CN102076709B

CN102076709B - Axmi-il5、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184：vip3a杀虫蛋白及其使用方法

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Publication number: CN102076709B
Application number: CN200980123077.5A
Authority: CN
Inventors: K·S·桑普森; S·阿加瓦尔; C·坎贝尔; B·麦克纳尔蒂; D·J·汤姆索; N·卡罗兹; T·哈吉斯; M·G·科兹尔; N·B·达克; V·海因里希斯
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: BASF SE; BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2029-07-02
Also published as: WO2010003065A2; EP2297190A2; PE20110310A1; EP2949659A1; NZ590039A; US20100004176A1; JP2014193182A; PE20140867A1; JP2011526791A; MX2010014379A; CN104263740A; AR072680A1; CL2010001457A1; NZ602351A; WO2010003065A3; US20150299274A1; CN102076709A; CO6341638A2; CN110734919A; CA3183317A1

Abstract

本发明提供了赋予宿主细胞杀虫活性的组合物和方法。提供了含有δ-内毒素多肽的编码序列的组合物。该编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于宿主细胞中的转化和表达。组合物还包括转化的宿主细胞。特别地，提供了分离的δ-内毒素核酸分子。另外，包含与多核苷酸对应的氨基酸序列，和特异性结合这些氨基酸序列的抗体。尤其是，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO：4、5、6、13或14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1、2、3、11或12中陈列的核苷酸序列，及其变体和片段。

Description

AXMI-IL5、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184:VIP3A杀虫蛋白及其使用方法

发明领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。

发明背景

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它能产生对某些目和种的昆虫有特异性毒性，但是对植物和其他非靶向生物体无害的晶状包含体。因此，包含苏云金杆菌菌株或它们的杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀虫剂以控制农业虫害或针对多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目，双翅目和鞘翅目幼虫的有效杀虫活性。这些蛋白质还显示出抗膜翅目，同翅目，虱目，食毛目和螨害虫目，以及如线虫，扁形动物和Sarcomastigorphora等其他无脊椎动物目的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白质主要基于它们的杀虫活性而最初被划分为CryI到CryV。这些主要的类别是鳞翅目特异性的(I)，鳞翅目和双翅目特异性的(II)，鞘翅目特异性的(III)，双翅目特异性的(IV)，以及线虫特异性的(V)和(VI)。所述蛋白质被进一步划分为亚家族；各个家族内更密切相关的蛋白质被指派上分类字母，如Cry 1A，Cry 1B，Cry 1C等等。在各亚类内更紧密相关的蛋白质则命名为如Cry 1C1，Cry1C2等等。

最近出现了一种针对Cry基因的新命名法，其基于的是氨基酸序列同源性而非昆虫靶特异性(Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在该新的分类法中，每种毒素被分配了一个独特的名称，其中合并了第一分类(阿拉伯数字)、第二分类(大写字母)、第三分类(小写字母)和第四分类(另一个阿拉伯数字)。在该新的分类法中，罗马数字被转换成第一分类的阿拉伯数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的第一分类，而对于第二和第三分类而言这一标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在已经被摄取和在昆虫中肠溶解前不显示杀虫活性。被摄取的前毒素在昆虫消化道内经蛋白酶水解成活性的毒性分子。( 和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。此毒素与靶幼虫中肠内的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(参见，例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成，并涉及膜插入和孔形成。结构域Ⅱ由排列成“希腊语key”构型的3个β折叠片组成，而结构域III由“薄卷饼型(非同源蛋白质折叠)”形式的两个反向平行β折叠组成(de Maagd等人，2001，同上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，并因此被认为是毒素特异性的决定簇。

除了δ-内毒素以外，还有几种其他已知类型的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素(见，例如，美国专利5,770,696)为二元杀虫毒素，认为其通过类似其他二元(“A/B”)毒素的作用模式的、涉及受体介导的胞吞和之后的细胞毒化机制对昆虫展示强活性。A/B毒素例如VIP、C2、CDT、CST或炭疽杆菌(B.anthracis)水肿和致命毒素首先通过特异性受体介导的与单体形式的“B”组分结合与靶细胞发生相互作用。这些单体之后形成同型七聚体。之后“B”七聚体-受体复合物作为对接平台接着结合“A”酶组分并通过受体介导的胞吞将其运输至胞浆。一旦进入细胞的胞浆，“A”组分通过例如G肌动蛋白的ADP核糖基化或提高环腺苷酸(cAMP)的胞内水平抑制正常细胞功能。见Barth等人(2004)Microbiol Mol Biol Rev68：373--402。

基于苏云金杆菌的杀虫剂的密集使用已经在小菜蛾(Plutella xylostella)的野生种群中引起了抗性(Ferr éand Van Rie(2002)Annu.Rev.Entomol.47：501-533)。产生抗性最通常的机制是毒素与其特异性中肠受体的结合降低。这也会引起共享相同抗体的其他毒素的交叉抗性(Ferr éand Van Rie(2002))。

发明概述

提供了赋予细菌，植物，植物细胞，组织和种子昆虫抗性的组合物和方法。组合物包括编码δ-内毒素多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括内毒素多肽序列和针对那些多肽的抗体。该核苷酸序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于转化生物体和在生物体中表达，该生物体包括微生物和植物。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计成用于在生物体中表达的合成序列，包括但不限于，微生物或植物。组合物还包括转化的细菌，植物，植物细胞，组织和种子。

特别地，提供了对应δ-内毒素核酸序列的分离的核酸分子。另外，包含该多核苷酸对应的氨基酸序列。尤其是，本发明提供了下述分离的核酸分子，其含有编码SEQ ID NO：4、5、6、13或14任一条中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，和SEQ ID NO：1、2、3、11或12中任一条所示的核苷酸序列，及其变体和片段。还包含与本发明的核苷酸序列互补或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。

本发明的组合物和方法用于产生具有杀虫剂抗性的生物体，具体是细菌和植物。这些生物体和来源于其的组合物是农业用途所需的。本发明的组合物也用于产生具有杀虫活性的经改变或改良的δ-内毒素蛋白质，或用于检测产品或生物体中δ-内毒素蛋白或核酸的存在。

附图简述

图1A和1B显示了AXMI-113(SEQ ID NO：5)、AXMI-005(SEQ ID NO：4)和AXMI-115(SEQ ID NO：6)的比对。左和右箭头标记了蛋白质C端1/3区域的边界。

图2描绘了AXMI-005和AXMI-115中被替换以产生新毒素的结构域。

详细说明

本发明涉及用于调控生物体，尤其是植物或植物细胞中昆虫抗性的组合物和方法。该方法包括用编码本发明的δ-内毒素蛋白的核苷酸序列转化生物体。具体而言，本发明的核苷酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供了转化的细菌，植物，植物细胞，植物组织和种子。组合物是苏云金杆菌的δ-内毒素核酸和蛋白质。所述序列发现用于构建表达载体，其用于随后转化入目的生物体内，作为探针用于分离其他的δ-内毒素基因，以及通过本领域已知的方法产生改变的杀虫蛋白，如结构域交换或DNA改组。见例如表2和图2。所述蛋白质发现用于控制或杀死鳞翅目，鞘翅目，和其他昆虫种群，以及用于产生具有杀虫活性的组合物。

“δ-内毒素”指来自苏云金杆菌的对一种或多种害虫具有毒性的毒素，或者与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述害虫包括但不限于，鳞翅目，双翅目和鞘翅目或线虫门的成员。在一些情况下，已经从其他生物体包括双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和Paenibacillus popilliae中分离出δ-内毒素蛋白。杀虫蛋白包含由这里公开的全长核苷酸序列推导出来的氨基酸序列，以及由于使用可选择的下游起始位点或者由于产生具有杀虫活性的较短蛋白质的加工所造成的比全长序列短的氨基酸序列。加工可发生在表达所述蛋白质的生物体内，或者在摄取所述蛋白质后的害虫体内。

δ-内毒素包括被确认为cry1到cry 43、cyt1和cyt2的蛋白质，以及Cyt-类毒素的蛋白质。目前有超过250种具有广泛特异性和毒性的已知δ-内毒素。更全面的名单参见Crickmore等(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813，而定期的更新参见www.biols.susx. ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index上的Crickmore等(2003)“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”。

这里提供了赋予杀虫活性的新的分离的核苷酸序列。还提供了δ-内毒素蛋白的氨基酸序列。由该基因的翻译而产生的蛋白质可使细胞控制或杀死摄取它的昆虫。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面是关于含有编码δ-内毒素蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列的分离的或重组核酸分子，以及足以用作杂交探针来鉴定编码δ-内毒素的核酸。如这里使用的，术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，重组DNA，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和利用核苷酸类似物产生的所述DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。

“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白质或者其生物学活性部分，指当通过重组技术生产时基本上无其他的细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上无化学前体或其他的化学物质。优选的，“分离的”核酸中没有在该核酸来源的生物体的基因组DNA内天然状态下处于该核酸两侧(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)的序列(优选蛋白质编码序列)。就本发明的目的而言，“分离的”当用于描述核酸分子时，并不包括分离的染色体。例如，在多种实施方案中，分离的编码δ-内毒素的核酸分子可包含天然存在于所述核酸来源的细胞的基因组DNA中该核酸分子两侧的小于大约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上无细胞物质的δ-内毒素蛋白包括具有少于大约30％，20％，10％或5％(干重)的非δ-内毒素蛋白(这里也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制品。

