CN102038932B

CN102038932B - 金属-结合性化合物及其用途

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Publication number: CN102038932B
Application number: CN2010105807752A
Authority: CN
Inventors: 戴维.巴奥; C.杰拉尔德.柯蒂斯; 爱德华.劳; 纳加拉加.K.R.拉奥; 詹姆斯.V.温克勒; 万尼尔.M.克鲁克
Original assignee: DMI Biosciences Inc
Current assignee: DMI Acquisition Corp; Ampio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: ATE553116T1; IL148797A0; CN1390231A; EP2327713A1; BR0014389A; AU770999C; IL148797A; AU770999B2; KR20090086437A; KR20020057966A; IL207923A0; KR20100075503A; IL202812A0; KR20120023147A; KR20110049875A; KR20120024890A; KR101312880B1; KR101062041B1; JP5349722B2; AU7740700A

Abstract

本发明提供减少由反应性氧类(ROS)所致动物损伤的方法。本发明还提供减少动物体内金属浓度的方法。这些方法包含对该动物给以有效量的金属-结合性化合物，本申请对此有进一步描述。本发明进一步提供减少由ROS所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出。该方法包含使该组织或器官与含有有效量的本发明金属-结合性化合物的溶液接触。本发明进一步提供新颖的金属-结合性化合物、包含该金属-结合性化合物的药物组合物和包含盛放本发明金属-结合性化合物的容器的试剂盒。

Description

金属-结合性化合物及其用途

本申请是中国申请00815718.9的分案申请，该母案于2000年9月29日以国际申请号PCT/US00/26952提交，于2002年5月15日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

发明领域

本发明涉及减少由反应性氧类(ROS)所致分子、细胞和组织损伤的方法。本发明还涉及某些化合物，尤其是某些肽和肽衍生物，它们与金属离子、特别是Cu(II)结合。本发明化合物与金属离子的结合抑制ROS的生成和/或蓄积，和/或使得ROS所致损伤靶向化合物本身(也就是说，本发明化合物可以充当牺牲性抗氧化剂)。

背景

反应性氧类(ROS)包括自由基(例如超氧化物阴离子和羟基、peroxyl与烷氧基原子团)和非原子团类(例如单线态氧和过氧化氢)。ROS能够导致广泛的细胞和组织损伤，据报道它们在各种疾病和疾患中扮演主要角色。的确，ROS在一百多种疾病和病理条件中都有牵连，据推测ROS可能构成涉及所有人类疾病的共同致病机理。Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)。关于描述ROS、它们的生成、它们导致细胞和组织损伤的机理和它们在大量疾病和障碍中的牵连，例如参见Manso，Rev.Port.Cardiol.，11，997-999(1992)；Florence，Aust.N Z J.Opthalmol.，23，3-7(1992)；Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Knight，Ann.Clin.Lab.Sci.，25，111-121(1995)；Kerr et al.，Heart & Lung，25，200-209(1996)；Roth，Acta Chir.Hung.，36，302-305(1997)。

缺血/再灌注是世界上病患和病残的主导原因。心血管缺血在美国是病患和死亡的主导原因，其中肌体向心脏供氧的能力减小了。脑缺血是脑血管意外(中风)的前兆，它在美国是死亡的第三大主导原因。缺血还发生在其他器官(例如肾、肝、肺和肠道)、所采集的器官(例如为移植或研究(例如灌注器官模型)而采集的器官)，以及作为其中有血流中断的手术(例如开心手术和冠脉旁路术)的结果而发生。缺血不必限于一个器官；它也可能是更加泛化的(例如在出血性休克中)。

作为缺氧的结果，在缺血期间发生细胞和组织损伤。不过，发生在缺血期间的损伤一般轻于发生在缺血组织和器官的再灌注之后的严重损伤。例如参见Manso，Rev.Port.Cardiol.，11，997-999(1992)；Stohs，J.BasicClin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Knight，Ann.Clin.Lab.Sci.，25，111-121(1995)；Kerr et al.，Heart & Lung，25，200-209(1996)；Roth，ActaChir.Hung.，36，302-305(1997)。据报道ROS对由缺血组织和器官的再灌注所导致的严重损伤负责。例如参见Manso，Rev.Port.Cardiol.，11，997-999(1992)；Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Knight，Ann.Clin.Lab.Sci.，25，111-121(1995)；Kerr et al.，Heart & Lung，25，200-209(1996)；Roth，Acta Chir.Hung，36，302-305(1997)。

金属离子、主要是过渡金属离子能够导致ROS的产生和蓄积。确切地说，从贮存部位释放的铜和铁离子是继发于损伤的ROS产生的主要原因之一，这些损伤包括缺血/再灌注损伤和由热、冷、创伤、过量运动、毒素、辐射和感染引起的损伤。Roth，Acta Chir.Hung.，36，302-305(1997)。据报道铜和铁离子以及其他过渡金属离子(例如钒和铬离子)催化ROS的产生。例如参见Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Halliwell et al.，Free Radicals In Biology And Medicine，pages 1-19(OxfordUniversity 1989)；Marx et al.，Biochem.J，236，397-400(1985)；Quinlan et al.，J.Pharmaceutical Sci.，81，611-614(1992)。据报道其他过渡金属离子(例如镉、汞和镍离子)和其他金属离子(例如砷和铅离子)耗尽一些天然抗氧化剂防御系统的分子，由此导致ROS的蓄积增加。例如参见Stohs，J.BasicClin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)。尽管据报道游离铜离子非特异性地与本质上任意蛋白质的氨基结合(Gutteridge et al.，Biochim.Biophys.Acta，759，38-41(1983))，不过与蛋白质结合的铜离子仍然能够导致ROS的产生，后者至少损害与铜离子结合的蛋白质。例如参见Gutteridge et al.，Biochim.Biophys.Acta，759，38-41(1983)；Marx et al.，Biochem.J.，236，397-400(1985)；Quinlan et al.，J Pharmaceutical Sci.，81，611-614(1992)。

白蛋白已被描绘为细胞外抗氧化剂。例如参见Halliwell andGutteridge，Arch.Biochem.Biophys.，280，1-8(1990)；Das et al.，MethodsEnzymol.，233，.601-610(1994)；Stohs，J Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Dunphy et al.，Am.J Physiol.，276，H1591-H1598(1999))。白蛋白的抗氧化剂特性归因于白蛋白的若干生理功能，包括白蛋白结合金属(特别是铜离子)、结合脂肪酸、结合和转运类固醇、结合和转运胆红素、清除HOCl等能力。例如参见Halliwell and Gutteridge，Arch.Biochem.Biophys.，280，1-8(1990)；Halliwell and Gutteridge，Arch.Biochem.Biophys.，246，501-514(1986)；Stohs，. .Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Dunphy et al.，Am.J.Physiol.，276，H 1591-H1598(1999))。白蛋白含有若干金属-结合性部位，其中一个位于N-末端。包括人、鼠和牛血清白蛋白在内的若干白蛋白的N-末端金属-结合性部位对Cu(II)和Ni(II)表现较高的亲和性，人们已经鉴别了参与这些金属离子的高亲和性结合的氨基酸。参见Laussac et al.，Biochem.，23，2832-2838(1984)；Predki et al.，Biochem.J.，287，211-215(1992)；Masuoka et al.，J.Biol.Chem.，268，21533-21537(1993)。据报道在除高亲和性N-末端部位以外的金属-结合性部位与白蛋白结合的铜产生自由基，后者在听命于“宽松”金属-结合性部位位置的部位对白蛋白导致广泛损伤，致使白蛋白被描绘为“牺牲抗氧化剂”。参见Marx et al.，Biochem.J.，236，397-400(1985)；Halliwell et al.，Free Radicals In Biology And Medicine，pages 1-19(OxfordUniversity 1989)；Halliwell and Gutteridge，Arch.Biochem.Biophys.，280，1-8(1990)；Quinlan et al.，J.Pharmaceutical Sci.，81，611-614(1992)。

尽管如此，使用白蛋白治疗脑缺血的尝试显示出形形色色的结果。据报道白蛋白在脑缺血的动物模型中是和不是神经保护剂。Compare Huhet al.，Brain Res.，804，105-113(1998)and Remmers et al.，Brain Res.，827，237-242(1999)，with Little et al.，Neurosurgery，9，552-558(1981)andBeaulieu et al.，J.Cereb.Blood Flow.Metab.，18，1022-1031(1998)。

在用于保藏切除心脏的心麻痹溶液中使用白蛋白也得到形形色色的结果。根据Dunphy et al.，Am.J.Physiol.，276，H 1591-H1598(1999)的报道，向用于保藏切除心脏的标准心麻痹溶液中加入白蛋白没有改善被该溶液灌注二十四小时的心脏的功能。当用含有白蛋白和若干增强剂(胰岛素、ATP、皮质酮和丙酮酸)的心麻痹溶液灌注时，心脏的确证明有功能改善。这是一种协同效应，因为单独的增强剂以及单独的白蛋白都不显著改善心脏功能。使用含有白蛋白的心麻痹溶液改善心脏功能的早期报道也归因于增强剂与白蛋白之间的协同作用。参见Dunphy et al.，Am.J.Physiol.，276，H1591-H1598(1999)的最后一段和其中引用的Hisatomi etal.，Transplantation，52，754-755(1991)。在另一项研究中，被含有白蛋白的心麻痹溶液灌注的心脏与不含白蛋白的溶液相比，以剂量相关的方式增加了再灌注损伤。Suzer et al.，Pharmacol.Res.，37，97-101(1998)。基于他们和其他人的研究，Suzer等得出结论，白蛋白尚未显示有效的心保护作用。他们进一步认为，由于可能的变态反应和与血液产品的使用有关的危险，在心麻痹溶液中使用白蛋白可能是不安全的。

最后，尽管白蛋白已被描绘为一种抗氧化剂，不过据报道它增强小神经胶质产生超氧化物阴离子(Si et al.，GLIA，21，413-418(1997))。这种结果引起作者推测，在某些障碍中从被破坏的血脑屏障漏出白蛋白加强小神经胶质产生超氧化物阴离子，这种超氧化物阴离子产生增加对脑缺血/再灌注中的神经元损伤发病和一些神经变性疾病负责。

如上所述，若干白蛋白的N-末端金属-结合性部位对Cu(II)和Ni(II)表现较高的亲和性。这些部位已经得到广泛研究，并且已经鉴别了一般性氨基末端Cu(II)-与Ni(II)-结合性(ATCUN)基序。例如参见Harford andSarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)。ATCUN基序可以被定义为存在于这样的蛋白质或肽中，它具有N-末端游离NH₂、第三位组氨酸残基和两个间插肽氮。例如参见Harfordand Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)。因而，ATCUN基序是由肽序列Xaa Xaa His所提供的，其中Xaa是任意氨基酸，脯氨酸除外。例如参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)。Cu(II)和Ni(II)与四个氮结合，这四个氮是由ATCUN基序的三个氨基酸所提供的(游离NH₂的氮、两个肽氮和组氨酸的咪唑氮)，呈略微扭曲的正方平面构型。例如参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)。组成ATCUN基序的三个氨基酸的侧链基团能够参与Cu(II)和Ni(II)的结合，接近这三个N-末端氨基酸的氨基酸也可以影响这些金属离子的结合。例如参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)；Bal et al.，Chem.Res.Toxicol.，10，906-914(1997)。例如，人血清白蛋白的N-末端金属-结合性部位的序列是Asp AlaHis Lys[SEQ ID NO：1]，N-末端Asp和Lys残基的游离侧链羧基据报道参与Cu(II)和Ni(II)的结合，除了由Asp Ala His所提供的四个氮以外。参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)；Laussac et al.，Biochem.，23，2832-2838(1984)；and Sadler e al.，Eur.J.Biochem.，220，193-200(1994)。

在除白蛋白以外的其他天然存在的蛋白质中已经发现了ATCUN基序，并且已经合成了包含ATCUN基序的非天然存在的肽和蛋白质。例如参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)；Bal et al.，Chem Res.Toxicol.，10，906-914(1997)；Mlynarz，et al.，Speciation 98：Abstracts，http://www.jate.u-szeged.hu/～spec98/abstr/mlynar.html。含有ATCUN的肽和蛋白质的Cu(II)与Ni(II)配合物据报道表现超氧化物歧化酶(SOD)活性。参见Cotelle e al.，J.Inorg.Biochem.，46，7-15(1992)；Ueda etal.，J.Inorg.Biochem.，55，123-130(1994)。尽管报道了它们的SOD活性，不过这些配合物仍然产生损害DNA、蛋白质和其他生物分子的自由基。参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-13((1997)；Bal et al.，Chem.Res.Toxicol.，10，915-21(1997)；Ueda et al.，Free Radical Biol.Med18，929-933(1995)；Ueda et al.，J.Inorg.Biochem.，55，123-130(1994)；Cotelle et al.，J.Inorg Biochem.，46，7-15(1992)。其结果是，假设铜和镍的体内副作用至少有一部分可归因于Cu(II)和Ni(II)与含有ATCUN的蛋白质的结合，导致损害性自由基的产生。参见Harforc and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)；Bal et al.，Chem.Res.Toxicol.，10，915-921(1997)；Cotelle et al.，J.Inorg.Biochem.，46，7-15(1992).Cf.Koch et al.，Chem.&Biol.，4，54960(1997)。由含有ATCUN的肽的Cu(II)配合物所产生的损害效应已被开发用于体外杀死癌细胞和体内产生抗肿瘤作用。参见Harfordand Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)。

发明概述

本发明提供减少由反应性氧类(ROS)所致哺乳动物损伤的方法。该方法包含对该动物给以有效量的具有通式P₁-P₂的金属-结合性肽或其生理学上可接受的盐。

本发明进一步提供减少由ROS所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出。该方法包含使该组织或器官与含有有效量的肽P₁-P₂或其生理学上可接受的盐的溶液接触。

本发明还提供在有相应需要的动物体内降低金属浓度的方法。该方法包含对该动物给以有效量的具有通式P₁-P₂的金属-结合性肽或其生理学上可接受的盐。

本发明还提供药物组合物，其包含药学上可接受的载体和肽P₁-P₂或其生理学上可接受的盐。

另外，本发明提供用于减少由ROS所致组织或器官损伤的试剂盒，该组织或器官已从动物体内取出。该试剂盒包含一个盛有肽P₁-P₂的容器。

式P₁-P₂中：

P₁是Xaa₁ Xaa₂ His或Xaa₁ Xaa₂ His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n。

Xaa₁是甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、羟赖氨酸(Hylys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)或α-羟甲基丝氨酸(HMS)。Xaa₁优选为Asp、Glu、Arg或HMS。更优选地，Xaa₁是Asp或Glu。最优选地，Xaa₁是Asp。

Xaa₂是Gly、Ala、β-Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、Lys、Hylys、His、Arg、Orn、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met或HMS。Xaa₂优选为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Asn、Met、His或HMS。更优选地，Xaa₂是Ala、Val、Thr、Ser或HMS。进而更优选地，Xaa₂是Ala、Thr或HMS。最优选地，Xaa₂是Ala。

Xaa₃是Gly、Ala、Val、Lys、Arg、Orn、Asp、Glu、Asn、Gln或Trp，优选为Lys。

Xaa₄是任意的氨基酸。

最后，n是0-100，优选为0-10，更优选为0-5，最优选为0。

在优选的实施方式中，P₁氨基酸至少有一个是D-氨基酸，若存在β-Ala则该氨基酸除外。优选地，该D-氨基酸是Xaa₁、His或二者皆是。最优选地，除β-Ala以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。在另一种优选的实施方式中，P₁氨基酸除β-Ala以外至少有一个是D-氨基酸，P₂氨基酸至少有50％也是D-氨基酸。最优选地，所有P₂氨基酸都是D-氨基酸。

