CN102031234B - 用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ANSB324 CGMCC No.3609，其所分泌的蛋白及应用。本发明还提供了所述菌株的发酵液或其分泌的蛋白用于降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的方法，通过所述方法，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素B1反应48小时后对B1的降解率达到85％，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素G1反应72小时后对G1的降解率达到66％左右，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素M1反应72小时后对M1的降解率达到68％左右，本发明的枯草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白解毒活性高、特异性强、作用效果温和，适用于降解及去除饲料中的黄曲霉毒素。同时，本发明的枯草芽孢杆菌具有生物活性强、益生性和抗逆性能好等优点，不会破坏饲料中的营养成分。

Description

用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌，特别是涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的枯草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白。

背景技术

霉菌毒素是霉菌生长过程中产生的次级代谢产物。霉菌毒素污染一直是全球畜牧业和食品工业的重大威胁。霉菌毒素具有高毒性，严重威胁动物的生产性能和人类健康，每年给饲料工业和畜牧业生产带来巨大的经济损失。据联合国粮农组织(FAO)估计，全世界谷物供应25％受真菌毒素污染而不能食用。目前对畜牧业威胁最大的霉菌毒素有黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素以及玉米赤霉烯酮等。霉菌毒素对畜牧业及人类产生如此严重的危害，因此自上个世纪被发现以来，科学工作者便不断地研究霉菌毒素的预防和解毒、去毒方法。传统的霉菌毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、紫外线照射法、超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定，营养成分损失较大，难以规模化生产等缺点；目前还有添加霉菌吸附剂的办法，这种方法在吸附毒素的同时会吸附一些营养成分，也不能彻底去除黄曲霉毒素的毒性，动物生产性能仍然受到很大的影响。因此，霉菌毒素污染的控制急切需要一种高效率、特异性强、以及对饲料和环境没有污染的技术。微生物或生物酶因其反应的准确性、有效性和环保性而成为人们关注的热点。

利用微生物脱毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有刘大岭等(真菌提取液对黄曲霉毒素解毒作用的研究[J].广东药学院学报，1995，11(2)：92～94.)发现一种真菌代谢产物具有降解黄曲霉毒素的作用。国外对黄曲霉毒素的研究报道比较多的集中在乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌和白腐真菌等，还有橙色黄杆菌、红球菌、假密环菌、根霉菌等。对于乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50％以下，而且最关键的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一些细菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作用时间、溶液pH值、菌体数量、毒素浓度、金属离子浓度等影响，尚未发现一种微生物能完全的不可逆的降解饲料中的黄曲霉毒素。

至今为止，未见关于枯草芽孢杆菌及其所产胞外酶能同时降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏号为CGMCC No.3609。及其所分泌的活性蛋白，

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌的培养方法及其所分泌的活性蛋白的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述枯草芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白在降解黄曲霉毒素中应用。

所述枯草芽孢杆菌是从发霉饲料、深海土壤、海洋生物消化道中分离并筛选得到的Bacillus subtilis ANSB324。其分离筛选方法为：以香豆素为唯一碳源进行初筛、再用黄曲霉毒素B1进行复筛得到。其细胞理化特征见表1：

表1.细胞理化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“w”表示弱阳性

枯草芽孢杆菌ANSB324的16S rDNA部分基因序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌的培养方法，取所述枯草芽孢杆菌种子液1-5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

其中，所述枯草芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同，种子液的活菌浓度以10⁹CFU/ml计。

所述培养基由如下组分组成：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1-3g、葡萄糖1-30g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2-5g、七水硫酸镁0.5-1.5g、硫酸锰1-3g、蒸馏水800-1200mL，pH值为7.0-7.4。

优选地，所述培养基由如下组分组成：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖20g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、硫酸锰1.0g、蒸馏水1000mL，pH值为7.2。

所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵时间20-30h，pH值7.0-7.4，转速180-220r/min。

优选地，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.2，转速220r/min。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3609所分泌的活性蛋白，其通过以下方法制备得到：

1)对枯草芽孢杆菌进行发酵培养；

2)发酵结束后，离心除菌体，用萃取剂提取上清液中的活性蛋白，在0℃沉淀1-24h，然后5000r/min离心10min得到蛋白沉淀；

其中，所用萃取剂为95％甲醇、95％乙醇、40％硫酸铵溶液、60％硫酸铵溶液或80％硫酸铵溶液；优选用乙醇在0℃沉淀1h；

3)将得到的蛋白沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩即得活性蛋白。

所述活性蛋白经热处理或蛋白酶K处理后，对黄曲霉毒素的降解率比未进行热处理或蛋白酶K处理的活性蛋白的降解率降低，表明起解毒作用的是由枯草芽孢杆菌分泌的胞外酶。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3609及其所分泌的活性蛋白在降解黄曲霉毒素中的应用，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素M1。

