CN102078644A - 一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床医学领域，具体涉及一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法，所提取的自体富血小板血浆中含有多种复合生长因子，能够有效地促进组织的修复。由1个注射器、1个静脉输液器连接管、1个静脉留置针塑料卡片和1个静脉输液器针头组成；注射器用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头通过静脉输液器连接管和注射器出口连接，静脉输液器针头用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂并向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片中。
Description
技术领域
本发明属于临床医学领域，具体涉及一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法，所提取的自体富血小板血浆中含有多种复合生长因子，能够有效地促进组织的修复。
背景技术
富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是新鲜全血经离心后提取的血小板含量比正常全血中血小板含量高4～5倍的血浆。
1984年，Assoian等发现人血浆中提取的PRP，体外激活后其中血小板α颗粒可释放多种生长因子，如：血小板衍化生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(vascularendothelial growth factor，EGF)、类胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor，IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等。它们以天然比例混合，发挥协同作用。其中PDGF、TGF-β在骨折愈合中有重要作用，一些研究者将PRP用于骨缺损的修复，发现PRP有利于刺激成骨、加速骨修复。PRP还可用于治疗各种原因导致的血小板减少和出血性疾病，并加速伤口愈合。
国内外已有机采PRP机，但价格昂贵，操作费时，基本原理都需要两个离心管，两次抽取血浆，易污染，血小板提取时有不同程度的损失。传统两次离心法需要两个离心管，即含枸橼酸钠抗凝剂的离心管和不含抗凝剂的离心管；一个抽血注射器，或采血针头；两个长针头：第一个用于第一次离心后白膜层其下2～3mm红细胞层和血浆层的抽取，第二个用于第二次离心后上层3/4血浆层的抽取；两个抽取PRP的注射器；10％氯化钙溶液；人凝血酶冻干粉；低温高速离心机；无菌环境如超净台。其缺点是污染率大，白膜层不完整，精确度低，操作步骤多，费时。
发明内容
鉴于上述传统PRP提取过程中的问题，本发明的目的是提供一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法。
本发明所述的自体富血小板血浆提取装置，其特征在于：
由1个5毫升(或2毫升)注射器1、1个静脉输液器连接管2、1个静脉留置针塑料卡片3和1个静脉输液器针头4组成；其中，注射器1用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头4通过静脉输液器连接管2和注射器1出口连接，静脉输液器针头4用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂或向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管2可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片3中，通过静脉留置针塑料卡片3夹紧输液器连接管2，实现输液器连接管2的关闭，从而阻止注射器1中的血液因离心力流出；所用注射器、针头、卡片均为无菌。
本发明所述的一种简便高效的自体富血小板血浆的提取方法，其步骤如下：
a.打开静脉留置针塑料卡片3，注射器1内先抽取无菌、浓度为102～109mmol/L的柠檬酸钠抗凝剂后再进行静脉采血，其中抗凝剂与全血血液的体积比为1∶9～10；
b.关闭静脉留置针塑料卡片3，阻断注射器1中的血流，反复颠倒注射器1数次，使全血和抗凝剂充分混合；