编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1，2，3，11或12中所示的序列及其变体，片段和互补序列。“互补”意指足以与给定核苷酸序列互补以致可与该给定核苷酸序列杂交从而形成稳定的双螺旋的核苷酸序列。由该核苷酸序列编码的δ-内毒素蛋白的相应氨基酸序列在SEQ ID NO：4，5，6，13或14中所示。

作为编码δ-内毒素的这些核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本发明内。“片段”指编码δ-内毒素蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码δ-内毒素蛋白的生物学活性部分，或者它可以是可以用作下面公开的方法中杂交探针或PCR引物的片段。为编码δ-内毒素核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750，1800，1850，1900，1950，2000，2050，2100，2150，2200，2250，2300，2350，2400，2450，2500，2550，2600，2650，2700，2750，2800，2850，2900，2950，3000，3050，3100，3150，3200，3250，3300，3350个连续核苷酸，或者至多编码这里公开的编码δ-内毒素的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目，这取决于目的用途。“连续”核苷酸指彼此紧密相邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留δ-内毒素蛋白的生物学活性，并从而保持杀虫活性的蛋白质片段。“保留活性”指所述片段具有δ-内毒素蛋白的杀虫活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％，80％，90％，95％或更高。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利公开号5,743,477，所有的都以其全部内容引入这里作为参考。

编码本发明蛋白质的生物学活性部分的δ-内毒素编码核苷酸序列的片段将编码本发明全长δ-内毒素蛋白中的至少大约15，25，30，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100个连续氨基酸，或至多其中所存在的总氨基酸数目。

优选的本发明δ-内毒素蛋白是由与SEQ ID NO：1、2、3、11或12的核苷酸序列具有足够同一性的核苷酸序列编码的。“具有足够同一性” 指用标准参数，通过这里描述的序列比对程序之一与参考序列比较而言具有至少大约60％或65％序列同一性，大约70％或75％序列同一性，大约80％或85％序列同一性，大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将认识到，这些数值可适当调整，以确定由于密码子简并性，氨基酸相似性，阅读框定位等原因而由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，将这些序列进行比对以达到最佳的比对效果。两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数目的函数(也即，同一性百分数＝相同位置的数目/总位置数目(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。在另一个实施方案中，比较跨越整个参考序列(例如，跨越SEQ ID NO：1、2、3、11或12之一的一整条序列，或跨越SEQ ID NO：4、5、6、13或14之一的整条序列)。两个序列之间的同一性百分数可以用类似于下面所述的那些技术的技术确定，允许或不允许有空位。在计算同一性百分数时，通常严格匹配的才被计算在内。

两个序列之间同一性百分数的确定可用数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性的例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，根据Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877进行修正。这种算法被合并到Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的δ-内毒素类核酸分子同源的核苷酸序列。用BLASTX程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的δ-内毒素蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位的比对，可使用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述的Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。做为选择，可用PSI-Blast进行检测两个分子之间疏远关系的迭代检索。参见Altschul等(1997)，同上文。当利用BLAST和Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如， BLASTX和BLASTN)的缺省参数。也可以通过目测人工进行序列比对。

用于比较序列的数学算法的另一个非限制性的例子是ClustalW算法(Higgins等(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列，并将氨基酸或DNA序列全部比对，因此可提供有关整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于几个商品化的DNA/氨基酸分析软件包中，如载体NTI Program Suite(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。用ClustalW进行氨基酸序列的比对后，可评估氨基酸同一性百分数。可用于ClustalW序列比对分析的软件程序的非限制性例子是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)可评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法。这种算法被整合到ALIGN程序(版本2.0)中，它是GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10的一部分(可获自Accelrys，Inc.，9685Scranton Rd.，San Diego，CA，USA)。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，空位长度罚分12和空位罚分4。

除非另有说明，采用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453的算法的GAP版本10将被用于确定序列同一性或相似性，其中使用下述参数：关于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62评分程序。还可以使用等价的程序。“等价的程序”意指任何这样的序列比较程序，即对于所研究的任何两个序列，当与由GAP版本10产生的相应比对相比较时，产生具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。本发明还包括变体核酸分子。δ-内毒素蛋白编码核苷酸序列的“变体”包括编码这里公开的这样的δ-内毒素蛋白，但是其由于遗传密码简并性而有保守性差别的那些序列，以及如上所述足够相同的那些序列。天然存在的等位基因变体可用公知的分子生物学技术鉴定，如下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，例如如下所述通过定点诱变产生，但仍然编码本发明中公开的δ-内毒素蛋白的序列。包含在本发明范围内的变体蛋白质是生物学活性的，也就是说，它们继续具有天然蛋白质的目的生物学活性，即保留杀虫活性。“保留活性”指变体具有天然蛋白质的杀虫活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％，或至少大约80％。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利5,743,477，所有的都以其全部内容引入这里作为参考。

熟练技术人员将理解，可通过突变本发明的核苷酸序列而引入变异，从而导致所编码的δ-内毒素蛋白的氨基酸序列的变化，但不改变所述蛋白质的生物学活性。因此，可通过在这里公开的相应核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而产生变异的分离核酸分子，从而在所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。突变可通过标准技术引入，如定点诱变和PCR介导的诱变。这种变异的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。

例如，可以在一个或多个预知的、非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“非必需的”氨基酸残基是可以在δ-内毒素蛋白的野生型序列中发生改变，而不改变生物学活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物学活性所必需的。“保守的氨基酸取代”是用具有相似侧链的氨基酸残基取代某一氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(参见，例如，de Maagd等(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成，并涉及膜插入和孔形成。结构域Ⅱ由排列成希腊语key构型的3个β折叠片组成，而结构域III由“薄卷饼型(非同源蛋白质折叠)”形式的两个反向平行β折叠组成(de Maagd等人，2001，同上文)。结构域II和III涉及受体识别和结合，并因此被认为是毒素特异性的决定区。

可以在非保守区内进行保持功能的氨基酸取代。通常，不对保守氨基酸残基、或定位在保守基序内的氨基酸残基进行这样的取代，其中这种残基对于蛋白质活性是必需的。保守的而且可能为蛋白质活性所必需的残基的例子包括，例如，在本发明的氨基酸序列和已知的δ-内毒素序列比对中含有的所有蛋白质之间均相同的残基。保守但可能允许保守氨基酸取代并仍然保持活性的残基的例子包括，例如，仅在与本发明的氨基酸序列和已知的δ-内毒素序列比对中含有的所有蛋白质之间具有保守取代的残基。不过，本领域技术人员应理解，功能性变体可以在保守残基中具有微小的保守或非保守变异。

做为选择，可通过如饱和诱变等方法沿着编码序列全部或部分随机引入突变而制备变异核苷酸序列，并可对所产生的突变体筛选赋予δ-内毒素活性的能力，以鉴定保留活性的突变体。诱变以后，可重组表达所编码的蛋白质，而且可以使用标准分析技术确定蛋白质的活性。

利用如PCR，杂交等方法，可鉴定相应的δ-内毒素序列，这种序列与本发明的序列基本上相同。参见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和Innis等人(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applicatiohs(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，可用全部或部分δ-内毒素核苷酸序列筛选cDNA或基因组文库。构建这种cDNA与基因组文库的方法是本领域普遍已知的，并公开于Sambrook和Russell，2001，上文中。所谓的杂交探针可以是基因组 DNA片段，cDNA片段，RNA片段或其他的寡核苷酸，而且可以用可检测基团如³²P或任何其他的可检测标记如其他的放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅因子进行标记。可通过标记基于这里公开的编码已知δ-内毒素的核苷酸序列的合成寡核苷酸制备用于杂交的探针。此外，还可以使用基于核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针通常包含在严谨条件下与编码本发明δ-内毒素的核苷酸序列或其片段或变体的至少大约12个，至少大约25个，至少大约50，75，100，125，150，175，200，250，300，350或400个连续的核苷酸杂交的核苷酸序列区。用于杂交的探针的制备方法是本领域普遍已知的，并公开于Sambrook和Russell，2001，上文，这里引入作为参考。

例如，这里公开的整个δ-内毒素序列或其一个或多个部分，可用作能特异性地与相应δ-内毒素样序列以及信使RNA杂交的探针。为了实现各种条件下的特异性杂交，所述探针包括独特的序列，并且优选长度为至少大约10个核苷酸，或长度为至少大约20个核苷酸。这样的探针可用于通过PCR从选定的生物体中扩增相应的δ-内毒素序列。该技术可用于从目的生物体分离额外的编码序列，或作为诊断检测法用于确定生物体中编码序列的存在。杂交技术包括铺板的DNA文库(噬菌斑或者克隆；参见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)的杂交筛选。

这些序列的杂交可以在严谨条件下进行。“严谨条件”或“严谨的杂交条件”指在此条件下，探针与其靶序列的杂交程度可检测性地高于与其他序列的杂交程度(例如，至少高于背景2倍)。严谨条件是随序列而定的，而且取决于环境而有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨性，可鉴别与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可将严谨条件调整成允许序列中有一些错配，从而检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选长度小于约500个核苷酸。

