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CN102058527A - 一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置 - Google Patents

一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置 Download PDF

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CN102058527A
CN102058527A CN2010102058403A CN201010205840A CN102058527A CN 102058527 A CN102058527 A CN 102058527A CN 2010102058403 A CN2010102058403 A CN 2010102058403A CN 201010205840 A CN201010205840 A CN 201010205840A CN 102058527 A CN102058527 A CN 102058527A
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陈坚
李新霞
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XINJIANG AILEXIN PHARMACEUTICAL CO Ltd
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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置。大蒜辣素注射液的制备方法，分两步：第一步，提取大蒜辣素；第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至0-4℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，可用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。本发明同时公开了一种制备大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置。本发明配方合理、制备工艺简单克服了现有技术的诸多缺点，实现了产物纯度高、性能稳定的优点。

Description

一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置
技术领域
本发明涉及制药领域，具体地，涉及一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法及其低温连续搅拌超滤装置。
背景技术
大蒜(Alliium sativun L.)及其制剂已列入美国、欧盟药典。确认蒜氨酸(Alliin)及大蒜辣素(Allicin)为主要功效成分。但是目前国内外上市的大蒜制剂蒜氨酸或大蒜辣素的含量很低。研发安全、有效、质量可控的大蒜高效新制剂成为各国药学家的研究热点。
1、蒜氨酸(Alliin)化学名：S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-Allyl-L-cysteine)。熔点：163-165℃(分解、炭化)，[α]D＝+60o，白色结粉末，几乎无臭。
Figure BSA00000155671300011
C6H11NO3S＝177.22
依据发明专利：从鲜蒜中制备蒜氨酸的方法(ZL 001012444)及从鲜蒜中制备蒜氨酸的生产工艺(ZL 03100420·2)：符合药典规定的大蒜，经脱皮、纯水洗净，微波照射5-10分钟或沸水煮沸5-10分钟使蒜酶灭活。打浆、纯水或5-70％乙醇提取、浓缩、精滤、离子交换柱吸附、氨水洗脱、浓缩、喷雾干燥、重结晶等步骤，制备蒜氨酸原料药。HPLC测定含量≥90％。
2、蒜酶(Alliinase，EC 4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、烯丙基半胱氨酸亚砜酶(Alliin lyase，S-allyl-L-cysteine sulfoxide lyase)。属二聚体糖蛋白，两个亚基分子量均为51.5KDa。结晶呈黄色，无臭，等电点pH：4.9。
依据发明专利：从鲜蒜中制备蒜酶的生产工艺(ZL 03100419·9)：在低温车间(0-3℃)，符合药典规定的大蒜，经脱皮、纯水洗净、胶体磨破壁打浆、缓冲保护液提取蒜酶，经(NH4)2SO4或PEG-4000～8000沉淀蒜酶，连续式低温管式离心机收集沉淀，缓冲保护液复溶。两组超滤装置除去大分子和小分子，冷冻干燥，得到蒜酶原料药。以蒜氨酸为底物，经HPLC测定，蒜酶活力≥1000IU/g。
3、大蒜辣素(Alliicin)化学名：二烯丙基硫代亚磺酸酯(2-propene-1-sulfinothioic acid S-2-propenyl ester)。常温下为淡黄色易挥发粘稠液体，有浓烈气味。密度：1.112g/cm3。熔点：25℃(分解)，微溶于水。在空气中数小时即分解变质。
Figure BSA00000155671300021
2[C6H11NO3S]＝2×177.2＝354.4     [C6H10OS2]＝162.3
两分子蒜氨酸被蒜酶催化裂解生成一分子大蒜辣素。即354.4克蒜氨酸(2[C6H11NO3S]＝2×177.2＝354)可生成大蒜辣素162.3克([C6H10OS2]＝162)。加入蒜氨酸纯度“C”及反应系数(0.9)。得到以下关系式：
Figure BSA00000155671300022
发明内容
本发明的目的在于，针对上述问题，提出一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法，以实现配方合理、制备简单、纯度高、性能稳定的优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法，分两步：
