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CN102037015A - 对血管生成的抑制 - Google Patents

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CN102037015A CN200880117292XA CN200880117292A CN102037015A CN 102037015 A CN102037015 A CN 102037015A CN 200880117292X A CN200880117292X A CN 200880117292XA CN 200880117292 A CN200880117292 A CN 200880117292A CN 102037015 A CN102037015 A CN 102037015A
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Abstract

本发明一般性地涉及抑制炎性细胞介导的血管生成。具体地说，本发明涉及用Bv8拮抗剂，如抗-Bv8抗体预防或治疗肿瘤血管生成和抑制肿瘤发展。

Description

对血管生成的抑制
发明领域
本发明一般性地涉及抑制炎性细胞介导的血管生成。具体地说，本发明涉及用Bv8拮抗剂，如抗-Bv8抗体，预防或治疗肿瘤血管生成和抑制肿瘤发展。
技术背景
已知血管生成在肿瘤发展和转移中发挥重要作用，抗-血管生成是一种临床上有效的抗癌策略(Folkman，J.，Nat Med 1，27-31(1995)；Ferrara，N和Kerbel，R.S.，Nature 438，967-974(2005)；Carmeliet，P.，Nat Med 9，653-660(2003))。血管生成还在包括年龄相关的黄斑变性(AMD)在内的许多其它疾病中起到关键性致病作用。已经报道脉络膜新生血管形成至少部分地依赖于中性白细胞浸润(Zhou等，Mol Vis 11；414-424(2005))。通常认为肿瘤细胞是血管生成介质的主要来源(Folkman，L，N Engl J Med385，1182-1186(1971))。实际上，许多研究已经显示，癌细胞可产生许多血管生成因子，其中包括血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、促血管生成素、肝细胞生长因子(HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，癌基因或肿瘤抑制基因的各种突变会导致至少一些这些因子的生成增加(Rak，J.等，Cancer Res 55，4575-4580(1995)；Wizigmann等，Cancer Res 55，1358-1364(1995))。然而，令人信服的证据目前支持的结论是，由成纤维细胞、外周细胞、间充质干细胞和炎性免疫细胞以及内皮细胞前体构成的基质不仅能通过分泌血管生成因子来促进肿瘤生长，而且还可通过调节免疫系统来促进肿瘤生长(Hanahan，D.和Weinberg，R.A.，Cell 100，57-70(2000)；Coussens，L.M.和Werb，Z.，Nature 420，860-867(2002)；Blankenstein T.，Curr Opin Immunol 17：180-186(2005)；Karnoub等，Nature449：557-563(2005)；Orimo等，Cell Cycle 5：1497-1601(2006)；和Rafii，S.等，Nat Rev Cancer 2，826-835(2002))。这些细胞中的一些还可能通过免疫监视机制抑制肿瘤生长，但多数证据表明肿瘤中白细胞和其它炎性细胞的显著浸润会带来预后不良(Coussens.等，同上)。
最近的研究直接表明，不同的骨髓细胞群参与成年人的肿瘤血管生成调节(Da Palma，M.等，Nat Med 9，789-795(2003)；Yang，L.等，CancerCell 6，409-421(2004)；De Palma M.等，Cancer Cell 8，211-226(2005))和VEGF-诱导的新生血管形成(Grunewald，M.等，Cell 124，175-189(2006))。最近的许多研究还证实CD11b+Gr1+骨髓细胞在一些肿瘤模型中调节抗-VEGF治疗的难治性(Shojaei，F.等，Cell 124，175-189(2006))。已经描述了中性白细胞在多阶段癌发生转移模型中启动血管生成开关的作用(Nozawa，H.等，Proc Natl Acad Sci USA 103，12493-12498(2006))。骨髓细胞可局部分泌血管生成因子或产生蛋白酶类如基质金属蛋白酶-9(Yang，L.等，同上；Nozawa等，同上；van Kempen，L.C.等，Eur J Cancer 42，728-734(2006))，这又提高了VFGF-A在肿瘤微环境下的生物利用度和活性从而促进血管生成(Bergers G.等，Nat CellBiol 2，737-744(2000))。然而，我们对骨髓细胞离开BM并促进肿瘤发生的机制仍然不完全理解。
Bv8和EG-VEGF是两种高度相关的分泌蛋白，也称为前动力蛋白(prokineticin)-1和-前动力蛋白2，它们在结构上属于由被称为共脂肪酶折叠的五个二硫化桥基序限定的一大类肽(DeCouter，J.等，Nature 420，860-867(2002)；LeCouter.J.等，Proc Natl Acad Sci USA 100，2685-2690(2003)；Li.M.等，Mol Pharmacol 59，692-698(2001))。Bv8最初被鉴定为来自蛙Bombina variegate皮肤的一种分泌蛋白(Mollay，C.等，Eur J Pharmacol 374，189-196(1999))。Bv8的克隆与表达描述于2003年3月13日公开的WO 03/020892。Bv8和EG-VEGF结合两种高度相关的G-蛋白偶联受体(GPCR)，EG-VEGF/PKR-1(R1)和EG-VEGF/PKR-2(R2)(Masuda，Y等，Biochem Biophys Res Commun 293，496-402(2002)；Lin，D.C.等，J Biol Chem277，19276-19280(2002))。EG-VEGF和Bv8被确定为对特定内皮细胞类型具有选择性的促分裂原(LeCouter，J.等，(2001)和(2003)，同上)。其它活性归因于该家族，包括伤害感受(Mollay，C.等，同上)、胃肠道运动性(Li，M.等，同上)、生理周期运动节律的调节(Cheng，M.Y.等，Nature 417，405-410(2002))以及嗅球神经发生(Matsumoto，S.等，Proc Natl Acad Sci USA 103，4140-4145(2006))。此外，Bv8或EG-VEGF在体外刺激粒细胞和单核细胞集落生成(LeCouter，J.等，(2003)，同上；Dorsch，M.等，J Leukoc Biol78(2)，426-34(2005))。Bv8已经被确定为巨噬细胞化学趋化剂(LeCouter等，Proc Natl Acad Sci USA 101，16813-16919(2004))。
