CN102050888B - 一种依诺肝素钠的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种依诺肝素钠的制备方法，其步骤包括盐化、干燥、酯化、醇沉、氧化、醇沉、精滤、冻干制得成品。本发明采用亲水液相反应和疏水液相反应以及固相反应，将大分子肝素钠降解为具有特定结构的低分子肝素钠，并控制产物分子量和分子量分布范围，使导致出血危险的抗FIIa活性大幅降低，抗FXa活性相对提高，产品有效性和安全性优势明显，可有效预防静脉血栓栓塞症和肺栓塞症，可用于矫形外科、神经外科术前和术后血栓形成，可大大降低患中风风险，能更有效减少不稳定性冠状动脉综合症患者的死亡、心力衰竭、复发性心绞痛等，并可降低高甘油三脂血症，能有效解决普通未分级肝素及其衍生物长期使用后的出血、骨质疏松、诱导血小板减少等副作用。

Description

一种依诺肝素钠的制备方法

技术领域

本发明涉及依诺肝素钠的制备方法。

背景技术

生物活性药物肝素自被发现起在临床应用已有近百年历史，它是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。另外，肝素及其衍生物还广泛用于调节血脂、抗炎、抗过敏以及免疫调节等，到目前它仍是重要的生化药物之一，也是我国主要出口创汇药物之一。

依诺肝素钠是低分子肝素的一种，它主要用于抗血栓、抗凝血、治疗急性心梗和不稳定性心绞痛等。其抗凝机理复杂，适应症比较广泛，对凝血的各个环节均有作用。包括抑制凝血酶原转变为凝血酶，抑制凝血酶活性，妨碍纤维蛋白原转变为纤维蛋白，防止血小板凝聚。依诺肝素钠可通过降低LDL、VLDL和升高HDL，来改变血液粘稠度、保护血管内皮细胞、预防血栓和动脉粥样硬化、改善冠状动脉循环等作用。依诺肝素钠具有临床适应症广(FDA批准了9个适应症)，生物利用度高，体内半衰期长，副作用小等优点，其市场占有率达到肝素和低分子肝素的2/3以上。但是目前市场出售的低分子肝素大多是在无机溶媒中反应制备，在制备过程中其化学结构的改变影响到产品的生物活性及稳定性。

发明内容

本发明旨在采用亲水液相反应和疏水液相反应以及固相反应相结合的技术，提供一种以β-消除法制备低分子肝素钠的生产工艺，以克服现有生产技术存在的不足。

为实现本发明目的，依诺肝素钠生产工艺其特征包括以下步骤：

a.按2000～4000、4800～10800重量份分别称取肝素钠和苄索氯铵后，在20000～40000重量份的30～40℃的纯化水中加入所称取的肝素钠，搅拌使之完全溶解；在28800～64800重量份的45～50℃的纯化水中加入所称取的苄索氯铵搅拌使之完全溶解；

b.盐化：在搅拌状态下将上述溶解的肝素钠溶液缓慢加入已溶解的苄索氯铵溶液中后，再继续搅拌30～60分钟后静置；

c.干燥：将上述静置液离心分离后得到的肝素盐化物结晶加入纯化水洗涤后，在50～60℃条件下干燥；

d.酯化：当上述肝素盐化物结晶含水量低于10％时，在30～35℃水浴温度下，将干燥的肝素盐化物结晶加入30000～40000重量份的N，N-二甲基甲酰胺中，当肝素盐化物结晶完全溶解后加入1000～4000重量份氯化苄，然后搅拌保温酯化20～30小时；

e.醇沉：上述酯化结束后，在搅拌状态下加入108000～144000重量份的2％乙酸钠乙醇溶液，继续搅拌15～30分钟后离心分离收集沉淀物，然后在搅拌状态下于沉淀物中加入54000～72000重量份的2％乙酸钠乙醇溶液，继续搅拌15～30分钟后，离心分离收集沉淀物，在沉淀物中加入2500～5000重量份的10％氯化钠溶液搅拌使之完全溶解，然后在搅拌状态下再加入10000～20000重量份的90～95％乙醇生成沉淀；

f.氧化：分离上清液后，将上述沉淀加入36000～72000重量份的纯化水溶解，在50～60℃水浴保温下，缓慢加入5～10M的氢氧化钠溶液，然后保温反应45～90分钟后迅速降温至25～40℃；

g.调节上述反应液pH值至6.0～7.0后过滤，然后加入360～720重量份的乙酸钠搅拌溶解，在搅拌状态下加入144000～288000重量份的90～95％乙醇；