通常，严谨条件是这样的条件，其中在pH 7.0到8.3时盐浓度小于大约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他的盐)，而且对于短探针(例如，10到50个核苷酸)而言温度至少约30℃，而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)而言至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来达到严谨条件。示例性的低严谨条件包括用30-35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液在37℃进行杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)于50-55℃漂洗。示例性的中等严谨条件包括在40-45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中于37℃杂交，并在0.5×至1×SSC中于55-60℃漂洗。示例性的高严谨条件包括在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中于37℃进行杂交，并在0.1×SSC中于60-65℃漂洗。任选地，漂洗缓冲液可包括大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间一般少于大约24小时，通常约为4到12小时。

一般而言，特异性是杂交后漂洗条件的函数，关键因素是最终漂洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，T_m可用Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284中的公式估计：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中的M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是杂化物中碱基对的长度。“T_m”是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m下降约1℃；因此，为了与所期望的同一性的序列杂交，可以调节T_m、杂交和/或漂洗条件。例如，如果搜寻具有≥90％同一性的序列，T_m可下降10℃。通常，将严谨条件选择成比该具体序列与其互补序列在确定的离子强度和pH时的热解链温度(T_m)低约5℃。不过，严格的严谨条件可利用比热解链温度(T_m)低1，2，3或4℃的条件进行杂交和/或漂洗；中等的严谨条件可利用比热解链温度(T_m)低6，7，8，9或10℃的条件进行杂交和/或漂洗；低严谨条件可利用比热解链温度(T_m)低11，12，13，14，15或20℃的条件进行杂交和/或漂洗。利用所述公式、杂交和漂洗组合物以及预期的T_m，普通技术人员将理解杂交和/或漂洗溶液的严谨性的变化已得到本质的描述。如果所需程度的错配导致T_m小于45℃(水溶液)或32℃ (甲酰胺溶液)，则优选提高SSC浓度，以可利用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指南可参阅：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等编著(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

分离的蛋白质及其变体和片段

δ-内毒素蛋白也包含在本发明的范围内。“δ-内毒素蛋白”指具有SEQ ID NO：4、5、6、13或14中所示的氨基酸序列的蛋白质。还提供了其片段，生物学活性部分和变体，它们可用于实施本发明的方法。

“片段”或“生物学活性部分”包括含有与SEQ ID NO：4、5、6、13或14中任一条所示的氨基酸序列具有足够同一性的氨基酸序列且显示杀虫活性的多肽片段。δ-内毒素蛋白的生物学活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。这样的生物学活性部分可通过重组技术制备，并评估其杀虫活性。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利5,743,477，所有的都以其全部内容引入这里作为参考。如这里使用的，片段含有SEQ ID NO：4、5、6、13或14的至少8个连续的氨基酸。不过，本发明还包含其他的片段，如该蛋白质中的任何大于约10，20，30，50，100，150，200，250，300，350，400，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250或1300个氨基酸的片段。

“变体”指具有与SEQ ID NO：4、5、6、13或14中任意的氨基酸序列至少约60％，65％，约70％，75％，约80％，85％，约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包括在严谨条件下与SEQ ID NO：1、2、3、11或12的核酸分子或其互补分子杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而氨基酸序列有所区别的多肽。本发明所包含的变体蛋白质是有生物学活性的，也就是说，它们继续具有天然蛋白质的所需生物学活性，即保持杀虫活性。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293；和美国专利5,743,477，所有的都以其全部内容引入这里作为参考。

细菌基因，如本发明的axmi基因，常常在接近于开放阅读框的起点处具有许多甲硫氨酸起始密码子。位于这些起始密码子的一个或多个处的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可包括ATG密码子。然而，细菌如芽孢杆菌属菌种也识别GTG密码子为起始密码子，而且在GTG密码子处开始翻译的蛋白质包括位于第一个氨基酸的甲硫氨酸。而且，经常不能先验地确定这些密码子中的哪些是细菌中天然使用的。因此，应当理解使用备选的甲硫氨酸密码子之一也可能导致编码杀虫活性的δ-内毒素蛋白的产生。这些δ-内毒素蛋白包含在本发明的范围内，而且可用于本发明的方法中。

还包含针对本发明多肽或其变体或片段的抗体。用于生产抗体的方法是本领域公知的(参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；美国专利4,196,265)。

改变或改良的变体

应认识到，可通过各种方法改变δ-内毒素的DNA序列，而且这些改变可能产生所编码的蛋白质氨基酸序列不同于本发明δ-内毒素氨基酸序列的DNA序列。该蛋白质可以多种方式改变，包括SEQ ID NO：4、5、6、13或14的一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短和插入，包括至多大约2个、大约3个、大约4个、大约5个、大约6个、大约7个、大约8个、大约9个、大约10个、大约15个、大约20个、大约25、大约30个、大约35个、大约40个、大约45个、大约50个、大约55个、大约60个、大约65个、大约70个、大约75个、大约80个、大约85个、大约90个、大约100个、大约105个、大约110个、大约115个、大约120个、大约125个、大约130个或更多个氨基酸取代、缺失或插入。

这种操作方法是本领域通常已知的。例如，δ-内毒素蛋白的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。这还可以通过数种诱变之一和/或定向进化来完成。在某些方面，氨基酸序列中编码的改变基本上不会影响蛋白质的功能。这样的变体将具有所需的杀虫活性。不过，应理解δ-内毒素赋予杀虫活性的能力可通过对本发明的组合物使用所述技术得以提高。例如，可以在于DNA复制期间呈现出高比率碱基错误掺入的宿主细胞中表达δ-内毒素，如XL-1 Red(Stratagene)。在所述株系中增殖后，可分离δ-内毒素DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过PCR扩增并将得到的PCR片段克隆到载体中)，在非诱变菌株中培养δ-内毒素突变，鉴定具有杀虫活性的突变δ-内毒素基因，例如通过进行检测来测试杀虫活性。通常，将所述蛋白质混合并用于喂养分析中。参见，例如，Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。这样的分析可包括使植物接触一种或多种昆虫，并测定植物存活的能力和/或导致昆虫死亡的能力。导致毒性增强的突变的例子参见Schnepf等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806。

做为选择，可在氨基或羧基末端对许多蛋白质的蛋白质序列进行改变而基本上不影响其活性。这可包括利用现代分子方法引入的插入、缺失或改变，方法如PCR，包括由于在PCR扩增所用的寡核苷酸中含有氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。或者，添加的蛋白序列可包括完整的蛋白质编码序列，如那些在本领域中通常用于产生蛋白质融合体的序列。这样的融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白质的表达，(2)引入结合结构域，酶促活性或表位以方便蛋白质纯化，蛋白质检测，或本领域已知的其他实验性应用，(3)使蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞性细胞器，如革兰氏阴性细菌的周质空间，或者真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包括来自如DNA改组等诱变和重组方法的序列。通过这样的方法，可利用一个或多个不同的δ-内毒素蛋白编码区构建具有所需特性的新的δ-内毒素蛋白。用这样的方式，由含有具有充分的序列同一性且可体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群体产生重组多核苷酸文库。例如，用此方法，可在本发明的δ-内毒素基因与其他已知的δ-内毒素基因之间对编码目的结构域的序列基元进行改组，以获得编码具有改良的目的特性的蛋白质的新基因，如增强的杀虫活性。所述的DNA改组策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是产生改变的δ-内毒素蛋白的另一机制。结构域II和III可在δ-内毒素蛋白之间进行交换，产生具有改良的杀虫活性或目标谱的杂合或嵌合毒素。产生重组蛋白并检测其杀虫活性的方法是本领域公知的(参见，例如，Naimov等(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；de Maagd等(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等(1990；J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等人91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。

载体

本发明的δ-内毒素序列可以提供于表达盒中，用于在目标植物中表达。“植物表达盒”指能导致蛋白质在植物细胞中从开放阅读框表达的DNA构建体。一般这些构建体包含启动子和编码序列。经常，这样的构建体还包含3’非翻译区。这样的构建体可包含“信号序列”或“前导序列”，以促进肽在翻译的同时或翻译后转运到某些细胞内结构，如叶绿体(或其他的质体)，内质网或高尔基体。

“信号序列”指已知或猜测会导致翻译时或翻译后的跨细胞膜肽转运的序列。真核生物中，这通常包括分泌入高尔基体内，具有某些由此产生的糖基化作用。“前导序列”指在翻译时产生的氨基酸序列足以引起肽链共翻译转运至亚细胞器的任何序列。因此，这包括通过进入内质网、穿越液泡、包括叶绿体、线粒体等在内的质体而靶向转运和/或糖基化作用的前导序列。

“植物转化载体”指植物细胞有效转化所必需的DNA分子。这样的分子可由一个或多个植物表达盒组成，且可组装入一个以上的“载体”DNA分子中。例如，二元载体是利用两个非毗连的DNA载体编码植物细胞转化所需的所有顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”指设计成在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”指能在外源细胞中掺入、整合并表达异源DNA序列或片段的载体。所述的盒将包括与本发明的序列有效连接的5’和3’调控序列。“有效连接”指在启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导了与第二序列相应的DNA序列的转录。通常，有效连接意味着被连接的核酸序列是毗邻的，而且，在需连接两个蛋白质编码区时，则是毗邻且处于同一阅读框中。所述的盒可另外含有至少一个其他待共转化入生物体中的基因。或者，所述的其他基因可存在于多个表达盒中。