认识到血管内皮生长因子(VEGF)是病理状况下血管生成的主要调节物，这导致许多阻断VEGF活性的尝试。VEGF是一种被充分表征且最有效的血管生成正性调节物。参见，例如，Ferrara，N.& Kerbel，R.S.Angiogenesis as a therapeutic target Nature 438：967-74(2005)。除了作为血管生成和血管发生中的血管生成因子，VEGF这种多效生长因子在其它生理过程如内皮细胞存活、血管渗透和血管舒张、单核细胞趋化和钙流入中也显示出多种生物效应。Ferrara和Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18：4-25。此外，研究报道了VEGF对一些类型的非内皮细胞如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和施万细胞的促分裂原效应。参见，例如，Guerrin等，J.Cell Physiol.164：385-394(1995)；Oberg-Welsh等，Mol.Cell.Endocrinol.126：125-132(1997)；和Sondell等，J.Neurosci.19：5731-5740(1999)。
认识到血管内皮生长因子(VEGF)作为病理状况下血管生成的主要调节物，这导致许多阻断VEGF活性的尝试。已经提议抑制性抗-VEGF受体抗体、可溶性受体构建物、反义策略、抗VEGF的RNA适体和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RFK)抑制剂都可用于干扰VEGF信号传导。参见，例如，Siemeister等，Cancer Metastasis Rev.17：241-248(1998)。显示抗-VEGF中和抗体可抑制裸鼠中各种人肿瘤细胞系的生长(Kim等，Nature 362：841-844(1993)；Warren等，J.Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；Borgstrδm等，Cancer Res.56：4032-4039(1996)；和Melnyk等，Cancer Res.56：921-924(1996))，同时可抑制缺血性视网膜病模型的眼内血管生成(Adamis等，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。实际上，人源化抗-VEGF抗体，贝伐单抗(bevacizumab)(
Figure GPA00001140320700041
Genentech，South SanFrancisco，CA)，已被美国FDA批准与基于5-氟尿嘧啶(5-FU)的静脉内化疗联合用于转移性结肠癌或直肠癌患者的一线和二线治疗，以及与卡铂和紫杉醇联合用于不可切除的局部晚期复发性或转移性非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线治疗。参见，例如，Ferrara等，Nature ReviewsDrug Discovery，3：391-400(2004)。
然而，治疗性化合物长期干扰肿瘤生长的能力通常受限于耐药性的产生。已经鉴定出并在功能上表征了一些针对各种细胞毒化合物的耐药性机制，尤其是在单细胞肿瘤模型中。参见，例如，Longley，D.B.&Johnston，P.G.Molecular mechanisms of drug resistance.J Pathol205：275-92(2005)。此外，宿主基质-肿瘤细胞的相互作用可能导致耐药性表型。基质细胞分泌多种促血管生成因子，且不易发生与肿瘤细胞相同的遗传不稳定性和突变率的增加(Kerbel，R.S.Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cacer therapeutic agents.Bioessays 13：31-6(1991)。可参见Ferrara & Kerbel和Hazlehurst等，Ferrara，N.& Kerbel，R.S.Angiogenesis as a therapeutic target.Nature 438：967-74(2005)；以及Hazlehurst，L.A.，Landowski，T.H.&Dalton，W.S.Role of the tumor microenvironment in mediatingde novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death.Oncogene22：7396-402(2003)。
在临床前模型中，在测试的大多数异种移植模型中，用人源化单克隆抗体贝伐单抗(AVASTIN，Genentech，South San Francisco，CA)或者贝伐单抗的鼠前体(A4.6.1(杂交瘤细胞系产生的A4.6.1，保藏于3/29/91，ATCC HB-10709))阻断VEGF信号传导能显著抑制肿瘤生成及降低肿瘤血管生成(Gerber和Ferrara进行了综述，见Gerber，H.P.&Ferrara，N.Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies.Cancer Res65：671-80(2005))。当在肿瘤生长早期开始治疗时，单剂抗-VEGF治疗的药理作用最显著。如果直到肿瘤充分长成才开始治疗，抑制作用通常是短暂的，且肿瘤最终会产生耐药性。参见，例如，Klement，G.等，Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemoth erapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts.Clin Cancer Res 8：221-32(2002)。构成这种抗-VEGF治疗耐药性基础的细胞和分子事件是复杂的。参见，例如，Casanovas，O.，Hicklin，D.J.，Bergers，G.&Hanahan，D.Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors.Cancer Cell8：299-309(2005)；以及Kerbel，R.S.