h.持续搅拌15～30分钟后静置8～10小时，分离出上清液后加入18000～36000重量份的纯化水搅拌使沉淀物完全溶解，然后在pH10.0～11.0、20～30℃条件下加入60～120重量份的双氧水；

i.醇沉：上述氧化反应6～8小时后，调整反应液pH6.5～7.0后过滤，然后加入120～240重量份的氯化钠搅拌溶解，再加入60000～120000重量份的90～95％乙醇搅拌沉淀物，持续搅拌15～30分钟后静置8～10小时；

j.精滤：加入10～15倍量的纯化水将上述沉淀物搅拌溶解后过滤，然后将滤液用1000D超滤膜超滤浓缩；

k.冻干：将上述浓缩液用0.1μm滤膜除菌过滤后，滤液入冻干机冷冻干燥，制得依诺肝素钠成品。

本发明工艺产品与国家和进口标准有关比较数据：

本发明取得的技术进步：

(1).本发明在特定条件下利用β-消除法将普通大分子肝素钠降解为低分子量肝素钠，采用亲水液相反应和疏水液相反应以及固相反应相结合，将大分子肝素钠降解为具有特定结构的低分子肝素钠，即在非还原端有一个4，5不饱和双键，而在还原端有1，6-脱水环结构。并进一步采用超滤和纳滤等工艺过程控制产物的分子量和分子量分布范围，制备出高纯度的低分子肝素钠。采用β-消除降解反应，该法不在肝素活性部位降解，不发生脱硫，使导致出血危险的主要因素抗FIIa活性大幅降低，而发挥抗栓作用的抗FXa活性相对提高，抗FXa/抗FIIa比值大于3.3，使得产品的有效性和安全性具有明显优势。

(2).本发明制备的依诺肝素钠与普通肝素相比，具有以下特点：①分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长，普通肝素的分子量在3000～30000之间而依诺肝素钠的平均分子量在3800～5000之间，小剂量皮下注射依诺肝素钠，其抗Fxa活性回收近100％，而普通肝素只有约30％，其血浆半衰期是普通肝素的2～4倍；②有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；③抗FXa因子强，抗FIIa因子弱，抗血栓作用强，出血副作用小；④较少与血小板结合，不易引起血小板减少等优点。临床上目前已作为防治深部静脉血栓形成及相关疾病的首选药物，同时该产品可有效预防普通外科、矫形外科的术前和术后的血栓形成，在术后开始血栓预防，与华法林、安慰剂以及加压袜对比，DVT的术后发生率本发明依诺肝素钠组为19％～45％，而对照组为43％～65％；除此外，本发明依诺肝素钠还可有效预防缺血性中风患者的DVT，降低患风险约70％，能有效解决普通未分级肝素长期使用后易出现的出血、骨质疏松、诱导血小板减少等副作用，具有十分广阔的发展前景。

附图说明

图1为本发明工艺流程示意图。

具体实施方式

实施例1：如图1所示，本发明制备依诺肝素钠工艺过程为：

a.称取3kg肝素钠(注射级去DS)、5kg苄索氯铵备用；

b.向30升30～40℃的纯化水中加入所称取的肝素钠，搅拌使之完全溶解；向30升45～50℃的纯化水中加入所称取的苄索氯铵搅拌使之完全溶解；

c.盐化：将上述溶解好的肝素钠溶液缓慢加入到已溶解的苄索氯铵溶液中，边搅拌边加入，加完后继续搅拌30～60分钟后静置；

d.干燥：利用离心机将上述反应物离心，弃去上清液，得到肝素盐化物结晶，加入100升纯化水洗涤肝素盐化物结晶，洗涤后离心弃去上清液，重复操作3～4次后，开启热风循环烘箱，在50～60℃条件下干燥18～24小时；

e.酯化：当上述肝素盐化物结晶含水量低于10％时，设定水浴温度30～35℃下，将干燥好的肝素盐化物结晶加入到5～7重量倍的N，N-二甲基甲酰胺中搅拌使之溶解，待肝素盐化物结晶完全溶解后加入9L氯化苄，开始搅拌保温酯化20～30小时；

f.醇沉：上述酯化反应结束后，在搅拌状态下加入3～4重量倍浓度为2％～3％乙酸钠乙醇溶液搅拌沉淀，加完后继续搅拌15～30分钟后离心分离收集沉淀物，然后在搅拌状态下于沉淀物中加入54000～72000重量份的2％乙酸钠乙醇溶液，继续搅拌15～30分钟后，离心分离收集沉淀物，按10％浓度在沉淀物中加入10％氯化钠溶液搅拌使之完全溶解，然后在搅拌状态下再加入3～4重量倍的90～95％乙醇生成沉淀，用10％氯化钠溶液重复洗涤沉淀2次；

