CN102059157B

CN102059157B - 阴离子交换整体材料和以其为分离介质的常规液相色谱柱或石英毛细管柱及其制法

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Publication number: CN102059157B
Application number: CN201010578029.XA
Authority: CN
Inventors: 刘震; 刘晶
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: CN102059157A

Abstract

一种阴离子交换整体材料，它是具有相互贯穿的通透孔道的聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]为多孔整体材料骨架，用NH₃使环氧基团开环形成伯胺基团的、可用于进行阴离子交换的多孔整体材料。该整体材料制备简单，具有可控的微米尺寸的通孔和很好的亲水性，这些特点使得该整体材料能够作为色谱分离介质以及阴离子样品的富集介质，特别适用于极性的复杂样品的分离和富集。本发明公开了其制备方法。

Description

阴离子交换整体材料和以其为分离介质的常规液相色谱柱或石英毛细管柱及其制法

技术领域

本发明涉及一种阴离子交换型整体材料以及该整体材料在样品预处理和色谱分离方面的应用。

背景技术

随着液相色谱技术在环境、医学、生命科学等领域的广泛应用，围绕液相色谱分离材料的制备以及色谱分离方法的研究日渐深入。其中，液相色谱分离介质是分离分析技术的核心部分。最近几年发展起来一种新型的色谱固定相——整体材料，它由于具有通透性能好、柱压低、制备简单、传质速度快等优点，成为当前研究的热点之一，现已在反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等中获得应用，并成功分离了氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、类胆固醇等多种化合物。整体材料按照制备单体的不同，主要分为两大类：有机聚合物整体材料和硅胶整体材料[参见J. Chromatogr. A 2002, 954, 5]。其中，有机聚合物整体柱的制备更加简单。因为只含有一个相，所以能够用于制备整体柱的单体种类可以有更多的选择，这就大大增加了合成材料的种类，也大大增加了它的应用范围，尤其是在生物分子的分析检测方面。制备过程概括来说是将待聚合的反应混合物 (反应单体、交联剂、引发剂及致孔剂) 脱气混匀后，通过加热或者紫外光照射使其形成连续多孔的有机聚合物骨架，当反应完成后，用溶剂将未反应的单体以及致孔剂冲洗干净。为了制备出适用于不同领域的有机整体材料，工作者对后修饰法制备聚合物整体材料进行了研究，尤其是环氧树脂基质的有机聚合物整体材料，由于活性聚合的可控性，对其后修饰进行深入的研究具有重要的意义[参见Macromolecules 2005, 38, 9901]。在离子交换型整体材料方面，Gu等[参见Anal. Chem. 2007, 79, 5848；Anal. Chem. 2006, 78, 3509]直接利用含有磺酸根的单体，包括2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙烷磺酸、甲基丙烯酸-2-乙磺酸酯、乙烯基磺酸，在整体材料上引入阳离子交换基团制备离子交换型整体材料。用聚乙二醇二丙烯酸酯作为交联剂，由于聚乙二醇二丙烯酸酯上存在亲水基团羟基，一定程度上提高了整体材料的亲水性。Bisjak等则利用后修饰法[Chromatographia 2005, 62, S31]用二乙胺对聚 (甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-二乙烯基苯) 表面的环氧基团进行开环，开环反应生成氨基基团,制备出具有阴离子交换能力的固定相。Wei等[J. Sep. Sci. 2006, 29, 5]则通过对聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯) 整体材料基质上的环氧基团进行开环反应制备了弱阳离子交换整体材料。材料表面的弱阳离子交换基团是通过胺化反应得到的。即先用乙二胺对整体材料表面的环氧基团进行开环，再用氯乙酸对整体材料表面进行处理，就可以得到表面有羧基的固定相。除了上述对整体材料进行后修饰的方法外，还可以将凝胶颗粒涂覆在整体材料的表面，对整体材料进行功能化修饰。Hilder等[J. Chromatogr. A 2004, 1053, 101]将粒径为60 nm的季铵盐纳米粒子通过静电相互作用涂覆在聚 (甲基丙烯酸丁酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯-co-丙烯酰胺基甲基丙烷磺酸) 整体材料基质上，制得了用于分离多糖类化合物的阴离子交换整体材料。在离子交换模式的应用方面，作为分离和富集介质与质谱联用已成为普遍的方法。Wang等人[Anal. Chem. 2007, 79, 6599] 用乙二醇甲基丙烯酸磷酸盐和甲叉双丙烯酰胺进行共聚制备了一种以磷酸根作为阳离子交换基团的整体材料，并将其作为蛋白质酶解产物的预富集介质（相当于二维液相色谱中的第一维），与第二维的反相色谱联用，在nano-LC-MS 上对肽段进行分离分析。