等，Possible mechanisms of acquired resistance to anti-angiogenic drugs：implications for the use of combination therapy approaches.Cancer Metastasis Rev 20：79-86(2001)。可能涉及许多因子。例如，在胰腺胰岛癌发生遗传模型中，用靶向VEGF和成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的化合物联合进行治疗能提高功效并延迟晚期肿瘤耐受性的产生。见Casanovas，O.，Hicklin，D.J.，Bergers，G.&Hanahan，D.Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors.Cancer Cell 8，299-309(2005)。其它研究者也鉴定出肿瘤浸润性基质成纤维细胞是替代性促血管生成因子的有效来源。参见，例如，Dong，J.等，VEGF-null cells require PDGFR alpha signaling-mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis.Embo J 23：2800-10(2004)；以及Orimo，A.等，Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.Cell 121：335-48(2005)。
炎性细胞可通过分泌影响内皮细胞活化、增殖、迁移和存活的炎性细胞因子参与血管生成(Albini和Balkwill等人进行了综述，见Albini，A.，Tosetti，F.，Benelli，R.&Noonan，D.M.Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention.Cancer Res 65：10637-41(2005)；以及Balkwill，F.，Charles，K.A.&Mantovani，A.Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease.CancerCell 7：211-7(2005)。一些肿瘤浸润性炎性细胞分泌促血管生成因子，包括单核细胞/巨噬细胞(参见，例如，De Palma，M.等，Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors.Cancer Cell8：211-26(2005)；和Yang，L.等，Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis.Cancer Cell 6：409-21(2004))、T-淋巴细胞和B-淋巴细胞(参见，例如，Freeman，M.R.等，Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor：a potential role for Tcells in angiogenesis.Cancer Res 55：4140-5(1995))、血管白细胞(参见，例如，Conejo-Garcia，J.R.等，Vascular leukocytes contribute to tumor vascularization.Blood 105：679-81(2005))、树突细胞(参见，例如，Conejo-Garcia，J.R.等，Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to angiogenesis under the influence of Vegf-A.Nat Med 10：950-8(2004))、中性白细胞(参见，例如，Coussens，L.M.，Tinkle，C.L.，Hanahan，D.&Werb，Z.MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis.Cell 103：481-90(2000))以及肥大细胞(参见，例如，Coussens，L.M.等，Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis.Genes Dev13：382-97(1999)；和(de Visser和Coussens进行了综述，见de Visser，K.E.，Eichten，A.&Coussens，L.M.Paradoxical roles of the immune system during cancer development.Nat Rev Cancer 6：24-37(2006))。有提示骨髓衍生的内皮祖细胞(EPC(参见，例如，Lyden，D.等，Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth.NAt Med 7，1194-201(2001))和血管周祖细胞(参见，例如，Song，S.，Ewald，A.J.，Stallcup，W.，Werb，Z.&Bergers，G.PDGFRbeta+perivascular progenitor cells in tumours regulate pericyte differentiation and vascular survival.Nat Cell Biol 7：870-9(2005))在一些肿瘤生长实验模型中有助于血管形成(Rafii等人进行了综述，见Rafii，S.，Lyden，D..Benezra，R.，Hattori，K.&Heissig，B.Vascular and haematopoietic stem cells：novel targets for anti-angiogenesis therapy？NatRev Cancer 2：826-35(2002))。髓系造血细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，显示能通过分泌血管生成因子直接刺激血管生成，或通过产生胞外基质降解蛋白酶间接刺激血管生成，该酶又能释放隐蔽的血管生成因子(Lewis，CE.&Pollard，J.W.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments中进行了综述；和Naldini，A.&Carraro，F.Role of inflammatory mediators in angiogenesis.Curr Drug Targets InflammAllrgy 4：3-8(2005))。在骨髓细胞谱系中，分离自肿瘤小鼠脾脏的CD11b+Gr1+祖细胞与肿瘤细胞共注射能促进血管生成(参见，例如，Yang，L.