在另一种优选的实施方式中，P₁和/或P₂氨基酸至少有一个是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

本发明提供另一种减少由ROS所致动物损伤的方法。该方法包含对该动物给以有效量的金属-结合性肽(MBP)，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。金属-结合性肽MBP可以是任意的金属-结合性肽，而不仅仅是P₁-P₂。

本发明进一步提供另一种减少由ROS所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出。该方法包含使该组织或器官与含有有效量的金属-结合性肽MBP的溶液接触，其中该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

本发明提供另一种在有需要的动物体内降低金属浓度的方法。该方法包含对该动物给以有效量的金属-结合性肽MBP，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

本发明还提供药物组合物，它包含药学上可接受的载体和金属-结合性肽MBP，其中该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

本发明还提供用于减少由ROS所致组织或器官损伤的试剂盒，该组织或器官已从动物体内取出。该试剂盒包含一个盛有金属-结合性肽MBP的容器，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

本发明还提供另外一种减少由反应性氧类(ROS)所致动物损伤的方法。该方法包含对该动物给以有效量的式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体，其中每个P₃可以是相同或不同的，而且是能够与金属离子结合的肽，L是通过它们的C-末端氨基酸连接这两个P₃肽的化学基团。在优选的实施方式中，这两个P₃肽之一是P₁，或二者皆是。

本发明进一步提供减少由ROS所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出。该方法包含使该组织或器官与含有有效量的式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体的溶液接触。

本发明还提供在有相应需要的动物体内降低金属浓度的方法。该方法包含对该动物给以有效量的式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体。

本发明还提供药物组合物，其包含药学上可接受的载体和式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体。

另外，本发明还提供用于减少由ROS所致组织或器官损伤的试剂盒，其中该组织或器官已从动物体内取出。该试剂盒包含一个盛有式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体的容器。

另外，本发明提供具有式P₁-P₂的肽或其生理学上可接受的盐，其中除β-Ala以外的P₁氨基酸至少有一个是D-氨基酸。

进一步由本发明所提供的是具有式P₁-P₂的肽或其生理学上可接受的盐，其中P₁和/或P₂氨基酸至少有一个是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

另外，本发明提供具有式P₁-P₂的肽，其中P₁定义同上，P₂是包含金属-结合性部位的序列的肽序列。确切地说，P₂可以具有下列序列之一：(Xaa₄)m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂HisXaa₃或(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

本发明还提供金属-结合性肽MBP，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

最后，本发明提供具有通式P₃-L-P₃的金属-结合性肽二聚体。

更具体地，本发明涉及

1.减少由反应性氧类(ROS)所致动物损伤的方法，包含对该动物给以有效量的具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₁是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸或α-羟甲基丝氨酸；

Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸或α-羟甲基丝氨酸；

Xaa₃是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或色氨酸；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

或其生理学上可接受的盐。

2.项1的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

3.项1的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

4.项1的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

5.项1的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

6.项5的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

7.项6的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

8.项7的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

9.项1的方法，其中n是0-10。

10.项9的方法，其中n是0-5。

11.项10的方法，其中n是0。

12.项1的方法，其中P₂包含金属-结合性序列。

13.项12的方法，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

14.项13的方法，其中Xaa₅是Orn或Lys。

15.项1的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

16.项15的方法，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

17.项16的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

18.项15的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

19.项16的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

20.项17的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

21.项1-20中任一项的方法，其中该动物是需要该肽的，因为需要再灌注该动物的缺血组织或器官。

22.项21的方法，其中该动物患有脑血管缺血，缺血组织位于动物大脑中。

23.项21的方法，其中该动物患有心血管缺血，缺血组织位于动物心脏中。

24.项21的方法，其中该肽是在再灌注之前、与再灌注同时、在再灌注之后或其组合的情况下给药的。

25.项1-20中任一项的方法，其中该动物是需要该肽的，因为神经病学创伤的缘故。

26.项1-20中任一项的方法，其中该动物是需要该肽的，因为它患有神经变性疾病。

27.项1-20中任一项的方法，其中该肽是预防性给药的。

28.项27的方法，其中将该肽对表现可能的脑血管缺血或可能的心血管缺血症状的正在接受诊断的动物给药。

29.项27的方法，其中在手术之前、手术期间、手术之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

30.项29的方法，其中该手术是开心手术或向动物移植器官的手术。

31.项27的方法，其中在放射疗法之前、放射疗法期间、放射疗法之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

32.项1-20中任一项的方法，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

33.项32的方法，其中该动物是需要该肽的，因为需要再灌注该动物的缺血组织或器官。

34.项33的方法，其中该动物患有脑血管缺血，缺血组织位于动物大脑中。

35.项33的方法，其中该动物患有心血管缺血，缺血组织位于动物心脏中。

36.项33的方法，其中该肽是在再灌注之前、与再灌注同时、在再灌注之后或其组合的情况下给药的。

37.项32的方法，其中该动物是需要该肽的，因为神经病学创伤的缘故。

38.项32的方法，其中该动物是需要该肽的，因为它患有神经变性疾病。

39.项32的方法，其中该肽是预防性给药的。

40.项39的方法，其中将该肽对表现可能的脑血管缺血或可能的心血管缺血症状的正在接受诊断的动物给药。

41.项39的方法，其中在手术之前、手术期间、手术之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

42.项41的方法，其中该手术是开心手术或向动物移植器官的手术。

43.项39的方法，其中在放射疗法之前、放射疗法期间、放射疗法之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

44.项32的方法，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

R₃是H、非肽类金属-结合性官能团，或者两个R₃基团一起构成非肽类金属-结合性官能团。

45.项44的方法，其中该动物是需要该肽的，因为需要再灌注该动物的缺血组织或器官。

46.项45的方法，其中该动物患有脑血管缺血，缺血组织位于动物大脑中。

47.项45的方法，其中该动物患有心血管缺血，缺血组织位于动物心脏中。

48.项45的方法，其中该肽是在再灌注之前、与再灌注同时、在再灌注之后或其组合的情况下给药的。

49.项44的方法，其中该动物是需要该肽的，因为神经病学创伤的缘故。

50.项44的方法，其中该动物是需要该肽的，因为它患有神经变性疾病。

51.项44的方法，其中该肽是预防性给药的。

52.项51的方法，其中将该肽对表现可能的脑血管缺血或可能的心血管缺血症状的正在接受诊断的动物给药。

53.项51的方法，其中在手术之前、手术期间、手术之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

54.项53的方法，其中该手术是开心手术或向动物移植器官的手术。

55.项51的方法，其中在放射疗法之前、放射疗法期间、放射疗法之后或其组合的情况下将该肽对动物给药。

56.项1-20中任一项的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，提高肽与金属离子结合的活性。

57.项32的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，提高肽与金属离子结合的活性。

58.减少由反应性氧类(ROS)所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出，该方法包含使该组织或器官与含有有效量的具有下式的肽的溶液接触：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

或其生理学上可接受的盐。

59.项58的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

60.项58的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

61.项58的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

62.项58的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

63.项62的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

64.项63的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

65.项64的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

66.项58的方法，其中n是0-10。

67.项66的方法，其中n是0-5。

68.项67的方法，其中n是0。

69.项58的方法，其中P₂包含金属-结合性序列。

70.项69的方法，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

71.项70的方法，其中Xaa₅是Orn或Lys。

72.项58的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

73.项72的方法，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

74.项73的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

75.项72的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

76.项73的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

77.项74的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

78.项58-77中任一项的方法，其中该组织或器官在与含有该肽的溶液接触之后向动物移植。

79.项58-77中任一项的方法，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加该肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

80.项79的方法，其中该组织或器官在与含有该肽的溶液接触之后向动物移植。

81.项79的方法，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

82.项81的方法，其中该组织或器官在与含有该肽的溶液接触之后向动物移植。

83.项58-77中任一项的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

84.项79的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

85.在有相应需要的动物中减少金属浓度的方法，包括对该动物给以有效量的具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

或其生理学上可接受的盐。

86.项85的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

87.项85的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

88.项85的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

89.项85的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

90.项89的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

91.项90的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

92.项91的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

93.项85的方法，其中n是0-10。

94.项85的方法，其中P₂包含金属-结合性序列。

95.项94的方法，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

96.项95的方法，其中Xaa₅是Orn或Lys。

97.项85的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

98.项97的方法，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

99.项98的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

100.项97的方法，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

101.项85-100中任一项的方法，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

102.项101的方法，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

103.项85-100中任一项的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

104.项101的方法，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

105.减少由反应性氧类(ROS)所致动物损伤的方法，包括对该动物给以有效量的金属-结合性肽，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

106.项105的方法，其中该肽含有2-10个氨基酸。

107.项106的方法，其中该肽含有3-5个氨基酸。

108.项105、106或107的方法，其中该肽的氨基酸是D-氨基酸。

109.减少由反应性氧类(ROS)所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出，该方法包括使该组织或器官与含有有效量的金属-结合性肽的溶液接触，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

110.项109的方法，其中该肽含有2-10个氨基酸。

111.项110的方法，其中该肽含有3-5个氨基酸。

112.项109、110或111的方法，其中该肽的氨基酸是D-氨基酸。

113.在有相应需要的动物中减少金属浓度的方法，包括对该动物给以有效量的金属-结合性肽，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

114.项113的方法，其中该肽含有2-10个氨基酸。

115.项114的方法，其中该肽含有3-5个氨基酸。

116.项113、114或115的方法，其中该肽的氨基酸是D-氨基酸。

117.减少由反应性氧类(ROS)所致动物损伤的方法，包含对该动物给以有效量的下式所示金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

其中：

每个P₃可以相同或不同，并且是能够与金属离子结合的肽；

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

118.项117的方法，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

119.项117的方法，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

Xaa₃是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或色氨酸。

120.项119的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

121.项119的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

122.项119的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

123.项119的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

124.项123的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

125.项124的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

126.项125的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

127.项119的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

128.项127的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

129.项119的方法，其中两个P₃肽都是P₁。

130.项117的方法，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

131.项117的方法，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

132.项117的方法，其中L是中性的。

133.项117的方法，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

134.项133的方法，其中L含有2-8个碳原子。

135.项117的方法，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

136.项135的方法，其中L含有3-5个碳原子。

137.项117的方法，其中L是含氮杂环烷烃残基。

138.项137的方法，其中L是哌嗪(piperazide)。

139.项117的方法，其中L是甘油酯。

140.减少由反应性氧类(ROS)所致组织或器官损伤的方法，该组织或器官已从动物体内取出，该方法包括使该组织或器官与含有有效量的下式所示金属-结合性肽二聚体的溶液接触：

P₃-L-P₃

其中：

每个P₃可以相同或不同，且是能够与金属离子结合的肽；

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

141.项140的方法，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

142.项140的方法，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

143.项142的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

144.项142的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

145.项142的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

146.项142的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

147.项146的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

148.项147的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

149.项148的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

150.项142的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

151.项150的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

152.项142的方法，其中两个P₃肽都是P₁。

153.项140的方法，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

154.项140的方法，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

155.项140的方法，其中L是中性的。

156.项140的方法，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

157.项156的方法，其中L含有2-8个碳原子。

158.项140的方法，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

159.项158的方法，其中L含有3-5个碳原子。

160.项140的方法，其中L是含氮杂环烷烃残基。

161.项160的方法，其中L是哌嗪。

162.项140的方法，其中L是甘油酯。

163.在有相应需要的动物体内减少金属浓度的方法，包括对该动物给以有效量的下式所示金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

其中：

每个P₃可以相同或不同，并且是能够与金属离子结合的肽；

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

164.项163的方法，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

165.项163的方法，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；且

166.项165的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

167.项165的方法，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

168.项165的方法，其中Xaa₃是赖氨酸。

169.项165的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

170.项169的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

171.项170的方法，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

172.项171的方法，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

173.项165的方法，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

174.项173的方法，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

175.项165的方法，其中两个P₃肽都是P₁。

176.项163的方法，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

177.项163的方法，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

178.项163的方法，其中L是中性的。

179.项163的方法，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

180.项179的方法，其中L含有2-8个碳原子。

181.项163的方法，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

182.项181的方法，其中L含有3-5个碳原子。

183.项163的方法，其中L是含氮杂环烷烃残基。

184.项183的方法，其中L是哌嗪。

185.项163的方法，其中L是甘油酯。

186、药物组合物，包含药学上可接受的载体和具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

或其生理学上可接受的盐。

187.项186的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

188.项186的组合物，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

189.项186的组合物，其中Xaa₃是赖氨酸。

190.项186的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

191.项190的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

192.项191的组合物，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

193.项192的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

194.项186的组合物，其中n是0-10。

195.项194的组合物，其中n是0-5。

196.项195的组合物，其中n是0。

197.项186的组合物，其中P₂包含金属-结合性序列。

198.项197的组合物，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

199.项198的组合物，其中Xaa₅是Orn或Lys。

200.项186的组合物，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

201.项200的组合物，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

202.项201的组合物，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

203.项200的组合物，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

204.项201的组合物，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

205.项202的组合物，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

206.项186-205中任一项的组合物，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

207.项206的组合物，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

208.项186-205中任一项的组合物，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

209.项207的组合物，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

210.试剂盒，包含一个容器，该容器盛放具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

或其生理学上可接受的盐。

211.项210的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

212.项210的试剂盒，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

213.项210的试剂盒，其中Xaa₃是赖氨酸。

214.项210的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

215.项214的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

216.项215的试剂盒，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

217.项216的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

218.项210的试剂盒，其中n是0-10。

219.项218的试剂盒，其中n是0-5。

220.项219的试剂盒，其中n是0。

221.项210的试剂盒，其中P₂包含金属-结合性序列。

222.项221的试剂盒，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

223.项222的试剂盒，其中Xaa₅是Orn或Lys。

224.项210的试剂盒，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

225.项224的试剂盒，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

226.项225的试剂盒，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

227.项224的试剂盒，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

228.项225的试剂盒，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

229.项226的试剂盒，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

230.项210-229中任一项的试剂盒，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

231.项230的试剂盒，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

232.项210-229中任一项的试剂盒，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

233.项231的试剂盒，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

234.药物组合物，包含药学上可接受的载体和金属-结合性肽，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

