P278T；V280N和N282T；F302N和S304T；S304N和Y306T；R312N和F314T；V313N和H315T；F314N和K316T；H315N和G317T；K316N和R318T；G317N和S319T；S319N和L321T；A320N和V322T；R327N和P329T；P329N和V331T；D332N和A334T；L337N和S339T；S339N和K341T；T340N和F342T；T343N和Y345T；G352N和H354T；F353N和E355T；H354N和G356T；E355N和G357T；G356N和R358T；G357N和D359T；E372N和E374T；W385N和E387T；G386N和E388T；A390N和K392T；
(c)D85N、K122T、和I251T；D85N、K122T、和E242N；E125N、P126A、和A127T；P126N、V128T、和P129A；T148N、F150T、和P151A；F150N、P151A、和D152T；P151N、V153T、和A161N；P151N、V153T、和T172N；V153N、Y155T、和E294N；T172N、G226N、和K228T；F353N、H354V、和E355T；F353N、H354I、和E355T；V370N、T371V、和E372T；V370N、T371I、和E372T；M391N、K392V、和G393T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；T148N、F150T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、和R338A；P151N、V153T、D177E、和F178T；P151N、V153T、G226N、和K228T；T172N、G226N、K228T、和R338A；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；K122T、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；T148N、F150T、G226N、K228T、和R338A；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T；P151N、V153T、D177E、F178T、和R338A；P151N、V153T、G226N、K228T、和R338A；和P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和R338A；和其任意组合。
本申请部分提供了包含一个或多个通过将内源O-连接的糖基化位点转变为N-连接的糖基化位点来引入的糖基化位点的FIX多肽。已经报告了N-连接的糖基化位点比O-连接的糖基化位点更可能是唾液酸化的，而且有较高的唾液酸含量赋予延长的蛋白质半衰期的证据。一般认为由额外的N-连接的糖基化提供的唾液酸含量增加可以负责血液中的半衰期延长(White等，Thromb.Haemost.78：261-265，1997)。此类经修饰的FIX多肽的例示性实施方案如下。在一些实施方案中，提供了包含T169N取代的FIX多肽。在一些实施方案中，提供了包含T172N取代的FIX多肽。在一些实施方案中，提供了包含T148N取代和F150T取代的FIX多肽。在一些实施方案中，提供了包含T159N取代和A161T取代的FIX多肽。
本发明的另一方面提供了将氨基酸插入激活肽中以产生一个或多个糖基化位点。本申请部分提供了包含一个或多个引入人FIX的氨基酸残基160至164之间的糖基化位点的FIX多肽。在一些实施方案中，引入的氨基酸残基包括糖基化位点。在一些实施方案中，引入的氨基酸残基与野生型FIX氨基酸残基组合形成糖基化位点。来自8种物种的FIX序列的多序列比对表明小鼠、大鼠、和豚鼠序列在激活肽中都具有其它物种(人、猕猴、犬、兔、猪)中没有找到的额外的氨基酸(7-10个残基)(图1)。这些额外的序列位于人FIX的E160和E162之间。这提示至少10个氨基酸残基的插入在FIX结构中在此位点处是耐受的。此区域靶向用于引入额外的氨基酸，而且发现是良好的位置，因为没有显著地降低活性。在一些实施方案中，可以在人FIX的氨基酸残基160至164之间插入多至30、25、20、18、16、14、或12个氨基酸残基。在一些实施方案中，可以插入多至10个氨基酸。在一些实施方案中，可以插入多至9个氨基酸。
根据用于在来自8种物种的FIX间实施多序列比对的标准，找到大鼠、小鼠、和豚鼠中的额外氨基酸的表观位点(apparent site)可以有所变化，使得位点可以在人FIX的E160和A161之间、A161和E162之间、E162和T163之间、或T163和I164之间。在一些实施方案中，插入E160和A161之间的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，插入A161和E162之间的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，插入E162和T163之间的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，插入T163和I164之间的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，可以在E160和A161之间插入一个或多个氨基酸，并可以在A161和E162之间插入一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，可以在E160和A161之间插入一个或多个氨基酸，并可以在E162和T163之间插入一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，可以在A161和E162之间插入一个或多个氨基酸，并可以在E162和T163之间插入一个或多个氨基酸。在一些上文所描述的实施方案中，可以在T163和I164之间插入一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，可以在人FIX的氨基酸残基160至164之间插入多至约30、25、20、18、16、14、或12个总体氨基酸残基。在一些实施方案中，可以在人FIX的氨基酸残基160至164之间插入多至约10个总体氨基酸。在一些实施方案中，可以在人FIX的氨基酸残基160至164之间插入多至约9个总体氨基酸。在一些实施方案中，可以引入1、2、3、或4个糖基化位点。
本申请进一步提供了经修饰的FIX多肽，其包含超过一个本文中所公开的引入的糖基化位点。提供了包含催化域中的至少一个引入的糖基化位点和激活肽中的至少一个引入的糖基化位点的FIX多肽。提供了包含催化域中的至少两个引入的糖基化位点的FIX多肽。提供了包含激活肽中的至少两个引入的糖基化位点的FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可以包含一个或多个下列取代：R37N；D85N；K122T；S138N；A146N；A161N；Q170N；T172N；D177N；F178T；K201N；K228N；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；E374N；和E410N。其它实施方案可以包含一个或多个下列取代：G59N和S61T；K63N和D65T；G76N和E78T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；S136N和S138T；Q139N和S141T；T140N和K142T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；V156N和S158T；S158N和E160T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；D166N和I168T；I168N和Q170T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；T241N和H243T；I251N和I253T；I253N和P255T；A262N和N264T；V280N和N282T；T343N和Y345T；E372N和E374T；F150N，P151A，和D152T；和A161和E162间的SEQID NO：2插入。在一些实施方案中，经修饰的多肽可以进一步包含至少一处取代，诸如例如R338A和V86A。在一些实施方案中，经修饰的多肽可以进一步包含R338A和V86A取代两者。
本申请进一步提供了经修饰的FIX多肽，其包含在FIX多肽的C端(即FIX多肽的氨基酸残基415后)的至少一个引入的糖基化位点。提供了在FIX多肽的C端包含至少2、至少3、至少4、或更多个糖基化位点的FIX多肽。在一些实施方案中，所述FIX多肽可以包含在FIX多肽的C端添加的氨基酸序列SEQID NO：4。在一些实施方案中，所述FIX多肽可以包含在FIX多肽的C端添加的氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，所述FIX多肽可以包含在FIX多肽的C端添加的氨基酸序列SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，所述FIX多肽可以包含在FIX多肽的C端添加的氨基酸序列SEQ ID NO：7。
本申请的一方面提供了经修饰的FIX多肽，其包含至少一个或多个糖基化位点和一种或多个提高FIX活性的取代。激活性取代的例子包括R338A和V86A取代。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽可以包含R338A取代。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽可以包含V86A取代。在一些实施方案中，经修饰的FIX多肽可以包含R338A和V86A取代两者。
本申请的别的方面提供了具有升高的比活的FIX多肽。在一些实施方案中，FIX多肽可以包含R338A取代和V86A取代。在一些实施方案中，所述多肽可以具有每mg多肽至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1400、1600、1800、或2000个单位的比活。可以诸如例如使用APTT测定法来测定比活，如先前所描述的。这些多肽可用作治疗剂，特别地在罹患血友病B的患者中。这些多肽可以包含别的取代或修饰，诸如本文中所描述的糖基化位点。