“启动子”指起到指导下游编码序列转录的功能的核酸序列。启动子与其他转录和翻译调节核酸序列(也称“调控序列”)一起是目的DNA序列表达所必需的。

所述的表达盒提供多个限制性位点，以供插入处于调控区的转录调控下的δ-内毒素序列。

所述的表达盒沿5’-3’转录方向将包含在植物中发挥作用的转录和翻译起始区(也即，启动子)，本发明的DNA序列，以及转录和翻译终止区(也即，终止区)。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列而言是天然的或类似的，或者外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或者可以是合成序列。启动子对于植物宿主而言是“天然的”或“同源的”，指启动子在该启动子将被引入的天然植物中存在。启动子对本发明的DNA序列而言是“外源的”或“异源的”，指启动子对于其有效连接的本发明DNA序列而言不是天然的或者天然存在的启动子。

终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以是就有效连接的目的DNA序列而言是天然的，可以是就植物宿主而言是天然的，或者可以来自其他来源(也即，对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或其任何组合而言是外源的或异源的)。合适的终止区可从根癌农杆菌的Ti-质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等(1991)Mol Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等(1990)Gene 91：151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

在适当的情况下，可将基因最优化以提高其在被转化的宿主细胞中的表达。也即，所述基因可以用宿主细胞偏好的密码子合成以促进表达，或者可以宿主偏好的密码子使用频率用密码子合成。通常，将增加基因的GC含量。例如，有关宿主偏好密码子使用的讨论参见Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本领域所已知的。参见，例如，美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其引入这里作为参考。

在一个实施方案中，δ-内毒素被靶向叶绿体以进行表达。用这样的方式，当δ-内毒素不是直接插入叶绿体的情况下，表达盒将另外含有编码转运肽的核酸以指导δ-内毒素进入叶绿体。这种转运肽是本领域已知的。参见，例如，Yon Heijne等(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126； Clark等(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等(1986)Science 233：478-481。

可优化靶向叶绿体的δ-内毒素基因以表达于叶绿体中，从而解决植物细胞核和此细胞器之间的密码子使用中的差异。按照这种方式，目的核酸可以用叶绿体偏好的密码子合成。参见，例如，美国专利5,380,831，其引入这里作为参考。

植物转化

本发明的方法包括把核苷酸构建体引入到植物中。“引入”指以这样的方式把核苷酸构建体呈现给植物，其中该构建体进入植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用把核苷酸构建体引入到植物中的特定方法，只要核苷酸构建体能进入至少一个植物细胞的内部。用于引入核苷酸构建体到植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化方法，瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“植物”指完整的植株，植物器官(例如，叶子，茎，根，等等)，种子，植物细胞，繁殖体，胚以及该植株的后代。植物细胞可以是分化或未分化的(例如愈伤组织，悬浮培养细胞，原生质体，叶细胞，根细胞，韧皮部细胞，花粉)。

“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织，指在植物细胞中掺入或整合了外源核酸序列或DNA片段的植物。这些核酸序列包括外源的，或不存在于未转化植物细胞内的那些核酸序列，以及可能是内源的，或存在于未转化植物细胞内的那些核酸序列。“异源的”通常指对于它们所存在的细胞或部分天然的基因组而言不是内源性的，而且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击等等方式加入细胞内的核酸序列。

可通过本领域已知的数种技术之一完成植物细胞的转化。可以修饰本发明的δ-内毒素基因以获得或增强在植物细胞中的表达。通常，表达这种蛋白质的构建体应含有驱动基因转录的启动子，以及允许转录终止和聚腺苷酸化的3′非翻译区。这样的构建体的组成是本领域公知的。在某些情况下，可有效改造基因，使得产生的肽被分泌出来，或者相反定向于植物细胞内。例如，可改造基因，使其含有信号肽，以方便所述的肽转移至内质网。还可能优选的是，改造植物表达盒使其含有内含子，从而使内含子的mRNA加工为表达所必需。

通常该“植物表达盒”将被插入到“植物转化载体”中。该植物转化载体可由完成植物转化所需的一个或多个DNA载体组成。例如，本领域的通常惯例是利用由一个以上毗连DNA片段组成的植物转化载体。这些载体在本领域中常常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体是最常用于农杆菌介导的转化中的，其中完成有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性是相当大的，并且将功能分摊到分开的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体含有T-DNA转移所必需的顺式作用序列(如左边界和右边界)，经改造能在植物细胞中表达的可选择标记，以及“目的基因”(经改造能在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。还存在于这种质粒载体中的是细菌复制所需的序列。顺式作用序列以可有效转移入植物细胞中并在其中表达的形式安排。例如，可选择标记基因和δ-内毒素基因位于左和右边界之间。常常第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。按照本领域中所理解的，该质粒常常具有使植物细胞可被农杆菌感染并通过在边界序列处的裂解以及vir介导的DNA转移来转移DNA的毒力功能(Vir基因)(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404，GV3101，EHA101，EHA105，等等)可用于植物转化。该第二质粒载体不是用如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等其他方法转化植物所必需的。

一般而言，植物转化方法包括将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等等)中，随后进行最大极限水平的适当选择(取决于可选择标记基因)，以从未转化细胞集合组中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移至新鲜置换的相同培养基中并进行常规培养。随后，在放置于补充了最大极限水平的选择剂的再生培养基中后，已转化的细胞被分化成芽。然后将所述的芽转移到选择性生根培养基中，以回收生根的芽或苗。然后转基因苗生长成成熟的植物并产生能繁殖的种子(例如，Hiei等(1994)The Plant Journal6：271-282；Ishida等(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。通常将外植体转移至新鲜置换的相同培养基中并进行常规培养。产生转基因植物的技术和方法的全面描述参见Ayres和Park(1994)CriticalReviews in Plant Sc ience 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120。由于被转化的材料包含许多细胞；转化和未转化的细胞都存在于任何受试靶愈伤组织片或组织或细胞组中。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力使被转化的植物培养物得以生长。通常，去除未转化细胞的能力是对快速回收被转化的植物细胞并成功产生转基因植物的限制。

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可随着作为转化的靶标的植物或植物细胞的类型，也即单子叶或双子叶而变化。转基因植物的产生可以通过几种方法之一来进行，包括但不限于，显微注射，电穿孔，直接的基因转移，通过土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞内(土壤杆菌介导的转化)，用与颗粒附着的异源外源DNA轰击植物细胞，射弹粒子加速，气溶胶束转化(美国公开申请号20010026941；美国专利4,945,050；国际公开号WO 91/00915；美国公申请号2002015066)，Lec1转化，和用于转移DNA的各种其他的非颗粒直接介导的方法。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于包含选择标记的DNA的基因枪传递，并通过同源重组将该DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码且质体指导的RNA聚合酶的组织偏爱的表达，经由沉默的质体携带的转基因的反式激活来完成。McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中报道了此类系统。

在将异源外源DNA整合入植物细胞中后，然后在培养基中应用最大阈值水平的合适选择以杀死未转化的细胞，并通过定期转移至新鲜培养基来分离和增殖从该选择处理中存活的假定经转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，可鉴定和增殖用所述质粒载体转化的细胞。然后，分子和生物化学方法可用于证实转基因植物的基因组中存在整合的异源目的基因。

已转化的细胞可以依照常规方法生长为植物。参见，例如，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以让这些植物生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，并且鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得到的杂种。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定地保持和遗传，并随后收获种子以确保已获得了所需表型特征的表达。按照这样的方式，本发明提供了经转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有本发明的核苷酸构建体，例如，稳定地整合入其基因组内的本发明的表达盒。

植物转化的评估

在将异源外源DNA引入植物细胞中后，通过多种方法来证实异源基因已转化或整合到植物基因组中，所述方法例如为分析与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢产物。

PCR分析是在移植到土壤中之前的较早阶段时就整合的基因的存在，来筛选转化的细胞、组织或芽的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。使用对目的基因或土壤杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物来进行PCR。

可通过基因组DNA的Southern印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell，2001，同上)。一般而言，从转化体提取总DNA，用合适的限制性内切酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分离，并转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。随后，根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，同上)用例如放射性标记³²P标记的靶DNA片段来探测膜或“印迹”，以证实引入的基因整合到植物基因组中。

在Northern印迹分析中，从转化的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并根据本领域常规使用的标准操作程序印迹到尼龙滤纸上(Sambrook和Russell，2001，同上)。随后，通过采用本领域已知的方法将滤纸与衍生自δ-内毒素基因的放射性探针杂交来测试由δ-内毒素基因编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，2001，同上)。

可以对转基因植物进行Western印迹法、生物化学分析等，以通过标准操作程序来确证由δ-内毒素基因编码的蛋白质的存在(Sambrook和Russell，2001，同上)，其中使用与δ-内毒素蛋白上存在的一个或多个表位结合的抗体。

植物中的杀虫活性

在本发明的另一个方面，可产生表达具有杀虫活性的δ-内毒素的转基因植物。如上所述作为实例而描述的方法可用于产生转基因植物，但产生转基因植物细胞的方式对于本发明而言不是至关重要的。可依据实验者的判断，使用本领域中已知或描述的方法，例如土壤杆菌介导的转化，生物射弹转化，和非颗粒介导的方法。可通过在本领域中描述的普遍方法来分离表达δ-内毒素的植物，例如通过愈伤组织的转化，选择经转化的愈伤组织，并从此类转基因愈伤组织中再生出可繁殖的植物。在这样的方法中，可使用任何基因作为选择标记，只要其在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择经转化的细胞的能力。