235.项234的组合物，其中该肽含有2-10个氨基酸。

236.项235的组合物，其中该肽含有3-5个氨基酸。

237.项234、235或236的组合物，其中该肽的氨基酸是D-氨基酸。

238.试剂盒，包含一个容器，该容器盛放金属-结合性肽，该肽连接有非肽类金属-结合性官能团。

239.项238的试剂盒，其中该肽含有2-10个氨基酸。

240.项239的试剂盒，其中该肽含有3-5个氨基酸。

241.项238、239或240的试剂盒，其中该肽的氨基酸是D-氨基酸。

242.组合物，包含下式所示金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

其中：

每个P₃可以是相同或不同的，并且是能够与金属离子结合的肽；

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

243.项242的组合物，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

244.项242的组合物，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

245.项244的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

246.项244的组合物，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

247.项244的组合物，其中Xaa₃是赖氨酸。

248.项244的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

249.项248的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

250.项249的组合物，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

251.项250的组合物，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

252.项244的组合物，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

253.项252的组合物，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

254.项244的组合物，其中两个P₃肽都是P₁。

255.项242的组合物，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

256.项242的组合物，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

257.项242的组合物，其中L是中性的。

258.项242的组合物，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

259.项258的组合物，其中L含有2-8个碳原子。

260.项244的组合物，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

261.项260的组合物，其中L含有3-5个碳原子。

262.项244的组合物，其中L是含氮杂环烷烃残基。

263.项262的组合物，其中L是哌嗪。

264.项244的组合物，其中L是甘油酯。

265.试剂盒，包含一个容器，该容器盛放下式所示金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

其中：

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

266.项265的试剂盒，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

267.项265的试剂盒，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

268.项267的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

269.项267的试剂盒，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

270.项267的试剂盒，其中Xaa₃是赖氨酸。

271.项267的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

272.项271的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

273.项272的试剂盒，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

274.项273的试剂盒，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

275.项267的试剂盒，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

276.项275的试剂盒，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

277.项267的试剂盒，其中两个P₃肽都是P₁。

278.项265的试剂盒，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

279.项265的试剂盒，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

280.项265的试剂盒，其中L是中性的。

281.项265的试剂盒，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

282.项281的试剂盒，其中L含有2-8个碳原子。

283.项265的试剂盒，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

284.项283的试剂盒，其中L含有3-5个碳原子。

285.项265的试剂盒，其中L是含氮杂环烷烃残基。

286.项285的试剂盒，其中L是哌嗪。

287.项265的试剂盒，其中L是甘油酯。

288.具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

且至少一个P₁氨基酸是D-氨基酸；

或其生理学上可接受的盐。

289.项288的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

290.项288的肽，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

291.项288的肽，其中Xaa₃是赖氨酸。

292.项288的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

293.项292的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

294.项293的肽，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

295.项294的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

296.项288的肽，其中n是0-10。

297.项296的肽，其中n是0-5。

298.项297的肽，其中n是0。

299.项288的肽，其中P₂包含金属-结合性序列。

300.项299的肽，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

301.项300的肽，其中Xaa₅是Orn或Lys。

302.项288的肽，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

303.项302的肽，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

304.项288的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

305.项302的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

306.项303的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

307.项288-306中任一项的肽，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

308.项307的肽，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

309.项288-306中任一项的肽，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

310.项308的肽，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

311.具有下式的肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是(Xaa₄)_n；

Xaa₄是任意的氨基酸；

n是0-100；

P₁和/或P₂的至少一个氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性；

或其生理学上可接受的盐。

312.项311的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

313.项311的肽，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

314.项311的肽，其中Xaa₃是赖氨酸。

315.项311的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

316.项315的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

317.项316的肽，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

318.项317的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

319.项311的肽，其中n是0-10。

320.项319的肽，其中n是0-5。

321.项320的肽，其中n是0。

322.项311的肽，其中P₂包含金属-结合性序列。

323.项322的肽，其中P₂包含下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

其中Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，m是0-5。

324.项323的肽，其中Xaa₅是Orn或Lys。

325.项311的肽，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

326.项325的肽，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

327.项326的肽，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

328.项325的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

329.项326的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

330.项327的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

331.项311-330中任一项的肽，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

332.具有下式的金属-结合性肽：

P₁-P₂，

其中：

P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

P₂是包含金属-结合性部位的序列的肽序列；

或其生理学上可接受的盐。

333.项332的肽，其中P₂具有下列序列之一：

(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或

(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His，

Xaa₄是任意的氨基酸；

Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸；

m是0-5。

334.项332的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

335.项332的肽，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

336.项332的肽，其中Xaa₃是赖氨酸。

337.项332的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

338.项337的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

339.项338的肽，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

340.项339的肽，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

341.项333的肽，其中Xaa₅是Orn或Lys。

342.项332的肽，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

343.项342的肽，其中Xaa₁是D-氨基酸，His是D-氨基酸，或者Xaa₁和His都是D-氨基酸。

344.项343的肽，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

345.项342的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

346.项343的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

347.项344的肽，其中P₂氨基酸至少有50％是D-氨基酸。

348.项332-347中任一项的肽，其中至少一个P₁氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

349.项348的肽，其中P₁具有下式之一：

其中：

R₁是烷基、芳基或杂芳基；

R₂是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁；

350.项332-347中任一项的肽，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

351.项348的肽，其中至少一个P₂氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₁与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₁与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

352.具有下式的金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

其中：

L是将这两个P₃肽通过它们的C-末端氨基酸连接的化学基团。

353.项352的肽二聚体，其中每个P₃含有2-10个氨基酸。

354.项352的肽二聚体，其中至少一个P₃是P₁，其中P₁是：

Xaa₁Xaa₂His或

Xaa₁Xaa₂His Xaa₃；

355.项354的肽二聚体，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

356.项354的肽二聚体，其中Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

357.项354的肽二聚体，其中Xaa₃是赖氨酸。

358.项354的肽二聚体，其中Xaa₁是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₂是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、组氨酸或α-羟甲基丝氨酸，Xaa₃是赖氨酸。

359.项358的肽二聚体，其中Xaa₁是天冬氨酸或谷氨酸，Xaa₂是丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

360.项359的肽二聚体，其中Xaa₂是丙氨酸、苏氨酸或α-羟甲基丝氨酸。

361.项360的肽二聚体，其中Xaa₁是天冬氨酸，Xaa₂是丙氨酸。

362.项354的肽二聚体，其中P₁氨基酸除β-丙氨酸以外至少有一个是D-氨基酸。

363.项354的肽二聚体，其中除β-丙氨酸以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。

364.项354的肽二聚体，其中两个P₃肽都是P₁。

365.项352的肽二聚体，其中至少一个P₃氨基酸是被取代的，(a)取代基增加肽的亲脂性，而不改变P₃与金属离子结合的活性，(b)取代基保护肽不受蛋白酶的作用，而不改变P₃与金属离子结合的活性，或者(c)取代基是非肽类金属-结合性官能团，它提高肽与金属离子结合的活性。

366.项352的肽二聚体，其中P₃包含被非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。

367.项352的肽二聚体，其中L是中性的。

368.项352的肽二聚体，其中L是含有1-18个碳原子的直链或支链链烷烃或链烯烃残基。

369.项368的肽二聚体，其中L含有2-8个碳原子。

370.项352的肽二聚体，其中L是含有2-8个碳原子的环烷烃残基。

371.项370的肽二聚体，其中L含有3-5个碳原子。

372.项352的肽二聚体，其中L是含氮杂环烷烃残基。

373.项372的肽二聚体，其中L是哌嗪。

374.项352的肽二聚体，其中L是甘油酯。

附图的简要说明

图1A-D：四肽Asp Ala His Lys的结构式[SEQ ID NO：1]，显示出可能的取代点。

图2A-B：在图1C(图2A)和图1B(图2B)结构式范围内的四肽Asp AlaHis Lys[SEQ ID NO：1]衍生物的合成流程图。

图3A-B：环己烷二胺衍生物的结构式。

图3C-D：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的环己烷二胺衍生物的合成流程图。

图4：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的四乙酸衍生物的结构式。

图5：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的双吡啶基乙胺衍生物的结构式。

图6A-B：带有(图6B)和没有(图6A)所结合的金属离子M的中卟啉IX的结构式。

图6C：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的中卟啉IX衍生物的结构式。

图7：单糖的结构式。

图8：联体血液灌注系统图，其中在37℃下按兰根道尔夫氏(langendorff)模式向离体心脏灌注同种动物供体血液。

图9：在图8所述联体血液灌注系统中，将离体灌注的心脏用药物和盐水处理。

图10：挛缩-缺血持续时间图，显示出在图8和9所述血液-灌注大鼠心脏模型中，药物(D-Asp D-Ala D-His D-Lys)对缺血期间挛缩的作用。图10中，-□-是盐水对照，-○-是药物。

图11：左心室舒张压(LVDP；以干预前20分钟基线值的百分率表示)-再灌注持续时间图，显示出在图8和9所述血液-灌注大鼠心脏模型中，药物(D-Asp D-Ala D-His D-Lys)对缺血后LVDP恢复的作用。*表示p≤0.05。图11中，-□-是盐水对照，-○-是药物。

图12：左心室末期舒张压(LVEDP)-再灌注持续时间图，显示出在图8和9所述血液-灌注大鼠心脏模型中，药物(D-Asp D-Ala D-His D-Lys)对缺血后LVEDP恢复的作用。*表示p≤0.05。图12中，-□-是盐水对照，-○-是药物。

图13：心率(以干预前20分钟基线值的百分率表示)-再灌注持续时间图，显示出在图8和9所述血液-灌注大鼠心脏模型中，药物(D-Asp D-A1aD-His D-Lys)对缺血后心率恢复的作用。*表示p≤0.05。图13中，-□-是盐水对照，-○-是药物。

图14：灌注压(以干预前20分钟基线值的百分率表示)-再灌注持续时间图，显示出在图8和9所述血液-灌注大鼠心脏模型中，药物(D-AspD-Ala D-His D-Lys)对缺血后灌注压恢复的作用。图14中，-□-是盐水对照，-○-是药物。

图15A-B：在测定羟基原子团产生的试验中在532nm下的吸光度(A532)-保温时间图。图15A中，■＝仅有抗坏血酸盐，◆＝铜和抗坏血酸盐，▲＝四肽(L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1])、铜和抗坏血酸盐(四肽/铜之比为1∶1)，X＝四肽、铜和抗坏血酸盐(四肽/铜之比为2∶1)。图15B中，◆＝铜和抗坏血酸盐，■＝四肽、铜和抗坏血酸盐(四肽/铜之比为2∶1)。

图16：在测定超氧化物歧化酶活性的黄嘌呤氧化酶试验中，抑制效应％-四肽(L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1])-铜配合物浓度图，四肽/铜之比为1∶1。

图17：测定超氧化物原子团产生的试验中在560nm下的吸光度(A560)-时间图。图17中，■＝仅有抗坏血酸盐，◆＝铜和抗坏血酸盐，Δ＝四肽(L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1])、铜和抗坏血酸盐(四肽/铜之比为1∶1)，X＝四肽、铜和抗坏血酸盐(四肽/铜之比为2∶1)。

图18：经过各种方式处理的DNA电泳的凝胶。泳道1-17μg/ml质粒DNA(未经处理的对照)；泳道2-17μg/ml质粒DNA和50μM CuCl₂；泳道3-17μg/ml质粒DNA和2.5mM抗坏血酸盐；泳道4-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐、50μM CuCl₂和200μM四肽(L-Asp L-AlaL-His L-Lys[SEQ ID NO：1])(四肽/铜之比为4∶1)；泳道5-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐、50μM CuCl₂和100μM四肽(四肽/铜之比为2∶1)；泳道6-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐、50μM CuCl₂和50μM四肽(四肽/铜之比为1∶1)；泳道7-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐、50μM CuCl₂和25μM四肽(四肽/铜之比为1∶2)；泳道8-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐、50μM CuCl₂和12.5μM四肽(四肽/铜之比为1∶4)；泳道9-17μg/ml质粒DNA、2.5mM抗坏血酸盐和50μM CuCl₂(阳性对照)；泳道10-DNA梯。

图19A：根据本发明的肽二聚体的结构式。

图19B-D：根据本发明的肽二聚体的合成图。

目前优选的实施方式的详细说明

本发明提供式P₁-P₂的肽。P₁是Xaa₁Xaa₂His或Xaa₁Xaa₂His Xaa₃，其中Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃定义同上。P₁是金属-结合性肽序列，它与元素周期表第1b-7b或8族过渡金属离子(包括V、Co、Cr、Mo、Mn、Ba、Zn、Hg、Cd、Au、Ag、Co、Fe、Ni和Cu)和其他金属离子(包括As、Sb和Pb)结合。P₁与金属离子的结合抑制(也就是减少或防止)这些金属离子产生和/或蓄积ROS，和/或将仍由所结合的金属离子所产生的ROS所致损伤靶向于肽本身。其结果是减少了在没有金属离子与P₁结合的存在下可能由ROS所导致的损伤。确切地说，P₁与Cu(II)、Ni(II)、Co(II)和Mn(II)高亲和性结合。因此它特别有效于减少由铜和镍产生和蓄积的ROS所导致的损伤。

P₁中，Xaa₁最优选为Asp，Xaa₂最优选为Ala，Xaa₃最优选为Lys。因而，优选的P₁序列是Asp Ala His和Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]。最优选地，P₁序列是Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]。Asp Ala His是人血清白蛋白的N-末端金属-结合性部位与Cu(II)和Ni(II)高亲和性结合所必要的最小序列，Lys据报道对这些金属离子与该部位的结合有贡献。其他P₁序列也可以优选地用在除人以外的动物中。

P₂是(Xaa₄)_n，其中Xaa₄是任意氨基酸，n是0-100。若n很大(n＞约20)，则肽将减少由ROS所致细胞外损伤。较小的肽越能更好地进入细胞，因此较小的肽能用于减少由ROS所致细胞内和细胞外损伤。越小的肽也越不易被蛋白水解。因此在P₂中，优选地n是0-10，更优选地n是0-5，最优选地n是0。尽管P₂可以具有任意序列，不过P₂优选地包含这样一种序列，它(1)与过渡金属结合，(2)是疏水性的，以增强肽穿透细胞膜和/或达到靶组织(例如能够穿过血脑屏障)的能力，或者(3)稳定或增强肽的性能。P₂与P₁一起还可以是这样一种蛋白质的N-末端序列，该蛋白质具有针对铜和镍的高亲和性的N-末端金属-结合性部位，例如人、大鼠或牛的血清白蛋白。在n＝100的情况下，肽将具有这些白蛋白的大约第1结构域的序列。

很多包含过渡金属离子结合部位的肽序列都是已知的。例如参见美国专利Nos.4,022,888、4,461,724、4,665,054、4,760,051、4,767,753、4,810,693、4,877,770、5,023,237、5,059,588、5,102,990、5,118,665、5,120,831、5,135,913、5,145,838、5,164,367、5,591,711、5,177,061、5,214,032、5,252,559、5,348,943、5,443,816、5,538,945、5,550,183、5,591,711、5,690,905、5,759,515、5,861,139、5,891,418、5,928,955和6,017,888，PCT申请WO 94/26295、WO 99/57262和WO 99/67284，欧洲专利申请327263，Lappin et al.，Inorg.Chem.，17，1630-34(1978)，Bossu etal.，Inorg.Chem.，17，1634-40(1978)，Chakrabarti，Protein Eng.，4，57-63(1990)，Adman，Avances In Protein Chemistry，42，145-97(1991)，Cotelle etal.，J Inorg.Biochem.，46，7-15(1992)，Canters et al.，FEBS，325，39-48(1993)，Regan，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Smuct.，22，257-281(1993)，Ueda et al.，J Inorg.Biochem.，55，123-30(1994)，Ueda et al.，Free RadicalBiol.Med.，18，929-33(1995)，Regan，TIBS，20，280-85(1995)，Ueda et al.，Chem.Pharm.Blill.，43，359-61(1995)，Bal et al.，Chem.Res.Toxicol.，10，906-914(1997)，Bal et al.，Chem.Res.Toxicol.，10，915-21(1997)，Kochet al.，Chem.Biol.，4，549-60(1997)，Kowalik-Jankowska et al.，J.Inorg.Biochem.，66，19396(1997)，Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)，Prince et al.，TIBS，23，19798(1998)，Mlynarz，et al.，Speciation 98：Abstracts，http://www.iate.uszeged.hu/-spec98/abstr/mlynar.html，Aitken，Molec.Biotechnol.，12，241-53(1999)，Whittal et al.，ProteinScience，9，332-343(2000)。P₂可以包含这些肽的一个或多个金属-结合性部位的序列。