第一步，提取大蒜辣素，步骤为：
(1)、在充满氩气或高纯氮的容器中加入脱氧纯水和蒜酶，其中脱氧纯水∶蒜酶＝1000～2000ml∶35.4g，此比例可按照产量和浓度的不同要求，加以扩大或缩小。充分搅拌使蒜酶充分溶解，调节水浴温度至25-35℃，控制pH值在6.5-8.5范围内；
(2)、配制蒜氨酸溶液，其中蒜氨酸∶脱氧纯水＝35.4∶500～1000ml，将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器，其中蒜氨酸∶蒜酶＝1mg∶1～2IU，充分搅拌，并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；；
(3)、滴加完毕后继续搅拌，反应总时间20～40分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液，立即用冰水置换水浴中的温水，水浴温度降至0℃(有过量冰块)，最后利用1000～5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净生物安全柜(无菌)环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至0-4℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为：1.0mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml；规格：1ml/Amp、2ml/Amp、5ml/Amp及10ml/Amp。棕色盒装，0～-20℃保存，保存期6-12个月。
进一步地，所述溶剂为脱氧纯水、含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水、含有丙二醇的脱氧纯水中的一种。
进一步地，所述蒜氨酸纯度大于90％。
进一步地，所述蒜酶活力大于1000IU/g。
进一步地，所述搅拌速度为60～120rpm。
进一步地，所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水，底部通入高纯氮或氩气1小时/10L，脱除水中存在的溶解氧。
本发明的另一目的，是提供一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置，包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台，所述广口容器放置在制冷平台上，所述广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分，所述广口容器上部设置有搅拌装置，并设置有一进气口，所述高纯氮或氩气由此口进入；所述广口容器下部配套设置有取液装置，可将除蒜酶后的大蒜辣素水溶液抽出。
药效学试验数据
将利用本发明方法制备的大蒜辣素注射液应用在临床上进行药效学试验：将5.0mg/ml大蒜辣素注射液送上海美迪西生物医药公司及南京医科大学第一临床医学院进行抗肿瘤及抗病原微生物实验，实验效果明显，大蒜辣素注射液对多种致病微生物及肿瘤有效。为新药注册及临床试验准备了试验样本和条件。具体实验数据如下：
一、上海美迪西生物医药公司抗肿瘤实验
表一IC50计算结果
结果显示，Taxol对多种细胞的半数抑制浓度在10nM左右或10nM以下，根据抗肿瘤药效学指导原则的标准(植物提取纯品的IC50＜10μg/ml或植物粗提物的IC50＜20μg/ml)，反映其在体外对这几种细胞有显著的杀伤作用。大蒜辣素对13株肿瘤细胞的半数抑制浓度基本在10μg/ml以下，说明大蒜辣素在体外对这13株肿瘤细胞有杀伤作用。
二、南京医科大学第一临床医学院抗病原微生物实验
通过一些列实验，结果显示：大蒜辣素对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、不动杆菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌(白念)等具有明显的杀菌活性，其中以MRSA和幽门螺杆菌最为敏感。其MIC值约在10～30mg/L；其次白念对大蒜辣素的敏感性亦较高。大蒜辣素有望替代万古霉素成为治疗MRSA感染的重要药物；大蒜辣素或可用于治疗幽门螺杆菌引起的胃炎和胃溃疡；大蒜辣素亦可作为酵母样真菌感染的治疗药物(内服或外用)。
Figure BSA00000155671300061
有益效果
本发明通过使用在国内外未见报道的惰性气体保护及封闭式隔绝空气条件下发生蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣素的反应；首创冰水浴超滤除蒜酶技术。该技术和方法减少了大蒜辣素的分解，产率≥90％。仪器和设备设置在生物无菌柜中无菌操作(洁净度：100级)。
HPLC测定大蒜辣素含量后配制成大蒜辣素注射液。采用安瓿充氩气或高纯氮灌封。规格：1.0～10.0mg/ml×1.0ml；1.0～10.0mg/ml×2.0ml；1.0～10.0mg/ml×5.0ml；1.0～10.0mg/ml×10.0ml。0～4℃避光处保存6个月，含量无明显改变。加入20％乙醇及/或丙二醇抗冻剂，-10℃避光处保存24个月，含量无明显改变。
本发明涉及酶催化动力学、超滤等新技术研发新药。以鲜蒜中提取的蒜氨酸及蒜酶为原料，在生物安全柜中的特殊装置中，以氩气(惰性气体)保护，蒜酶催化裂解蒜氨酸，生成大蒜辣素。反应液经低温搅拌，超滤膜除去蒜酶。HPLC测定大蒜辣素含量，用脱氧注射用水或乙醇、丙二醇等特殊溶媒定量稀释。安瓿充氮灌封制成注射液。大蒜辣素注射液经药效学试验，证明对多种致病性微生物及肿瘤有效。为新药注册及临床试验准备了试验样本和条件。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的蒜酶催化裂解蒜氨酸产生大蒜辣素装置示意图；