等，Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis.Cancer Cell6：409-21(2004))，而肿瘤浸润性巨噬细胞的数目与一些人类肿瘤的预后不良有关(Balkwill等进行了综述，见Balkwill，F.，Charles，K.A.和Mantovani，A.Smoldering and polarized inflammationin the initiation and promotion of malignant disease.Cancer Cell 7：211-7(2005))。然而，在另一研究中，巨噬细胞能抑制小鼠中实验性肿瘤的生长，提示它们有作为抗癌疗法的潜能。参见，例如，Kohchi，C.等，Utilization of macrophages in anticancer therapy：the macrophage network theory.AntiCancer Res 24：331 1-20(2004)。Shojaei，F.Wu等，Tumor refractoriness to anti-VEGF treatment is mediated by CD11b(+)Gr1(+)myeloid cells.Nat Biotechnology 2007 25(8)：911-20，报道了CD11b(+)Gr1(+)骨髓细胞在肿瘤的抗-VEGF抗体治疗耐药性中的作用。2007年3月28日提交的待决美国申请11/692681也披露了类似的发现。
除了骨髓细胞的相对丰度以及它们产生促血管生成因子的潜能，骨髓细胞在肿瘤的抗-VEGF治疗耐药性中的作用仍旧未知。需要发现和理解骨髓细胞、耐药性肿瘤以及它们产生的因子的生物学功能。通过以下描述可见，本发明解决了这些及其它需求。
发明概述
本发明至少部分地基于显示Bv8在肿瘤发展期间能调节来自骨髓(BM)的CD11b+Gr1+细胞的动员并促进肿瘤血管生成的实验数据。因此，本发明提供了诊断和治疗对VEGF拮抗剂治疗具有耐药性的肿瘤的方法和组合物。
一方面，本发明提供了一种肿瘤治疗方法，所述方法包括向之前用血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂治疗过的患有肿瘤的哺乳动物个体(如人类个体)施用有效量的Bv8拮抗剂。所述人类个体可以是，但不必须是，VEGF拮抗剂治疗难治性的。
在一个实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体或其片段，其中该抗-VEGF抗体可以是，例如，贝伐单抗或其片段或变体。
在另一个实施方案中，所述Bv8拮抗剂是抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段，其中所述Bv8受体可以是PKR-1/EG-VEGFR1或PKR-2/EG-VEGFR2。所述抗体结合的Bv8是被治疗哺乳动物的天然序列Bv8多肽。类似地，抗体结合的Bv8受体是被治疗哺乳动物的天然序列Bv8受体。
所述抗体或抗体片段可以是嵌合的、人源化的或人的。
在进一步的实施方案中，还向所述个体施用抗-VEGF抗体，其中的VEGF可以是任何VEGF分子，尤其包括但不限于165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子以及相关的121个、145个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，还包括天然产生的其等位基因形式和加工形式。
在一个具体实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐单抗或其片段或变体。
在另一个实施方案中，除了施用Bv8拮抗剂和任选的VEGF拮抗剂，所述哺乳动物个体，如人类个体，用一种或多种其它骨髓细胞减少剂如Gr1拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-I拮抗剂和/或MIP-1α拮抗剂治疗。
在再一个实施方案中，对治疗的哺乳动物个体，如人类个体，进行化疗和/或放疗，其中所述化疗可以包括，例如，施用细胞毒性制剂。优选地，所述其它治疗是已知作为特定靶定肿瘤“标准护理”的治疗。
所述肿瘤可以是任何类型的良性或恶性肿瘤，包括但不限于腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤和白血病。本发明优选的癌症是结肠癌、直肠癌、肺癌和乳腺癌，尤其是转移性结肠或直肠癌或非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一个具体实施方案中，上述方法还包括通过测定哺乳动物个体如人类个体生物学样品中循环和/或骨髓CD11b+Gr1+细胞相对于治疗前的数目或频率变化来监测所述治疗的功效的步骤。
另一方面，本发明涉及一种肿瘤治疗方法，该方法包括
(a)向患有肿瘤的哺乳动物个体，如人，施用有效量的Bv8拮抗剂，和
(b)通过测定哺乳动物个体如人类个体生物学样品中循环和/或骨髓CD11b+Gr1+细胞相对于治疗前的数目或频率变化来监测所述治疗的功效，其中数目或频率降低表示治疗有效。
再一方面，本发明涉及一种抑制哺乳动物如人类个体中炎性细胞介导的血管生成的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
所述拮抗剂可以是，例如，抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段，可以是嵌合的、人源化的或人的。抗体结合的Bv8是被治疗哺乳动物的天然序列Bv8多肽。类似地，抗体结合的Bv8受体是被治疗哺乳动物的天然序列Bv8受体。
所述方法还可包括通过测定哺乳动物个体如人类个体的生物学样品中循环和/或骨髓CD11b+Gr1+细胞相对于治疗前的数目或频率变化来监测所述治疗的功效的步骤。
在另一个实施方案中，所述方法还可包括施用其它血管生成抑制剂，如血管生成因子的抗体。
血管生成因子的实例包括，但不限于：血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、肝细胞生长因子(HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定可用Bv8拮抗剂治疗的患有肿瘤的人类个体的方法，包括确定所述个体是VEGF拮抗剂治疗难治的。
在另一个方面，本发明涉及通过单独施用Bv8拮抗剂或其与G-CSF拮抗剂的联合来抑制G-CSF刺激的中性白细胞动员。
本发明还涉及通过Bv8拮抗剂来抑制Bv8介导的骨髓谱系细胞的迁移。
本发明还涉及通过施用Bv8拮抗剂耗尽CD11b+Gr1+骨髓细胞以抑制肿瘤发展和/或生长。
另一方面，本发明涉及一种肿瘤治疗方法，所述方法包括向患有肿瘤的人类个体施用有效量的G-CSF拮抗剂。