c.使注射器出口向下，将注射器1放入离心机中，第一次离心，离心温度15～22℃，离心速度2000～5000rpm，离心时间3～6min；离心后血液分层，下层为红细胞(RBC)层、中层为包括白细胞(WBC)和血小板(PLE)的白膜层，上层为血浆层，见图2；
d.打开静脉留置针塑料卡片3，推动注射器活塞，使靠近注射器1出口的大部分红细胞层从静脉输液器针头4排出，保留0.5～1毫米高度的红细胞层及其上的白膜层、血浆层，然后关闭静脉留置针塑料卡片3；
e.反复颠倒注射器1数次，重新混合注射器1中血液，并使注射器出口向上，第二次离心，离心速度2000～5000rpm，离心时间10～15min；离心后血液再次分为3层，上层为血浆层、中间层为包括白细胞(WBC)和血小板(PLE)的白膜层、下层为红细胞层，见图3；
f.打开静脉留置针塑料卡片3，推动注射器活塞，使靠近注射器1出口的70～80％体积的血浆层从针头4排出，余下的20～30％体积的血浆层和白膜层、红细胞层的混合物即为富血小板血浆(Platelet-richplasma，PRP)。
在次期间，不需要更换静脉输液器连接管2和静脉输液器针头4，但若疑有污染，必须立即更换。
制备得到富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)后，从静脉输液器针头4吸取无菌的含人凝血酶500U·ml-1的10％(9mmol/L)氯化钙激活剂，激活剂与注射器内PRP的体积比为1∶9～10，再关闭静脉留置针塑料卡3，充分混合注射器1的液体，在激活剂的作用下，激活富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)中的α颗粒使其释放各种生长因子。若需立即使用可直接注射于需要的创伤部位；或室温静置10min后，使注射器1出口在上，高速离心8000～15000r/min，离心3～5min，提取萃取液，注射于需要的创伤部位；或离心后将萃取液置于无菌容器中-80℃冻存。
柠檬酸钠抗凝剂的作用是阻止血液凝固，在两次离心过程中需要保持血液为抗凝状态，保持血小板未被激活；在血小板浓缩后抽取无菌10％氯化钙(CaCl2)溶液，CaCl2作为柠檬酸钠抗凝剂的拈抗剂，使静脉血不处于抗凝状态，才能使人凝血酶激活PRP中血小板，使血小板释放出各种生长因子。
附图说明
图1：改良的PRP提取装置结构示意图；
图2：第一次离心后注射器中血液分层示意图；
图3：第二次离心后注射器中血液分层示意图。
如图1所示，各部分名称为：5毫升或2毫升注射器1、静脉输液器连接管2、静脉留置针塑料卡片3、静脉输液器针头4；
如图2所示，第一次离心后，注射器的针头向下，其中血液分层的各层为：血浆层5、白膜层6、红细胞层7；
如图3所示，第二次离心后，注射器的针头向上，其中血液分层的各层为：血浆层5、白膜层6、红细胞层7。
具体实施方式
实施例1：
a.注射器1内先抽取0.2ml、3.2％(109mmol/L)柠檬酸钠抗凝剂后再进行静脉采血1.8ml；
b.关闭静脉留置针塑料卡片3，阻断注射器1中的血流，反复颠倒注射器1数次，使全血和抗凝剂充分混合；
c.使注射器出口在下，将注射器1放入离心机中，第一次离心，离心温度20℃，离心速度3000rpm，离心4min；离心后血液分层，即下层为红细胞(RBC)层、中层为包括白细胞(WBC)和血小板(PLE)的白膜层，上层为血浆层，见图2；
d.打开静脉留置针塑料卡片3，推动注射器活塞，使靠近注射器1出口的大部分RBC层从静脉输液器针头4排出，保留0.5毫米高度的RBC层及其上的白膜层、血浆层，然后关闭静脉留置针塑料卡片3；
e.反复颠倒注射器1数次，重新混合注射器1中血液，并使注射器出口向上，第二次离心，离心速度3000rpm，离心15min；离心后血液再次分为3层，即上层为血浆层、中间层为包括白细胞(WBC)和血小板(PLE)的白膜层、下层为红细胞层，见图3；
f.打开静脉留置针塑料卡片3，推动注射器活塞，使靠近注射器1出口的3/4体积的血浆层从针头4排出，余下的1/4体积的血浆层和白膜层、红细胞层的混合物即为富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)。
从静脉输液器针头4吸取无菌的含人凝血酶500U·ml-1的10％氯化钙激活剂，激活剂与注射器内PRP的体积比为1∶9，关闭静脉留置针塑料卡3，充分混合注射器1的液体，在激活剂的作用下，激活血小板中的α颗粒使其释放各种生长因子。若需立即使用可直接注射于需要的创伤部位；或室温静置10min后，针头4出口向上，高速离心12000r/min，离心5min，提取萃取液，注射于需要的创伤部位，或离心后将萃取液置于无菌容器中-80℃冻存。
实验结果讨论与分析：
①酶联免疫法(ELISA)检测生长因子含量