本发明还提供利用上述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3609及其所分泌的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1的方法，取所述枯草芽孢杆菌的发酵液或所述活性蛋白的PBS溶液(PBS溶液浓度为0.01mol/L，将活性蛋白溶于PBS溶液中得到浓度为0.01g/ml的活性蛋白PBS溶液)600-900μl，加入黄曲霉毒素B1溶液100-400μl。将反应体系的pH值调节为6.5-7.5，在30-40℃反应2-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素B1。

其中，所述黄曲霉毒素B 1溶液的浓度以500ppb计。

优选地，将反应体系的pH值调节为7.0，在37℃反应48h。

一种降解黄曲霉毒素G1的方法，包括下述步骤：取所述枯草芽孢杆菌的发酵液或所述活性蛋白的PBS溶液(PBS溶液浓度为0.01mol/L，将活性蛋白溶于PBS溶液中得到浓度为0.01g/ml的活性蛋白PBS溶液)600-900μl，将反应体系调整至pH值为6.5-7.5，在30-40℃反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素G1。

优选地，将反应体系调整至pH值7.0，在37℃反应64h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素G1。

一种降解黄曲霉毒素M1的方法，包括下述步骤：取所述枯草芽孢杆菌的发酵液或所述活性蛋白的PBS溶液(PBS溶液浓度为0.01mol/L，将活性蛋白溶于PBS溶液中得到浓度为0.01g/ml的活性蛋白PBS溶液)600-900μl，加入黄曲霉毒素G1溶液100-400μl，将反应体系调整至pH值为6.5-7.5，在30-40℃反应36-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素M1。

优选地，将反应体系调整至pH值7.0，在37℃反应48h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素M1。

特别的，本发明所述的枯草芽孢杆菌CGMCC No.3609及其所分泌的活性蛋白可用于同时降解饲料中的黄曲霉毒素B1、G1和M1。

本发明枯草芽孢杆菌ANSB324益生性的检验方法如下：

采用平板扩散的方法，平板在使用前置于37℃下培养24h，除去部分水分以便于抗菌物质在培养基中扩散。将枯草芽孢杆菌ANSB324用接种棒取少许分别点种到LB平板中央，30-45℃培养18-36h，然后将平板倒扣于盛一薄层氯仿的培养皿盖上熏蒸约25-40min，以杀死活细胞并使菌落固定于平板的表面。移去培养皿盖，让平板里的残余氯仿彻底挥发20-40min。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液(大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌)，均匀涂布后倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于30-45℃培养18-36h，观察点种的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度，判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

本发明枯草芽孢杆菌ANSB324抗逆性的检验方法如下：

1、模拟胃液环境的耐受试验：将胃蛋白酶溶解在0.5％-0.85％生理盐水中，使其终浓度为3g/L，用浓盐酸或10％的NaOH调整pH值到2.0-4.0。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB324活菌菌液进行计数。试验时，取0.5mL活菌菌液加入到4.5mL模拟胃液中(即10倍稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于30-45℃静置培养2-4h得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

2、模拟胆盐环境的耐受试验：用胰液素制成1g/L-1.5g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH值到7.0-9.0，配成的胆盐溶液用0.45μm微滤膜过滤除菌。对试验前的枯草芽孢杆菌ANSB324活菌菌液进行计数。试验时，将0.5ml活菌菌液接种到4.5ml模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存芽孢的活菌数。

3、高温环境的耐受试验：取5mL枯草芽孢杆菌ANSB324活菌菌液注入到离心管1中，用无菌生理盐水10倍逐级稀释，选择合适稀释度的稀释液，在营养琼脂培养基平板1上涂布。另取5mL活菌菌液注入到离心管2中，置于75-90℃水浴锅中加热10-20min，取加热后的芽孢杆菌活菌菌液用无菌生理盐水进行10倍逐级稀释，选择与前述相同稀释度的稀释液，在LB培养基平板2上涂布。将平板1和平板2在30-45℃条件下培养18-36h，计算芽孢杆菌加热前后的数量。

模拟胃液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：

将试验前的活菌菌液或试验得到的培养液用无菌生理盐水10倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。采用LB培养基，取0.5mL稀释液涂布在平板上，30-45℃条件下培养18-36h。

本发明的枯草芽孢杆菌及其解毒方法具有以下有益效果：

1)本发明的枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的效率高、特异性强，对黄曲霉毒素B1、G1和M1的降解率可分别达到85％、66％和68％左右，且本解毒反应为不可逆降解。