若P₂包含金属-结合性部位，则它优选地具有这样一种序列，该序列在P₁与P₂的金属-结合性部位之间包括短的间隔臂，以便P₁和P₂的金属-结合性部位可以有效地协同结合金属离子(与2∶1肽∶金属配合物相似；见实施例10)。优选地，该间隔臂由1-5个、优选为1-3个天然氨基酸组成。因而，该间隔臂序列可以是Gly、Gly Gly、Gly Ala Gly、Pro、Gly ProGly等。

确切地说，若P₂包含金属-结合性部位，则它优选地包含下列序列之一：(Xaa₄)_m Xaa₃His Xaa₂Xaa₅，(Xaa₄)_m His Xaa₂Xaa₅，(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His Xaa₃或(Xaa₄)_m Xaa₅Xaa₂His。Xaa₂、Xaa₃和Xaa₄定义同上，m是0-5，优选为1-3。Xaa₄氨基酸构成在P₁与P₂的金属-结合性部位之间的短间隔臂，以便P₁和P₂的金属-结合性部位可以协同结合金属离子，Xaa₄优选为天然氨基酸(参见前段)。Xaa₅是具有游离侧链NH₂的氨基酸，优选为Orn或Lys，更优选为Orn。参见Harford and Sarkar，Acc.Chem.Res.，30，123-130(1997)(肽序列内的Orn游离侧链NH₂据报道已成功取代了ATCU基序的游离N-末端NH₂)。因而，P₁-P₂例如可以是Asp Ala His GlyGly His Ala Orn[SEQ ID NO：2]。

肽的氨基酸可以是L-氨基酸、D-氨基酸或其组合。优选地，P₁氨基酸至少有一个是D-氨基酸(优选为Xaa₁和/或His)，β-Ala除外。最优选地，除β-Ala以外的所有P₁氨基酸都是D-氨基酸。而且优选地，P₂氨基酸约有50％是D-氨基酸，最优选地，所有P₂氨基酸都是D-氨基酸。D-氨基酸是优选的，因为含有D-氨基酸的肽对蛋白水解酶有抗性，例如将会在肽对动物(包括人)给药后遇到的那些或者将会在用含有肽的溶液灌注的切除器官中存在的那些。D-氨基酸的使用也不会改变肽与金属离子结合的能力，包括肽与铜高亲和性结合的能力。

本发明的肽可以通过本领域熟知的方法加以制备。例如，肽无论含有L-氨基酸、D-氨基酸还是L-与D-氨基酸的组合，都可以通过标准的固相肽合成法加以合成。适合的技术是本领域熟知的，包括下列文献所述那些：Merrifield，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis andPanayotis eds.1973)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963)；Daviset al.，Biochem.Int′l，10，394-414(1985)；Stewart and Young，Solid PhasePeptide Synthesis(1969)；美国专利Nos.3,941,763和5,786,335；Finn et al.，The Proteins，3rd ed.，vol.2，pp.105-253(1976)；Erickson et al.The Proteins，3rd ed.，vol.2，pp.257-527(1976)。另见波兰专利315474(含有HMS的肽的合成)。作为替代选择，肽可以通过重组DNA技术加以合成，如果它们仅含有L-氨基酸的话。重组DNA法和适合的宿主细胞、载体和其他所用试剂是本领域熟知的。例如参见Maniatis et al.，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)。

本发明进一步包含肽P₁-P₂的衍生物，无论由L-氨基酸、D-氨基酸还是由L-与D-氨基酸的组合组成，它们具有更高的蛋白水解酶抗性、更高的脂溶性(以便肽更容易穿透细胞膜和/或到达靶器官，例如脑)或二者皆是。如图1A所述，可以在箭头所示区域修饰P₁，而不改变P₁的金属-结合功能。确切地说，P₁可以在碳1或2被R₁取代，P₁的末端-COOH可以被保护基团R₂取代(图1B-D)。可以按针对P₁相似的方式修饰P₂，使P₂具有更高的蛋白水解酶抗性、更高的脂溶性或二者皆有。

R₁可以是含有1至16个碳原子的直链或支链烷基，术语“烷基”包括R和S异构体。R₁还可以是含有1或2个环的芳基或杂芳基。术语“芳基”表示含有至少一个芳族环的化合物(例如苯基、萘基和二苯基)。术语“杂芳基”表示这样一种芳基，其中至少一个环含有一个或多个S、N或O原子。这些取代基基本上不减少P₁与金属离子结合的能力。确切地说，P₁与铜高亲和性结合的能力不被这些取代所减少。例如，有些取代基、例如与碳2连接的正-丁基(见图1C，R₁是正-丁基)应当增加肽对金属离子、例如铜的亲和性，这是由于烷基的诱导效应。碳2被芳基、杂芳基或长链烷基(约6-16个碳原子)取代(图1C)应当增强肽跨脂质膜的转运。

如上所述，合成肽的固相合成法是熟知的。这些方法经过修饰，可以制备图1B-C所示衍生物。例如，如图1C所述其中R₁是辛基的P₁衍生物可以如图2A所述加以制备。图2A中，椭圆形单元代表聚合物树脂，R_p是标准的羧基保护基团。如图2A所述，将(新近蒸馏的)辛酸用无水溴处理，然后用三氯化磷处理。将混合物加热至约100℃，在该温度下保持4小时。蒸馏后得到α-溴代辛酸，为无色液体。将溴代酸和氨溶液置于40-50℃下达30小时，完成酸的胺化作用。用甲醇洗涤除去溴化铵，得到氨基酸的辛基衍生物。经典的拆分方法得到所需的光学纯D-型。其中R₁是烷基、芳基或杂芳基的其他衍生物可以按图2A所述方式加以制备。

另外，如图1B所述其中R₁是苯基的P₁衍生物可以如图2B所述加以制备。图2B中，聚合物是树脂，t-Bu是叔-丁基，Bz是苄基。其中R₁是烷基、芳基或杂芳基的其他衍生物可以按图2B所述方式加以制备。

R₂可以是-NH₂、-NHR₁、-N(R₁)₂、-OR₁或R₁(见图1D)，其中R₁定义同上。通过本领域熟知的方法，可以在从树脂除去肽之前，作为固相肽合成的最后一步制备这些衍生物。用R₂取代基本上不减少P₁与金属离子结合的能力。

另外，P₁和P₂可以被与金属离子结合的非肽类官能团取代。这些金属-结合性官能团可以连接于肽的一个或多个未决(pendent)基团，所得肽衍生物除了由P₁所提供的结合部位和可选的由P₂所提供的结合部位以外，还将具有一个或多个能够与金属离子结合的部位。所以，与对应的未经修饰的肽相比，这类肽衍生物与金属离子结合的能力提高了。例如，肽衍生物能够与两个相同类型金属离子结合而不是一个(例如两个Cu(II))，肽衍生物能够与两种不同的金属离子结合而不是一种类型金属离子(例如一个Cu(II)和一个Fe(III))，或者肽衍生物能够比对应的未经修饰的肽更好地与一个金属离子结合(例如具有更大的亲和性)。

金属-结合性官能团包括多元胺(例如二胺、三胺等)。适合的二胺包括1，2-烷基二胺，优选为这样的烷基二胺，其中该烷基含有2-10个碳原子(例如H₂N-(CH₂)_n-NH₂，其中n＝2-10)。适合的二胺还包括1，2-芳基二胺，优选为苯二胺(例如1，2-二氨基苯)。适合的二胺进一步包括1，2-环烷二胺。“环烷”是含有1-3个环的化合物，每个环含有5-7个碳原子。优选地，环烷二胺是1，2-二氨基环己烷(环己烷二胺)。

特别优选的二胺是1，2-二氨基环己烷(图3A-B)。以前由Rao & P.Williams所进行的研究(J.ChromatographyA，693,633(1995))显示，环己烷二胺衍生物(图3A，其中PYR是吡啶)与各种金属离子结合。所得金属螯合物已经成功地用于拆分氨基酸和肽，说明该分子对α-氨基酸具有非常高的亲和性，生成非常稳定的配位化合物，它在很多方面都是独一无二的。1，2-二氨基环己烷具有反应性氨基官能团，使本发明的肽能够与该官能团连接。见图3B，其中M是金属离子，至少一个R₄是-烷基-CO-肽、-芳基-CO-肽、-芳基-烷基-CO-肽或-烷基-芳基-CO-肽(另见图3C-D)。其他R₄可以是相同的或者可以是-烷基-COOH、-芳基-COOH、-芳基-烷基-COOH或-烷基-芳基-COOH。图3B所示类型衍生物将具有若干金属-结合性部位，因此可以预期比未取代的肽更容易与金属离子结合。进而，由于环己烷官能度(functionality)的存在，该化合物将具有脂质样特征，这将有助于它的跨脂质膜转运。

本发明肽的环己烷二胺衍生物可以通过两种不同途径加以制备。第一种涉及先与醛缩合，再还原(见图3C；图3C中，Bz是苄基)。大量的醛(烷基和芳基)在室温下容易与环己烷二胺反应，生成肟。在厌氧条件下可以用硼氢化钠还原肟，得到二酸衍生物。然后使羧基部分与存在于羧基被保护的P₁中的游离氨基反应，得到肽的环己烷二胺衍生物。第二种途径是直接的烷基化过程，如图3D所述。例如，使环己烷二胺与溴代乙酸反应，得到双乙酸衍生物。然后使羧基部分与存在于羧基被保护的P₁中的游离氨基反应，得到衍生物。图3D中，R₅是H或另一种肽。若R₅是H，则该衍生物可以通过本领域熟知的方法进一步反应生成典型的羧酸衍生物，例如酯。金属结合实验表明，这种基团的存在或不存在对整个分子的金属结合能力都没有关系。不过，这些基团会使分子成为疏水性或亲水性，因取代基而异，这本身又对分子跨膜释放或者释放到靶组织产生影响。利用上述其他二胺，这两种合成途径将用于合成二胺肽衍生物。

另外适合的多元胺与多元胺衍生物和使它们与肽连接的方法描述在美国专利Nos.5,101,041和5,650,134中。其他适合与肽连接的多元胺螯合物是已知的。例如参见美国专利Nos.5,422,096、5,527,522、5,628,982、5,874,573、5,906,996和PCT申请WO 97/44313、WO 97/49409、WO99/39706。

众所周知，连位二酸能与金属离子结合，且对铜的亲和性特别高。因此可以想象，具有连位二酸官能团的肽将在金属结合中是极为有效的。适合的连位二酸包括任意的1，2-烷基二酸，例如双乙酸(琥珀酸)，和任意的1，2-芳基二酸。

肽的氨基可以与双乙酸反应，生成二酸衍生物(见图4)。该反应适宜这样实现，使树脂结合型肽的氨基与卤代乙酸(例如溴代乙酸或氯代乙酸)或卤代乙酸衍生物(例如苄氧基酯)反应。固相合成工艺能够通过溶剂洗涤除去未反应的原料。通过水解裂解从树脂释放终产物。本发明肽的其他二酸衍生物可以按相同方式加以制备。

多氨基多羧酸已知与金属，例如铜和铁结合。适合于制备本发明肽的衍生物的多氨基多羧酸和使它们与肽连接的方法描述在美国专利Nos.5,807,535、5,650,134和PCT申请WO 93/23425中。另见美国专利No.5,739,395。

连位多羟基衍生物也包括在本发明内。适合的连位多羟基化合物包括单糖和多糖(也就是二糖、三糖等)。目前优选的是单糖。参见图7。单糖分为两大类——呋喃糖和吡喃糖。呋喃糖环系的基本实例之一是葡萄糖。葡萄糖的羟基可以被保护为苄基或不稳定的叔-丁氧基官能团，同时使醛自由地与四肽的胺基(例如赖氨酸的氨基)反应。温和的还原/水解作用生成单糖肽衍生物。其他单糖肽衍生物可以按这种方式加以制备。

双吡啶基乙胺衍生物已知与二价金属离子生成强配合物。若与肽连接，则这种官能团会为金属离子、包括铜提供另外的螯合部位。四肽AspAla His Lys[SEQ ID NO：1]的双吡啶基乙基衍生物如图5所示。预期这种四肽衍生物的金属-结合能力将比未经衍生的肽增加至少三倍。这种双吡啶基乙胺衍生物的制备与二酸衍生物的制备具有一些相似性。使四肽的两个氨基(一个在Asp，另一个在Lys)与2-溴乙基吡啶反应，得到四-取代的肽衍生物。该反应是这样实现的，使树脂结合型四肽与溴乙基吡啶反应；然后从树脂裂解该产物。

菲咯啉是另一种能够与二价金属离子结合的杂环化合物。肽的菲咯啉衍生物可以按与双吡啶基乙胺衍生物相同的方式加以合成。

卟啉是一组见于所有有生命物质的化合物，含有能够与金属结合的四吡咯大环。血红素、叶绿素和咕啉是这类化合物的基本实例，分别含有铁、镁和钴。中卟啉IX(图6A-B，其中M是金属离子)是从血红素衍生的，已经观察到对铜具有特异性亲和性。向本发明的肽加入这种结构会生成卟啉-肽衍生物，它具有若干与铜结合的部位(见图6C)。除了它们在金属结合中的作用以外，位于图6C所示四肽中3与3’位的咪唑残基可以提供除铜以外的金属结合部位，由此使卟啉-金属配合物稳定。确切地说，氰钴胺素(维生素B-12)含有钴作为卟啉核中的金属，该配合物被咪唑基所稳定。在这种类比的基础上，预期卟啉-四肽衍生物会在卟啉核中与钴(或其他金属)在正常生理条件下结合，且该配合物会被His咪唑基所稳定。

为了制备图6C所示卟啉-肽衍生物，可以采用标准的固相肽合成法，将中卟啉IX的羧基活化，并与肽的氨基偶联。通常，与树脂结合的肽的赖氨酸残基的游离氨基可以与羧基被活化的卟啉核偶联。利用标准方法可以从树脂上裂解缩合产物。这种方法可以用于合成本发明肽的其他卟啉衍生物。

其他适合的卟啉与大环螯合剂和使它们与肽连接的方法描述在美国专利Nos.5,994,339和5,087,696中。其他能够与肽连接的卟啉和大环螯合剂是已知的。例如参见美国专利Nos.5,422,096、5,527,522、5,628,982、5,637,311、5,874,573、6,004,953和PCT申请WO 97/44313、WO 99/39706。

各种另外的金属螯合剂和使它们与蛋白质连接的方法描述在美国专利No.5,683,907中。

二硫代氨基甲酸酯已知与金属、包括铁结合。适合于制备本发明肽的衍生物的二硫代氨基甲酸酯描述在美国专利Nos.5,380,747和5,922,761中。

羟基吡啶酮也已知是铁螯合剂。适合于制备本发明肽的衍生物的羟基吡啶酮描述在美国专利Nos.4,912,118、5,104,865和PCT申请wO98/54138中。