本申请的一方面提供了经修饰的因子IX多肽，其包含如下的氨基酸序列：
YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86TCNIKNGRCEQFCKNSAX104NKVVCSCTEGYRLAENX121KSCEPAVPFPCGRVSVX138QTSKLTRAEX148VX150X151X152X153DYVNSX159EZ1X161Z2EZ3TZ4ILDNIX169QSX172QX174FNX177X178TRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETX226VX228 ITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRV
其中X85选自D和E；
其中X86选自A、E、P、S、和V；
其中X104选自D、N、和T；
其中X121选自N、Q、和T；
其中X138选自N、S、和T；
其中X148和X150选自：
(i)X148是T而X150是F；
(ii)X148是N而X150是T；和
(iii)X148是N而X150是S；
其中X151选自A、P、和T；
其中X151和X153选自：
(i)X151是P而X153是V；
(ii)X151是N而X153是T；和
(iii)X151是N而X153是S；
其中Z1、Z2、Z3、和Z4独立地选自：
(i)0至12个氨基酸残基和
(ii)SEQ ID NO：2；
其中X152选自D、N、和T；
其中X159和X161选自：
(i)X159是T而X161是A；
(ii)X159是N而X161是T；和
(iii)X159是N而X161是S；
其中X169选自T和N；
其中X172选自T和N；
其中X174选自S和T；
其中X177和X178选自：
(i)X177是D而X178是F；
(ii)X177是E而X178是T；和
(iii)X177是E或D而X178是S；
其中X226和X228选自：
(i)X226是G而X228是K；
(ii)X226是N而X228是T；和
(iii)X226是N而X228是S；
其中X338选自R和A；
其中X353、X354、和X355选自：
(i)X353是F，X354是H，X355是E；
(ii)X353是N，X354是V，X355是T；
(iii)X353是N，X354是I，X355是T；和
(iv)X353是N，X354是H、V、或I，X355是S；
其中X370、X371、和X372选自：
(i)X370是V，X371是T、X372是E；
(ii)X370是N，X371是V，X372是T；
(iii)X370是N，X371是I，X372是T；和
(iv)X370是N，X371是T、V、或I，X372是S；
其中X391、X392、和X393选自：
(i)X391是M，X392是K，X393是G；
(ii)X391是N，X392是K，X393是T；
(iii)X391是N，X392是V，X393是T；和
(iv)X391是N，X392是V或K，X393是S；
其中X413和X414选自：
(i)X413是K而X414是L；
(ii)X413是N而X414是L；和
(iii)X413是N而X414是I；和
其中与具有SEQ ID NO：1的FIX多肽相比，所述FIX多肽包含至少一个引入的糖基化位点。
至少一个糖基化位点的引入是至少一个X位置处的取代或至少一个Z位置中的插入的结果。在一些实施方案中，经修饰的多肽额外包含约1-30、1-20、或1-10处保守的氨基酸变化，而且保持FIX活性。在一些实施方案中，经修饰的多肽与SEQ ID NO：1至少约80、85、90、95、或99％相同，而且维持FIX活性。
经修饰的FIX多肽的生成
可以插入、删除、或取代氨基酸残基以引入非天然糖基化位点。例如，可以通过改变FIX的氨基酸序列来引入糖基化位点。氨基酸序列改变可以通过多种技术(诸如例如通过位点特异性诱变来修饰相应的核酸序列)来实现。用于位点特异性诱变的技术是本领域中公知的，并且记载于例如Zoller等(DNA 3：479-488，1984)或Horton等，(Gene 77：61-68，1989，第61页-第68页)。如此，使用FIX的核苷酸和氨基酸序列，可以引入挑选的改变。同样地，使用特异性引物使用聚合酶链式反应来制备DNA构建体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如PCR Protocols，1990，Academic Press，San Diego，California，USA)。
也可以通过建立的标准方法(例如Beaucage等(Gene Amplif.Anal.3：1-26，1983)描述的亚磷酰胺方法)合成制备编码FIX多肽的核酸构建体。依照亚磷酰胺方法，将寡核苷酸在例如自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接，并在合适的载体中克隆。也可以通过使用特异性引物进行的聚合酶链式反应来制备编码人FIX多肽的DNA序列，例如，如记载于美国专利号4,683,202；或Saiki等(Science 239：487-491，1988)的。此外，核酸构建体可以是混合的合成的和基因组的、混合的合成的和cDNA、或混合的基因组的和cDNA起源的，其通过依照标准的技术连接与整个核酸构建体的各部分对应的合成的、基因组的、或cDNA起源(在适当时)的片段来制备。
可以使用重组DNA方法来将编码FIX多肽的DNA序列插入重组载体中。载体的选择通常会取决于要导入载体的宿主细胞。载体可以是自主复制型载体或整合型载体。自主复制型载体以染色体外实体存在，而且其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。整合型载体是整合入宿主细胞基因组中并与已经将其整合的染色体一起复制的载体。
载体可以是表达载体，其中编码经修饰的FIX的DNA序列与转录、翻译、或加工DNA所需要的别的区段，诸如启动子、终止子、和多聚腺苷酸化位点可操作连接。一般而言，表达载体可以源自质粒或病毒DNA，或者可以含有这两者的元件。术语“可操作连接”指明排列区段以使它们为了其预期目的而一致地发挥功能，例如，转录在启动子中启动，并在整个编码多肽的DNA序列中继续进行。
用于表达FIX多肽的表达载体可以包含能够指导克隆基因或cDNA转录的启动子。启动子可以是在挑选的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，而且可以源自编码对于宿主细胞而言同源的或异源的蛋白质的基因。
适合于指导编码FIX多肽的DNA在哺乳动物细胞中转录的启动子的例子是例如，SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1：854-864，1981)、MT-I(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222：809-814，1983)、CMV启动子(Boshart等，Cell 41：521-530，1985)、或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman等，Mol.Cell Biol，2：1304-1319，1982)。
若必要的话，也可以将编码FIX多肽的DNA序列可操作连接至合适的终止子，诸如人生长激素终止子(Palmiter等，Science 222：809-814，1983)或TPIl(Alber等，J.MoI.Appl.Gen.1：419-434，1982)或ADH3(McKnight等，EMBO J.4：2093-2099，1985)终止子。表达载体还可以含有位于插入位点下游的多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信号、来自腺病毒5EIb区的多聚腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等，Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)、或来自人FIX基因的多聚腺苷酸化信号。表达载体还可以包含增强子序列，诸如SV40增强子。
为了将本发明的FIX多肽引导入宿主细胞的分泌途径中，可以使用天然的FIX分泌信号。或者，可以在重组载体中提供分泌信号序列(又称为前导序列、前原序列(prepro sequence)、或前序列)。可以以正确的读码框将分泌信号序列连接至编码FIX类似物的DNA序列。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。例示性信号序列包括例如，MPIF-1信号序列和司腺钙蛋白信号序列。
用于连接编码FIX多肽的DNA序列、启动子、和任选地终止子和/或分泌信号序列和用于将它们插入含有对于复制必要的信息的合适载体中的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
转染哺乳动物细胞并表达导入细胞中的DNA序列的方法记载于例如Kaufman等(J.Mol.Biol.159：601-621，1982)；Southern等(J.Mol.Appl.Genet.1：327-341，1982)；Loyter等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426，1982)；Wigler等，(Cell 14：725-731，1978)；Corsaro等，(Somatic Cell Genetics 7：603-616，1981)，Graham等，(Virology 52：456-467，1973)；及Neumann等，(EMBO J.1：841-845，1982)。可以通过例如脂转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、微注射、原生质体融合、磷酸钙沉淀、逆转录病毒投递、电穿孔、声穿孔(sonoporation)、激光照射、磁转染(magnetofection)、天然转化、和生物射弹转化来将克隆的DNA序列导入培养的哺乳动物细胞中(参见例如Mehier-Humbert等，Adv.Drug Deliv.Rev.57：733-753，2005)。为了鉴定并选择表达外源DNA的细胞，一般与感兴趣的基因或cDNA一起将赋予可选择表型(选择标志)的基因导入细胞中。选择标志包括例如，赋予对药物诸如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、和甲氨蝶呤的抗性的基因。选择标志可以是可扩增选择标志，其容许扩增标志物和外源DNA(在连接所述序列时)。例示性的可扩增选择标志包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和腺苷脱氨酶。选择合适的选择标志是在本领域技术人员的范围内的(参见例如美国专利号5,238,820)。