在一个具体实施方案中，所述G-CSF拮抗剂是抗-G-CSF抗体或抗体片段。所述抗体或抗体片段可以是嵌合的、人源化的或人的。任选地，所述G-CSF拮抗剂是与Bv8拮抗剂和/或VEGF拮抗剂如抗-Bv8抗体和/或抗-VEGF抗体联合施用的。
在另一个实施方案中，所述G-CSF拮抗剂是与不同的抗肿瘤药和/或治疗方案如化疗和/或放疗联合施用的。
在另一方面，本发明涉及一种抑制人类个体中中性白细胞迁移的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
在再一方面，本发明涉及一种治疗受益于抗血管生成治疗的非肿瘤性症状的方法，所述方法包括向之前被诊断患有所述非肿瘤性症状并用血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂治疗过的人类个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
在一个实施方案中，所述非肿瘤性症状是VHGF拮抗剂治疗难治的。
所述非肿瘤性症状可以，例如，选自下组：不希望的或异常的增生、关节炎、类风湿关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、心肌梗塞造成的水肿、糖尿病性和其它增生性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管、角膜移植新生血管形成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新生血管形成、眼角新生血管形成(发红)、眼部新生血管疾病、血管狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、肺恶性胸腔积液、脑水肿(例如，与急性中风/闭合性颅脑损伤/创伤相关)、滑膜发炎、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三间隙液体疾病(胰腺炎、隔综合征、烧伤、肠道疾病)、子宫肌瘤、早产、慢性炎症如IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肾移植排斥、炎性肠病、肾病综合症、不希望的或异常肿块增长(非癌症)、肥胖、脂肪组织大规模增长、血友病性关节、肥厚性疤痕、头发生长受抑、毛细血管扩张症、化脓性肉芽肿、晶状体后纤维增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液、和胸腔积液。
在其它方面，本发明涉及一种中和抗-Bv8抗体以及包含这种抗体的组合物。
在一个具体实施方案中，所述中和抗体与鼠抗-Bv8抗体3F1或2B9实质上结合相同表位。与之前相同，所述抗体可以是抗体片段，并且可以是嵌合的、人源化的或人的。
附图简述
在描述中，BM＝骨髓，PB＝外周血。
图1.BM细胞上Bv8表达和活性的调节a.肿瘤诱导Bv8蛋白在BM中表达。给灰褐色裸鼠植入A673或HM7肿瘤细胞。特异性ELISA显示，6天后，相对于植入MatrigelTM的小鼠，植入肿瘤的小鼠BMMNC中Bv8水平较高(p＜0.05)。b.在BM细胞CD11b+Gr1+亚组中Bv8表达特异性上调。给灰褐色裸鼠植入A673、HM7、HPAC、Calu-6和Jurkat细胞。10天后从小鼠BM分离CD11b+Gr1+骨髓细胞并用TaqmanTM分析确定骨髓-和非骨髓-(CD11b-Gr1-)亚组中Bv8的表达。星号表示，各肿瘤中的CD11b+Gr1+群与相应的CD11b-Gr1-群相比显著不同(p＜0.05)。c.G-CSF是Bv8表达的主要诱导物。从初次接受实验的小鼠分离BMMNC并与一系列细胞因子和趋化因子一起培育，并用TaqmanTM评价Bv8表达，如“方法”章节中所述。d.G-CSF是CD11b+Gr1+细胞中Bv8的主要诱导物。从Balb-c小鼠分离BMMNC并通过FACS分选成CD11b+Gr1+和CD11b-Gr1-亚组。全部BM、CD11b+Gr1+和CD11b-Gr1-群用SDF1α、G-CSF和GM-CSF处理，如“方法”章节中所述。e.缺氧能增强G-CSF在骨髓细胞中上调Bv8的作用。将BM CD11b+Gr1+与20或2500pg/mlG-CSF一起在含氧或缺氧(1％O2)条件下培育4小时。f.注射G-CSF后BM中的Bv8水平显著升高。在第0天给Balb-c小鼠皮下注射G-CSF且每日注射持续8天。在第1、3、6和8天采集BM样品并按照描述测量Bv8蛋白的水平。g.抗-G-CSF治疗能够抑制G-CSF诱导的Bv8上调。将新鲜分离的BMMNC与HM7肿瘤裂解产物和所述各种浓度的抗-G-CSF一起培育。通过TaqmanTM监测BMMNC中Bv8的表达。h.抗-G-CSF降低无肿瘤小鼠BM中的Bv8水平。用PBS、对照IgG和抗-G-CSF处理Balb/c裸鼠并按照“方法”章节中所述，用ELISA测量BMMNC中Bv8的水平。i.抗-G-CSF降低HM-7肿瘤小鼠BM中Bv8的水平。参见“方法”章节以了解细节。植入肿瘤或MatrigelTM48小时后按照描述测量BMMNC中Bv8蛋白的水平。j.Bv8在G-CSF诱导的中性白细胞动员中发挥作用。如“方法”章节中所述，在12小时内用包括抗-G-CSF、抗-Bv8、对照Mab和对照IgG抗体在内的各种试剂i.p.处理Balb/c裸鼠两次。最后一次注射6小时后采集所有小鼠的血样，并按照描述在FACSCalibur流式细胞计数仪(Becton Dickinson)中测定CD11b+Gr1+细胞的频率。
图2.抗-Bv8抗体对植入裸鼠的肿瘤细胞系生长的影响根据本文描述，将A673(a)、HM7(b)、HPAC(c)和Jurkat(d)肿瘤细胞植入Balb-c裸鼠。接种肿瘤细胞24-48小时后开始用对照(抗-Ragweed)、抗-Bv8Mab或抗-VHGF-A Mab(n＝10)治疗。每周测量两次肿瘤体积。实验结束时测量肿瘤重量。数据表示为平均值±SEM。星号表示与对照治疗组相比抗-Bv8或抗-VEGF组显著不同(p＜0.05)。e.抗-Bv8和抗-VEGF对于抑制抗-VEGF耐药性肿瘤的生长有加成效应。给灰褐色裸鼠植入TIB42细胞并用对照、抗-Bv8抗体、抗-VEGF抗体和抗-Bv8抗体+抗-VEGF抗体处理。插图显示了所有四种治疗的最终肿瘤重量。C：对照，AV：抗-VEGF，AB：抗-Bv8。