另外的非肽类金属螯合剂是本领域已知的或者有待开发。使化合物与蛋白质和肽连接的方法是本领域熟知的，使非肽类金属螯合剂与本发明的肽连接属于本领域的技术范围。例如参见描述这类连接方法的上述专利。

正如可以领会的是，非肽类金属-结合性官能团能够与另一种金属-结合性肽(MBP)连接，方式与它们连接肽P₁-P₂的方式相同。所得肽衍生物除了MBP的金属-结合性部位以外还会含有一个或多个金属-结合性官能团。优选地，MBP含有2-10个、优选为3-5个氨基酸。优选地，MBP含有一个或多个D-氨基酸；最优选地，MBP的所有氨基酸都是D-氨基酸。如上所述，很多金属-结合性肽的序列是已知的。这些肽和包含这些肽的金属-结合性部位的肽可以按与上述关于肽P₁-P₂所述相同的方法加以制备。这些肽连接有一个或多个金属-结合性官能团的衍生物可以按与上述关于肽P₁-P₂衍生物所述相同的方法加以制备。

本发明还提供具有下式的金属-结合性肽二聚体：

P₃-L-P₃

P₃是任意能够与金属离子结合的肽，每个P₃可以是相同或不同的。每个P₃优选地含有2-10个、更优选为3-5个氨基酸。如上所述，金属-结合性肽是已知的，每个P₃可以包含这些肽的一个或多个金属-结合性部位的序列。尽管每个P₃可以如上关于P₁和P₂所述被取代，包括被非肽类金属-结合性官能团取代(特别参见图6C)，不过两个P₃肽都优选地是未取代的。P₃还可以包含任意被上述非肽类金属-结合性官能团取代的氨基酸序列，以提供P₃的金属-结合能力。优选地，每个P₃是未取代的金属-结合性肽(也就是未取代的肽，其包含与金属离子结合的肽序列)。最优选地，一个或两个P₃基团是P₁(也就是说，二聚体具有序列P₃-S-P₁、P₁-S-P₃，或者最优选为P₁-S-P₁)。P₁定义同上。

L是连接基团，它与每个P₃的C-末端氨基酸连接。L可以是任意的化学基团，它能够通过它们的C-末端氨基酸连接两个P₃肽，并且它是生理学上可接受的。“生理学上可接受的”表示在肽二聚体内包含连接基团L时，含有连接基团L的肽二聚体对接受该肽二聚体给药的动物(包括人)或器官没有毒性。优选地，L连接两个P₃基团，以便它们能够协同结合金属离子(与2∶1肽∶金属配合物相似；见实施例10)。L还优选地是中性的。最优选地，L是含有1-18个、优选为2-8个碳原子的直链或支链烷烃或烯烃残基(例如-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂(CH₃)CH₂-、-CHCH-等)，或者是含有3-8个、优选为5-6个碳原子的环状烷烃或烯烃残基(见图19A，化合物D₁)，优选地借助酰胺键与P₃连接。这样的连接基团是特别优选的，因为它们赋予肽二聚体以疏水性。在另一种优选的实施方式中，L是含氮杂环烷烃残基(见图19A，化合物D₂、D₃和D₄)，优选为哌嗪化合物(见图19A，化合物D₂)。在另一种优选的实施方式中，L是甘油酯(见图19A，化合物D₅；式D₅中，R是烷基或芳基，优选地含有1-6个碳原子)。这些优选的连接基团L将允许两个肽P₃协同结合金属离子，并且它们是生物可相容的，肽二聚体也能够容易地大量制备。“生物可相容的”表示含有连接基团L的肽二聚体不会由于连接基团L而对接受该肽二聚体给药的动物(包括人)或器官产生任何不可取的副作用。

合成肽二聚体的方法阐述在图19B-D中。一般来说，使两个P₃基团的C-末端氨基酸(被本领域熟知的方法和保护基团所保护)与L连接，所得氨基酸二聚体在标准的肽合成法中用于制备肽二聚体。

例如，其中每个肽具有序列Asp Ala His Lys的肽二聚体可以这样合成，使被保护的赖氨酸，要么作为酰基氯要么利用肽合成法中所用的标准偶联剂偶联到游离的二胺官能团上(见图19B-C)。很多适合的二胺是商业上可得到的，或者适合的二胺可以通过本领域已知的方法容易合成。

例如，赖氨酸二聚体2(图19B)可以如下制备。向搅拌着的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)-与叔-苄氧羰基(Boc)-保护的D-Lys(Fmoc-D-Lys(Boc)-OH)(20mmol)的无水二甲基甲酰胺(DMF；100ml；经干燥氩冲洗)溶液中加入丁烷-1，4-二胺1和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU；0.5mmol)。将溶液在室温下搅拌36小时。通过二氧化硅快速色谱分离双保护的赖氨酸2，用乙酸乙酯/甲醇混合物洗脱。然后采用经典的肽合成方法，从被保护的赖氨酸二聚体2制备肽二聚体3(见图19B)。

其中每个肽具有序列Asp Ala His Lys的另一种肽二聚体可以如下制备。首先，通过酰化哌嗪5的两个氨基中心，合成另一种被保护的赖氨酸二聚体4(见图19C；另见Chambrier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，96，10824-10829(1999))。然后，采用标准的肽合成方法加入其余氨基酸残基，得到肽二聚体6(见图19C)。

其中每个肽具有序列Asp Ala His Lys并且其中L是甘油酯的肽二聚体可以如下合成。图19D中式7的3-取代的丙烷-1，2-二醇(其中R是烷基或芳基)是商业上可得到的。其中R是甲基的赖氨酸二酯8可以如下制备(见图19D)。向搅拌着的Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(20mmol)的无水甲苯(100ml；经干燥氩冲洗)溶液中加入3-甲氧基丙烷-1，2-二醇(200mmol)和咪唑(15mmol)。将溶液在室温下搅拌36小时。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯。将该溶液用柠檬酸溶液(2％)、水、0.5N NaHCO₃溶液洗涤，再用水洗涤；然后使有机层经硫酸镁干燥(除去溶剂，得到淡黄色残余物)。通过二氧化硅快速色谱分离双保护的赖氨酸8，用乙酸乙酯/甲醇混合物洗脱。然后采用经典的肽合成方法，从被保护的赖氨酸二聚体8制备肽二聚体9(见图19D)。

金属-结合性化合物的生理学上可接受的盐也包括在本发明内。生理学上可接受的盐包括常规的无毒性盐，例如从无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)、有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸等)或碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)衍生的盐。盐是按常规方式制备的，例如用酸中和游离碱形式的化合物。

本发明的金属-结合性化合物可以用于减少由ROS所致损伤，或者减少过量金属离子集中在动物体内。为此，将本发明的金属-结合性化合物对动物给药。优选地，动物是哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。关于本发明各种化合物的有效剂型、给药方式和剂量可以凭经验决定，做出这样的决定属于本领域的技术范围。已经发现，有效剂量从约2至约200mg/kg，优选地从约10至约40mg/kg，最优选为约20mg/kg。不过，为本领域技术人员所理解的是，剂量将因所采用的特定金属-结合性化合物、所治疗的疾病或疾患、该疾病或疾患的严重性、给药途径、化合物的排泄速率、治疗的持续时间、对动物给药的任意其他药物的确定、动物的年龄、大小与种类等医学与兽医领域已知的因素而异。一般来说，本发明化合物的适合的每日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量。不过，每日剂量将由主治医师或兽医在合理的医学判断范围内加以决定。如果需要的话，有效的每日剂量可以在全天内按适当间隔分两次、三次、四次、五次、六次或以上单独给药。化合物的给药应当持续至达到可接受的反应。

本发明化合物可以通过任意适合的给药途径对动物患者给药进行治疗，包括口服、鼻、直肠、阴道、肠胃外(例如静脉内、脊柱内、腹膜内、皮下或肌内)、脑池内、透皮、颅内、脑内和局部(包括颊和舌下)。优选的给药途径是口服和静脉内。

尽管对本发明的金属-结合性化合物来说单独给药是可能的，不过优选的是将该化合物作为药物制剂(组合物)的形式给药。本发明的药物组合物包含金属-结合性化合物或本发明化合物作为混合物中的活性成分，还包含一种或多种药学上可接受的载体，和可选的一种或多种其他化合物、药物或其他物质。每种载体在与制剂中其他成分相容和对动物无害的意义上必须是“可接受的”。药学上可接受的载体是本领域熟知的。不管选择何种给药途径，都可通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明化合物配制成药学上可接受的剂型。例如参见Remington′s PharmaceuticalSciences。

适合于口服给药的本发明制剂可以是胶囊剂、扁囊剂(cachet)、丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂，或者是在水性或非水性液体中的溶液或悬液，或者是水包油或油包水型液体乳剂，或者是酏剂或糖浆剂，或者是锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)等，各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明化合物还可以作为大丸剂、干药糖剂或糊剂给药。

在用于口服给药的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体、例如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或任意下列成分混合：(1)填充剂或填料，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)增湿剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和皂粘土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。可以采用相似类型的固体组合物作为软与硬明胶胶囊剂中的填充剂，并使用诸如乳糖或奶糖等赋形剂，以及高分子聚乙二醇等。

通过与可选的一种或多种辅助性成分一起压制或模制，可以制备片剂。在制备压制片时可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。模制片可以这样制备，在适合的机械内，将被惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物进行模制。

可以可选地使本发明药物组合物的片剂和其他固体剂型、例如锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂带有刻痕或包衣和外壳，例如肠溶衣和药物制剂领域熟知的其他包衣。它们经过配制，还可以使其中所用活性成分的缓慢或控制释放，例如用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放特点，还可用其他聚合材料、脂质体和/或微球体。它们可以通过截留细菌的滤器进行过滤而除菌。这些组合物还可以可选地含有不透明剂，并且可以是这样一种组合物，它们仅在或者优先在胃肠道的某一部分释放活性成分，可选地按延迟方式释放。可以使用的包埋组合物实例包括聚合性物质和蜡类。活性成分还可以是微囊包封的形式。

用于本发明化合物口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉子油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。

除了惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括助剂，例如增湿剂、乳化与悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、香料和防腐剂。

除了活性化合物以外，悬液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇与脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂粘土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。

用于直肠或阴道给药的本发明药物组合物制剂可以是栓剂，它可以这样制备，将一种或多种本发明化合物与一种或多种适合的非刺激性赋形剂或载体包括如可可脂、聚乙二醇、栓剂用蜡或水杨酸酯混合，它在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此将在直肠或阴道腔内熔化，释放活性化合物。适合于阴道给药的本发明制剂还包括子宫托、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，酌情含有本领域已知的载体。

用于本发明化合物局部或透皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物于药学上可接受的载体、任意缓冲剂或可能需要的推进剂混合。

除了本发明的活性化合物以外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，例如动物与植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅氧聚合物、皂粘土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。

除了本发明化合物以外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有惯用的推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷。

透皮贴剂所具有的附加优点是向身体提供本发明化合物的控制释放。这类剂型可以这样制备，将本发明化合物溶解、分散或掺合在恰当的介质，例如弹性基质材料中。还可以使用吸收增强剂，以增加化合物跨越皮肤的通量。提供速率控制膜或者将化合物分散在聚合物基质或凝胶中，都可以控制这种通量的速率。

适合于肠胃外给药的本发明药物组合物包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的水性或非水性溶液、分散系、悬液或乳液，或无菌粉末，可以在使用前再生为无菌的可注射溶液或分散系，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、赋予该制剂与受药者血液等渗的溶质、悬浮或增稠剂。

可以用在本发明药物组合物中的适合的水性与非水性载体实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。为了维持恰当的流动性，例如可以利用包衣材料、例如卵磷脂，也可在分散系的情况下维持所需的粒径，和利用表面活性剂。

这些组合物还可以含有助剂，例如增湿剂、乳化剂和分散剂。它还可以优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，通过包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射型药剂的吸收。

在有些情况下，为了延长药物的效果，需延缓从皮下或肌内注射后的药物吸收。这一点可以利用水溶性较差的结晶或无定形材料的液体悬液来实现。使药物的吸收速率取决于它的溶解速率，后者又取决于晶体大小和晶型。作为替代选择，将药物溶解或悬浮在油载体中，也可实现肠胃外给药的药物的延迟吸收。

可注射药库(depot)剂型是这样制备的，在生物可降解的聚合物，例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中，形成药物的微囊包封基质。根据药物与聚合物的比例和所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解的聚合物实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射的药库制剂还可以这样制备，将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中。可注射材料例如可以通过截留细菌的滤器进行过滤而除菌。

制剂可以存放在单剂量或多剂量的密封容器内，例如安瓿和小瓶，可以贮存在冻干条件下，仅需在即将使用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。从上述类型的无菌粉末、颗粒剂和片剂可以制备临时注射溶液和悬液。

如上所述，ROS据报道在各种疾病和疾患中扮演主要角色。参见Manso，Rev.Port.Cardiol.，11，997-999(1992)；Florence，Aust.NZJ.Opthalmol.，23，3-7(1992)；Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)；Knight，Ann.Clin.Lab.Sci.，25，111-121(1995)；Kerr etal.，Heart & Lung，25，200-209(1996)。牵涉过量金属离子或者由过量金属离子导致的疾病也是已知的。本发明的金属-结合性化合物可以用于治疗任意这些疾病和疾患以及由ROS或过渡金属在其中扮演角色的其他疾病和疾患。可用本发明的金属-结合性化合物治疗的具体疾病和疾患包括成人呼吸窘迫综合征、老化、AIDS、动脉粥样硬化(高血压、衰老和阳痿)、关节炎、哮喘、自身免疫疾病、癌症(例如肾、肝、结肠和脑的癌)、癌发生、由电离辐射导致的细胞损伤(例如肿瘤的放射疗法)、慢性肉芽肿疾病、肝硬化、克罗恩氏(Crohn)病、糖尿病(糖尿病性视网膜病、肾疾病、阳痿和外周血管疾病)、眼疾病(例如白内障、中央动脉梗阻、良性单克隆丙种球蛋白病和黄斑变性)、肺气肿、炎症、缺血、瘤性疾病、神经创伤、神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏(Alzheimer)病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏(Parkinson)病、多发性硬化和老年性痴呆)、胰腺炎、外周血管疾病、肺栓塞、肾疾病(透析患者)、再灌注、休克、发生在化疗剂给药后的组织损伤、手术后的组织损伤(例如移植手术、开心手术和任意切断向组织供应血液的手术、和四肢的手术性缺血(止血带损伤))、毒性反应(例如除草剂中毒、过渡金属(铜、钴和镍)中毒、一氧化碳中毒和抗生素毒性)、创伤性挤压伤和威尔逊氏(Wilson)病(先天性高水平铜)。可用本发明的金属-结合性化合物治疗的具体缺血性疾患和疾病包括：

中枢神经系统缺血——

手术后脑缺血

高热脑损伤

产期低氧诱发的缺血(“大脑性麻痹”)

脊髓损伤

中风(血栓性、栓塞性或出血性脑血管意外)

一过性缺血发作

创伤性脑损伤

心肌缺血——

急性心肌梗塞

心绞痛

心律失常

手术后心肌缺血

充血性心力衰竭

心肌“晕厥”

缺血性肠疾病

胎盘缺血

肺栓塞

切断向组织或器官供应血液的手术——

血管成形术

心旁路手术

移植手术(包括供体器官和受体器官)