发明内容

本发明旨在提供一种采用含有环氧基团和氨基基团的单体，通过热引发聚合反应制备含环氧基团的整体柱骨架，然后用氨水进行后修饰，将多余的环氧基团开环，制备一种阴离子交换型整体材料。具体采用三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯和三(2-氨基乙基)胺为单体，PEG200为致孔剂。该整体材料可用于阴离子样品的预富集以及应用在HPLC下进行分离。

本发明的技术方案如下：

一种阴离子交换整体材料，它是具有相互贯穿的通透孔道的聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]为整体材料骨架，用NH₃使环氧基团开环形成伯胺基团的、可用于进行阴离子交换的整体材料。

一种制备上述的阴离子交换整体材料的方法，它包括如下步骤：

步骤1. 将三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯完全溶解于聚乙二醇中，再加入三(2-氨基乙基)胺，将该混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液，在60～120 ℃水浴中反应6～24h，将制得的整体材料骨架用甲醇冲洗除去残留的致孔剂以及未反应物，得到聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]的整体材料骨架，其中三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯与三(2-氨基乙基)胺的质量比为85:15～90:10，单体混合物总质量与致孔剂之间的质量比为26:74～20:80。

步骤2. 将步骤1得到的整体材料骨架加入氨水，氨水的质量百分浓度为45～73%，加入量为每克整体材料骨架加氨水1～3ml，在30～60 ℃下反应12～48 h，环氧基团发生开环反应，生成伯胺基团，即得阴离子交换整体材料。

上述的制备阴离子交换整体材料的方法，所述的聚乙二醇是PEG200。

一种直接聚合充填上述的阴离子交换整体材料的常规液相色谱柱或石英毛细管色谱柱，它是在色谱柱中注入反应物，加热聚合生成具有相互贯穿的通透孔道的聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]为整体材料骨架，用NH₃使环氧基团开环形成伯胺基团的、可用于进行阴离子交换的整体材料的常规液相色谱柱或石英毛细管柱。

一种制备上述的阴离子交换整体材料的石英毛细管柱的方法，它包括下列步骤：

步骤1. 为了使反应生成的聚合物与毛细管内壁共价连接，毛细管内壁需用氨基硅烷化试剂进行处理。首先，石英毛细管依次用甲醇、水各冲洗10 min，接着用1 M的氢氧化钠溶液冲洗毛细管内壁1 h，再用超纯水冲洗至流出液为中性，然后，再用1 M的盐酸溶液冲洗1 h，超纯水冲洗至流出液为中性，再用甲醇冲洗毛细管，氮气吹扫12 h至干，将 (3-氨丙基)三甲氧基硅烷/四氢呋喃 (1: 1，v/v) 溶液注入毛细管，在80℃水浴中反应12 h，反应结束后，用甲醇将毛细管内残留物质冲出，接着用氮气将毛细管吹干，得到内壁衍生了氨基的毛细管空管；

步骤2. 将三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯完全溶解于聚乙二醇中，再加入三(2-氨基乙基)胺，将该混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液，将其灌注入常规色谱柱或石英毛细管柱中，在60～120 ℃水浴中反应6～24h，用甲醇冲洗色谱柱或石英毛细管柱除去残留的致孔剂以及未反应物，得到充有聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]整体材料骨架的色谱柱或石英毛细管柱，其中三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯和三(2-氨基乙基)胺及聚乙二醇的质量比为17:3:57～9:1:40；

步骤3. 将质量百分浓度为45～73%的氨水持续流动注入步骤2制得的含有聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]整体材料骨架的色谱柱或石英毛细管柱，在60 ℃下反应48 h，然后用纯净水将柱子冲洗除去氨水，洗净，即得充有阴离子交换整体材料的常规色谱柱或石英毛细管柱。

一种制备上述的阴离子交换整体材料的常规色谱柱的方法，它与制备上述的阴离子交换整体材料的石英毛细管柱的方法相同，但可省略步骤1。

本发明制备的整体材料对阴离子样品进行抓取和富集。本发明离子交换型整体材料具有如下优点：

1. 制备简单，原料易得，工艺设备少；

2. 吸附容量高，化学性质稳定，再生方便；

3. 传质速度快，渗透性好；

4. 亲水性好，适用于极性分子以及复杂生物大分子的分离分析。

附图说明

图1为实施例1整体材料的电镜扫描图。

图2为实施例1整体材料的红外光谱图，其中A为整体材料骨架的红外光谱图；B为氨水处理后的整体材料的红外光谱图。

图3为实施例4液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

将1.6 g TEPIC完全溶解于7.0 g PEG200中，再加入200 μL(0.2 g) TAEA，将该混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液，在80 ℃水浴中反应12 h。利用索氏提取的方法，将制得的整体材料用甲醇冲洗除去残留的致孔剂以及未反应物，得到具有相互贯穿的通透孔道的的整体材料。图1为此整体材料的电镜扫描图，图2A为此整体材料的红外光谱图。此整体材料为后续氨水开环，制备弱阴离子整体材料的基础。