图2为本发明的低温连续搅拌超滤装置示意图；
图3为本发明5.0mg/ml大蒜辣素注射液HPLC色谱图。
结合附图，本发明实施例中附图标记如下：
A-三口瓶；P-取液泵；M-封闭式搅拌器；I-水浴；G-进气口；R-生物安全柜(100级洁净、无菌)；C-保温罩；H-超滤膜；S-搅拌器；T-制冷平台。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
图1-3为本发明的实施例示意图，大蒜辣素注射液的制备方法如下：
(1)、5000ml硬质三口瓶A中，加脱氧纯水约1000～2000ml，投入蒜酶35.4g，搅拌(M，60rpm)使溶解。调节水浴I温度至25-35℃，检查确认pH值为6.5-8.5。
(2)、在封闭式刻度分液漏斗中置脱氧纯水约500～1000ml ml，加入规定量蒜氨酸35.4g，轻摇溶解。高纯氮或氩气充满三口瓶G空间。
(3)、不断搅拌(M，60rpm)下，蒜氨酸溶液由封闭式刻度分液漏斗经B口进入三口瓶A，速度约50ml/min。滴加完毕后继续搅拌10min，反应总时间约30分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液。立即用冰水置换水浴I中的温水，水浴温度降至0℃。装置见图1。
酶解反应的条件为：反应器温度25-35℃，水相pH＝6.5-8.5。反应时间约30分钟。保持大蒜辣素的化学形治稳定，是成功的关键。本专利采用惰性气体保护，隔绝空气的方法、反应结束(从滴加蒜氨酸开始30分钟)立即降至低温(0℃)。
低温搅拌超滤装置(图2)安装在生物安全柜中。取液泵P吸出反应溶液W，转移至超滤装置。的耐压瓶中。调节制冷机平台T温度至-2℃。套上保温罩C。启动搅拌器S，高纯高压氮气钢瓶与进气口G连接。在规定压力下，溶液通过分子量为5000的超滤膜H除去蒜酶等大分子，得到除酶大蒜辣素溶液A约1500～3000ml。
在洁净生物安全柜中，吸取除蒜酶后的大蒜辣素水溶液A适量，HPLC测定大蒜辣素含量。加预冷(0℃)的脱氧纯水(或加适量抗冻剂乙醇或丙二醇的脱氧纯水)稀释并得到10.0mg/ml大蒜辣素溶液约1500ml。或得到5.0mg/ml大蒜辣素溶液约3000mg。HPLC再次测定含量，应为表示量的98％-102％。
实施例二
大蒜辣素注射液的制备方法如下：
(1)、在容器中加入脱氧纯水和蒜酶，其中脱氧纯水∶蒜酶＝1000ml∶35.4g，充分搅拌使蒜酶充分溶解，所述搅拌速度为60rpm，调节水浴温度至25℃，控制pH值在6.5范围内，蒜酶活力大于1000IU/g；所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水，底部通入高纯氮或氩气1小时/10L，脱除水中存在的溶解氧。
(2)、配制蒜氨酸溶液，其中蒜氨酸∶脱氧纯水＝35.4∶500ml的，将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器，其中蒜氨酸∶蒜酶＝1mg∶1IU，充分搅拌，所述搅拌速度为60rpm，并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；，述蒜氨酸纯度大于90％；
(3)、滴加完毕后继续搅拌，反应总时间20分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液，立即用冰水置换水浴中的温水，水浴温度降至0℃，最后利用1000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至0℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；溶剂为脱氧纯水、含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为：1.0mg/ml；规格：1ml/Amp。棕色盒装，0～-20℃保存，保存期6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置，包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台，广口容器放置在制冷平台上，广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分，广口容器上部设置有搅拌装置，并设置有一进气口，所述高纯氮或氩气由此口进入；广口容器下部配套设置有取液装置，可将除蒜酶后的大蒜辣素水溶液抽出。
实施例三
(1)、在容器中加入脱氧纯水和蒜酶，其中脱氧纯水∶蒜酶＝2000ml∶35.4g，充分搅拌使蒜酶充分溶解，所述搅拌速度为120rpm，调节水浴温度至35℃，控制pH值在8.5范围内，蒜酶活力大于1000IU/g；所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水，底部通入高纯氮或氩气1小时/10L，脱除水中存在的溶解氧。
(2)、配制蒜氨酸溶液，其中蒜氨酸∶脱氧纯水＝35.4∶1000ml的，将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器，其中蒜氨酸∶蒜酶＝1mg∶2IU，充分搅拌，所述搅拌速度为60rpm，并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；，述蒜氨酸纯度大于90％；