四肢的手术性缺血(止血带损伤)。

本发明化合物优选地是预防性给药的。例如，本发明化合物优选在缺血组织或器官再灌注之前和/或同时给药(例如在血管成形术或者用凝块溶解性药物、例如组织纤溶酶原激活物治疗之前和/或同时)。当然，本发明化合物的给药应当在已经达到再灌注之后持续一段时间。类似地，本发明化合物应当在手术(例如开心手术或向动物体内移植器官的手术)之前和/或期间给药，并且化合物的给药应当在手术之后持续一段时间。作为预防性给药的另一个实例，本发明化合物可以对表现严重疾患(例如脑血管缺血或心血管缺血)症状的患者在进行诊断的同时给药。按这种方式，患者将在诊断期间被保护起来，用本发明的金属-结合性化合物治疗还可以延长施用其他疗法(例如针对脑血管缺血的组织纤溶酶原激活物给药)的时间。作为进一步的实例，本发明化合物可以在患者经历放射疗法期间给药(例如针对肿瘤或者在骨髓移植之前的放射)。

本发明化合物还可以用于治疗患有钝伤的患者。确切地说，本发明化合物非常有益于治疗患有多处钝伤且白蛋白水平低的患者，因为已经发现低白蛋白水平是这类患者死亡的先兆。更具体地，研究了34名患有多处钝伤的患者。这些患者于1998年被收入Swedish Hospital，Denver，CO的加强护理单元。创伤外科医生比较了两组患者的年龄、损伤的严重性评分(ISS)和损伤的类型与面积，但是不知道患者的白蛋白水平。一组由死亡的患者组成，另一组由幸存者组成。在比较之后，由另一观察人员从病历中找回入院时的白蛋白水平，对比两组的白蛋白水平。17名幸存者的平均白蛋白水平为3.50±1.00g/dl。17名死亡的患者的平均白蛋白水平为2.52±0.73g/dl。％差异分别为28.6和28.9，p值为0.0026(95％置信区间0.3462-0.4771)。

本发明化合物可以单独给药，以减少由ROS所致损伤。作为替代选择，本发明化合物可以与“自由基清除剂”联合给药。“自由基清除剂”包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、依布硒啉(ebselen)、谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、青霉胺、别嘌呤醇、羟基嘌呤醇、抗坏血酸、α-生育酚、Trolox(水溶性α-生育酚)、β-胡萝卜素、脂肪酸结合蛋白、fenozan、普罗布考(probucol)、cyanidanol-3、二巯基丙醇、吲达帕胺(indapamide)、emoxipine、二甲亚砜等。例如参见Das et al.，Methods Enzymol.，233，601-610(1994)；Stohs，J.Basic Clin.Physiol.Pharmacol.，6，205-228(1995)。本发明化合物当然还可以与针对特定疾患的标准疗法(例如治疗糖尿病的胰岛素)一起给药。

本发明的金属-结合性化合物还可以用于减少由ROS所致组织或器官损伤，该组织或器官已从动物体内取出。为此，使组织或器官与含有有效量的本发明金属-结合性化合物的溶液接触。很多适合的溶液是已知的。例如参见Dunphy et al.，Am.J.Physiol.，276，H1591-H1598(1999)；Suzer et al.，Pharmacol.Res.，37，97-101(1998)；Hisatomi et al.，Transplantation，52，754-755(1991)；美国专利No.5,710,172。包括在这类溶液中的肽的有效量可以凭经验决定，这属于本领域的技术范围。所收获的组织或器官随后可以用于移植到受体内或者用于研究目的(例如使用灌注的肝脏筛选药物)。

本发明进一步提供用于减少由ROS所致组织或器官损伤的试剂盒，该组织或器官已从动物体内取出。试剂盒是一个或多个盛放试剂的容器和其他可用于保存所收获器官的物件的包装组合。试剂盒包含盛放本发明的金属-结合性化合物的容器。适合的容器包括瓶、袋、小瓶、试管、注射器和本领域已知的其他容器。试剂盒还可以含有其他物件，它们是本领域已知的，并且从商家和用户观点来看都是需要的，例如稀释剂、缓冲剂、空注射器、管线、纱布垫、消毒溶液等。

实施例

实施例1：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的合成

本例描述利用标准的固相合成技术合成全部由L-氨基酸组成的四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]。首先，将Wang树脂(0.6mmol；NovaBiochem)上被9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护的Asp(vCOO-酯；Tolsulfonyl)悬浮在哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)(40％v/v；3ml)溶液中达30分钟，偶尔搅拌。在该时段结束时，排尽溶剂，将树脂连续用DMF和二氯甲烷(DCM；5×3ml)洗涤。利用茚三酮试验监测该反应。将树脂用DMF(～1ml)溶胀。加入C-保护的丙氨酸叔-苄氧羰基(Boc)酯的DMF溶液，然后加入二异丙胺(8当量)与2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，2，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)(4当量)的混合物。将树脂摇动约24小时，用茚三酮试验监测反应。在该时段结束时，排尽DMF，将树脂用DMF和DCM洗涤。排尽溶液，将珠粒用DCM洗涤(3×2ml)。除去二肽-树脂的保护基团，将珠粒悬浮在DMF中。加入组氨酸的氨基被保护的(苄氧基)衍生物(4mmol)，然后加入二异丙胺(8当量)与TBTU(4当量)的混合物。将树脂摇动约24小时，用茚三酮试验监测反应。在该时段结束时，排尽DMF，将树脂用DMF和DCM洗涤。将三肽-树脂在轻微的氮流中简单干燥，悬浮在氮-饱和的DMF中。加入被保护的赖氨酸，然后加入二异丙胺(8当量)与TBTU(4当量)的混合物。将树脂摇动约24小时，用茚三酮试验监测反应。在该时段结束时，排尽DMF，将树脂用DMF和DCM洗涤。小心地除去Boc保护基团，得到与树脂结合的四肽，典型的负载率为5mmol/g。将与树脂结合的四肽(0.25gm；5mmol)用三氟乙酸(TFA)处理，摇动24小时。在该时段结束时，茚三酮试验结果为蓝色，说明从树脂释放出四肽。在有些情况下，向TFA中加入5％(V/V)DMF加速从树脂释放肽的速率。在减压下除去TFA，得到四肽(全D型)的TFA盐，在5℃真空下干燥24小时。残余物为白色粉末，通过光谱测定法鉴别之。

通过这种方式可制备所述四肽的多种对映体。例如，在肽合成中使用D-氨基酸可形成含有全部D-氨基酸的四肽。此外，也可使用L-氨基酸与D-氨基酸的组合。

实施例2：Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]的环己烷二胺衍生物的制备

通过拆分顺式/反式1，2-二氨基环己烷(Aldrich-Sigma)，制备反式-二氨基环己烷，为酒石酸盐。R-反式异构体在75℃下熔化，S-反式异构体在43-45℃之间熔化(Ph.D.Thesis，P.D.Newman，University College，Cardiff，U.K.，1994)。然后将反式-二氨基环己烷(10gm)悬浮在无水甲苯(30ml)中，在冰浴中冷却至5℃，滴加溴乙酸(8gm)的甲苯(25ml)溶液。在滴加结束时，使反应温度升至30℃，在该温度下保持另外5小时。蒸发甲苯，从己烷/甲苯中结晶出R-反式1，2-二氨基环己烷二乙酸，得到白色固体(收率70％)。通过光谱法鉴别产物。

将实施例1制备的与树脂结合的四肽(20mg)悬浮在DMF(5ml)中，用R-反式1，2-二氨基环己烷二乙酸(20mg)处理，然后加入二异丙胺(8当量)与TBTU(4当量)的混合物。将树脂在滚筒上摇动约24小时。然后将树脂用DMF洗涤，再用DCM洗涤(5×3ml)，不完全干燥。将与树脂结合的反应产物用TFA处理(5ml；5hr)，进行树脂键的水解作用。分离树脂，用DCM洗涤。合并洗液与TFA，在真空下浓缩。通过光谱测定分析鉴别残余物(环己烷二胺四肽；结构式见图3D，其中R₅是H)。

实施例3：四肽四乙酸的制备

将实施例1制备的与树脂结合的四肽(20mg)悬浮在DMF(5ml)中，用过量(10倍)氯乙酸处理。将树脂在室温下摇动48小时，然后加热至60℃达另外一小时。过滤除去DMF，将树脂用DMF洗涤，再用DCM洗涤(5×3ml)。不完全干燥的树脂无需进一步处理而直接用在下一阶段。将与树脂结合的反应产物用TFA处理(5ml；5hr)，进行树脂键的水解作用。分离树脂，用DCM洗涤。合并洗液与TFA，在真空下浓缩(收率30％)。通过光谱测定法鉴别产物(结构式见图4)。

实施例4：中卟啉IX四肽的制备

将实施例1制备的与树脂结合的四肽(20mg)悬浮在DMF(5ml)中，用中卟啉IX二羧酸(10μmol；结构式见图6A)处理，然后加入二异丙胺(8当量)与TBTU(4当量)的混合物。将树脂在滚筒上避光摇动约24小时。将树脂用DMF洗涤，再用DCM洗涤(5×3ml)并部分干燥。将与树脂结合的反应产物用TFA处理(5ml；5hr)，进行树脂键的水解作用。分离树脂，用DCM/TFA混合物(1∶1.5ml)洗涤。合并洗液，在真空下浓缩。通过半制备型HPLC纯化卟啉四肽(收率60％)(结构式见图6C)。通过光谱测定法确认结构。

这种工艺可以用于合成其他卟啉-肽，例如中卟啉I和相关分子。

实施例5：四双吡啶基乙基四肽的制备

将实施例1制备的与树脂结合的四肽(20mg)悬浮在DMF(5ml)中，用溴乙基吡啶(20μmol)处理。然后加入吡啶(0.5ml)。将树脂在滚筒上摇动约48小时。将树脂用DMF洗涤，再用DCM洗涤(5×3ml)，以除去所有未反应的单体，然后在真空下干燥30分钟。将与树脂结合的反应产物用TFA处理(5ml；5hr)，进行树脂键的水解作用。分离树脂，用DCM/TFA混合物(1∶1.5ml)洗涤。合并洗液，在真空下浓缩。通过半制备型HPLC纯化吡啶基乙基四肽衍生物(收率50％)(结构式见图5)。通过光谱测定法确认结构。

这种工艺可以应用于其他杂环，例如菲咯啉和相关分子。

实施例6：Asp Ala His Lys[SEO ID NO；1]的芳基衍生物的制备

制备了具有图1B所示结构式的衍生物，其中R₁是苯基。向乙醇钠的乙醇浆液(5gm；50ml)中加入乙酰氨基丙二酸二乙酯(10gm)的无水乙醇(100ml)溶液，加热至回流30分钟。将产物冷却(10℃)，与α-溴苯基乙酸乙酯(5gm)反应。使反应进行完全(24h)，过量乙醇钠用稀酸中和。将三酯萃取到乙酸乙酯中，除去溶剂后，得到粘性液体。将粗产物用盐酸(100ml)水解，脱羧，得到苯基被取代的天冬氨酸(10gm)。利用标准的反应程序制备N-苯甲酰氧基叔-丁基衍生物。向如实施例1所述制备的与树脂结合的三肽(Lys His Ala)(20mg)的DMF溶液中加入N-苯甲酰氧基叔-丁基天冬氨酸衍生物，然后加入二异丙胺(8当量)与TBTU(4当量)的混合物。将树脂摇动约24小时，用茚三酮试验监测反应。在该时段结束时，排尽DMF，将树脂用DMF和DCM洗涤。排尽溶液，将珠粒用DCM洗涤(3×2ml)。通过小心的水解作用分离四肽衍生物。通过制备规模的HPLC分离四肽的立体异构体。

实施例7：四肽Asp Ala His Lys[SEQ ID NO：1]抑制ROS的产生

从一家或多家从事肽合成的公司获得具有序列L-Asp L-Ala L-HisL-Lys[SEQ ID NO：1]的四肽(L-四肽)，这些公司包括Ansynth Services、QCB、Genosys和Bowman Research。通过标准的固相合成法制备肽(另见实施例1)。

如下文献所述检验L-四肽抑制ROS产生的能力：Gutteridge andWilkins，Biochim.Biophys.Acta，759，38-41(1983)和Cheeseman et al.，Biochem.J.，252，649-653(1988)。简言之，将Cu(II)与H₂O₂混合，在芬顿(Fenton)型反应中导致羟基原子团的产生。羟基原子团攻击糖2-脱氧-D-核糖(DNA的糖残基)，生成片段。在低pH下加热这些片段，生成丙二醛，加入2-硫代巴比土酸后，得到粉红色色原体，能够在532nm下通过分光光度法测量之。因而，532nm下的吸光度是对2-脱氧-D-核糖损伤的量度。

在有和没有L-四肽的存在下进行测定。结果总结在表1中。从表1可以看到，若存在L-四肽，且Cu(II)：四肽之比为1∶1.2和1∶2，则2-脱氧-D-核糖的降解分别被抑制了38％和73％。显然，L-四肽抑制羟基原子团对2-脱氧-D-核糖的降解。

表1

还利用全部由D-氨基酸组成的具有序列Asp Ala His Lys的四肽(D-四肽)进行相似的测定。从一家或多家从事肽合成的公司获得D-四肽，这些公司包括Ansynth Services和QCB。通过标准的固相合成法制备肽(见实施例1)。

如Zhao and Jung，Free Radic Res，23(3)，229-43(1995)所述，检验D-四肽抑制ROS产生的能力。简言之，将Cu(II)与抗坏血酸混合，在芬顿型反应中导致羟基原子团的产生。使用抗坏血酸代替过氧化氢的优点是抗坏血酸不干扰其他测定(即LDH测定)，而过氧化物则不然。羟基原子团攻击糖2-脱氧-D-核糖，生成片段。在低pH下加热这些片段，生成丙二醛，加入2-硫代巴比土酸后，得到粉红色色原体，能够在532nm下通过分光光度法测量之。因而，532nm下的吸光度是对2-脱氧-D-核糖损伤的量度。

确立最佳的Cu(II)和抗坏血酸的浓度是开发这种方案的第一步。首先，基于在体内发现的Cu(II)生理浓度(包括结合的和未结合的Cu(II))，使用10μM的恒定浓度。改变抗坏血酸的浓度，目的是确立线性范围。所选择的抗坏血酸浓度是500μM，因为在532nm下的吸光度最大且仍然在线性范围内。有趣的是，抗坏血酸浓度大于500μM时，羟基原子团平稳减少，假定这是由于抗坏血酸的双重效果，它在低浓度下是羟基原子团发生剂，在高浓度下是抗氧化剂。

使用上述浓度的Cu(II)和抗坏血酸，建立关于D-四肽的滴定曲线。简言之，将D-四肽与Cu(II)在室温下预先保温15分钟，然后加入抗坏血酸。这样做是允许D-四肽与Cu(II)结合，因此抑制ROS的产生。从下表可以看到，若Cu(II)∶D-四肽之比在4∶1至4∶7之间，则对羟基原子团的产生几乎没有或根本没有抑制作用。若该比例是1∶2或以上，则存在对羟基原子团生成的彻底抑制作用。

表2

Cu(II)∶D-四肽	Cu(II)(μM)	抗坏血酸(μM)	D-四肽(μM)	A532	抑制％
						1∶0	10	500	0	0.767
4∶1	10	500	2.5	0.751
						2∶1	10	500	5	0.743
1∶1	10	500	10	0.751
						4∶5	10	500	12.5	0.789
2∶3	10	500	15	0.774
						4∶7	10	500	17.5	0.737
1∶2	10	500	20	0.029	96.2
						1∶4	10	500	40	0.016	97.9