已经开发了许多用于植物细胞的标记，如对于氯霉素，氨基糖苷G418，潮霉素等的抗性。编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可用作选择标记。例如，提供对于植物除草剂如草甘膦，溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可以是特别有用的。已报道了此类基因(Stalker等(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等(1990)Nucl.Acids Res.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，这里公开的基因可用作标记来评估细菌或植物细胞的转化。用于检测植物、植物器官(例如，叶，茎，根等等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其后代中转基因的存在的方法是本领域公知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性来检测转基因的存在。

可测试表达δ-内毒素的可繁殖植物的杀虫活性，并选择显示出最佳活性的植物以用于进一步的育种。在本领域中可获得用于检验昆虫活性的方法。通常，将所述蛋白质混合并用于喂养分析中。参见，例如，Marrone等(1985)J.of Economic Entomology 78：290-293。

本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括，但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属物种(Brassica sp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘类树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏树、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括，但不限于，番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆、以及甜瓜属(Curcumis)的成员，如黄瓜、罗马甜瓜和香瓜。观赏植物包括，但不限于，杜鹃花、绣球、木槿、玫瑰花、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物是农作物植物(例如，玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜等)。

在昆虫控治中的用途

用于在昆虫防治中或在改造其他生物体中使用包含本发明的核苷酸序列或其变体的株系作为杀虫剂的一般方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利5,039,523和EP 0480762A2。

包含本发明的核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌菌株或者已被遗传改变而包含杀虫基因和蛋白质的微生物可用于保护农作物和产品免受昆虫侵害。在本发明的一个方面，用这样的试剂来处理产生毒素(杀虫剂)的生物体的完整的，也即未裂解的细胞，所述试剂在将所述细胞适用于靶昆虫的环境时延长在所述细胞中产生的毒素的活性。

做为选择，通过向细胞宿主中引入δ-内毒素基因来产生杀虫剂。δ-内毒素基因的表达直接或间接地导致杀虫剂的细胞内生产和维持。在本发明的一个方面，然后在当将所述细胞施用于靶昆虫的环境时延长在所述细胞中产生的毒素的活性的条件下处理这些细胞。所得的产物保持所述毒素的毒性。然后可按照常规技术来配制这些天然胶囊化的杀虫剂，以施用于栖宿有靶昆虫的环境例如土壤、水和植物的叶。参见，例如，EPA 0192319，以及其中所引用的文献。做为选择，可制备表达本发明的基因的细胞，以便允许作为杀虫剂来施用所得的物质。

杀虫剂组合物

本发明的活性成分通常以组合物的形式进行施用，并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、去污剂、杀虫肥皂、休眠喷洒油、聚合物和/或定时释放或生物可降解的载体制剂，其允许在单次施用所述制剂后对靶区域进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀害虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或几种这些制剂的混合物，如果想要，与其他农业上可接受的载体、表面活性剂或在制剂领域中通常使用的促进施用的助剂一起使用。合适的载体和助剂可以是固体或液体，并且相应于配制技术中常常使用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，可将所述制剂制备成可食用的“诱饵”或塑造成害虫“陷阱”，以允许靶害虫摄食或摄取所述杀虫制剂。

用于施用本发明的活性成分或本发明农业化学组合物(包含至少一种由本发明细菌菌株产生的杀虫蛋白)的方法，包括叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用率取决于受相应昆虫侵染的强度。

可以将组合物配制成粉剂、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳液、胶体、溶液等，并且可以通过常规方法，例如包含所述多肽的细胞培养物的干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩来制备所述组合物。在包含至少一种此类杀虫多肽的所有这些组合物中，所述多肽可以按重量计算，以约1％到约99％的浓度存在。

可通过本发明的方法在给定区域内杀死鳞翅目、鞘翅目或其他昆虫或减少其数目，或者可将本发明的方法预防性地应用于环境区域以防止被可能的昆虫侵染。优选地，昆虫摄取杀虫有效量的多肽，或与杀虫有效量的多肽接触。“杀虫有效量”指这样的杀虫剂的量，所述量能够引起至少一个昆虫死亡，或者明显减少昆虫生长、取食或正常的生理发育。该量将随下列因素而变化：例如，待防治的具体的靶昆虫，待处理的特定的环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件，以及施用杀虫有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性和数量。所述制剂还可以随气候条件、环境考虑和/或施用频率和/或昆虫侵染的严重程度而变化。

可通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮物或者分离的蛋白质组分与所希望的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述的杀虫剂组合物。在施用前，可以以合适的方法例如冻干、冷冻干燥、干燥，或者在水性载体、介质或合适稀释剂例如盐水或其他的缓冲液中配制所述组合物。配制的组合物可以为粉尘剂或颗粒材料的形式，或者在油(植物或矿物油)中的悬浮液的形式，或者水或油/水乳剂的形式，或者作为可湿性粉剂，或者与适合于农业应用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体或液体，而且是本领域公知的。术语“农业上可接受的载体”包括通常用于杀虫剂配制技术的所有助剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些对于杀虫剂配制领域的技术人员来说是公知的。所述制剂可以与一种或多种固体或液体助剂相混合，并且可以通过多种方法来制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适的助剂一起均匀地混合、掺合和/或研磨。合适的制剂和施用方法描述于美国专利6,468,523中，其引入这里作为参考。

“害虫”包括但不限于，昆虫，真菌，细菌，线虫，螨，蜱等。昆虫害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等的昆虫，特别是选自鞘翅目、鳞翅目和双翅目的昆虫。

鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)，而多食亚目包括水龟虫总科(Hydrophiloidea)、隐翅虫总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公虫总科(Cleroidea)、叩头虫总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芜菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步行甲总科(Tenebrionoidea)、长蠢总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象虫总科(Curculionoi dea)。步甲总科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龙虱科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟虫总科包括水龟虫科(Hydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(Coccinellidae)。芜菁总科包括芫菁科(Meloidae)。拟步行甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜣科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象虫总科包括象虫科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(Aschiza Division)和有缝组(Schizophora Division)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、草螟蛾科(Crambidae)和谷蛾科(Tineidae)。

线虫类包括寄生性线虫，例如根节，胞囊和损伤线虫，包括胞囊线虫属物种(Heterodera spp.)、根结线虫数物种(Meloidogyne spp.)和球胞囊线虫属物种(Globodera spp.)，特别是胞囊线虫类的成员，包括但不局限于，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(甜菜胞囊线虫)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)(谷类胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)以及马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potata cyst nematodes))。损伤线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)。