图3.在一些模型中抗-Bv8治疗减少了PB和肿瘤中的CD11b+Gr1+细胞a和b.裸鼠(n＝5)被植入A673、Calu6、HM7、HPAC和Jurkat细胞。然后按照“方法”章节中的描述用抗-Bv8Mab或对照Mab处理小鼠。植入肿瘤10天后进行分析，并按照描述测量PB(a)和肿瘤(b)中CD11b+、Gr1+和CD11b+Gr1+细胞的频率。(a)部分的插图显示了MatrigelTM小鼠中CD11b+、Gr1+和CD11b+Gr1+细胞的频率。c和d.肿瘤内注射BMCD11b+Gr1+可克服抗-Bv8治疗造成的肿瘤生长抑制。给裸鼠植入A673(c)和HM7(d)肿瘤并用抗-Bv8Mab或对照Mab处理。在第7天(用箭头表示)，用CD11b+珠从用A673和HM7肿瘤初次免疫的小鼠BM中分离CD11b+Gr1+细胞。将纯化的细胞群直接注入携带肿瘤的小鼠并按照描述继续治疗。
图4.Bv8调节肿瘤血管生成按照描述给免疫缺陷小鼠植入5×106HM7细胞。植入5天后给小鼠注射107pfu Av-Bv8、Av-VEGF或Av-LacZ。a.所有经处理的最终肿瘤体积测量值表明，与Av-LacZ肿瘤相比，Av-Bv8肿瘤和Av-VEGF肿瘤的体积显著不同。b.与Av-VEGF和Av-LaczZ动物相比，Av-Bv8处理的小鼠外周血(PB)中的CD11b+Gr1+细胞频率较高。c和d.Micro-CT分析显示，与注射LacZ的小鼠相比，注射Bv8-腺病毒和VEGF-腺病毒的小鼠血管体积增加(c)。e.显示注射了Av-LacZ、Av-VEGF和Av-Bv8的肿瘤的示意图。血管网和肿瘤分别用红色和灰色显示。f.抗-Bv8Mab处理通过影响肿瘤脉管系统而抑制肿瘤生长。给裸鼠植入HM7细胞并用抗-Bv8抗体、抗-VEGF抗体或对照抗体处理。与图2b所示数据一致，与对照相比，抗-Bv8和抗-VEGF处理都导致显著的肿瘤生长抑制。g.与抗-VEGF处理和对照相比，抗-Bv8处理降低了PB中循环CD11b+Gr1+的频率。h和i.上述Micro-CT法显示，与对照处理的小鼠相比，抗-Bv8处理小鼠的血管体积(h)和血管密度(i)显著降低。抑制程度类似于抗-VEGF处理。j.抗-Bv8、抗-VEGF和对照处理获得的典型Micro-CT血管造影数据。血管网和肿瘤分别用红色和灰色显示。
图5.抗-VEGF处理降低Bv8表达a-d.按照描述给裸鼠植入HM7细胞并用抗-VEGF或对照Mab处理。在肿瘤植入1、3、6、9、12和15天后测量BM(a)、PB(b)、脾(c)和肿瘤(d)中的Bv8蛋白浓度。所有实验在植入MatrigelTM的小鼠和初次接受实验的小鼠中平行进行。e.IHC数据进一步证实植入A673和HM7的动物中中性白细胞的浸润。从携带A673或HM7并用对照、抗-Bv8抗体或抗-VEGF抗体处理15天的小鼠获得福尔马林固定切片。按照“方法”章节中的描述用抗-Gr1抗体染色切片。f.CD11b+细胞是肿瘤中Bv8的主要来源。给灰褐色裸鼠植入A673、Calu-6、HM7、HPAC和Jurkat细胞并在植入肿瘤细胞10天后实施安乐死。按照描述用CD11b微珠分离富含CD11b+的细胞群。用小鼠Bv8转录物特异性TaqmanTM引物分析Bv8的表达。用小鼠GAPDH对数据进行标准化。
图6.抗-Bv8对抗-VEGF或细胞毒化疗具有加成效应a和b.在肿瘤发展早期开始抗-Bv8处理通常是有效的。给裸鼠植入HM7(a)和A673(b)肿瘤，不接受任何处理直到肿瘤达到约400mm3。然后用对照、抗-Bv8、抗-VEGF或抗体的组合(抗-VEGF+抗-Bv8)处理小鼠。按照描述测量肿瘤体积。*表示联合治疗和抗-VEGF单一疗法之间的肿瘤体积有显著差异(p＜0.05)。c和d.当与抗-VEGF联合使用时抗-Bv8对抗-VEGF耐药性肿瘤具有加成效应。给裸鼠(c)和C57B1/6(d)小鼠植入EL4细胞并用对照、抗-Bv8、抗-VEGF或其组合进行处理。按照描述测量肿瘤体积和最终肿瘤重量。*表示与对照相比，各单一疗法或联合疗法中的肿瘤体积显著不同(p＜0.5)。当将联合治疗与各种单一疗法对比时肿瘤体积的差异也是显著的。e.顺铂和抗-VEGF处理提高Bv8的血清浓度。给灰褐色裸鼠植入A673细胞并用PBS、顺铂(5mg/kg)+对照抗体、顺铂+抗-Bv8、顺铂+抗-VEGF或者顺铂、抗-Bv8和抗-VEGF的组合进行处理。通过ELISA测量血清Bv8蛋白浓度。f.化疗+抗-VEGF和抗-Bv8能有效抑制已形成的A673肿瘤的生长。给灰褐色裸鼠注射A673细胞并在植入肿瘤细胞13天后进行上述处理。*表示联合治疗与顺铂+对照之间有显著差异(p＜0.05)。
图7.编码人Bv8同源物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。粗体和下划线表示各起始密码子和终止密码子的位置。
图8.源自编码序列SEQ ID NO：1的人Bv8同源物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。认定的信号序列包含氨基酸1-21。
图9.编码人Bv8同源物选择性剪接形式的cDNA的核苷酸序列(SEQIDNO：3)。粗体和下划线表示各起始密码子和终止密码子的位置。
图10.源自编码序列SEQ ID NO：3的人Bv8同源物多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)。
图11.小鼠Bv8同源物的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。粗体和下划线表示各起始密码子和终止密码子的位置。
图12.源自编码序列SEQ ID NO：5的小鼠Bv8同源物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图13.小鼠Bv8同源物(SEQ ID NO：37)和人Bv8同源物(SEQ ID NO：2)的比对。框出了潜在的肝素结合域。如图所示，该结构域不存在于选择性剪接转录物中。小鼠和人Bv8同源物大约96％相同。
图14.用纯化的人血液细胞和新鲜的骨髓细胞体外调节Rv8表达。细胞用10ng/ml的各种细胞因子或趋化因子处理4小时，之后提取RNA并用Taqman分析Bv8表达。所有数据用内部对照基因RPL19进一步标准化为变化倍数，以未处理样品作为1。如“材料和方法”章节中所述，该研究采用20位未接受药物的不同的人供体。右侧显示通过FACS获得的纯化细胞及其标记物表达的典型图像。(A)新鲜骨髓细胞，(B)中性白细胞，(C)单核细胞，(D)淋巴细胞。***与未处理对照相比p＜0.01。
图15.人骨髓细胞和中性白细胞中的各种G-CSF-相关细胞因子对Bv8受体PKR2/EG-VEGFR2表达的调节。用各种G-CSF-相关细胞因子处理(A)新鲜分离的中性白细胞或(B)骨髓细胞。体外培育4小时后收集细胞并提取RNA以便通过Taqman分析PKR2/EG-VEGFR2表达。将RL19用作内部对照基因进行标准化。用3位独立健康供体完成实验。显示了对来自各独立供体的细胞因子的应答以及3位供体的平均表达水平，然后绘制在插图中。***与未处理对照相比p＜0.01。