(3)、滴加完毕后继续搅拌，反应总时间40分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液，立即用冰水置换水浴中的温水，水浴温度降至4℃，最后利用5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至4℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；溶剂为脱氧纯水、含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为：2.0mg/ml；规格：2ml/Amp。棕色盒装，0～-20℃保存，保存期6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置，包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台，广口容器放置在制冷平台上，广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分，广口容器上部设置有搅拌装置，并设置有一进气口，所述高纯氮或氩气由此口进入；广口容器下部配套设置有取液装置，可将除蒜酶后的大蒜辣素水溶液抽出。
实施例四
(1)、在容器中加入脱氧纯水和蒜酶，其中脱氧纯水∶蒜酶＝1500ml∶35.4g，充分搅拌使蒜酶充分溶解，所述搅拌速度为60rpm，调节水浴温度至35℃，控制pH值在8.5范围内，蒜酶活力大于1000IU/g；所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水，底部通入高纯氮或氩气1小时/10L，脱除水中存在的溶解氧。
(2)、配制蒜氨酸溶液，其中蒜氨酸∶脱氧纯水＝35.4∶800ml的，将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器，其中蒜氨酸∶蒜酶＝1mg∶1.5IU，充分搅拌，所述搅拌速度为60rpm，并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；，述蒜氨酸纯度大于90％；
(3)、滴加完毕后继续搅拌，反应总时间30分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液，立即用冰水置换水浴中的温水，水浴温度降至2℃，最后利用5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至2℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；溶剂为脱氧纯水、含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水和含有丙二醇的脱氧纯水中的一种。
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。
所述大蒜辣素浓度为：2.5mg/ml；规格：5ml/Amp。棕色盒装，0～-20℃保存，保存期6-12个月。
大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置，包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台，广口容器放置在制冷平台上，广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分，广口容器上部设置有搅拌装置，并设置有一进气口，所述高纯氮或氩气由此口进入；广口容器下部配套设置有取液装置，可将除蒜酶后的大蒜辣素水溶液抽出。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗肿瘤及抗感染的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，分两步：
第一步，提取大蒜辣素，步骤为：
(1)、在充满氩气或高纯氮的容器中加入脱氧纯水和蒜酶，其中脱氧纯水∶蒜酶＝1000～2000ml∶35.4g，充分搅拌使蒜酶充分溶解，调节水浴温度至25-35℃，控制pH值在6.5-8.5范围内；
(2)、配制蒜氨酸溶液，其中蒜氨酸∶脱氧纯水＝35.4∶500～1000ml，将蒜氨酸溶液缓慢滴加入上述容器，其中蒜氨酸∶蒜酶＝1mg∶1～2IU，充分搅拌，并连续通入氩气或高纯氮使容器内充满高纯氮或氩气；
(3)、滴加完毕后继续搅拌，反应总时间20～40分钟。得到含大蒜辣素等成分的酶解反应溶液，立即用冰水置换水浴中的温水，水浴温度降至0℃(有过量冰块)，最后利用1000～5000D超滤膜除去蒜酶得到大蒜辣素水溶液。
第二步，在洁净生物安全柜环境下，将步骤一中提取的大蒜辣素用预冷至0-4℃的溶剂稀释得到大蒜辣素溶液；
将上述大蒜辣素溶液按照需要充氮或充氩气安瓿灌封成不同规格的大蒜辣素注射液，用于静脉滴注，治疗败血症或肿瘤等疾病。
2.根据权利要求1所述的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，所述溶剂为脱氧纯水、含有抗冻剂乙醇的脱氧纯水、含有丙二醇的脱氧纯水中的一种。
3.根据权利要求1所述的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，所述蒜氨酸纯度大于90％。
4.根据权利要求1所述的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，所述蒜酶活力大于1000IU/g。
5.根据权利要求1所述的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，所述搅拌速度为60-120rpm。
6.根据权利要求1所述的大蒜辣素注射液的制备方法，其特征在于，所述脱氧纯水是新煮沸放冷的纯水，底部通入高纯氮或氩气1小时/10L，脱除水中存在的溶解氧。
7.权利要求1所述的大蒜辣素注射液的低温连续搅拌超滤装置，其特征在于，包括设置有保温罩的广口容器和制冷平台，所述广口容器放置在制冷平台上，所述广口容器的横截面通过超滤膜将容器分为上下两部分，所述广口容器上部设置有搅拌装置，并设置有一进气口，所述高纯氮或氩气由此口进入；所述广口容器下部配套设置有取液装置。
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