用DNA转染细胞后，将它们在合适的培养基中培养以表达感兴趣的基因。如本文中所使用的，术语“合适的培养基”指含有细胞生长和活性FIX多肽表达所需要的营养物和其它成分的培养基。
培养基一般包含例如碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖类、维生素、盐类、磷脂、蛋白质、和生长因子，并且在维生素K依赖性蛋白质诸如FIX的情况中，还可以提供维生素K。然后应用药物选择来选择以稳定的方式表达选择标志的细胞的生长。对于已经用可扩增选择标志转染过的细胞，可以提高药物浓度以选择克隆序列的拷贝数目增加，由此提高表达水平。然后对稳定转染细胞的克隆筛选FIX多肽的表达。
用于本发明的哺乳动物细胞系的例子是COS-1(ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)、HKB11细胞(Cho等，J.Biomed.Sci，9：631-638，2002)、和HEK-293(ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。另外，可以在本发明内使用许多其它细胞系，包括大鼠Hep I(大鼠肝癌；ATCC CRL1600)、大鼠Hep II(大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK-1(ATCC CCL 139)、Hep-G2(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、CHO-K1(ATCC CCL61)、和CHO-DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，1980)。
可以从细胞培养基回收FIX多肽，然后可以通过本领域中已知的多种方法来纯化所述FIX多肽，所述方法包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如制备等电聚焦(preparativeisoelectric focusing，IEF)、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀))、提取(参见例如Protein Purification，Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)，或其各种组合。在一个例示性的实施方案中，可以通过在抗FIX抗体柱上的亲和层析来纯化多肽。可以通过常规的化学纯化手段，诸如高效液相层析来实现别的纯化。其它纯化方法是本领域中已知的，而且可以适用于经修饰的FIX多肽的纯化(参见例如Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。
一般而言，“纯化的”应当指已经进行过分级以除去各种其它成分，而且基本上保留其表达的生物学活性的蛋白质或肽组成。在使用术语“基本上纯化的”的情况中，此名称应当指如下的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要成分，诸如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、或更多的蛋白质。
多种用于量化多肽纯化程度的方法是本领域技术人员已知的。这些包括例如测定活性级分的比活，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内的多肽量。用于评估级分纯度的例示性方法是计算级分的比活，与初始提取物的比活比较活性，并且如此计算在本文中通过“倍值纯化数目”评估的纯度。当然，用于表示活性量的实际单位会取决于特定的测定技术。
在一些实施方案中，在组织培养细胞中重组表达FIX多肽，并且糖基化是宿主细胞诸如哺乳动物细胞的正常翻译后细胞运行的结果。
或者，糖基化可以经由化学或酶促修饰来实现。可以通过使用例如向蛋白质添加α-(2，6)-连接的唾液酸的酶来使FIX多肽糖基化。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞是通常用于重组糖蛋白生成的宿主细胞。CHO细胞没有内源性表达酶β-半乳糖苷α-2，6唾液酸转移酶，其用于将2，6连接中的唾液酸添加至甘露糖α-1，3分支上的半乳糖。为了将此连接处的唾液酸添加至CHO细胞中所生成的蛋白质，可以用功能性β-半乳糖苷酶α-2，6唾液酸转移酶基因转染CHO细胞以容许根据需要将2，6连接中的唾液酸掺入半乳糖(参见例如Lee等，J.Biol.Chem.264：13848-13855，1989)。
类似地，可以通过用酶N-乙酰葡糖胺基转移酶(已经报告了其催化截开型GlcNAc结构的形成)的功能性基因转染没有内源性生成此寡糖连接的宿主细胞来将截开型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)添加至FIX。还已经建立了系统来在以哺乳动物糖基化样式生成蛋白质的植物细胞(参见例如苔藓植物细胞，WO2004/057002)中表达蛋白质。
对于N-连接的糖基化，N-聚糖的最终结构通常依赖于生成多肽的生物体。一般而言，细菌中所生成的多肽是完全未糖基化的。昆虫细胞中表达的多肽含有高的甘露糖和少-甘露糖N-连接的寡糖链等。哺乳动物细胞培养中生成的多肽通常是不同地进行糖基化的，这取决于例如物种和细胞培养条件。此外，植物细胞中所生成的多肽包含与那些在动物细胞中生成的聚糖显著不同的聚糖结构。重组多肽(特别地在多肽要用作治疗剂时)生产领域中的目的是要能够生成正确糖基化的多肽，即要能够生成具有与天然存在形式的多肽上存在的聚糖结构类似或相同的聚糖结构的多肽。
本领域中已经提出了多种方法来定制多肽的糖基化样式(参见例如WO99/22764；WO 98/58964；WO 99/54342；美国公开文本号2008/0050772；和美国专利号5,047,335)。基本上，已经将多肽的体外糖基化所要求的许多酶克隆和测序。在许多例子中，已经在体外使用这些酶来将特定的糖添加至多肽上的不完全聚糖分子。在其它例子中，已经将细胞进行遗传工程化改造以表达酶和想要多肽的组合，使得想要糖模块向所表达多肽的添加在细胞内发生。
对于O-连接的糖基化，O-聚糖主要连接至丝氨酸和苏氨酸残基，并通过逐渐添加来自核苷酸糖的糖来形成(Tanner等，Biochim.Biophys.Acta.906：81-99，1987)；Hounsell等，Glycoconj.J.13：19-26，1996)。可以通过存在的O-连接的聚糖的结构来影响多肽功能。关于O-连接的聚糖结构的综述，参见例如Schachter和Brockhausen，The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans，1989，Society for Experimental Biology，第1页-第26页(英国)。
可以使用标准技术(参见例如Techniques in Glycobiology，R.Townsend和A.Hotchkiss编(1997)Marcel Dekker；及Glycoanalysis Protocols(Methods inMolecular Biology，第76卷)，E.Hounsell编(1998)Humana Press)来测定FIX多肽是否具有N-连接的和/或O-连接的糖基化。常规地使用用化学或酶促去糖基化(例如使用内切糖苷酶和/或外切糖苷酶)处理前和后的蛋白质电泳迁移率的变化来确定蛋白质的糖基化状态。可以使用多种酶之任一种(包括但不限于肽-N4-(N-乙酰基-β-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNG酶F)、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3等)来实施酶促去糖基化。例如，可以进行对用PNG酶F预处理的或未用PNG酶F处理的蛋白质的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。用PNG酶F处理后条带宽度的显著降低和迁移位置的变化可以认为是诊断性的N-连接的糖基化。也可以使用对蛋白质印迹(例如通过SDS-PAGE分开并转移到支持物诸如尼龙膜的蛋白质)的凝集素分析来检测糖基化蛋白质的碳水化合物含量。凝集素，即来自多种植物组织的碳水化合物结合蛋白对糖蛋白聚糖上找到的广泛范围的限定的糖表位具有高亲和力和窄特异性两者(Cummings，Methods Enzymol.230：66-86，1994)。可以标记凝集素(直接地或间接地)，这容许检测凝集素对糖基化蛋白质上碳水化合物的结合。例如，在与生物素或地高辛配基(digoxigenin)偶联时，可以容易地经由利用与酶诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、或辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白或抗地高辛配基抗体的反应在膜印迹上鉴定与糖基化蛋白质结合的凝集素以产生可检测的产物。用具有定义明确的特异性的一组凝集素进行的筛选提供了关于糖蛋白的碳水化合物互补物的相当多的信息。也可以比较经修饰的FIX多肽的电泳迁移率与参照蛋白质的迁移率。