2)本发明枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的方法解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响，适用于同时去除饲料中的黄曲霉毒素B1、G1和M1。

3)本发明枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的方法操作简单，对饲料和环境没有污染，有效地解决了传统去毒方法存在的问题。

4)本发明枯草芽孢杆菌具有良好的益生性和抗逆性，有利于添加到动物饲料中使用。

附图说明

图1为对照组黄曲霉毒素B1图谱；

图2为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素B1图谱；

图3为对照组黄曲霉毒素G1图谱；

图4为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素G1图谱；

图5为对照组黄曲霉毒素M1图谱；

图6为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素M1图谱；

图7为枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的时间规律图；

图8显示了枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1、G1和M1的降解率；

图9为枯草芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈；

图10为枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌圈；

图11为枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌圈。

保藏信息说明

本发明所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB324，已于2009年01月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3609。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

黄曲霉毒素B1购自Sigma公司(生产批号为LB56678)购自Supelco公司(其生产批号分别是LB64302和LB64710)；

PBS(0.01mol/L)的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L。

实施例1本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB324 CGMCC No.36091.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于80ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速200r/min，发酵时间24h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g、硫酸锰1.0g、蒸馏水1000mL，pH值为7.2。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例2本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB324 CGMCC No.36090.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为30℃，pH值7.0，转速180r/min，发酵时间20h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖1.5g、牛肉膏2g、氯化钠3g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸锰1.0g、蒸馏水800mL，pH值为7.0。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例3本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB324 CGMCC No.36092.5ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为40℃，pH值7.4，转速220r/min，发酵时间30h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨12g、酵母浸膏3g、葡萄糖4g、牛肉膏5g、氯化钠6g、磷酸氢二钠4g、七水硫酸镁1.5g、硫酸锰1.5g、蒸馏水1200mL，pH值为7.4。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例4本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB324 CGMCC No.36091ml(活菌浓度为10⁹CFU/ml)，接种于60ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为35℃，pH值7.3，转速190r/min，发酵时间28h。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：胰蛋白胨9g、酵母浸膏1.5g、葡萄糖1.5g、牛肉膏3.5g、氯化钠4.5g、磷酸氢二钠2.5g、七水硫酸镁1.0g、硫酸锰1.0g、蒸馏水1000mL，pH值为7.3。

发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

实施例5本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素B1

吸取800μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与200μl黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为800μl PBS缓冲液中加入200μl黄曲霉毒素B1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.2，处理组和对照组分别在37℃反应2h、12h、24h、48h以及72h。

将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素B1的浓度。

检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，72h时黄曲霉毒素B 1的出峰时间分别为9.66min(对照组，图1)和9.60min(处理组，图2)。

检测结果：枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1的降解率随时间变化的曲线见图3。在2h时枯草芽孢杆菌处理组对黄曲霉毒素B1的降解率为76.9％，12小时可达到80％以上，24小时后，其降解率没有显著变化，72h时的降解率为82.1％。

实施例6本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素G1

吸取800μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与200μl黄曲霉毒素G1(500ppb)反应；对照组为800μl PBS缓冲液中加入200μl黄曲霉毒素G1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.0，处理组和对照组分别在37℃反应72h。

将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素G1的浓度。

检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，72h时黄曲霉毒素G1的出峰时间为7.35min(图4，处理组)，对照组出峰时间如图3所示。

检测结果：在72h时枯草芽孢杆菌处理组对黄曲霉毒素G1的降解率为66％左右。

实施例7本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素M1

吸取800μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与200μl黄曲霉毒素M1(500ppb)反应；对照组为800μl PBS缓冲液中加入200μl黄曲霉毒素M1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.0，处理组和对照组分别在37℃反应72h。

将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素M1的浓度。

检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，72h时黄曲霉毒素M1的出峰时间为7.77min(图6，处理组)，对照组出峰时间如图5所示。

检测结果：在72h时枯草芽孢杆菌处理组对黄曲霉毒素M1的降解率为68％左右。

实施例5～7枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的时间规律图如图7所示。枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1、G1和M1的降解率如图8所示。

实施例8本发明枯草芽孢杆菌所分泌的活性蛋白的制备

取实施例1得到的发酵液离心除菌体后得上清液，使用乙醇进行沉淀，沉淀1h后离心(5000r/min，10min)。得到的活性蛋白使用PBS缓冲液洗涤，再离心去除残余的乙醇。得到的沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩得到活性蛋白。