针对主要农作物的本发明虫害包括：玉米：玉米螟(Ostrinia nubilalis)、欧洲玉米螟(European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon)、黑地老虎(black cutworm)；谷实夜娥(Helicoverpa zea)、棉铃虫(corn earworm)；草地夜娥(Spodoptera frugiperda)、秋夜蛾(fall armyworm)；西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)、西南玉米螟(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米秆螟(lesser cornstalk boror)；小蔗螟(Diatraea saccharalis)，小蔗螟(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)、西方玉米根虫(western corn rootworm)；长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)、北方玉米根虫(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)、金针虫(wireworms)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)、北方假面金龟子(northern masked chafer)(蛴螬)；南方圆头犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方假面金龟子(southern masked chafer)(蛴螬)；日本弧丽金龟(Popillia japonica)，日本金龟子(Japanese beetle)；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)、玉米铜色跳甲；玉米长啄象(Sphenophorus maidis)，玉米长啄象；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米蚜；玉米根蚜(Anuraphis maidiradicis)，玉米根蚜(corn root aphid)；美洲谷秆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)，美洲谷秆长蝽(chinch bug)；赤胫黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红胫蝗虫(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蝗虫；灰种蝇(Hylemya platura)、玉米种蝇(seedcorn maggot)；玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis)、玉米斑潜蝇；黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)、草蓟马(grass thrips)；窃蚁(Solenopsis milesta)、窃蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)、二斑叶螨；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱螟；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；粒肽脏切夜娥(Feltia subterranea)，颗粒地老虎(granulate cutworm)；长毛食叶然金龟 (Phyllophaga crinita)、蛴螬；伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、单叶叩甲属物种(Conoderus spp.)、以及Aeolus spp.，线虫；黑角负泥虫(Oulema melanopus)，谷类叶甲(cereal leaf beetle)；玉米铜色跳甲，玉米铜色跳甲；玉米长啄象，玉米谷象；玉米蚜，玉米蚜；美甘蔗伪毛蚜(Sipha flava)，黄甘蔗蚜(yellow sugarcane aphid)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola)，粱痪蚊(sorghum midge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)；二斑叶蹒(Tetranychus urticae)，二斑叶蹒；小麦：一点黏虫(Pseudaletia unipunctata)，黏虫(army worm)；草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西方地老虎；南美玉米苗斑螟，小玉米秆螟；黑角负泥虫，谷类叶甲；三叶草叶象(Hypera punctata)，三叶草叶象；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，麦二叉蚜；麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，麦长管蚜；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗(Melanoplus differentialis)，特异黑蝗；血黑蝗，迁徙蝗虫；小麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，麦蛆(wheat midge)；美洲杆蝇(Meromyza americana)，美洲麦秆黄潜蝇(wheat stem maggot)；麦瘿种蝇(Hylemya coarctata)，麦种蝇(wheat bulb fly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草褐蓟马(tobacco thrips)；麦茎蜂(Cephus cinctus)，麦茎蜂；郁金香瘤瘿螨(Aceria tulipae)，小麦曲叶螨(wheat curl mite)；向日葵：向日葵芽卷叶娥(Suleima helianthana)，向日葵芽娥；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵娥；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis)，向日葵甲虫；胡萝卜利犀金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽瘿蚊；棉花：烟芽夜娥(Heliothis virescens)，棉花蚜虫；谷实夜娥，棉铃虫；甜菜夜娥(Spodoptera exigua)，甜菜夜娥；红铃麦娥 (Pectinophora gossypiella)，粉色螟蛉(pink bollworm)；墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)，棉子象鼻虫；棉蚜(Aphis gossypii)，棉蚜；棉序盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)，棉花跳盲蝽；茼麻粉虱(Trialeurodes abutilonea)，带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)；美国牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，tarnished plant bug；赤胫黑蝗，红胫蝗虫；特异黑蝗，特异黑蝗；烟蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马；烟褐花蓟马，烟草褐蓟马；朱砂叶螨，朱砂叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；稻：小蔗螟，小蔗螟；草地夜娥，秋夜娥；谷实夜娥，棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄鞘叶甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象甲；米象(Sitophilus oryzae)，米象；二条黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，米叶蝉；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽(Acrosternum hilare)，绿蝽；大豆：大豆夜娥(Pseudoplusia includens)，大豆尺夜娥(soybean looper)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，梨豆夜蛾(velvetbean caterpillar)；夜蛾科；苜蓿绿夜娥(Plathypena scabra)，苜蓿绿夜娥；玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；甜菜夜娥，甜菜夜娥；烟芽夜娥(Heliothis virescens)，烟芽夜蛾；谷实夜娥，棉铃虫；墨西哥大豆瓢虫(Epilachna varivestis)，墨西哥大豆瓢虫；桃蚜(Myzus persicae)，桃蚜；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯叶蝉；拟缘蝽，绿蝽；赤胫黑蝗，赤胫黑蝗；特异黑蝗，特异黑蝗；灰种蝇(Hylemya platura)，玉米种蝇；大豆蓟马(Sericothrips variabilis)，大豆蓟马；烟蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)，草莓叶螨；二斑叶螨，二斑叶螨；大麦：玉米螟，欧洲玉米螟；小地老虎，黑地老虎；麦二叉蚜，麦二叉蚜(greenbug)；美洲谷秆长蝽，美洲谷秆长蝽；拟缘蝽，绿蝽；烟草蝽(Euschistus servus)，褐臭蝽；灰地种蝇(Delia platura)，玉米种蝇(seedcorn maggot)；小麦瘿蚊，小麦瘿蚊；麦岩螨(Petrobia latens)，麦长腿蜘蛛；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，卷心菜蚜；黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲(Flea beetle)；蓓带夜娥(Mamestra configurata)，贝莎夜蛾(Bertha armyworm)；菜蛾(Plutella xylostella)，小菜蛾(Diamond-back moth)；地种蝇属物种(Delia ssp.)，根蛆(Root maggot)。

用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括将包含这里公开的杀虫序列的多核苷酸引入到植物或植物细胞中。如这里所定义的，植物的“产量”指由植物产生的生物量的品质和/或数量。“生物量”指任何经测量的植物产物。生物量生产方面的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改善。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。另外，增加叶生物量可以用于增加植物衍生的药物或工业产物的生产。产量的增加可以包括相对于不表达所述杀虫序列的植物而言任何统计学上显著的增加，包括但不限于，产量的至少1％的增加，至少3％的增加，至少5％的增加，至少10％的增加，至少20％的增加，至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，增加的植物产量是表达这里公开的杀虫蛋白的植物所改进的昆虫抗性的结果。杀虫蛋白的表达导致昆虫侵染或进食植物的能力降低，因此改进植物产量。

提供了下述实施例，这是为了举例说明而不是为了限制。

实验

实施例1.来自苏云金杆菌ATX12983菌株的新毒素基因Axmi115的发现

通过如下的MiDAS基因组学方法从选择的菌株中鉴定完整的基因序列：

●从菌株中制备染色体外DNA。

染色体外DNA包含以下一些或以下所有的混合物：各种大小的质粒；噬菌体染色体；纯化方案不能分离的基因组DNA片段；其他未表征的染色体外分子。

●将染色体外DNA进行机械或酶剪切以产生依大小分布的片段。

●将片段化DNA测序。

●通过同源性和/或其他计算分析鉴定推定的毒素基因。

●如果需要，通过一些PCR或克隆策略(例如TAIL-PCR)中的一种对

目的基因进行序列整理(sequence finishing)。

在这里将新基因称为axmi-115(SEQ ID NO：3)，将编码的氨基酸称为AXMI-115(SEQ ID NO：6)。编码AXMI-115的合成核苷酸序列陈列于SEQ ID NO：15和16。

基因和蛋白质特征

基因长度，DNA碱基对：2409

蛋白质长度，氨基酸残基：803

预测的蛋白质分子量(Da)：90877

已知的同系物和大约的百分比一致性：

Vip3Af1-70.7％

Axmi005-70.4％

Axmi026-70.4％

Vip3Aa7-70.1

实施例2.来自苏云金杆菌ATX13002菌株的新杀虫蛋白AXMI-005

从ATX13002菌株中鉴定AXMI-005杀虫基因，使用如美国专利公开号20040014091中描述的MiDAS方法，其在这里以整体引入作为参考，使用以下步骤：

在现行策略中涉及基因发现的步骤：

步骤1：大量培养菌株的培养物。在超速离心机中通过氯化铯梯度离心将质粒DNA从染色体DNA中分离。之后将纯化的质粒DNA雾化(nebulized)为5-10kb的大小范围以合适的覆盖编码区的平均大小。补齐片段末端并与用限制酶切割产生的平末端载体连接过夜。

步骤3：在检验和确认了鸟枪文库质量之后，培养、准备和以96孔格式测序菌落。将文库板在载体骨架外进行末端测序以进行初始筛选。

步骤5：将所有阅读序列汇编成装配方案，并排列在一起形成重叠群。将这些重叠群和可能未加入重叠群的任意单个阅读序列使用BLAST分析，使用批量(batch)格式，和由所有类型的已知δ-内毒素基因组成的内部数据库相比较。通过从文库中选择覆盖整个假设编码区的单个克隆进一步分析与已知基因具有任意同源性的任意重叠群或单个阅读序列。

步骤6：通过设计延伸序列的引物，沿一个个阅读序列(read by read)检测覆盖目的区域的单个克隆。如此操作直到克隆两端的阅读序列汇合，覆盖范围至少为2X。单个克隆的完整重叠群之后使用BLAST分析(blastn和blastx两种)，和所有已知杀虫基因的公共数据库相比较。之后从所有基因(剪为仅含编码序列)的内部数据库中拉出2种检索的击中结果(hit)并与完整的文库克隆序列比对以确定和已知基因的差异百分比。

通过此方法鉴定了新基因，这里称为axmi-005(SEQ ID NO：1)，其编码的氨基酸称为AXMI-005(SEQ ID NO：4)。在包括GENBANK 数据库的公共序列数据库的检索结果显示AXMI-005为独特的蛋白质，其与vip3Aa杀虫蛋白(GenePept ID L48841)具有最高的同源性(94.9％)。

设计了编码AXMI-005蛋白的合成序列，称为optaxmi-005。其核苷酸序列陈列于SEQ ID NO：7，编码的氨基酸序列陈列于SEQ ID NO：9(含有添加的C端组氨酸标签)。这里公开的optaxmi-005基因可包含或不含C端组氨酸标签使用。

实施例3.来自苏云金杆菌ATX12987菌株的新毒素基因Axmi-113的发现

通过如下的MiDAS基因组方法从选择的菌株中鉴定完整的基因序列：

●从菌株中制备染色体外DNA。

染色体外DNA包含以下一些或所有的混合物：各种大小的质粒；噬茵体染色体；纯化方案不能分离的基因组DNA片段；其他未表征的染色体外分子。

●将片段化DNA测序。

●通过同源性和/或其他计算分析鉴定推定的毒素基因。

●如果需要，通过一些PCR或克隆策略(例如TAIL-PCR)中的一种对

目的基因进行序列整理(sequence finishing)。

在这里将新基因称为axmi-113(SEQ ID NO：2)，将编码的氨基酸称为AXMI-113(SEQ ID NO：5)。

基因和蛋白质特征

基因长度，DNA碱基对：2385

蛋白质长度，氨基酸残基：795

预测的蛋白质分子量，Da：89475

已知的同系物和大约的百分比一致性：

Vip3Ah-99％

Vip3Aa18-79.8％

Axmi005-79％

设计了编码AXMI-113蛋白的合成序列，称为optaxmi-113。其核苷酸序列陈列于SEQ ID NO：8，编码的氨基酸序列陈列于SEQ ID NO：5或10(含有添加的C端组氨酸标签)。这里公开的optaxmi-113基因可包含或不含 C端组氨酸标签使用。