本申请部分提供了具有引入的糖基化位点的FIX多肽，其中附接于糖基化位点的碳水化合物链可以具有哺乳动物碳水化合物链结构，即哺乳动物糖基化样式。在一些实施方案中，碳水化合物链具有人糖基化样式。如本文中所使用的，糖基化样式指给定FIX多肽群体内的特定寡糖结构的代表。此类样式的非限制例子包括寡糖链的相对比例，所述寡糖链(i)具有至少一个唾液酸残基；(ii)缺乏任何唾液酸残基(即在电荷上是中性的)；(iii)具有至少一个末端半乳糖残基；(iv)具有至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；(v)具有至少一个“未加帽的”触角(antenna)，即具有至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基；或(vi)具有至少一个与触角N-乙酰葡糖胺残基进行α1-＞3连接的岩藻糖。
可以使用本领域中已知的任何方法来测定糖基化图谱，所述方法包括但不限于：高效液相层析(HPLC)；毛细管电泳(CE)；核磁共振(NMR)；使用离子化技术诸如快原子轰击、电喷射、或基质辅助激光解吸(MALDI)的质谱术(MS)；气相层析(GC)；和用与阴离子交换(AIE)-HPLC、大小排阻层析(SEC)、或MS结合的外切糖苷酶的处理(参见例如Weber等，Anal.Biochem.225：135-142，1995；Klausen等，J.Chromatog.718：195-202，1995；Morris等，于Mass Spectrometry of Biological Materials，McEwen等编，Marcel Dekker，(1990)，第137页-第167页；Conboy等，Biol.Mass Spectrom.21：397-407，1992；Hellerqvist，Meth.Enzymol.193：554-573，1990；Sutton等，Anal.Biochem.218：34-46，1994；Harvey等，Organic Mass Spectrometry 29：753-766，1994)。
药物组合物
基于用于测定治疗哺乳动物中的上文所鉴定状况的功效的公知测定法，并通过比较这些结果与用于治疗这些状况的已知药物的结果，可以容易地确定本发明多肽的有效剂量来治疗每种想要的适应症。要在治疗这些状况之一中施用的活性成分量可以随诸如所采用的特定多肽和剂量单位、施用模式、治疗期间、所治疗患者的年龄和性别、和所治疗状况的性质和程度等考虑因素而广泛变化。
本申请部分提供了组合物，其包含具有一个或多个引入的糖基化位点的FIX多肽，如本文中所描述的。所述组合物可以适合于体内施用，而且是无热原的。组合物还可以包含药学可接受载体。短语“药学或药理学可接受的”指在对动物或人施用时不产生不利的、变态反应的、或其它不适当的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层物质、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中公知的。也可以将补充的活性成分掺入组合物中。
本发明的组合物包括典型的药物制剂。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常见的路径。可以通过任何常规的方法(例如通过静脉内、皮内、肌肉内、皮下、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内、口服、舌下、鼻、肛门、阴道、或经皮投递、或者通过特定位置处的手术植入)来将药物组合物导入受试者中。治疗可以由单剂或一段时间里的多剂组成。
活性化合物可以作为水中游离碱(free base)或药理学可接受盐的溶液适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合地制备用于施用。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、和其混合物中、及在油中制备。在贮存和使用的通常条件下，这些制剂含有防腐剂以阻止微生物生长。
适合用于可注射使用的药学形式包括无菌水溶液或分散体和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。所述形式应当是无菌的，而且应当是流体的，其程度使得存在容易的可注射性。它在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用提供防护。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、蔗糖、L-组氨酸、Polysorbate 80、或其合适的混合物、和植物油。可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、在分散体的情况中通过维持所要求的粒度、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)可以实现阻止微生物的作用。可注射组合物可以包含等张剂(例如糖类或氯化钠)。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的吸收延长。
可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的多种其它成分的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物(例如FIX多肽)，接着过滤灭菌。
一般而言，可以通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌媒介含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法包括例如自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥。
配制后，可以以与剂量配制剂相容的方式和以诸如治疗有效的量来施用溶液。“治疗有效量”在本文中用于指在血流中或在靶组织中提供想要水平的多肽所需要的多肽量。精确量会取决于多种因素，例如特定的FIX多肽、治疗性组合物的成分和物理特征、预期的患者群体、投递模式、个体患者考虑等，而且本领域技术人员可以基于本文中所提供的信息来容易地确定。
可以以多种剂量形式诸如可注射溶液等来容易地施用配制剂。对于水溶液中的胃肠外施用，例如若必要的话，应当适当地使溶液缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖给予液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。
FIX的剂量通常按单位表示。每kg体重的一个单位的FIX可以将血浆水平提高0.01个U/ml，即1％。其它方面健康的患者具有每ml血浆一个单位的FIX，即100％。血友病B的轻度病例以6-60％之间的FIX血浆浓度限定，中度病例以1-5％之间的FIX血浆浓度限定，而重度病例(其占血友病B病例的约一半)具有小于1％的FIX。预防性处理或小出血(minor hemorrhaging)的处理通常需要将FIX水平提高至15-30％之间。中度出血的处理通常需要将水平提高至30-50％之间，而大创伤(major trauma)的处理可以需要将水平自50升高至100％。可以如下测定提高患者的血液水平所需要的总计单位数目：1.0个单位/kg x体重(kg)x想要的百分比升高(％正常的)。可以通过初始推注接着连续输注以维持药物产品的治疗性循环水平来实施胃肠外施用。在一些实施方案中，可以施用15-150个单位/kg FIX多肽。本领域普通技术人员会容易优化有效剂量和施用方案，如通过优良医学实践和个体患者的临床状况所确定的。
剂量给药的频率会取决于药剂的药动学参数和施用路径。本领域技术人员可以根据施用路径和想要的剂量来确定最佳的药物配制剂(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，第20版，2000，通过提及而将其收入本文)。此类配制剂可以影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放率、和体内清除率。根据施用路径，可以依照体重、体表面积、或器官大小来计算合适的剂量。本领域普通技术人员无需过度实验，特别地根据本文中所公开的剂量信息和测定法以及在动物或人临床试验中观察到的药动学数据常规地进行用于确定合适的治疗剂量所必需的计算的进一步精化。例示性的剂量给药日程表包括但不限于一天五次、一天四次、一天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、和其任意组合的施用。
合适的剂量可以经由使用已建立的用于测定血液凝固水平的测定法连同相关的剂量响应数据来确定。主治医生可以考虑修饰药物作用的因素，例如药物的比活、损伤的严重性、和患者的响应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、施用的时间、和其它临床因素来确定最终的剂量方案。
组合物还可以包括用于预防或阻止微生物生长的抗微生物剂。适合用于本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethoniumchloride)、苯甲醇、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、三氯叔丁醇、酚、苯基乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)、和其组合。
抗氧化剂也可以存在于组合物中。可以使用抗氧化剂来阻止氧化，由此防止制剂变质。适合用于本发明的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟茴醚(butylated hydroxyanisole)、丁羟甲苯(butylated hydroxytoluene)、次磷酸、单硫代甘油(monothioglycerol)、没食子酸丙酯(propyl gallate)、亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)、甲醛合次硫酸氢钠(sodium formaldehyde sulfoxylate)、焦亚硫酸钠、和其组合。
表面活性剂可以作为赋形剂存在。例示性的表面活性剂包括：Polysorbates诸如
Figure BPA00001277735800331