将1.0 g上述聚合反应制得的含有大量环氧基团的块状整体材料与1 mL氨水(质量百分数为47％) 溶液在60 ℃下反应48h（反应时间经过具体实验优化而得），环氧基团发生开环反应，生成伯氨基团。红外谱图如图2B。

比较图2A与2B中整体材料的红外谱图，在1566 cm-1和1646 cm-1处出现两个新的吸收峰，可以归属为N-H的特征振动峰；在1254 cm-1附近出现一个新的吸收峰，可以归属为C-N的振动吸收峰。三个吸收峰的出现表明，整体材料上的环基团与氨水成功进行了开环反应。结合此类开环反应的理论，推测反应过程中生成羟基和氨基。

实施例2

在常规液相色谱柱中将上述整体材料制成整体柱。

将12.8g TEPIC完全溶解于56.0 g PEG200中，再加入1.6 mL TAEA，将该混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液。然后注入钢柱中（4.6 mm i.d. ×150 mm），将钢柱两端封口，在80 ℃水浴中反应12 h。制得的整体柱用甲醇冲洗除去残留的致孔剂以及未反应物。将上述聚合反应制得的含有大量环氧基团的常规整体柱持续流动注入氨水/水（质量百分浓度为47％）溶液，使其在60 ℃下反应48 h。环氧基团发生开环反应，生成的伯氨基团，可用于进行阴离子交换。

实施例3：

在毛细管中将上述整体材料制成整体柱。

为了使反应生成的聚合物与毛细管内壁共价连接，毛细管内壁需用氨基硅烷化试剂进行处理。首先，150 μm内径的石英毛细管依次用甲醇、水各冲洗10 min。接着用1 M的氢氧化钠溶液冲洗毛细管内壁1 h，再用超纯水冲洗至流出液为中性。然后，再用1 M的盐酸溶液冲洗1 h，超纯水冲洗至流出液为中性。再用甲醇冲洗毛细管，氮气吹扫12 h至干。将 (3-氨丙基)三甲氧基硅烷/四氢呋喃 (1: 1，v/v) 溶液注入毛细管，在80℃水浴中反应12 h。反应结束后，用甲醇将毛细管内残留物质冲出，接着用氮气将毛细管吹干，得到内壁衍生了氨基的毛细管空管。

将0.32 g TEPIC完全溶解于1.4 g PEG200中，再加入40 μL TAEA，将该混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液。然后注入内壁衍生了氨基的毛细管中，在80 ℃水浴中反应12 h。制得的整体柱用甲醇冲洗除去残留的致孔剂以及未反应物。在显微镜下观察整体柱固定相与毛细管内壁连为一体。将上述聚合反应制得的含有大量环氧基团的毛细管整体柱持续流动注入氨水（质量百分数为47％）溶液，使其在60 ℃下反应48 h。环氧基团发生开环反应，生成的伯氨基团，可用于进行阴离子交换。

实施例4：

用实施例3制备的毛细管整体柱，采用微柱HPLC盐梯度洗脱的方式分离α-酸性糖蛋白的异构体。具体实验条件如下：弱洗脱缓冲液和强洗脱缓冲液分别为10 mM乙酸钠溶液和含有400 mM 氯化钠的10 mM乙酸钠溶液 (pH = 4.1)（pH值用1 M的盐酸调节）。分流前的流速为0.075 mL/min，氯化钠盐梯度的变化速率为3.5 %/min。结果如图3表明，在此阴离子交换聚合物毛细管整体柱上，α-酸性糖蛋白能够分离得到10个异构体的峰分布在6个主峰之中，分离时间 < 20 min。说明此类整体材料对于复杂生物大分子样品选择性好。