实施例8：在兰根道尔夫氏再灌注模型中检验Asp Ala His Lys D-四肽

在制备血液灌注的心脏时基本上同前人的研究(Galinanes et al.，Circulation，88：673-683(1993)；Kolocassides et al.，Am.J.Physiol.，269：H1415-H1420(1995)；Hearse et al.，J：Mol.Cell.Cardiol.，31：1961-1973(1999))。参见图8。下面简要描述工艺。

使用从Bantin and Kingman Universal，UK获得的雄性Wistar大鼠。依照由National Society for Medical Research制订的″实验动物护理原则(Principles of Laboratory Animal Care)″和由National Academy of Sciences制订、由US National Institutes of Health出版的″实验动物护理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)″(NIH出版No.85-23，1996修订)，对全部动物给予人道主义关怀。

将所供养的大鼠(300-400g)用戊巴比通钠(60mg/kg，腹膜内)麻醉，用肝素(1000IU/kg；静脉内)抗凝。通过钝器解剖法暴露右股静脉和左股动脉，插套管(分别为18G和22G Abbocath-T导管)以便血液向受灌注的心脏的回流和供应。建立体外回路，灌注

代血浆(B.BraunMedical Ltd.，Aylesbury，UK)，维持15分钟，然后连接于离体心脏。该阶段是为了确保灌注溶液与实验大鼠血液充分混合，并确保整个制备物的稳定。每500ml

含有20.00g琥珀酸化明胶(平均分子量30,000)、3.65g氯化钠、使用注射用水补至500ml(电解质mmol/500ml：阳离子Na 77，阴离子Cl 62.5，pH 7.4)。在灌注供体心脏之前，向中央储器加入另外7-8ml同一品种大鼠血液。这是为了确保在实验期间当血液没有再循环而是被收集2分钟时，实验大鼠有充分的血液供应。在实验大鼠的动脉流出口放置蠕动泵(Gilson Minipuls 3)，在10分钟内逐渐增加体外回路的流通量至2.5ml/min。这种逐渐增加防止立即确立2.5ml/min的流速时可能会发生的动脉压陡降。血液被泵入套管(随后会使受灌注心脏的主动脉与之连接)，受重力作用返回，经由储器过滤至实验动物的静脉流入线路。灌注套管上方的充满空气的注射器充当缓冲腔，起到使灌注压力的振动减幅的作用，振动是离体心脏的收缩和泵的蠕动作用的结果。使实验动物通过35％Venturi面罩呼吸95％O₂+5％CO₂的混合物。调节流速，以维持血液pO₂和pCO₂在生理范围内。借助恒温控制加热垫使体温稳定在37.0(±0.5)℃，用直肠温度计监测。借助与动脉线路连接的压力传感器监测血压。全部压力传感器均连接于MacLab(ADInstruments，Australia)，后者在实验中连续工作。在供体心脏与体外回路连接之前和每次实验结束时，监测实验大鼠的血液气体(pO₂，pCO₂，pH)、血细胞比容、葡萄糖和电解质水平(Na⁺，K⁺，Ca²⁺)。在实验期间，根据需要输液最小量的供体血液(来自同一品种的另一只大鼠)，目的是保持制备物的体积和稳定性。根据需要向中央储器给以另外的肝素和戊巴比通。

为了分离心脏，将每只大鼠(270-350g)用二乙醚麻醉，用肝素(1000IU/kg静脉内)抗凝。然后立即切除心脏，浸在冷的(4℃)

中。向主动脉迅速插套管，按兰根道尔夫氏方式(Langendorff，PflugersArchivesfur die Gestamte Physiologie des Menschen and der Tiere，61：291332(1895))灌注来自实验动物的动脉血，流速恒定为2.5ml/min。除去左动脉附件后，将与压力传感器连接的充满流体的气囊导管(用于测量左心室收缩压和舒张压，和二者之差左心室developed pressure)经由二尖瓣引入左心室。向气囊内充水，直至左心室末期舒张压(LVEDP)达到4-8mmHg之间。从压力跟踪计算心率，以每分钟心搏数(bpm)表示。经由主动脉套管的侧支测量灌注压。全部压力传感器均连接于MacLab，后者在实验中连续工作。

将所切除的心脏随机分为两个处理组(见图9；6只心脏/组)，需氧灌注20分钟，然后(i)盐水对照组灌注2分钟盐水输液，立即缺血30分钟加2分钟盐水输液然后开始再灌注，(ii)药物组灌注2分钟药物输液，立即缺血30分钟(药物因此被捕集在脉管系统内，以确保缺血持续一段时间)再灌注发生时的加2分钟药物输液。然后使心脏受到30分钟全面的零-血流缺血，在此期间浸在37.0℃盐水中。夹住由泵到主动脉套管之间的线路来引发缺血，从而转移血流离开离体心脏，经由旁路回到实验动物。然后使心脏再灌注40分钟，在此期间连续测量收缩功能。

药物是四肽D-Asp D-Ala D-His D-Lys，其特性对进行实验的研究人员来说是未知的。该四肽是由Bowman Research，UK提供给研究人员的，其盐水溶液浓度为16.7mg/ml。供货后直接输液，无需任何稀释或修饰。生理盐水是由Baxter，UK提供的，用于对照。每天使用新鲜的盐水溶液和药物溶液。

借助蠕动泵(Gilson Minipuls 3)向主动脉套管的侧支输入药物或载体，设置恒定流速为0.25ml/min。由于流经主动脉套管的血流是2.5ml/min，药物输液是0.25ml/min，因此释放到心脏的药物最终浓度是由Bowman Research所提供的1/11。在缺血前的2分钟载体或药物输液期间和图9所示时间点采集动脉与静脉血样，离心，冷冻，以备分析。然后在再灌注期的前2分钟重复输液，在此期间不采集血样，但是再循环。

预先定义的排除标准是：(i)如果在供体心脏插套管之前，实验动物的收缩压没有稳定到≥80mmHg，那么将从研究中排除，(ii)如果按照20分钟基线的干预前读数，LVDP≤100mmHg，那么供体心脏将从研究中排除，或者(iii)血液化学值超过正常范围以外。

结果以平均值±SEM表示。每只心脏的全部恢复值以干预前基线值(实验开始后20分钟时测量)的百分率表示。双-尾不成对Student’s t检验用于比较组间的两个平均值。若p＜0.05，则认为差异在统计学上是显著的。

出于质量控制的原因，也为了适用预先定义的排除标准，通过测量每只实验动物(在即将灌注供体每个心脏之前和在每次实验结束时)和每只灌注心脏的血液化学(pH、pO₂、pCO₂、血细胞比容、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、葡萄糖)和基线收缩功能，监测系统的稳定性和可再现性。表3揭示，在每种所测量的指标中仅有微小变化，证实在两个研究组中所应用的灌注条件是相似的，而且全部数值均在可接受的生理范围内。实验大鼠的收缩压和心率如表4所示。可以看到，在15分钟基线读数下，两个研究组之间没有显著差异。

表5显示，在20分钟需氧灌注期结束时(也就是恰在药物或载体灌注之前)，组间LVDP、心率和灌注压没有显著差异。因而，就LVDP而言，研究中的主要终点，盐水对照组和药物治疗组的平均值是177.3±10.6mmHg和177.2±5.6mmHg。

正如所预期的，心肌缺血导致心肌收缩停止，心搏停止最初呈舒张状态。不过，由于随时间推移发展出缺血损伤，当心脏走向缺血性收缩时发生舒张状态增加。每个研究组发展为缺血性收缩的暂时轮廓如图10所示。从表6可以看到，在任意所测量的指标中都没有差异，不过在药物治疗组有一定证据表明延迟达到50％收缩的时间的趋势，这提示有保护作用。

图11显示两个研究组中平均LVDP恢复率的变化(以干预前基线值的百分率表示)。显而易见的是，盐水对照组心脏恢复较慢和较差，以致在40分钟再灌注期结束之际，LVDP仅为干预前对照的15.3±3.2％。相形之下，药物组心脏恢复更迅速，程度更高(50.5±9.3％)。

图12显示在40分钟再灌注期间两个研究组中左心室末期舒张压的绝对值。两组中，由在缺血期间发展起来的收缩引起的高水平LVEDP随时间推移向干预前的对照值下降。不过，药物组比盐水对照组更快速和更完全地使它们的LVEDP正常化，差异在每个所研究的时间点都是显著的。这与在药物组再灌注期间所见到的恢复增强是一致的。

如图13所示，盐水对照组与药物组所得心率的对比揭示了这两组本质上是相同的(115.0±3.8对127.2±22.8％)。

如图14所示，两组40分钟再灌注期间的灌注压本质上是恒定的，数值在40分钟再灌注期结束时彼此之间没有显著区别。盐水对照中，再灌注结束时的平均值是其干预前对照的109.9±8.2％，而药物组是其干预前值的87.4±8.0％。因而，尽管药物组的数值在整个再灌注期趋于更低(这与所观察到的心保护作用是一致的)，不过这些变化没有统计学上的显著性。

本试点研究的结果表明，在离体血液灌注的大鼠心脏中，Asp Ala HisLys似乎具有显著的和实质性的保护性质，缺血后的功能恢复增强了三倍半(15.3±3.2％对50.5±9.3％)。保护作用的幅度等于部分所研究的最强有力的干预。

表3

灌注离体供体心脏的血液组成

每组有4-6只实验动物。全部数值均以平均值±SEM表示。

*药物是D-Asp D-Ala D-His D-Lys。

表4

血液-灌注的实验大鼠的基线收缩压和心率

全部数值均以平均值±SEM表示。每组有6只实验动物。

*药物是D-Asp D-Ala D-His D-Lys。

表5

血液-灌注的离体大鼠心脏在各种干预之前的基线左心室developed pressure(LVDP)、心率和灌注压

全部数值均以平均值±SEM表示。每组有6只实验动物。

*药物是D-Asp D-Ala D-His D-Lys。

表6

在30分钟全面的零血流缺血期间的缺血性收缩

全部数值均以平均值±SEM表示。每组有6只心脏。

*药物是D-Asp D-Ala D-His D-Lys。

实施例9：在脑缺血模型中检验Asp Ala His Lys

在成熟雄性Wistar大鼠(270-300g，Charles River Laboratories)中制造病灶性缺血梗塞，如前人所述(Koizumi et al，Jpn.J.Stroke，8：1-8(1986)；Chen et al.，J.Cereb.lood Flow Metab.，12(4)：621-628(1992))。手术前允许动物自由接近食物和水。将它们用3.5％氟烷麻醉，利用面罩在70％N₂/30％O₂中用1.0％-2.0％氟烷维持麻醉。在手术期间利用反馈调节的水加热系统(YSI 73A直肠探针，Fisher，与K-20/64N水下过滤层连接，Hamilton Industries，Cincinnati，OH)保持直肠温度在37℃。前人的研究已经显示，这种模型在缺血期间和之后的直肠温度和大脑温度是相同的(Chen et al.，J.Cereb.lood Flow Metab.，12(4)：621-628(1992))。向右股动脉插入医疗级硅氧烷管线(Technical Products，Inc.，Decatur，GA)，用于测量血液中气体和血压，向股静脉插套管用于输液。套管从皮下通道进入，从背侧颈部出来。在缺血前后测量全部动物的动脉血液气体。

关于缺血手术，暴露右颈总动脉的分杈。将4-0尼龙缝合线尖端在火焰上烧圆，然后从外颈动脉向内颈动脉前进18.5-19.5mm(因动物体重而异)，然后穿过颅内颈动脉，直至尖端封闭中脑动脉(MCA)起点。然后使动物从麻醉中醒来。MCA闭合后2小时，将它们再次麻醉，将动脉内缝合线撤回到外颈动脉。

从闭合前一分钟开始，历经一分钟向动物静脉内输注单独的载体(对照)或药物(D-Asp D-Ala D-His D-Lys)的载体溶液。药物的特性对进行实验的研究人员来说是未知的。提供给研究人员的是在磷酸盐缓冲液pH 7.4中的浓缩原液(16.67mg/ml)，贮存在-80℃下。通过如实施例7所述测定体外减少自由基生成的能力，确定药物在使用前是生物学活性的。将原液在临使用前解冻，足量给药，剂量为20mg/kg。在药物或载体的静脉内给药结束时，立即推进尼龙缝合线以封闭MCA。在MCA闭合后2小时，历经一分钟向动物静脉内重复输注药物或载体。第二次输注结束时，立即拉回封闭MCA的尼龙缝合线，以便再灌注。而且，在第二次输注后将动物再次麻醉，除去套管。将动物返回它们的笼子，在那里允许它们自由接近食物和水。

在缺血之前和处死之前称重动物。再灌注后1小时和24小时给以神经病学检查，如Zea Longa et al.，Stroke，20：84-91(1989)所述。评分如下：0，正常；1，不能完全伸展对侧(左)前爪(轻微的病灶性神经病学缺陷)；2，向左转圈(中度的病灶性神经病学缺陷)；3，向左跌倒(严重的病灶性神经病学缺陷)；4，没有自发的步态，意识水平降低。

MCA闭合后二十四小时，将动物用氯胺酮(44mg/kg)和赛拉嗪(13mg/kg)麻醉，二者均为肌内给药，经贲门灌注肝素化盐水，然后是10％缓冲的福尔马林。取出大脑，使用大鼠脑基质切成2mm冠状切片(Activational System，Inc.，Warren，MI；共7片)。然后将切片埋入石蜡，从每张切片前表面切6mm切片，用苏木精和曙红(H和E)染色。利用“间接”法(Swanson et al.，J.Cerebral Blood Flow Metabol.，10：290-293(1990))，使用计算机界面图象分析系统(Global Lab Image system，Data Translation，Marlboro，MA)测定梗塞体积：测定每张切片的完整的同侧(右)半球区域面积和完整的对侧(左)半球区域面积，从后者中减去前者，从而计算每张切片的梗塞面积。然后合计梗塞面积，乘以切片厚度，得到每只大脑的梗塞体积(以mm³计)。

结果列在下表7-10中。有些数据以平均值±S.E.M.表示。通过反复测量值ANOVA和成对或不成对双侧t检验分析连续的数据，酌情采用Bonferroni校正。通过Mann-Shitney U-检验分析不连续的行为数据。

表7

梗塞体积

*用D-Asp D-Ala D-His D-Lys治疗

表8

神经病学分级

*用D-Asp D-Ala D-His D-Lys治疗

^a缺血手术当天

^b缺血手术后一天

表9

体重

*用D-Asp D-Ala D-His D-Lys治疗

^a缺血手术当天

^b缺血手术后一天

表10

血液气体和血压

实施例10：对ROS的产生的抑制作用

检验了四肽L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1]和其他肽及化合物抑制ROS生成的能力。所检验的其他肽是：L-Asp L-Ala L-His L-LysL-Ser L-Glu L-Val L-Ala L-His L-Arg L-Phe L-Lys[SEQ ID NO：3]、L-AlaL-His L-Lys L-Ser L-Glu L-Val L-Ala L-His L-Arg L-Phe L-Lys[SEQ IDNO：4]、L-His L-Lys L-Ser L-Glu L-Val L-Ala L-His L-Arg L-Phe L-Lys[SEQ ID NO：5]和乙酰化-L-Asp L-Ala L-His L-Lys L-Ser L-Glu L-ValL-Ala L-His L-Arg L-Phe L-Lys[SEQ ID NO：6]。从一家或多家从事肽合成的公司获得肽，包括Ansynth Services、QCB、Genosys和BowmanResearch。其他所检验的化合物是组氨酸(Sigma Chemical Co.)、过氧化氢酶(Sigma Chemical Co.)和超氧物歧化酶(Sigma Chemical Co.)。

1、对羟基原子团生成的抑制作用

羟基原子团很可能是反应性最高的氧衍生物质。羟基自由基是非常高能的、短寿命的和有毒性的。

有些研究人员提出，过氧化氢和超氧化物原子团的毒性可能是由于它们转化为羟基自由基。超氧化物原子团能够经由Haber-Weiss反应直接转化为羟基原子团。作为替代选择，它也能够转化为过氧化氢，后者经由芬顿反应转化为羟基原子团。两种途径都需要过渡金属，例如铜(Acworth and Bailey，The Handbook Of Oxidative Metabolism(ESA，Inc.1997))。

还已知铜在有抗坏血酸盐时生成羟基原子团。有人已经提出了下列反应流程：

抗坏血酸盐+2Cu²⁺→2Cu⁺+脱氢抗坏血酸盐+2H⁺ (方程式1)

Cu⁺+O₂→O₂ ^.-+Cu²⁺ (方程式2)

Cu⁺+O₂ ^.-→Cu²⁺+H₂O₂ (方程式3)

Cu⁺+H₂O₂→OH^-+OH^.+Cu²⁺ (方程式4)

Biaglow et al.，Free Radic.Biol.Med.，22(7)：1129-1138(1997).