图16.经G-CSF处理的供体的单核细胞中，Bv8和PKR2/EG-VEGFR2未被上调。将G-CSF处理个体(n＝12)和未处理个体(n＝11)(未配对)来源的白细胞简单冲洗并沉淀，然后提取RNA或用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解。对Bv8(A)、PKR2/EG-VEGFR2表达(C)和特异性人Bv8ELISA(B)进行Taqman分析。对于Taqman，数据用RLP19表达标准化，对于ELISA，数据用总蛋白浓度标准化。***与未处理对照相比p＜0.01。
图17.人中性白细胞产生的Bv8蛋白的表征。(A)按照“材料和方法”章节中所述分离和溶解人中性白细胞。按照描述将裂解产物施加于肝素-琼脂糖柱。在约0.4M NaCl时洗脱的馏分9、10和11具有最高水平Bv8。本文所示数据代表3次独立分离结果。(B)人中性白细胞来源的纯化的人Bv8的生物学活性。用PKR1/EG-VEGFR1转染的GeneBLAzer NFAT-CHO细胞来检测Bv8-诱导的下游G蛋白偶联受体信号传导途径的活化。用20ng/ml的重组人Bv8作为阳性对照，用200ng/ml的人VEGF作为阴性对照。将数据进一步标准化为倍数变化，以未处理孔作为1。***与未处理或缓冲液对照相比p＜0.01。进行三次独立研究。
图18.应答Bv8的中性白细胞迁移。将悬浮于含0.2％BSA的HBSS中的106个中性白细胞加入孔径为5μm的细胞培养插入皿(transwell insert)中。在下室中仅加入培养基或者培养基和纯化的重组人Bv8(0.2pM-20nM)或者各种浓度(最高20nM)的其它已知趋化因子，如SDF-1α。37℃培育3小时后对下室内的细胞进行计数并进一步标准化为增加倍数，以未处理样品作为1。实验在6名健康供体上进行。
补充图1.BMMNC生成的Bv8蛋白的表征。a.按照实施例1的“材料和方法”部分所述，分离和溶解来自小鼠骨髓的单核细胞(BMMNC)。将裂解产物施加于用20mM Tris pH7.2、50mM NaCl预平衡的肝素-琼脂糖TM柱。按照“材料和方法”中所述用NaCl梯度洗脱该柱。通过ELISA测量各馏分中的Bv8浓度。在约0.4M NaCl时洗脱出的馏分13和14具有最高水平Bv8。b.与ELISA数据一致，Western印迹分析显示馏分13和14最富含Bv8。
补充图2.G-CSF是正常小鼠和肿瘤携带小鼠中Bv8表达的关键调节物。a.注射G-CSF之后血清中的Bv8水平显著提高。在第0天给Balb-c裸鼠i.p.注射G-CSF，之后的8天每天注射。在第1、3、6和8天采集样品。b.上述实验的中性白细胞计数显示经G-CSF处理小鼠的循环中性白细胞数目增加。c和d.Balb/c裸鼠用PBS、对照IgG和抗-G-CSF连续处理8天，并按照描述用FACS染色测定外周血(PB)中CD11b+Gr1+细胞的频率(c)和BM中CD11b+Gr1+细胞的频率(d)。e和f.Balb/c裸鼠用抗-G-CSF或对照IgG抗体预处理，12小时后植入肿瘤-MatrigelTM。携带MatrigclTM和肿瘤的小鼠用抗-G-CSF或对照IgG连续处理2天。在最终分析时用FACS检测PB中CD11b+Gr1+的频率(e)和BM中CD11b+Gr1+的频率(f)。
补充图3.a.Bv8诱导CD11b+Gr1+骨髓细胞穿孔迁移。对照为PBS或培养基。b和c.BMMNC中Bv8受体的表达。按照描述给灰褐色裸鼠植入A673、HM7、HPAC或Calu-06细胞。10天后从BM分离CD11b+Gr1+骨髓细胞并进行TaqmanTM分析以检测骨髓和非骨髓肿瘤(CD11b-Gr1-)亚组和植入MatrigelTM的小鼠中EG-VEGFR的表达。该分析显示，在BMMNC中，EG-VEGF/PK-R2(c)的表达高于EG-VEGF/PK-R1(b)。d.Bv8改变了骨髓细胞祖细胞群(CD11b+Gr1+)的命运，同时抑制Lin群体的细胞死亡。将从灰褐色裸鼠的BMMNC分离的Lin组分与Bv8一起培育5天，并用FACSCalibur仪器评估CD11b+Gr1+细胞的频率。此外，进行7AAD染色以测量每次处理中死亡细胞的数目。e.Bv8诱导祖细胞的克隆形成能力。Lin群体用Bv8或PBS处理5天，铺在甲基纤维素上(7500细胞/孔)并在5％CO2、37℃下培育15天。差异集落计数和总集落计数显示Bv8处理细胞的克隆能力较强。f.Bv8是骨髓群的存活因子。从灰褐色/裸鼠BMMNC分离的CD11b+Gr1+细胞在培养基中培养并用Bv8(300ng/ml)处理5天。用7AAD染色在FACSCalibur仪中测量细胞死亡。g和h.不连续抗-Bv8处理导致肿瘤生长加速。给小鼠植入A673肿瘤(e)或HM7肿瘤(f)并按照描述用抗-Bv8或对照抗体处理。植入7天后停止处理，如图中箭头所示。i和j.不连续抗-Bv8处理导致CD11b+Gr1+细胞对A673肿瘤(i)和HM7肿瘤(j)反弹。
补充图4.抗-Bv8抗体对非肿瘤携带小鼠血细胞生成的影响。Balb/c裸鼠用PBS、对照抗体或治疗剂量的抗-Bv8抗体处理3周。分析体重(a)、器官重量(b)以及BM(c)、脾脏(d)和PB(e)中的骨髓细胞系和淋巴细胞系。
补充图5.用抗-Bv8抗体处理降低了A673模型PB和肿瘤内CD11b+Gr1+细胞的数目。给灰褐色/裸鼠植入5×106个A673细胞，并在植入48小时后开始接受每周两次抗-Bv8处理。在不同时间点(即植入后5天、10天、19天和29天)监测抗-Bv8和对照处理小鼠的CD11b+(数据未显示)、Gr1+(数据未显示)和CD11b+Gr1+细胞动力学。a.从各治疗组分离BMMNC并按照实施例1“材料和方法”部分所述进行染色。b。在各时间点采集小鼠血液并用FACSCalibur测量CD11b+Gr1+的频率。c.对肿瘤细胞单独计数并将CD11b+Gr1+细胞的频率乘以肿瘤细胞的总数以得到CD11b+Gr1+细胞的数目。星号表示在各时间点当将抗-Bv8处理小鼠与相应的对照处理群体比较时显著不同(p＜0.05)。
补充图6.肿瘤携带小鼠中CD11b、Gr1和CD11b+Gr1+细胞群的典型FACS曲线。给灰褐色裸鼠(n＝5)植入5×106个A673、Calu6、HM7、HPAC或Jurkat细胞。按照实施例1“材料和方法”部分所述用抗-Bv8或对照Mab处理小鼠。植入肿瘤10天后分析小鼠并按照描述测量BM、PB、肿瘤和脾中CD11b+、Gr1+和CDb11+Gr1+细胞的频率。
补充图7.肿瘤植入提高了BM和脾中CD11b+Gr1+的频率。给灰褐色裸鼠(n＝5)植入5×106个A673、Calu6、HM7、HPAC或Jurkat细胞。按照“材料和方法”的描述用抗-Bv8对照Mab处理小鼠，然后从肿瘤携带小鼠分离BM或脾细胞并用抗-G11和抗-CD11b染色。各图代表BM(a)和脾(b)中CD11b+、Gr1+和CD11b+Gr1+细胞的百分比。右上方的插图显示了MatrigelTM-植入小鼠中CD11b+、Gr1+和CD11b+Gr1+细胞的频率。c.抗-Bv8处理降低了BMMNC和脾细胞的克隆形成能力。给裸鼠植入A673和HM7细胞，然后按照描述用抗-Bv8或对照抗体处理。肿瘤植入10天后从肿瘤携带小鼠收获BMMNC和脾细胞并接种供CFU测定。