实施例4.来自苏云金杆菌ATX14775菌株的新毒素基因Axmi-163和Axmi-184的发现

●从菌株中制备染色体外DNA。

●将片段化DNA测序。

●通过同源性和/或其他计算分析鉴定推定的毒素基因。

●如果需要，通过一些PCR或克隆策略(例如TAIL-PCR)中的一种对

目的基因进行序列整理(sequence finishing)。

在这里将新基因称为axmi-163，陈列于SEQ ID NO：11，将编码的氨基酸称为AXMI-163，陈列于SEQ ID NO：13。

基因和蛋白质特征

基因长度，DNA碱基对：2370

蛋白质长度，氨基酸残基：790

预测的蛋白质分子量，Da：88,700

已知的同系物和大约的百分比一致性：

SEQ ID NO：17来自美国专利7,129,212-98％

Axmi005-78％

在这里将新基因称为axmi-184，陈列于SEQ ID NO：12，将编码的氨基酸称为AXMI-184，陈列于SEQ ID NO：14。编码AXMI-184的合成核苷酸序列陈列于SEQ ID NO：17和18。

基因和蛋白质特征

基因长度，DNA碱基对：2370

蛋白质长度，氨基酸残基：790

预测的蛋白质分子量，Da：88,300

已知的同系物和大约的百分比一致性：

Vip3Af1-93％

Axmi005-86％

实施例5.合成序列的构建

在本发明的一个方面，生成了合成axmi序列。这些合成序列相比亲本axmi序列具有改变的DNA序列，并编码与其对应的亲本AXMI蛋白共线的但缺乏在许多δ-内毒素蛋白中存在的C端“结晶区”的蛋白质，。

在本发明的另一个方面，设计了合成基因的修饰版本从而使得到的多肽靶向植物细胞器，例如内质网或质外体。可导致融合蛋白靶向植物细胞器的已知多肽序列是本领域所公知的。例如，本领域所公知的来自白羽扇豆(Lupinus albus)酸性磷酸酶基因的N端区(Genebank ID GI：14276838；Miller等(2001)Plant Physiology 127：594-606)可导致异源蛋白质靶向内质网。如果得到的融合蛋白在C端也含有包含N端赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸肽(即“KDEL”基序(SEQ ID NO：19))的内质网滞留序列，则融合蛋白将靶向内质网。如果融合蛋白在C端缺乏内质网靶向序列，蛋白质将靶向内质网但最终将隔绝在质外体中。

实施例6.芽孢杆菌中的表达

作为本发明的基因和蛋白质在芽孢杆菌物种中表达的实例，经PCR扩增这里公开的杀虫基因，将PCR产物克隆至芽孢杆菌表达载体pAX916或其他合适的载体，使用本领域熟知的方法。将得到的包含具有axmi基因的载体的芽孢杆菌菌株在传统生长培养基例如CYS培养基(10g/l细菌用(Bacto)酪胨；3g/1酵母提取物；6g/l KH₂PO₄；14g/1K₂HPO₄；0.5mM MgSO₄；0.05mM MnC1₂；0.05mM FeSO₄)中培养，直至通过显微镜检查确认孢子形成。准备样品并用生物测定检测活性。

实施例7.大肠杆菌(E.coli)中的表达

作为本发明的基因和蛋白质在基于大肠杆菌的系统中的表达方法的实例，将各个axmi基因克隆至基于pRSF1b的大肠杆菌表达载体。得到的克隆通过限制性内切分析和最终通过对克隆基因的完整测序确认。

为在大肠杆菌中表达，用表达axmi基因的载体转化BL21*DE3菌株。将单个菌落接种于添加卡那霉素的LB中并于37℃培养过夜。第二天，一式两份将1％过夜培养物接种于新鲜培养基中并在37℃培养至对数期。之后，用1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在37℃3小时或在20℃过夜诱导培养物。各细胞沉淀重悬于添加1mM DTT二硫苏糖醇的50mM碳酸钠缓冲液(pH10.5)中并超声破碎。准备样品并用生物测定检测活性。

实施例8.AXMI-115，AXMI-113和AXMI-005在大肠杆茵中的表达

生成了包含DNA片段的大肠杆菌克隆，所述DNA片段含有完整的开放阅读框和与各基因毗邻的天然存在的上游DNA区部分。axmi-113(SEQ ID：2)、axmi-115(SEQ ID NO：3)或axmi-005(SEQ ID NO：1)的各个DNA片段经扩增克隆至载体pAX916，分别得到克隆pAX5463、pAX5464和pAX5465。得到的克隆通过限制性内切分析和通过对克隆片段的完整测序确认。

用pAX5463、pAX5464和pAX5465的各个克隆转化大肠杆菌细胞。

利用T7启动子，也在大肠杆菌表达载体上表达了用于在玉米中表达而进行密码子优化并添加C端6组氨酸标签的axmi005、axmi113和axmi115基因。此外，也生成了表达N端6组氨酸标签或不合标签版本的optaxmi005 (pAX5475，pAX5478)和optaxmi115(pAX5476，pAX5477)构建体。

Axmi-115、axmi-113和axmi-005表达克隆的大肠杆菌单菌落之后在LB培养基中于37℃培养过夜。第二天，一式两份将1％过夜培养物接种于新鲜培养基中并在37℃培养至对数期。之后，用1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在20℃过夜诱导培养物。得到的细胞通过离心收集，并重悬于添加1mM DTT的50mM碳酸钠缓冲液(pH10.5)或具有1mM DTT的50mM Tris Cl缓冲液(pH 8)中并超声破碎。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示在所有样品中有～90kD的蛋白质的表达。

实施例9.大肠杆菌表达的蛋白质的昆虫生物测定

将包含AXMI-005、AXMI-113或AXMI-115的可溶性提取物在昆虫试验中检测，使用合适的对照。24孔组织培养板(Corning)中加入1ml多物种饵料(Bio-Serv)并使其固化。一旦固化，在各个孔的饵料表面加入40μl蛋白质样品并使其在室温渗透/干燥。取决于试验，在各个孔中放置卵块或新生幼虫。用透气膜(Research Products International)密封板，并在25℃和90％相对湿度下培养。5或7天后，对样品目测评分，与只有缓冲液或未转化的提取物对照比较。

观察到AXMI-005提取物对谷实夜娥(Helicoverpa zea)(HZ)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(HV)、秋夜蛾(FAW)、黑地老虎(BCW)、甘蔗螟虫(Sugarcane borer)(SCB)和绒毛豆毛虫(Velvet Bean caterpillar)(VBC)具有强活性。AXMI-005还对西南玉米螟(SWCB)显示了活性。

观察到AXMI-115提取物对烟芽夜蛾、秋夜蛾、黑地老虎和绒毛豆毛虫具有强活性。AXMI-115还对欧洲玉米螟(ECB)、SCB、SWCB和小菜蛾(DBM)展示了活性。AXMI-115对谷实夜娥(HZ)的活性不如对其他昆虫的明显，但仍然显著。

对各个AXMI-005和AXMI-115提取物的活性评分，基于试验中的相对活性指定了从1至5的数值。具体试验中评分的总结显示于表1。

AXMI-005显示了对SWCB(评分为2)的一定活性和对Hz，Hv，FAW，BCW和VBC(评分为4至5)的高活性水平。AXMI-115显示了对SWCB(80％死亡率)，ECB，FAW和VBC(评分为4至5)的高活性水平和对Hz和Hv的较低活性。AXMI-113也显示了对SWCB(评分为4，具有20％死亡率)和SCB的高活性。对其他检测的昆虫没有观察到活性。

表1.AXMI-115，AXMI-113和AXMI-005*的杀虫活性

*＝表示抑制和死亡率，其中抑制根据以下等级评分：

评分	定义
		0	无活性
1	轻微，非一致抑制
		2	非一致抑制
3	一致抑制
		4	一致抑制和具死亡率(以百分数表示)
5	一致抑制和100％死亡率

实施例10.Axmi184的生物测定

基因表达和纯化

●将编码Axmi184毒素区的DNA区克隆至大肠杆菌表达载体pMAL-C4x，置于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的ma1E基因后面。此依读框的融合导致MBP-Axmi184融合蛋白在大肠杆菌中表达。

●为在大肠杆菌中表达，用单个质粒转化BL21*DE3。将单菌落接种于添加羧苄青霉素和葡萄糖的LB中，于37℃培养过夜。第二天，将1％过夜培养物接种于新鲜培养基中并在37℃培养至对数期。之后，用0.3mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在20℃过夜诱导培养物。将各个细胞沉淀重悬于添加200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂的20mM Tris Cl缓冲液(pH 7.4)中并超声破碎。通过SDS-PAGE分析确认融合蛋白的表达。

●总无细胞提取物经FPLC附带的直链淀粉柱过柱以对MBP-AXMI184融合蛋白进行亲和纯化。使用10mM麦芽糖溶液将结合的融合蛋白从树脂上洗脱。之后将纯化的融合蛋白用Xa因子或胰蛋白酶切割以去除AXMI184上的N端MBP标签。通过SDS-PAGE确定切割和蛋白质的可溶性。

●切割的蛋白质在昆虫试验中检测，使用合适的对照。5天后的板读数显示AXMI-184对小菜蛾的以下活性。

实施例11.结构域替换

在此实施例中使用为了在玉米中表达而进行密码子优化的axmi005，axmi113和axmi115基因。使用表达无标签版本的optaxmi005(pAX5478)，optaxmi113(pAX5493)和optaxmi115(pAX5477)质粒设计如这里描述的DNA替换构建体。