g.氧化：分离上清液后，加入15～18重量倍的纯化水溶解沉淀物，在水浴保温50～60℃下，缓慢加入250ml 5～10M氢氧化钠溶液，然后保温反应45～90分钟后迅速降温至25～40℃；

h.调节上述溶液pH值至6.0～7.0后板框过滤，然后加入1000～2000克的乙酸钠搅拌溶解，在搅拌状态下加入4～6重量倍的90～95％乙醇搅拌沉淀；

i.继续搅拌15～30分钟后，沉淀静置8～10小时，分离出上清液后，在沉淀中加入8～10重量倍纯化水搅拌使沉淀物完全溶解，然后在pH10.0～11.0、20～30℃条件下加入200～300ml、30％的双氧水反应6～8小时；

j.醇沉：上述反应结束后，调整反应液pH值6.5～7.0后板框过滤，然后加入300～400克氯化钠搅拌溶解后，再加入100000～150000ml的90～95％乙醇搅拌沉淀，乙醇加完后继续搅拌15～30分钟，静置8小时以上；

k.精滤：在控制区，加入10～15重量倍的纯化水将上述沉淀物搅拌溶解后，依次使用板框和0.2μm滤膜过滤，然后将滤液用1000D超滤膜超滤浓缩；

l.冻干：在控制区，将上述浓缩液用0.1μm滤膜除菌过滤后，滤液入冻干机进行冷冻干燥，制得依诺肝素钠成品。

实施例2：本实施例与实施例1不同之处是肝素钠为2kg，氯化苄6L，氢氧化钠165g。

实施例3：本实施例与实施例1不同之处是肝素钠为4kg，氯化苄12L，氢氧化钠330g。

Claims (1)

1.一种依诺肝素钠的制备方法，其特征包括以下步骤：

a.按2000～4000、4800～10800重量份分别称取肝素钠和苄索氯铵后，在20000～40000重量份的30～40℃的纯化水中加入所称取的肝素钠，搅拌使之完全溶解；在28800～64800重量份的45～50℃的纯化水中加入所称取的苄索氯铵搅拌使之完全溶解；

b.盐化：在搅拌状态下将上述溶解的肝素钠溶液缓慢加入已溶解的苄索氯铵溶液中后，再继续搅拌30～60分钟后静置；

c.干燥：将上述静置液离心分离后得到的肝素盐化物结晶加入纯化水洗涤后，在50～60℃条件下干燥；

d.酯化：当上述肝素盐化物结晶含水量低于10％时，在30～35℃水浴温度下，将干燥的肝素盐化物结晶加入30000～40000重量份的N，N-二甲基甲酰胺中，当肝素盐化物结晶完全溶解后加入1000～4000重量份氯化苄，然后搅拌保温酯化20～30小时；

e.醇沉：上述酯化结束后，在搅拌状态下加入108000～144000重量份的2％乙酸钠乙醇溶液，继续搅拌15～30分钟后离心分离收集沉淀物，然后在搅拌状态下于沉淀物中加入54000～72000重量份的2％乙酸钠乙醇溶液，继续搅拌15～30分钟后，离心分离收集沉淀物，在沉淀物中加入2500～5000重量份的10％氯化钠溶液搅拌使之完全溶解，然后在搅拌状态下再加入10000～20000重量份的90～95％乙醇生成沉淀；

f.氧化：分离上清液后，将上述沉淀加入36000～72000重量份的纯化水溶解，在50～60℃水浴保温下，缓慢加入5～10M的氢氧化钠溶液，然后保温反应45～90分钟后迅速降温至25～40℃；

g.调节上述反应液pH值至6.0～7.0后过滤，然后加入360～720重量份的 乙酸钠搅拌溶解，在搅拌状态下加入144000～288000重量份的90～95％乙醇；

h.持续搅拌15～30分钟后静置8～10小时，分离出上清液后加入18000～36000重量份的纯化水搅拌使沉淀物完全溶解，然后在pH10.0～11.0、20～30℃条件下加入60～120重量份的双氧水；

i.醇沉：上述氧化反应6～8小时后，调整反应液pH6.5～7.0后过滤，然后加入120～240重量份的氯化钠搅拌溶解，再加入60000～120000重量份的90～95％乙醇搅拌沉淀物，持续搅拌15～30分钟后静置8～10小时；

j.精滤：加入10～15重量倍的纯化水将上述沉淀物搅拌溶解后过滤，然后将滤液用1000D超滤膜超滤浓缩；

k.冻干：将上述浓缩液用0.1μm滤膜除菌过滤后，滤液入冻干机冷冻干燥，制得依诺肝素钠成品。 

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