(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)和(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)和Pluronic诸如F68和F88(两者都可购自BASF，Mount Olive，N.J.)；脱水山梨糖醇酯；脂质诸如磷脂诸如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines)、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸和脂肪酯；类固醇诸如胆固醇；和螯合剂诸如EDTA、锌和其它此类合适的阳离子。
酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性例子包括氢氯酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、延胡索酸、和其组合。适合的碱的例子包括但不限于氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、醋酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、延胡索酸钾、和其组合。
组合物中任何个别赋形剂的量可以随赋形剂的活性和组合物的特定需要而所有变化。通常，可以经由常规实验，即通过制备含有不同量的赋形剂(范围为低的至高的)的组合物、检查稳定性和其它参数、然后测定保留最佳性能而没有显著不利效果的范围来确定任何个别赋形剂的最佳量。一般而言，赋形剂可以以约1％至约99％(按重量计)、约5％至约98％(按重量计)、约15至约95％(按重量计)的赋形剂的量存在于组合物中，其中浓度小于30％(按重量计)。这些上述药用赋形剂以及其它赋形剂记载于“Remington：TheScience&Practice of Pharmacy，”第19版，Williams&Williams，(1995)；“Physician’s Desk Reference，”第52版，Medical Economics，Montvale，N.J.(1998)；及Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。
例示性用途
可以使用本文中所描述的组合物来治疗与FIX的功能性缺陷或FIX缺乏诸如FIX的体内半衰期缩短、FIX的结合特性改变、FIX的遗传缺陷、和FIX的血浆浓度降低有关的任何出血病症。FIX的遗传缺陷包括例如，编码FIX的核苷酸序列中碱基的删除、添加、和/或取代。在一个实施方案中，出血病症可以是血友病B。此类出血病症的症状包括例如，严重鼻出血、口粘膜出血、关节血肿、血肿、持续性血尿、胃肠出血、腹膜后出血、舌/咽后出血、颅内出血、和创伤相关的出血。
本发明的组合物可以用于预防性应用。在一些实施方案中，可以对易感疾病状态或损伤或在其它情况中有疾病状态或损伤风险的受试者施用经修饰的FIX多肽以增强受试者自身的凝固能力。此类量可以定义为“预防有效剂量”。为了预防而施用经修饰的FIX多肽包括血友病B患者要经历手术，并在手术前1至4小时之间施用多肽的情况。另外，多肽适合于用作针对不受控制的出血，任选地在不患血友病的患者中的预防剂。如此，例如，可以在手术前对在不受控制的出血上有风险的患者施用多肽。
本文中所描述的多肽、材料、组合物、和方法意图为本发明的代表性例子，并且要理解本发明的范围不受例子的范围限制。本领域技术人员会认可，可以用对所公开的多肽、材料、组合物和方法的变型来实施本发明，并且认为此类变型在本发明的范围内。
呈现上述例子来例示本文中所描述的发明，但是不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
为了本发明可以得到更好的理解，列出了下列实施例。这些实施例仅是出于例示目的，并且不要以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的所有出版物。
实施例1：计算机分析
实施在溶剂可接近性、已知的二级结构、已知血友病B突变的位置、接近与FVIII和FX两者的相互作用的预测位点、和给定突变对FIX蛋白稳定性的预测影响上对FIX序列的计算机分析以鉴定用于添加新的N-糖基化位点共有序列的潜在位点。
基于此分析，在催化域内鉴定5个位点以创建新的N连接的糖基化位点。表2中显示了设计的选定位点和经改变的氨基酸序列。
表2
Figure BPA00001277735800351
实施例2：激活肽的序列比对
通过多物种序列比对来鉴定激活肽中保守的和非保守的残基，如图1中所显示的。
N-连接的糖基化位点的共有序列是Asn-X-Ser/Thr(其中X是除脯氨酸或天冬氨酸(可能也不是有利的)外的任何氨基酸)。为了设计FIX激活肽中新的N-连接的糖基化位点，避免激活肽内各物种间保守的氨基酸以及其它N-连接的位点的共有序列和酪氨酸硫酸化的共有序列，以便不破坏这些翻译后修饰，因为这些对于FIX的药动学可以是重要的。使用这些标准，鉴定用于在激活肽内添加新的N-连接的糖基化位点的三个位点，如表3中所显示的。
表3
  名称   突变蛋白质   天然序列   创建的糖基化位点
  HG1   A161N   A161-E162-T163   N161-E162-T163
  HG2   D177E加上F178T   D177-F178-T179   N176-E177-T178
  HG3   P151N加上V153T   P151-D152-V153   N151-D152-T153
实施例3：插入氨基酸以产生N-连接的糖基化位点
多序列比对(图1)还揭示了相对于人、猕猴、猪、犬、和兔FIX，小鼠、大鼠、和豚鼠在残基A161和E162之间具有额外的氨基酸。这些额外的氨基酸在三种物种间在大小上从7变化至10，而且含有Asp的过度表示和在某种程度上Ile残基。这种观察结果表明7-10个额外的残基在大鼠、小鼠、和豚鼠中在此位点处是耐受的，而对FIX活性没有显著的影响。根据用于在来自8种物种的FIX间实施多序列比对的标准，找到大鼠、小鼠、和豚鼠中的额外氨基酸的表观位点(apparent site)可以有所变化，使得位点可以在人FIX的E160和A161之间、A161和E162之间、E162和T163之间、或T163和I164之间。
在激活肽中在A161和E162之间插入具有序列N-S-T-Q-D-N-I-T-Q(SEQID NO：2)的9个额外的氨基酸。序列“N-S-T”和“N-I-T”是来自天然FIX激活肽的N-连接的共有序列。在这两种情况中，这些在天然FIX序列中后面有谷氨酰胺(Q)，而前面有天冬氨酸(D)。因此，包括谷氨酰胺以及天冬氨酸，试图模拟天然位点。预想也可以在A161和E162之间插入含有1-3个N-糖基化位点共有序列(N-X-S/T)的额外序列。
表4a、表4b、和表4c中描述了经修饰的FIX多肽的别的例子。
表4a
Figure BPA00001277735800361
Figure BPA00001277735800371
比活通过用细胞培养上清液中测量的活性除以相同上清液中的FIX抗原浓度来计算，并表示为缺乏新的糖基化位点的对照FIX分子的百分比。NT：未测试。
表4b
Figure BPA00001277735800372
Figure BPA00001277735800381
表4c
Figure BPA00001277735800382
Figure BPA00001277735800401
Figure BPA00001277735800421
按1至5的量表(其中1＝＜10％；2＝10-50％；3＝50-100％；4＝100-200％；5＝＞200％)表示相对于野生型对照的表达和活性。
实施例4：用于将O-连接的转变为N-连接的糖基化位点的取代
表5显示了设计用于将O-连接的糖基化位点转变为N-连接的糖基化位点的取代。
表5
Figure BPA00001277735800431
实施例5：在HKB11细胞中表达FIX变体
为了测定是否自哺乳动物细胞表达并分泌具有改变过的蛋白质序列的FIX基因并测定这些取代对FIX凝固活性的影响，将编码这些FIX变体的表达质粒转染入HKB11细胞中。HKB11是通过HEK293细胞与B细胞淋巴瘤的融合来生成的一种人细胞系。在此实施例中，将每处糖基化位点取代与第二处取代，即R338A组合，如图3中对HG1到HG8所显示的。R338A取代将FIX的比活提高3至4倍，如通过aPTT测定法所测量的。还创建并测试两个糖基化位点突变蛋白与R338A的别的组合(图3)。
转染后三天，收集来自细胞的培养基，并通过使用对FIX特异性的抗体的Western印迹来分析FIX表达。结果表明以与野生型FIX或仅具有R338A取代的FIX的水平相似的水平将所测试的FIX突变蛋白表达并分泌入培养基中(图2)。
还使用aPPT测定法来测试FIX突变蛋白的活性。结果表明因子IX突变蛋白具有与野生型FIX的活性相似的或与野生型FIX的活性相比升高的活性(图3和图4)。与R338A相比，突变蛋白的活性在14％和109％之间变化。具体地，突变蛋白HG1、HG3、HG4、HG5、HG6、HG7、HG8、和HG3加上HG8具有至少55％R338A的凝固活性和至少300％野生型FIX的凝固活性。
实施例6：HKB11细胞中因子IX变体的糖基化
对突变蛋白HG1到HG8(图3)和HG9(图5)的初始分析表明HG2、HG3、HG5、HG6、HG8、和HG9具有升高的糖基化，如通过SDS-PAGE凝胶上的表观分子量的增加所证明的。创建含有HG2、HG3、HG5、HG6、和HG8中存在的多种取代组合的别的FIX多肽。例如创建下列组合：HG2/HG3、HG8/HG2、HG8/HG3、HG8/HG2/HG3。其它可能的组合包括例如HG3/HG5、HG5/HG8、HG3/HG5/HG8.HG3/HG6、HG5/HG6、HG8/HG6、HG3/HG5/HG6、HG3/HG6/HG8、HG5/HG6/HG8、和HG3/HG5/HG6/HG8。还可以产生与HG9的组合。
糖基化提高蛋白质的分子量，并且这可以显现为SDS-PAGE凝胶中的迁移率降低。如图2和图3中所表明的，在HG2、HG3、HG5、HG6、HG8、和HG9中进行的取代导致SDS-PAGE凝胶上的迁移率降低。这8种单突变蛋白质中，具有在A161和E162之间插入的两个额外的N-连接的共有序列的HG8展现出最大的表观分子量增加，这提示这两个N-连接的位点都是功能性的。在将O-连接的位点突变为N-连接的位点的四个突变蛋白质(HG4至HG7)中，HG4展现出凝胶上迁移率的升高，这表明此取代破坏O-连接的位点(如此降低FIX蛋白的分子量)，但是不能创建功能性N-连接的位点。比较而言，HG5和HG6展现出凝胶上的迁移率降低，这表明这些克隆中的取代确实创建功能性N-连接的糖基化位点。与野生型FIX或FIX-R338A相比，还具有突变为N-连接的位点的O-连接的位点的突变蛋白HG7在凝胶上没有展现出迁移率的变化。假定预期HG7中的取代会消除O-连接的位点，并且如此提高凝胶上的迁移率的实情，没有迁移率的变化的发现提示引入的N-连接的位点可以是功能性的。