AXMI-005，AXMI-113和AXMI-115在它们的N端2/3区域具有显著的序列一致性/相似性。剩余的C端1/3区域显示了如图1A和1B提供的蛋白质序列比对中可见的大量序列差异。

将图1中显示的正向和反向箭头之间的AXMI-113蛋白质区域用AXMI-005(得到pAX5492)或AXMI-115(pAX5494)的相应片段替换。

为在大肠杆菌中表达，用单个构建体转化BL21*DE3。将单菌落接种于添加卡那霉素的LB中，于37℃培养过夜。第二天，一式两份将1％过夜培养物接种于新鲜培养基中并在37℃培养至对数期。之后，用1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在20℃过夜诱导培养物。将各个细胞沉淀重悬于添加1mM DTT的50mM碳酸钠缓冲液(pH 10.5)中并超声破碎。SDS-PAGE显示了所有蛋白质的非常好的可溶性表达。

将表达OptAxmi005，113，115，Optaxmi113+Optaxmi005CT和Optaxmi113+Optaxmi115CT的过滤除菌的可溶提取物在昆虫试验中检测，使用合适的对照。如实施例9中所示，AXMI-113显示了对SWCB(25％死亡率)的高活性。其对SCB(50％死亡率)显示了额外的活性。

还如实施例9中所示，AXMI-005显示了对SWCB，Hz，Hv，FAW，BCW和VBC的活性。其对SCB(25％死亡率)显示了额外的活性。也发现AXMI-115对SCB具有一定活性。

AXMI-113+AXMI-005CT融合蛋白显示了在AXMI-005中所见的所有昆虫活性。也就是说，将AXMI-113的C端片段替换为AXMI-005的C端片段赋予了AXMI-113在天然存在形式下所不具有的昆虫活性。

通过替换一种蛋白质的结构域至另一种可生成另外的毒素蛋白。例如，将图2中所示的一个或多个AXMI-005结构域引入AXMI-115。使用表2中所示的有义(“s”)和反义(“a”)寡核苷酸引入结构域。被引入axmi-115序列的axmi-005序列部分以加粗字体显示。各寡核苷酸的侧翼序列为用于将寡核苷酸与axmi-115模板退火的axmi-115序列。在各引物名中措辞“sub”之后的数字对应图2中编号的方框。可设计类似的寡核苷酸用于在多个序列中替换结构域，例如，在这里描述的AXMI-005，AXMI-113，AXMI-115，AXMI-163和AXMI-184序列之间。

表2

实施例12.杀虫活性的其他试验

常常以多种方式评估杀虫蛋白作为杀虫剂作用于害虫的能力。本领域公知的一种方法是进行喂养分析。在这种喂养分析中，将害虫暴露于含有待测化合物的样品或对照样品。通常，这是通过将待测材料或其合适稀释物置于害虫将要摄食的物质如人工饵料上来进行。待测材料可为液体，固体或浆料形式。可以将待测材料置于表面之上，然后使其干燥或被饵料吸收。或者，可以将待测材料与熔化的人工料料混合，然后分装到分析室中。分析室可以是，例如，杯、盘或微量滴定板的孔。

针对吸食害虫(例如蚜虫)的测定法可以包括使用隔离物将测试材料与昆虫分开，理想的是吸食昆虫的吸食口器能够刺穿的物体，从而能够摄食测试材料。通常，将测试材料与喂食刺激物如蔗糖混合，以促进测试化合物的摄食。

其他类型的测定法可包括将测试材料显微注射到害虫的口腔或肠中，以及开发转基因植物，随后测试害虫以转基因植物为食的能力。植物测试可以包括分离通常取食的植物部分，例如将小笼附于叶片上，或者在装有昆虫的笼中分离整个植株。

本领域已知测定害虫的其他方法和途径，并且可见于例如：Robertson，J.L.&H.K.Preisler.1992.Pesticide bioassays with arthropods.CRC，B℃a Raton，FL。或者，测定法一般描述于如下期刊中：“Arthropod Management Tests”和“Journal of Economic Entomology”，或者是与美国昆虫协会(Entomological S℃iety of America，ESA)成员的讨论。

实施例13.用于植物表达的杀虫基因的载体构建

将本发明基因的各个编码区各自与用于在植物中表达的合适的启动子和终止子序列连接。这些序列是本领域公知的，而且可包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉米泛素启动子、用于在双子叶植物中表达的拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子、以及nos或PinII终止子。用于构建和鉴定启动子-基因-终止子构建体的技术在本领域同样是公知的。

实施例14.通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化将本发明基因转化进植物细胞

在授粉以后8-12天采集玉米穗。由穗分离胚，而且大小为0.8-1.5mm的那些胚优选用于转化。将胚以盾片侧向上的方式置于合适的孵育培养基上，并于25℃在黑暗中孵育过夜。但是，本质上没有必要孵育胚过夜。使胚接触含有用于Ti质粒介导的转移的合适载体的土壤杆菌菌株达大约5-10min，之后置于共培养培养基上3天(25℃在黑暗中)。共培养之后，将外植体转移至恢复期培养基中孵育5天(25℃在黑暗中)。将外植体在选择培养基中孵育至多8周，这取决于所用具体选择方法的本质和特征。选择期后，将得到的愈伤组织转移到胚成熟培养基，直至观察到成熟体细胞胚的形成。然后将由此产生的成熟体细胞胚置于低光照下，并通过本领域已知方法启动再生程序。使由此产生的芽在生根培养基上生根，并将产生的植株转移到苗圃罐中，繁殖成转基因植物。

实施例15.用本发明的杀虫基因转化玉米细胞

在授粉以后8-12天采集玉米穗。由穗分离胚，而且大小为0.8-1.5mm的那些胚优选用于转化。将胚以盾片侧向上的方式置于合适的孵育培养基上，如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(1000×储液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL储液)2，4-D)并于25℃在黑暗中孵育过夜。

将产生的外植体转移到筛网上(每块板30-40粒)，转移到渗透培养基上30-45分钟，然后转移到光照板(beaming plate)上(参见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

采用基本上如PCT公开号WO/0138514中描述的条件，使用气溶胶气流加速器(aerosol beam accelerator)，将设计在植物细胞中表达本发明基因的DNA构建体加速进入到植物组织中。光照后，将胚在渗透培养基上孵育大约30min，然后置于孵育培养基上在黑暗中于25℃孵育过夜。为了避免过度损伤经过光照的外植体，在转移至恢复培养基之前将它们孵育至少24小时。再将胚散布到恢复期培养基上，在黑暗中于25℃孵育大约5天，然后转移到选择培养基上。将外植体在选择培养基中孵育至多8周，这取决于所用具体选择方法的本质和特征。选择期后，将得到的愈伤组织转移到胚成熟培养基，直至观察到成熟体细胞胚的形成。然后将由此产生的成熟体细胞胚置于低光照下，并通过本领域已知方法启动再生程序。使由此产生的芽在生根培养基上生根，并将产生的植株转移到苗圃罐中，繁殖成转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl将溶液的pH调至pH5.8，以3g/L的浓度添加Gelrite(Sigma)，并对培养基进行高压灭菌。冷却至50℃后，添加2ml/L的5mg/ml储液的硝酸银(Phytotechnology Labs)。此配方可制成约20块板。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请指示了本发明所属领域的熟练技术人员的技术水平。所有的出版物和专利申请都引入这里作为参考，其程度与专门和个别指出引入每一项出版物或专利申请作为参考相同。

虽然出于清楚理解的目的通过例示和实施例已经较为详细的描述了上述发明，但是显然可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修饰。

Claims

1.分离的或重组的核酸分子，其由选自以下的核苷酸序列组成：

a)SEQ ID NO：3、15或16的核苷酸序列，或其互补序列；

b)编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的或重组的核酸分子，其中所述核苷酸序列与启动子有效连接，所述启动子能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中的表达。

3.权利要求1或2的分离的或重组的核酸分子，其中所述核苷酸序列为设计为在植物中表达的合成序列。

4.包含权利要求1或2的核酸分子的表达盒。

5.权利要求4的表达盒，还包含编码异源多肽的核酸分子。

6.包含权利要求4的表达盒的细菌宿主细胞。

7.具有杀虫活性的分离的多肽，选自：

a)由SEQ ID NO：6的氨基酸片列组成的多肽；

b)由SEQ ID NO：3、15或16的核苷酸序列编码的多肽。

8.包含权利要求7的多肽的组合物。

9.权利要求8的组合物，其中所述组合物选自粉剂、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳液、胶体和溶液，其中任选的所述组合物是通过对苏云金杆菌细胞的培养物进行干燥、冻干、均质化、抽提、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备的。

10.用于控制或杀死鳞翅目或鞘翅目害虫种群的方法，包括将所述害虫种群接触杀虫有效量的权利要求7的多肽。

11.用于生产具有杀虫活性的多肽的方法，包括在表达编码该多肽的核酸分子的条件下培养权利要求6的宿主细胞。

12.用于保护植物免受虫害侵害的方法，包括引入至少一种表达载体到所述植物或其细胞中，该表达载体包含编码杀虫多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：3、15或16的核苷酸序列或其互补序列；

b)编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。