PBS(0.01mol/L)的制备过程：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L即可。

实施例9利用本发明枯草芽孢杆菌分泌的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1

取实施例8制备的活性蛋白0.01g溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液制备活性蛋白溶液，取800μl活性蛋白溶液进行热处理(100℃加热10min)后与200μl黄曲霉毒素B1(500ppb)反应，另取800μl活性蛋白溶液加入蛋白酶K(0.01g蛋白酶K)反应两小时后，向混合液中加入200μl黄曲霉毒素B1。

取800μl的发酵液和800μl未处理的活性蛋白溶液分别加入200μl黄曲霉毒素B1反应；对照组为800μl PBS缓冲液中加入200μl黄曲霉毒素B1(500ppb)；分别在37℃反应72h后检测。

检测结果表明，经过热处理或蛋白酶K处理后的活性蛋白溶液降解率比未处理的发酵液和活性蛋白溶液降低60-70％。

实施例10本发明的枯草芽孢杆菌的益生性与抗逆性实验

1、益生性实验是通过以大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌为指示菌，观察对指示菌的抑制作用。采用平板扩散的方法，LB平板在使用前置于37℃下培养24h，除去部分水分以便于抗菌物质在培养基中扩散。将枯草芽孢杆菌ANSB324用接种棒取少许分别点种到LB平板中央，37℃培养24h，然后将平板倒扣于盛一薄层氯仿的培养皿盖上熏蒸约30min，以杀死活细胞并使菌落固定于平板的表面。移去培养皿盖，让平板里的残余氯仿彻底挥发40min。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液(大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌)，均匀涂布倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培养24h，观察点种的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度，判断受试菌对指示菌的抗菌能力其中，所述LB平板是将121℃高温灭菌后的LB培养基，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的LB平板。所述LB培养基的配方为：胰蛋白胨12g、酵母浸膏3g、葡萄糖3g、牛肉膏5g、氯化钠6g、磷酸氢二钠3.5g、七水硫酸镁1.5g、硫酸锰1.5g、蒸馏水1200mL，pH值为7.4。

枯草芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为1.18cm(图9)，对大肠杆菌(图10)以及金黄色葡萄球菌(图11)的抑菌圈直径分别为1.15cm和1.10cm。

2、抗逆性实验是将菌种接种到模拟胃液以及模拟胆盐中培养，检测菌的存活率，从而推测出其对胃肠道环境的抵抗作用。

1)取保存好的5mL实施例1制备得到的菌液注入到离心管中，采用分级稀释，平板涂布。再将装有10ml实施例1制备得到的菌液的离心管置于80℃水浴锅中加热15min，取加热前和加热后的菌液进行逐级稀释，平板涂布。最后将加热前和加热后的平板均在37℃条件下培养24h，计算枯草芽孢杆菌加热前后的数量。

结果表明，活菌存活率达到了84％。

2)模拟胃液的耐受性试验：将胃蛋白酶溶解在0.5％生理盐水中，使其终浓度为3g/L，并用浓盐酸或者10％的NaOH调整pH值到2.0。取0.5mL实施例1制备得到的菌液分别加入到4.5mL的模拟胃液中和4.5mL的生理盐水中(即10倍稀释)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃静置培养24h。在处理2h后取出培养液并立即计数残存活菌数。

结果表明，活菌存活率为80％。

模拟模拟胆盐的耐受试验则是用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，配成的溶液用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将实施例1制备得到的菌液在生理盐水中和配好的模拟胆盐溶液中10倍分级稀释，并进行LB平板涂布，然后置于37℃静置培养24h后取出并立即计数残存的活菌数。

结果表明，活菌存活率为88％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ANSB324，其保藏编号为CGMCC No.3609。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，取所述枯草芽孢杆菌种子液0.5-2.5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，所述培养基由如下组分组成：胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1-3g、葡萄糖1-30g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2-5g、七水硫酸镁0.5-1.5g、硫酸锰1-3g、蒸馏水800-1200mL，pH值为7.0-7.4。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵时间20-30h，pH值7.0-7.4，转速180-220r/min。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在降解黄曲霉毒素中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为降解饲料或食品中的黄曲霉毒素B1、G1和M1。

6.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液600-900μl，加入黄曲霉毒素B1溶液100-400μl，将反应体系的pH值调节为6.5-7.5，在30-40℃反应2-72h。

7.一种降解黄曲霉毒素G1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液600-900μl，加入黄曲霉毒素G1溶液100-400μl，将反应体系调整至pH值为6.5-7.5，在25-45℃反应48-72h。

8.一种降解黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液600-900μl，加入黄曲霉毒素M1溶液100-400μl，将反应体系调整至pH值为6.5-7.5，在20-40℃反应36-72h。

Images