与个别突变蛋白质相比，HG2/HG3、HG8/HG2、HG8/HG3、和HG8/HG2/HG3中存在的取代组合导致更显著的迁移率降低，这指明这些组合中存在的多种新的糖基化位点在单个FIX分子中组合时是功能性的。含有总共4个新的N-连接的位点的HG8/HG2/HG3突变蛋白展现出最大的迁移率降低。
实施例7：R338A和V86A取代的组合
在野生型FIX(WT-FIX)或FIX-R338A的背景中通过定点诱变来将FIX的氨基酸V86改变为丙氨酸。将含有这些构建体的表达载体转染入HKB11细胞中，在三天后收集培养基，并通过ELISA来测定FIX蛋白水平，并通过aPTT测定法来测定FIX凝固活性。这两种突变蛋白以与WT-FIX和FIX-R338A相似的水平表达。表6a中汇总了来自单次实验的数据。表6b汇总了三次实验的平均值。
表6a
Figure BPA00001277735800451
表6b
Figure BPA00001277735800452
结果表明单独的V86A取代导致比活升高约1.8倍，而单独的R338A导致比活升高4.5倍。与野生型FIX相比，R338A和V86A的组合导致比活升高8.1倍。这些结果显示了R338A和V86A取代的积极效果是添加的，而且导致与WT-FIX相比具有8倍升高的比活的因子IX突变蛋白。R338A-V86A突变蛋白对血友病B患者会具有改善的治疗益处，因为它会容许实现与目前可获得的重组WT-IX相同的治疗效果的降低8倍的蛋白质剂量。另外，在创建FIX的糖基化形式(其中活性的降低可以源自糖基化)时，R338A-V86A的比活升高可以是有益的。
实施例8：人FIX cDNA的克隆
从公开的cDNA序列(NM_000133)设计与人FIX cDNA编码区的5’和3’端序列互补的一对PCR引物。5’引物(FIXF1；ATCATAAGCTTGCCACC CAGCGCGTGAACATG；(SEQ ID NO：8)，FIX的起始密码子在粗体文本中)含有FIX编码区的前18个核苷酸，包括ATG起始密码子，其前面有共有Kozak序列(加下划线的)和HindIII限制性位点。3’引物(FIXR3，ATCATAAGCTTGATTAGTTAGTGAGA GGCCCTG(SEQ ID NO：9))含有FIX序列的22个核苷酸，所述FIX序列位于前面有HindIII位点的FIX编码区末端3’的45个核苷酸处。使用这些引物和高保真度校正读码聚合酶(InVitrogen，Carlsbad，CA)从正常的人肝(Stratagene，San Diego，CA)扩增第一链cDNA，这导致对人FIX cDNA预期大小的单链(1464bp)。用HindIII消化后，将PCR产物进行凝胶纯化，然后克隆入质粒pAGE16的HindIII位点中。通过限制性消化来鉴定相对于载体中的CMV启动子以正向取向插入FIX cDNA的克隆。对数个克隆的插入物实施双链DNA测序，并且导出的序列与公开的FIX序列的比对表明cDNA编码在成熟蛋白质的氨基酸148处具有苏氨酸的人FIX。此质粒称为pAGE16-因子IX(pAGE16-FIX)。
实施例9：经修饰的FIX多肽的生成
为了改变人FIX序列内的多个氨基酸，使用可购自Stratagene的QuickchangeTM引物设计程序来设计引物对。采用QuickchangeTM II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，San Diego，CA)依照制造商的指令来使用这些引物以生成pAGE16-FIX质粒中的突变。通过对整个FIX编码区的DNA测序来鉴定含有想要取代的克隆。下文表7显示了用于创建取代的有义链寡核苷酸的序列。
表7
Figure BPA00001277735800461
加下划线的残基是那些相对于野生型FIX进行改变以创建用于N-连接的糖基化的共有序列的残基。
在上文所描述的取代外，将含有2个用于N-糖基化的共有序列的9个氨基酸的序列插入残基A161和E162之间的激活肽中。为了生成此FIX变体，通过用引物t8216c_g8218a和t8188c(表8)进行的定点诱变来创建在Y155和I164处对于SnaB1和XbaI而言唯一的限制性位点，而不改变氨基酸序列。用SnaB1和XbaI消化所得的质粒以除去与残基V156至I164对应的27bp片段，然后连接到通过寡核苷酸2PrimerF和2PrimerR(表8)的退火来创建的双链片段。通过双链DNA测序将所得的质粒的序列测定为具有编码9个氨基酸的27bp插入物，所述氨基酸具有含有两个用于N连接的糖基化的共有序列(NXT)的序列NSTQDNITQ(SEQ ID NO：2)。
表8
Figure BPA00001277735800471
粗体/下划线残基是那些相对于野生型因子IX进行改变以创建新的限制性位点的残基或编码两个用于N-接头糖基化的共有序列的9个额外的氨基酸的插入。
实施例10：细胞培养和瞬时转染
在悬浮培养中在轨道摇动器(100-125rpm)上在CO2(5％)培养箱中于37℃在补充有10ng/mL可溶性维生素K3(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的无血清培养基(RF#277)中培养HKB11细胞(HEK293与Burkitt B细胞淋巴瘤系2B8的杂种)，并维持在0.25和1.5x106个细胞/mL之间的密度。
通过以1000rpm离心5分钟来收集供转染用的细胞，然后在FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以1.1x106个细胞/mL重悬。将细胞在6孔板(4.6mL/孔)中接种，并在轨道旋转器(125rpm)上在37℃ CO2培养箱中温育。对于每孔，将5μg质粒DNA与0.2mL
Figure BPA00001277735800472
I培养基(Invitrogen)混合。对于每孔，将7μL 293fectinTM试剂(Invitrogen)与0.2mL
Figure BPA00001277735800473
I培养基温和地混合，并于室温温育5分钟。将稀释的293fectinTM添加至稀释的DNA溶液，温和混合，于室温温育20-30分钟，然后添加至已经用5x106个(4.6mL)HKB11细胞接种的每孔。然后在轨道旋转器(125rpm)上在CO2培养箱中于37℃将细胞温育3天，之后通过以1000rpm离心5分钟来沉淀细胞，收集上清液，并于4℃贮存。
在一些情况中，使用标准的脂转染方案和商业试剂在384孔板中用FIX变体的表达构建体转染HEK293细胞。转染后将细胞培养72小时，此时收获上清液用于进一步分析。
实施例11：针对FIX的Western印迹。
将细胞培养上清液(50μL)与20μL 4x SDS-PAGE加样染料混合，于95℃加热5分钟，在
Figure BPA00001277735800481
4-12％SDS PAGE凝胶上加样，然后转移至硝酸纤维素膜。用5％奶粉封闭30分钟后，将膜与针对人FIX的经HRP标记的山羊多克隆抗体(US Biological，Swampscott，Massachusetts，Catalog No.F0017-07B)于室温一起温育60分钟。用具有0.1％
Figure BPA00001277735800482
(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)缓冲液的磷酸盐缓冲盐水清洗后，使用
Figure BPA00001277735800483
Pico(Pierce，Rockford，IL)和暴露于x-射线胶片来检测来自HRP的信号。
实施例12：FIX ELISA
使用FIX ELISA试剂盒(Hyphen Biomed/Aniara，Mason，OH)来测定细胞培养上清液中的FIX抗原水平。在样品稀释剂缓冲液(在试剂盒中提供的)中稀释细胞培养上清液以达到标准曲线范围内的信号。使用样品稀释剂中稀释的自人血浆纯化的FIX蛋白(Hyphen Biomed/Aniara，产品目录编号RK032A，比活196个U/mg)以产生自100ng/mL至0.2ng/mL的标准曲线。将稀释的样品和标准品添加至ELISA板，其用多克隆抗FIX捕捉抗体来预先包被。添加多克隆检测抗体后，将平板于室温温育1小时，广泛地清洗，然后使用TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)来显现，如由试剂盒制造商所描述的，并使用
Figure BPA00001277735800484
读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)于450nM测量信号。将标准曲线拟合至2-要素图，并自曲线外推未知物的数值。
还使用商品化FIX ELISA试剂(Haemochrom Diagnostica GmbH，Essen，德国)依照制造商的指令来定量FIX表达水平。在384孔MaxiSorpTM板(NuncTM，Rochester，NY)上包被小麦胚凝集素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将孔封闭、清洗、然后添加上清液。进一步清洗后，使用经HRP偶联的多克隆抗FIX抗体(Haemochrom Diagnostica GmbH，Essen，德国)来实施检测。
实施例13：FIX凝固测定法
使用ElectraTM 1800C自动凝固分析仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上运行的FIX缺陷型人血浆中的aPTT测定法来测定FIX凝固活性。简言之，通过仪器来产生凝固稀释剂中的三种稀释的上清液样品，然后将100μL与100μLFIX缺陷型血浆(Aniara，Mason，OH)和100μL自动化aPTT试剂(兔脑磷脂和微粉化硅土(bioMérieux，Inc.，Durham，NC)混合。添加100μL 25mM CaCl2溶液后，记录到凝块形成的时间。使用在ELISA测定法中用作标准品的相同的纯化的人FIX(Hyphen Biomed/Aniara)的连续稀释物对每次运行产生标准曲线。标准曲线常规地是具有相关系数0.95或更好的直线，并且用于测定未知样品的FIX活性。