实施例5：

用实施例3制备的毛细管整体柱进行磷酸化肽段的富集，并进行MALDI TOF MS质谱检测。将1 mg β-酪蛋白溶解于1 mL 50 mM 碳酸氢铵溶液中（pH=8.2），然后按酶与蛋白质量比1:25（w/w）加入胰蛋白酶，在37 ℃反应18 h。用此阴离子交换型整体柱对磷酸化肽的富集主要包括上样、冲洗、洗脱三个步骤。碳酸氢铵溶液（50 mM, pH=8.2）为上样溶液。通过提高碳酸氢铵溶液的浓度冲洗除去非磷酸肽，然后用5%的甲酸溶液将保留在柱上的磷酸化肽洗脱下来。我们通过氮气压力进行上样，首先将装有样品的离心管置于泵中，然后将15 cm内径为 150 μL的毛细管整体柱插入样品溶液中，用200 psi 的氮气压力将样品完全压入毛细管整体柱中。然后用注射器进行冲洗或洗脱。首先将此整体柱用80 μL 的50 mM 碳酸氢铵溶液进行冲洗，然后用80 μL 的80 mM 碳酸氢铵溶液进行冲洗以除去非磷酸肽。然后用20 μL 5% 甲酸水溶液将富集的磷酸肽洗脱下来。取0.5 μL 此洗脱液，将其滴加到MALDI 靶板上，待干后，滴加0.5 mL 的2,5-二羟基苯甲酸基质（25 mg/mL, 溶解于50% 乙腈中，含有1 %磷酸）。结果表明此阴离子交换型整体柱能够对β-酪蛋白三种磷酸化肽进行特异性的抓取和富集。

Claims

1.一种阴离子交换整体材料，其特征是：它是具有相互贯穿的通透孔道的聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]为整体材料骨架，用NH₃使环氧基团开环形成伯胺基团的、可用于进行阴离子交换的整体材料。

2.一种制备权利要求1所述的阴离子交换整体材料的方法，其特征是它包括如下步骤：

步骤1. 将三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯完全溶解于聚乙二醇中，再加入三(2-氨基乙基)胺，将混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液，在60～120 ℃水浴中反应6～24h，将制得的整体材料骨架用甲醇冲洗除去残留的致孔剂以及未反应物，得到聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]整体材料骨架，其中三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯与三(2-氨基乙基)胺的质量比为85:15～90:10，单体混合物总质量与致孔剂之间的质量比为26:74～20:80；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：所述的聚乙二醇是PEG200。

4.一种直接聚合充填权利要求1所述的阴离子交换整体材料的常规液相色谱柱或石英毛细管色谱柱，其特征是：它是在液相色谱柱中充有相互贯穿的通透孔道的聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]为整体材料骨架，用NH₃使环氧基团开环形成伯胺基团的、可用于进行阴离子交换的整体材料的液相色谱柱或石英毛细管柱。

5.一种制备权利要求4所述的阴离子交换整体材料的石英毛细管色谱柱的方法，其特征是它包括下列步骤：

步骤1. 为了使反应生成的聚合物与毛细管内壁共价连接，毛细管内壁需用氨基硅烷化试剂进行处理，首先，石英毛细管依次用甲醇、水各冲洗10 min，接着用1 M的氢氧化钠溶液冲洗毛细管内壁1 h，再用超纯水冲洗至流出液为中性，然后，再用1 M的盐酸溶液冲洗1 h，超纯水冲洗至流出液为中性，再用甲醇冲洗毛细管，氮气吹扫12 h至干，将体积比为1: 1 的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷/四氢呋喃溶液注入毛细管，在80℃水浴中反应12 h，反应结束后，用甲醇将毛细管内残留物质冲出，接着用氮气将毛细管吹干，得到内壁衍生了氨基的毛细管空管；

步骤2. 将三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯完全溶解于聚乙二醇中，再加入三(2-氨基乙基)胺，将混和溶液超声脱气，得到均匀的溶液，将其灌注入常规色谱柱或石英毛细管柱中，在60～120 ℃水浴中反应6～24h，用甲醇冲洗色谱柱或石英毛细管柱除去残留的致孔剂以及未反应物，得到充有聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]整体材料骨架的色谱柱或石英毛细管柱，其中三(2,3-环氧丙基)异氰尿酸酯和三(2-氨基乙基)胺及聚乙二醇的质量比为17:3:57～9:1:40 ；

步骤3. 将氨水灌注入步骤2制得的充有聚[三（2,3-环氧丙基）异氰尿酸酯-co-三（2-氨基乙基）胺]整体材料骨架的色谱柱或石英毛细管柱，在60 ℃下反应48 h，然后用纯净水将柱子冲洗除去氨水，洗净，即得充有阴离子交换整体材料的常规色谱柱或石英毛细管柱。

6.一种制备权利要求4所述的阴离子交换整体材料的常规液相色谱柱的方法，其特征是：它与权利要求5所述的制备阴离子交换整体材料的石英毛细管柱的方法相同，但省略步骤1。

7.权利要求1所述的阴离子交换整体材料在极性分子以及复杂生物大分子的富集、分离或分析中的应用。