PRP中含的血小板被激活后α颗粒中的血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforminggrowth factor，TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)等释放出来。
采用酶联免疫法(ELISA)检测普通方法和采用本发明所述方法(改良组)提取PRP的中PDGF、TGF-β、VEGF含量的差异。改良组三种生长因子含量均高于普通组，P＜0.05，有统计学意义。见表1。
表1：普通及改良法提取的PRP中PDGF、TGF-b、VEGFb含量(x±s，n＝10)
②多功能血液分析仪检测PRP中血液成分
PRP是全血的离心产物，其中含有白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLE)。全自动血液分析仪检测普通组和改良组提取的PRP中主要血液成分WBC、RBC、PLE、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)含量的差异。改良组PLE含量显著高于普通组，P＜0.05，有统计学意义。见表2。
表格2：普通法和改良法提取PRP中血液成分含量(x±s，n＝10)
③统计学方法
GraphPadInstat3.1软件统计分析各组数据，配对t检验分析普通组和改良组中PDGF、TGF-1β和VEGF含量的差异，以单因素方差分析分析各组间差异。
本PRP提取方法的优点：其实现了最大限度保留PRP中血小板含量，进而提高各种生长因子含量；实现了PRP提取方法的简化，方便临床应用，降低成本；使PRP的应用部位更精确，剂量更准确；两次离心在一个装置中完成，保障无菌状态，不需超净台；保留完整的白膜层，血小板富集率高；可注射于精细的部位，如牙周袋下；设备简单只需1个注射器，1个针头，1个卡片；操作简单，节省时间；注射器的刻度可使提取量更精确。
研究表明，本方法制备的自体PRP，单独使用CaCl2而不需使用人凝血酶冻干粉同样可使PRP激活，释放生长因子，且重要的因子含量并不受影响，故凝血酶可以不用，尽管上述方法和实验结果中，使用了凝血酶。
Claims (2)
1.一种自体富血小板血浆提取装置，其特征在于：
由1个注射器(1)、1个静脉输液器连接管(2)、1个静脉留置针塑料卡片(3)和1个静脉输液器针头(4)组成；
注射器(1)用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头(4)通过静脉输液器连接管(2)和注射器(1)出口连接，静脉输液器针头(4)用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂或向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管(2)可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片(3)中。
2.一种自体富血小板血浆的提取方法，其步骤如下：
a.打开静脉留置针塑料卡片(3)，注射器(1)内先抽取无菌、浓度为102～109mmol/L的柠檬酸钠抗凝剂后再进行静脉采血，其中抗凝剂与全血血液的体积比为1∶9～10；
b.关闭静脉留置针塑料卡片(3)，阻断注射器(1)中的血流，反复颠倒注射器(1)数次，使全血和抗凝剂充分混合；
c.使注射器出口向下，将注射器(1)放入离心机中，第一次离心，离心温度15～22℃，离心速度2000～5000rpm，离心时间3～6min；离心后血液分层，下层为红细胞RBC层、中层为包括白细胞WBC和血小板PLE的白膜层，上层为血浆层；
d.打开静脉留置针塑料卡片(3)，推动注射器活塞，使靠近注射器(1)出口的大部分红细胞层从静脉输液器针头4排出，保留0.5～1毫米高度的红细胞层及其上的白膜层、血浆层，然后关闭静脉留置针塑料卡片(3)；
e.反复颠倒注射器(1)数次，重新混合注射器(1)中血液，并使注射器出口向上，第二次离心，离心速度2000～5000rpm，离心时间10～15min；离心后血液再次分为三层，上层为血浆层、中间层为包括白细胞WBC和血小板PLE的白膜层、下层为红细胞RBC层；
f.打开静脉留置针塑料卡片(3)，推动注射器活塞，使靠近注射器(1)出口的70～80％体积的血浆层从针头(4)排出，余下的20～30％体积的血浆层和白膜层、红细胞层的混合物即为富血小板血浆。
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