实施例14：循环FIX的测量
使用体外测定法来测量FIX多肽的循环半衰期。此测定法基于体内和体外的FIX在肝细胞中介导腺病毒(Ad)积累的能力。简言之，已经显示了FIX能结合Ad纤维结域，而且为经由细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)的病毒摄取提供桥(Shayakhmetov等，J.Virol 79：7478-7491，2005)。腺病毒载体突变体Ad5mut(其在纤维结域中含有突变)不结合FIX。Ad5mut具有显著降低的感染肝细胞的能力和体内肝毒性，表明FIX在将Ad载体靶向肝细胞中起主要作用(Shayakhmetov等，2005)。可以通过蛋白质-HSPG相互作用的抑制剂来阻断FIX将Ad载体靶向肝细胞的能力(Shayakhmetov等，2005)。
此外，HSPG-介导的FIX摄取显著促成FIX清除，因此预期干扰HSPG相互作用延长FIX的半衰期。因此，测量肝细胞中体外摄取FIX和/或FIX变体，并且预期具有降低的摄取的变体具有延长的体内半衰期。
为了测量FIX体外半衰期，在存在或缺乏FIX或FIX变体的情况中将哺乳动物细胞与腺病毒一起温育。通过野生型FIX来介导病毒摄取，并通过病毒基因组中编码的报告基因的表达，例如绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶表达来测量。在存在FIX变体的情况中腺病毒摄取降低测量为与野生型FXI相比报告基因表达降低，例如GFP荧光降低或萤光素酶酶促活性降低。
使用本领域普通技术人员公知的标准技术来在体内测量FIX循环半衰期。简言之，通过静脉内注射对受试者施用各自剂量的FIX或FIX变体。在注射后的许多时间点时采集血液样品，并通过合适的测定法(例如ELISA)来测定FIX浓度。为了测定半衰期(其是FIX的浓度为就在剂量给药后的FIX浓度的一半的时间)，比较在多个时间点时的FIX浓度与就在施用FIX的剂量后预期或测量的FIX浓度。预期在体外测定法中细胞摄取降低与体内测定法中半衰期延长之间的相互关系。
通过提及而将上述说明书中提及的所有出版物和专利收入本文。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，本发明所描述的方法的各种修饰和变型对于本领域技术人员会是显而易见的。
虽然本发明已经结合具体的实施方案进行了描述，但是应当理解如所要求保护的发明不应过度地受限于此类具体的实施方案。确实，意图用于实施本发明的上文所描述模式的各种修饰在所附权利要求书的范围内，所述各种修饰对于生物化学领域或相关领域中的技术人员是显而易见的。本领域技术人员会认可，或者仅仅使用常规的实验便能够确定本文中所描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。意图此类等同方案被所附权利要求书所涵盖。
Figure IPA00001277735200011
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Figure IPA00001277735200111

Claims (23)

1.一种因子IX多肽，其包含已经通过引入一个或多个氨基酸取代或插入来修饰的氨基酸序列。
2.依照权利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列已经通过引入一个或多个糖基化位点而修饰。
3.依照权利要求2的多肽，其中所述一个或多个糖基化位点选自：N-连接的糖基化位点和O-连接的糖基化位点。
4.依照权利要求2和3的多肽，其进一步包含附接于所述一个或多个引入的糖基化位点的碳水化合物链。
5.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自：G4T；E33N；E36T；E36N；R37N；F75N；F77T；E83T；D85N；V86A；K91T；A103T；V107T；K122N；K122T；S138N；A146N；T148N；F150T；P151N；T159N；A161T；A161N；T169N；Q170N；T172N；D177N；D177E；F178T；K201N；K201T；K214T；V223N；G226N；Y226T；K228N；K228T；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；R338A；R338N；K341N；F353N；H354V；H354I；E355T；V370N；T371V；T371I；E372T；E374N；M391N；K392V；G393T；E410N；K413N；L414I；Y1N和S3T；S3N和K5T；G4N和L6T；K5N和E7T；L6N和E8T；E7N和F9T；F9N和Q11T；V10N和G12T；Q11N和N13T；G12N和L14T；N13(N13T)和E15T；L14N和R16T；E15N和E17T；M19N和E21T；E20N和K22T；S24N和E26T；F25N和E27T；E26N和A28T；E27N和R29T；A28N和E30T；R29N和V31T；E30N和F32T；V31N和E33T；F32N和N34T；T35N和R37T；T38N和E40T；T39N和F41T；E40N和W42T；F41N和K43T；W42N和Q44T；K43N和Y45T；Q44N和V46T；Y45N和D47T；V46N和G48T；E52N和N54T；S53N和P55T；G59N和S61T；K63N和D65T；I66N和S68T；S68N和E70T；G76N和E78T；E78N和K80T；E83N和D85T；L84N和V86T；I90N和N92T；K100N和S102T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；K106N和V108T；R116N和A118T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；A127N和P129T；V135N和V137T；S136N和S138T；V137N和Q139T；Q139N和S141T；T140N和K142T；S141N和L143T；E147N和V149T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；Y155N和N157T；V156N和S158T；S158N和E160T；T159N和A161T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；L165N和N167T；D166N和I168T；I168N和Q170T；T169N和S171T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；G184N和D186T；E185N和A187T；D186N和K188T；A187N和P189T；P189N和Q191T；G200N和V202T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；V227N和I229T；H236N和I238T；I238N和E240T；E240N和E242T；T241N和H243T；H243N和E245T；K247N和N249T；V250N和R252T；I251N和I253T；I253N和P255T；A261N和I263T；A262N和N264T；D276N和P278T；V280N和N282T；F302N和S304T；S304N和Y306T；R312N和F314T；V313N和H315T；F314N和K316T；H315N和G317T；K316N和R318T；G317N和S319T；S319N和L321T；A320N和V322T；R327N和P329T；P329N和V331T；D332N和A334T；L337N和S339T；S339N和K341T；T340N和F342T；T343N和Y345T；G352N和H354T；F353N和E355T；H354N和G356T；E355N和G357T；G356N和R358T；G357N和D359T；E372N和E374T；W385N和E387T；G386N和E388T；A390N和K392T；D85N、K122T、和I251T；D85N、K122T、和E242N；E125N、P126A、和A127T；P126N、V128T、和P129A；T148N、F150T、和P151A；F150N、P151A、和D152T；P151N、V153T、和A161N；P151N、V153T、和T172N；V153N、Y155T、和E294N；T172N、G226N、和K228T；F353N、H354V、和E355T；F353N、H354I、和E355T；V370N、T371V、和E372T；V370N、T371I、和E372T；M391N、K392V、和G393T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；T148N、F150T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、和R338A；P151N、V153T、D177E、和F178T；P151N、V153T、G226N、和K228T；T172N、G226N、K228T、和R338A；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；K122T、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；T148N、F150T、G226N、K228T、和R338A；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T；P151N、V153T、D177E、F178T、和R338A；P151N、V153T、G226N、K228T、和R338A；和P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和R338A；和其任意组合。