如Gutteridge and Wilkins，Biochim.Biophys.Acta，759：38-41(1983)所述，试验上列化合物抑制羟基原子团产生的能力。简言之，将Cu(II)与抗坏血酸混合，导致羟基原子团的产生。然后加入脱氧核糖，如果存在羟基原子团的话，它们攻击脱氧核糖，生成片段。在低pH下加热这些片段，生成丙醛酸，加入2-硫代巴比土酸(TBA)后，得到粉红色色原体，能够在532nm下通过分光光度法测量之。因而，532nm下的吸光度是对脱氧核糖损伤、因此是羟基原子团生成的量度。

为了进行测定，向试管内加入含有CuCl₂的缓冲液(20mM KH₂PO₄缓冲液，pH 7.4)和含有供试化合物的缓冲液或单独的缓冲液(CuCl₂的最终浓度为10μM)。将试管在室温下保温15分钟。然后，向每支试管内加入含有0.5mM抗坏血酸的缓冲液和含有1.9mM 2-脱氧-D-核糖的缓冲液，将试管在37℃下保温1小时。最后，向每支试管内加入1ml含有1％(w/v)TBA的50mM NaOH和1ml浓乙酸，将试管在沸水中保温15分钟。将试管冷却15分钟后，读取532nm下的吸光度。

发现在本测定中，四肽L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1]在四肽/铜之比为2∶1或更高时完全抑制羟基原子团的生成。四肽/铜之比低于2∶1时无效。

时间进程的结果列在图15A中。在图15A中可以看到，铜和抗坏血酸盐(没有加入肽)快速生成TBA-反应性物质，在30分钟内达到最大。按四肽/铜之比为2∶1加入的四肽防止了TBA-反应性物质的生成。有趣的是，按四肽/铜之比为1∶1加入的四肽延缓了TBA-反应性物质的生成。这些数据提示，按四肽/铜之比为1∶1加入的四肽能够提供一定的保护作用，防止羟基原子团被铜结合，导致羟基定向攻击四肽。一旦足够的四肽被破坏，铜即被释放，允许其生成羟基原子团，攻击脱氧核糖。

若将按四肽/铜之比为2∶1加入的四肽保温更长时间，则它防止TBA-反应性物质生成的能力缓慢被削弱了。参见图15B。从图15B可以看到，在保温的前4个小时期间，TBA-反应性物质的生成被抑制了95％。到24小时后，抑制水平已经降至50％，到48小时后，抑制水平已经降至20％。这些数据提示，即使在四肽的存在下仍然在生成TBA-反应性物质。还提示了在实验的时间进程期间四肽一直在被降解。这种降解作用很可能是由于在四肽/铜配合物附近生成自由基，它们攻击和降解四肽，同时释放铜。由于自由基、例如羟基原子团的反应性非常高，它们将攻击它们接触到的第一个富含电子的分子，在这种情况下会是四肽。

在四肽/铜之比为2∶1下试验了pH对四肽抑制羟基原子团生成的影响。在该比例下，在pH 7.0-8.5下，四肽对TBA-反应性物质的生成产生＞95％的抑制作用。这是生理pH水平和在缺血期间所预期的pH水平(发生在缺血组织中的酸中毒)。在pH 6.0下，四肽不能有效防止TBA-反应性物质的生成，这可能是由于组氨酸结合铜的能力降低。组氨酸的咪唑环上的氮原子参与结合铜，pKa为6.0。因此，在pH 6.0下，组氨酸仅能结合50％的铜。另50％的铜会是未被结合的或者与四肽的其他氨基酸松散结合，因此将能够参与TBA-反应性物质的生成。

在1∶1和2∶1的肽∶铜条件下，试验了组氨酸和在不同位置具有组氨酸的若干肽抑制羟基原子团生成的能力。而且还试验了具有乙酰化天冬氨酸(Ac-Asp)作为N-末端氨基酸的肽。结果列在表11中。表11中，抑制％是与单独缓冲液相比的吸光度减少除以单独缓冲液的吸光度的百分率。

从表11结果可以看到，在第二和第三位具有组氨酸的肽在2∶1的肽∶铜条件下产生＞95％的抑制作用，而这些肽在1∶1的肽∶铜条件下是无效的。有趣的是，在2∶1的肽∶铜条件下，在第一位具有组氨酸的肽和具有乙酰化天冬氨酸作为N-末端氨基酸的肽提供一定的保护作用(分别为约47％和约28％的抑制作用)，不过这种保护作用大概分别可归因于这些肽中第七和第九位的组氨酸。按2∶1的组氨酸∶铜条件单独加入的组氨酸提供一定的保护作用(约20％的抑制作用)。

过氧化氢酶已经显示能防止羟基原子团的生成。Gutteridge andWilkins，Biochim.Biophys.Acta，759：38-41(1983)；Facchinetti et al.，Cell.Molec.Neurobiol.，18(6)：667682(1998)；Samuni et al.，Eur.J.Biochem.，137：119-124(1983)。因此，在本测定中试验了过氧化氢酶(0-80nM)，发现它防止粉红色色原体的生成(数据未显示)。这种发现提示，在本测定中生成了过氧化氢，因为过氧化氢酶分解过氧化氢为水，与上述方程式3和4一致。当按四肽/铜之比为1∶1加入L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ IDNO：1]时，过氧化氢酶也防止粉红色色原体的生成(数据未显示)。如上所示，在该比例下，铜仍然能够参与氧化还原反应，生成羟基原子团。这些实验显示，过氧化氢是生成羟基原子团的重要前体。

表11

^a所有氨基酸都是L-氨基酸

^bSEQ ID NO：5

^cSEQ ID NO：4

^dSEQ ID NO：3

^eSEQ ID NO：6

^fSEQ ID NO：1

*数据摘自实施例7表2。

2、超氧物歧化酶(SOD)活性测定

超氧物歧化酶(SOD)是一种天然存在的酶，它负责在体内分解超氧化物为过氧化氢(类似于方程式3)。过氧化氢然后能够被过氧化氢酶解毒。

在前节所述测定法中测定SOD的活性，发现没有活性(数据未显示)。这种结果并不令人惊讶，因为SOD事实上转化超氧化物原子团为过氧化氢。过氧化氢然后能够被还原的铜转化为羟基原子团。

有文献报道铜配合物具有SOD活性。Athar et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.，39(4)：813-821(1996)；Ciuffi et al.，Pharmacol Res.，38(4)：279-287(1998)；Pogni et al.，J.Inorg.Biochem.，73：157-165(1999)；Willingham andSorenson，Biochem.Biophys.Res.Commun.，150(1)：252-258(1988)；Konstantinova et al，Free Rad.Res.Comms.，1213：215-220(1991)；Goldstein et al.，J.Am.Chem.Soc.，112：6489-6492(1990)。这种发现并不令人惊讶，因为SOD本身在其活性部位中含有铜。

测定了四肽L-Asp L-Ala L-His L-Lys[SEQ ID NO：1]的铜配合物的SOD活性。利用Beauchamp and Fridovich，Anal.Biochem.，44：276-287(1971)的黄嘌呤氧化酶测定法生成超氧化物原子团。黄嘌呤氧化酶转化黄嘌呤为尿酸，氧充当电子受体。这导致超氧化物原子团的生成。超氧化物原子团能够还原氮蓝四唑(NBT)。被还原的NBT在560nm处有λmax。已知铜抑制黄嘌呤氧化酶的活性(Konstantinova et al.，FreeRad.Res.Comms.，12-13：215-220(1991))，因此所有含有铜的实验也含有乙二胺四乙酸(EDTA)，它是一种已知的铜螯合剂。试验了EDTA-铜配合物的SOD活性，显示没有SOD活性(数据未显示)。

为了进行SOD活性测定，将0.1mM黄嘌呤(Sigma Chemical Co.)、25μM NBT(Sigma Chemical Co.)、50mM碳酸钠和1.2μM EDTA(SigmaChemical Co.)在比色杯内混合(均为最终浓度，最终的pH为10.2)。加入不同量的四肽-铜配合物(四肽/铜之比为1∶1和2∶1)和20nM黄嘌呤氧化酶(Sigma Chemical Co.)引发反应。四肽-铜配合物是这样制备的，将四肽与铜(CuCl₂)混合，使混合物在室温下保温15分钟，立即加入到比色杯内。在560nm下读取样品，第0时间点一次，以后每60秒一次达五分钟。

四肽与铜的1∶1配合物显示具有SOD活性，它对NBT还原的抑制作用证明了这一点(见图16)。不过，基于本测定中的IC₅₀值(产生50％抑制作用的量)，配合物的作用比SOD本身弱500倍。四肽与铜的2∶1配合物发现没有SOD活性(数据未显示)。

为了验证1∶1四肽-铜配合物不会干扰黄嘌呤氧化酶活性，在295nm下测量尿酸的生成。Athar et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.，39(4)：813-821(1996)；Ciuffi et al.，Pharmacol Res.，38(4)：279-287(1998)。这种测定类似于SOD测定，但是不存在NBT。相反，在295nm下测定尿酸，每60秒一次达5分钟。发现1∶1四肽-铜配合物在600nM浓度下仅抑制11％的尿酸生成(数据未显示)。因此，1∶1四肽-铜配合物具有真正的SOD活性。由于超氧化物被该配合物转化为过氧化氢，这可能有助于解释为什么它不能有效防止羟基原子团生成。

超氧化物原子团的生成是在含有1∶1或2∶1四肽-铜配合物的溶液中测量的。该测定联合了TBA测定和黄嘌呤氧化酶测定的技术。向所有试管内加入NBT，目的是量化超氧化物原子团对它的还原作用。样品还含有抗坏血酸盐和铜，将样品保温在37℃下。在5、15、30和60分钟时，从恒温箱内取出样品，在560nm下读数。结果显示在图17中。在含有2∶1四肽-铜配合物的样品中，NBT还原作用随时间推移而增加，在30分钟达到最大值。含有1∶1四肽-铜配合物的样品也显示NBT还原作用的增加，在60分钟达到最大值，但较小。这些数据提示，超氧化物蓄积在含有2∶1四肽-铜配合物的样品中，而1∶1四肽-铜配合物模拟超氧物歧化酶。

发生在羟基原子团生成中的事件的可能顺序如下：

O₂→O₂ ^.-→H₂O₂→OH^. (方程式5)

已经显示，1∶1四肽-铜配合物能够转化超氧化物原子团(O₂ ^.-)为过氧化氢(H₂O₂)。这是该配合物的SOD活性。2∶1四肽-铜配合物不能促进这种转化作用，因为两分子的四肽占据了铜的全部六个配位键。这就解释了为什么2∶1四肽-铜配合物是如此的有效，因为它抑制过氧化氢的生成，后者能够与还原的铜反应，经由芬顿反应生成羟基原子团。1∶1四肽-铜配合物通过消除超氧化物原子团，也提供有价值的贡献。即使它生成过氧化氢，人体的多数体腔也具有足量的过氧化氢酶，这些酶能够消除过氧化氢。不过在大脑中，过氧化氢酶的活性据报道是最低的。Halliwell et al.，Methods in Enzymol.，186：1-85(1990)。因此，大脑在缺血期间是特别脆弱的器官，因为伴随缺血发生的酸中毒导致释放铜。

3、DNA的保护作用

按照Asaumi et al.，Biochem.Mol.Biol.Int.，39(1)：77-86(1996)的方法测量DNA链的断裂。简言之，将17μg/ml质粒pBR322DNA与50μMCuCl₂在室温下预保温15分钟，四肽的浓度为0-200μM。然后，向每种反应系中加入2.5mM抗坏血酸盐，将混合物在37℃下保温1小时。混合物的总体积是16μl。接着，加入3μl上样缓冲液，它是含有0.25％(w/v)溴酚蓝、0.25％(w/v)二甲苯胺FF和40％(w/v)蔗糖的水溶液。在70伏特下进行0.8％琼脂糖凝胶电泳90分钟以分离样品。将凝胶在含有2μg/ml溴化乙锭的1X TBE(Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液)中染色30分钟。然后将凝胶在1X TBE中脱色5分钟，再对凝胶照相。

结果显示，四肽对防止DNA链断裂的形成是非常有效的。参见图18。最佳的保护性四肽∶铜之比是2∶1及以上，因为在这些比例下超螺旋环状DNA在凝胶上仍然是可见的。若四肽∶铜之比是1∶1或以下，带切口的环状DNA、线性DNA和更多损伤的DNA(拖尾)是可见的。

Claims

1.不具有结合的金属离子的线性金属-结合肽或其生理上可接受的盐在制备用于减少有需要的动物中由反应性氧类所致损伤的药物中的用途，其中所述肽是：

Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys。

2.权利要求1的用途，其中动物因为再灌注动物中缺血性组织或器官的需要而需要所述肽或其生理上可接受的盐。

3.权利要求2的用途，其中所述动物患有脑血管缺血，并且所述缺血性组织位于所述动物脑部。

4.权利要求2的用途，其中所述动物患有心血管缺血并且缺血性组织位于所述动物的心脏中。

5.权利要求1的用途，其中所述动物需要肽或其生理上可接受的盐以治疗创伤。

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述肽的至少一个氨基酸是D-氨基酸。

7.不具有结合的金属离子的线性金属-结合肽或其生理上可接受的盐在制备用于减少从动物中摘除的器官或组织中的由反应性氧类所致损伤的药物中的用途，其中所述肽是

Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys。

8.权利要求7的用途，其中所述肽的至少一个氨基酸是D-氨基酸。

9.不具有结合的金属离子的线性金属-结合肽或其生理上可接受的盐在制备用于减少有需要的动物中的铜离子浓度的药物中的用途，其中所述肽是

Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys。

10.权利要求9的用途，其中所述肽的至少一个氨基酸是D-氨基酸。