6.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自：R37N；D85N；K122T；S138N；A146N；A161N；Q170N；T172N；D177N；F178T；K201N；K228N；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；E374N；E410N；G59N和S61T；K63N和D65T；G76N和E78T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；S136N和S138T；Q139N和S141T；T140N和K142T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；V153N和Y155T；D154N和V156T；V156N和S158T；S158N和E160T；E160N和E162T；E162N和I164T；T163N和L165T；I164N和D166T；D166N和I168T；I168N和Q170T；S171N和Q173T；T172N和S174T；Q173N和F175T；S174N和N176T；K201N和D203T；V202N和A204T；E224N和G226T；T225N和V227T；G226N和K228T；T241N和H243T；I251N和I253T；I253N和P255T；A262N和N264T；V280N和N282T；T343N和Y345T；E372N和E374T；D85N、K122T、和E242N；D85N、K122T、和I251T；F150N、P151A、和D152T；T172N、G226N、和K228T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；P151(P151N，P151T，或P151A)、V153T、G226N、和K228T；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T。
7.依照权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代选自：D85N；K122T；S138N；T172N；K201N；K228N；E239N；E242N；I251T；A262T；E294N；G59N和S61T；G76N和E78T；S102N和D104T；A103N和N105T；D104N和K106T；E119N和Q121T；Q121N和S123T；S136N和S138T；Q139N和S141T；T140N和K142T；T148N和F150T；V149N和P151T；P151N和V153T；D152N和D154T；S158N和E160T；E162N和I164T；T163N和L165T；T172N和S174T；Q173N和F175T；K201N和D203T；T225N和V227T；G226N和K228T；I253N和P255T；A262N和N264T；V280N和N282T；E372N和E374T；和D85N、K122T、和E242N；D85N、K122T、和I251T；F150N、P151A、和D152T；T172N、G226N、和K228T；D85N、P151N、V153T、和K228N；D85N、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和K228N；K122T、P151N、V153T、和E242N；K122T、P151N、V153T、和I251T；P151((P151N，P151T，或P151A))、V153T、G226N、和K228T；D85N、K122T、P151N、V153T、和E242N；D85N、P151N、V153T、G226N、和K228T；S138N、P151N、V153T、G226N、和K228T；P151N、V153T、T172N、G226N、和K228T。
8.一种因子IX多肽，其包含氨基酸序列
YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86TCNIKNGRCEQFCKNSAX104NKVVCSCTEGYRLAENX121KSCEPAVPFPCGRVSVX138QTSKLTRAEX148VX150X151X152X153DYVNSX159EZ1X161Z2EZ3TZ4ILDNIX169QSX172QX174FNX177X178TRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETX226VX228ITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLX338STKFTIYNNMFCAGX353X354X355GGRDSCQGDSGGPHX370X371X372VEGTSFLTGIISWGEECAX391X392X393KYGIYTKVSRYVNWIKEKTX413X414T(SEQ ID NO：3)；
其中X85选自D和E；
其中X86选自A、E、P、S、和V；
其中X104选自D、N、和T；
其中X121选自N、Q、和T；
其中X138选自N、S、和T；
其中X148和X150选自：
(i)X148是T而X150是F；
(ii)X148是N而X150是T；和
(iii)X148是N而X150是S；
其中X151选自A、P、和T；
其中X151和X153选自：
(i)X151是P而X153是V；
(ii)X151是N而X153是T；和
(iii)X151是N而X153是S；
其中Z1、Z2、Z3、和Z4独立地选自：
(i)0至12个氨基酸残基和
(ii)SEQ ID NO：2；
其中X152选自D、N、和T；
其中X159和X161选自：
(i)X159是T而X161是A；
(ii)X159是N而X161是T；和
(iii)X159是N而X161是S；
其中X169选自T和N；
其中X172选自T和N；
其中X174选自S和T；
其中X177和X178选自：
(i)X177是D而X178是F；
(ii)X177是E而X178是T；和
(iii)X177是E或D而X178是S；
其中X226和X228选自：
(i)X226是G而X228是K；
(ii)X226是N而X228是T；和
(iii)X226是N而X228是S；
其中X338选自R和A；
其中X353、X354、和X355选自：
(i)X353是F，X354是H，X355是E；
(ii)X353是N，X354是V，X355是T；
(iii)X353是N，X354是I，X355是T；和
(iv)X353是N，X354是H、V、或I，X355是S；
其中X370、X371、和X372选自：
(i)X370是V，X371是T、X372是E；
(ii)X370是N，X371是V，X372是T；
(iii)X370是N，X371是I，X372是T；和
(iv)X370是N，X371是T、V、或I，X372是S；
其中X391、X392、和X393选自：
(i)X391是M，X392是K，X393是G；
(ii)X391是N，X392是K，X393是T；
(iii)X391是N，X392是V，X393是T；和
(iv)X391是N，X392是V或K，X393是S；
其中X413和X414选自：
(i)X413是K而X414是L；
(ii)X413是N而X414是L；和
(iii)X413是N而X414是I；和
其中与具有SEQ ID NO：1的FIX多肽相比，所述FIX多肽包含至少一个引入的糖基化位点。
9.依照权利要求6或7的多肽，其进一步包含选自R338A和V86A的氨基酸取代。
10.依照权利要求1-9中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列已经如下修饰过，即在人因子IX的氨基酸残基160-164间引入1-10个氨基酸残基，导致引入一个或多个糖基化位点。
11.依照权利要求10的多肽，其中所述氨基酸残基插入氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164之间。
12.依照权利要求11的多肽，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽在氨基酸残基160-161之间、氨基酸残基161-162之间、氨基酸残基162-163之间、或氨基酸残基163-164之间引入。
13.依照权利要求11或12的多肽，其进一步包含选自如下的氨基酸取代：V86A；R338A；V86A和R338A；T148N和F150T；D177E和F178T；P151N和V153T；P151N、V153T、和T172N；G226N和K228T。
14.依照权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述氨基酸序列已经如下修饰过，即在因子IX多肽的C端引入1-10个氨基酸残基，导致引入一个或多个糖基化位点。
15.依照权利要求14的多肽，其中在因子IX多肽的C端引入包含选自SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、和SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽。
16.一种因子IX多肽，其包含R338A取代和V86A取代。
17.依照权利要求1至15中任一项的多肽，其中相对于缺乏所述引入的糖基化位点的多肽，在一个或多个所述引入的糖基化位点附接碳水化合物链将所述多肽的血清半衰期增加至少30％。
18.依照权利要求1至17中任一项的多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100个单位的比活。
19.一种药物制剂，其包含权利要求1-18中任一项的因子IX多肽和药学可接受载体。
20.一种治疗血友病B的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的权利要求19的药物制剂。
21.编码权利要求1-18中任一项的多肽的DNA序列。
22.一种真核宿主细胞，其以容许所述宿主细胞表达因子IX多肽的方式用依照权利要求20的DNA序列转染。
23.一种用于生成因子IX多肽的方法，包括(i)通过引入一个或多个糖基化位点来修饰所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容许在所述一个或多个糖基化位点糖基化的方式表达所述多肽；并(iii)纯化所述多肽。
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