补充图8.Bv8促进TAEC管道形成且不刺激肿瘤细胞生长。a.Bv8在体外诱导内皮细胞管道形成。将TAEC接种在涂布有MatrigelTM的平板上，然后与基础培养基(对照，Bv8或VEGF-A，含或不含抗-Bv8，如实施例1“材料和方法”所述)一起培育。各图(相差；最初放大20X)显示，培育36小时后出现内皮管道。b.TAEC表达常规内皮细胞标记物。通过流式细胞术(数据未显示)和RT-PCR在TAEC、皮肤内皮细胞(SkEC)、上皮细胞和成纤维细胞中使用CD31、VEGFR2、TIE2、VE-CADH、CK8和E-CDH来确认用于这些实验的TACE的身份。GAPDH被用作内部对照。c.TAEC应答Bv8刺激激活MAPK信号传导。在37℃用Bv8(200ng/ml)、VEGF(阳性对照；40ng/ml)、完全培养基(CM)或模拟物(0.5％DSA)将细胞处理5、10和20分钟。通过实施例1“材料和方法”章节所述的Western印迹分析检测到Bv8处理孔内的磷酸化MAPK(P-MAPK)，而模拟物(PBS)处理未诱导P-MAPK活化。d.Bv8不诱导肿瘤细胞增殖。A673、Calu-6、HM7和HPAC细胞用不同浓度的重组Bv8处理，然后用BrdU脉冲。通过BrdU掺入将增殖量化。
补充图9.a.Bv8促进肿瘤血管生成。在肿瘤植入5天后向HM7-肿瘤携带小鼠瘤内施用单剂量的Ad-LacZ、低效价Av-Bv8、高效价Av-Bv8、和Av-VEGF。输注腺病毒4天后用MECA-32染色肿瘤切片以测量血管表面积。b.抗-Bv8处理抑制肿瘤血管生成。给灰褐色裸鼠植入Jurkat细胞并用对照(图a-c)、抗-Bv8(图d-f)和抗-VEGF(图g-i)抗体处理。注意抗-Bv8或抗-VEGF处理对肿瘤血管生成的显著抑制。小图a、b、d、e、g、h是H&E染色，小图c、f、i是MECA-32染色(肿瘤区域用星号表示)。
补充图10.Bv8对肿瘤生长的作用。通过释放G-CSF、IL-6和SDF-1等趋化因子和细胞因子，肿瘤细胞和肿瘤相关基质发出信号引起Bv8在BM中的上调。Bv8可通过自分泌(autokrine)和旁分泌机制放大G-CSF引起的骨髓细胞动员。已知肿瘤坏死可促进骨髓细胞浸润。骨髓细胞通过各种机制向肿瘤集中，可在局部产生Bv8，这又直接刺激了内皮细胞增殖和血管生成。细胞因子、缺氧和抗-VEGF治疗也可导致肿瘤微环境内的骨髓细胞增加Bv8表达。肿瘤浸润的骨髓细胞产生的Bv8也可对BM发出信号以进一步促进动员、透皮迁移和骨髓细胞向肿瘤集中。
补充表1.从异种移植物分离并培养的人肿瘤细胞或肿瘤相关小鼠成纤维细胞的条件化培养基内的细胞因子水平。
补充表2.用10ng/ml的G-CSF或GM-CSF处理4小时的各种细胞系。随后提取RNA并进行Taqman分析，用RPL19作为管家基因进行标准化。显示了改变倍数，以未处理作为1。***与未处理对照相比p＜0.01。进行了三次独立研究。
发明详述
在详细描述本发明之前应理解，本发明不限于特定组合物或生物系统，它们当然是可变的。还应理解，本文使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的而并非意图进行限制。在本说明书和附加的权利要求书中，除非另有说明，单数形式包括复数指代。因此，例如，当提及“一个分子”时任选包括两个或多个此类分子的组合，等等。
A.定义
术语“Bv8”、“Bv8同源物”、“前动力蛋白-2”(也称为“PK2”、“KAL4”和“MIT1”)在文中可互换使用，表示天然序列、Bv8多肽、Bv8变体以及嵌合Bv8，上述各术语在这里定义。
Bv8核酸是编码Bv8多肽的RNA或DNA，如上文所定义，或与这种DNA或RNA杂交并在严格杂交条件下保持与之稳定结合且长度大于约10个核苷酸。严格条件为：(1)采用低离子强度和高洗涤温度，例如，0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，50℃；或(2)在杂交期间采用变性剂如甲酰胺，例如，50％(体积/体积)甲酰胺+0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5+750mMNaCl，75mM柠檬酸钠，42℃。
当核酸与另一核酸序列发生功能性关系时它们是操作性相连的。Bv8核酸可操作性连接于载体中的另一核酸序列，从而可在特定宿主生物中表达。这可通过本领域熟知的方法完成。例如，如果作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则将前序列或分泌性前导序列的DNA操作性连接于多肽DNA；如果影响编码序列转录，则将启动子或增强子操作性连接于该序列；或者，如果将其定位有助于翻译，则将核糖体结合位点操作性连接于编码序列。通常，“操作性连接”表示各DNA序列是毗连的，对于分泌性前导序列，则是毗连的且处于阅读相。然而，增强子不需要毗连。连接可通过在常规的限制性位点结合而实现。如果不存在这种位点，则可按照常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。
“天然序列Bv8”包含具有与天然Bv8相同的氨基酸序列的多肽，与其制备方式无关。因此，天然序列Bv8可具有天然形成的人Bv8、鼠Bv8、或任何其它哺乳动物种类来源的Bv8的氨基酸序列。例如，全长天然序列人Bv8氨基酸序列示于图8(SEQ ID NO：2)。第二全长天然序列人Bv8示于图10(SEQ ID NO：4)。这两种序列是编码常规肝素结合域的外显子选择性剪接的结果。因此，具有图8所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的天然序列人Bv8包含肝素结合域，而图10所示天然序列Bv8(SEQ ID NO：4)则不包含。天然序列小鼠Bv8氨基酸序列示于图12(SEQ ID NO：6)。已公开了人和鼠的Bv8序列，例如，描述于Wechselberger等，(FEBS Lett.462：177-181(1999))和Li等，(Mol.Pharm.59：692-698(2001))。这种天然序列Bv8可从天然物质中分离或者可通过重组和/或合成方法制备。术语“天然序列Bv8”具体包括天然产生的Bv8的前原形式、前形式和成熟形式以及截短形式，天然产生的变体形式(例如选择性剪接形式，如图10所示(SEQ ID NO：4))，以及天然产生的等位基因变体。一种优选的天然序列Bv8是如图8所示的全长天然序列人Bv8(SEQ ID NO：2)。
“Bv8变体”是生物学活性Bv8多肽，通过插入、删除、修饰和/或取代天然序列中的一个或多个氨基酸残基导致其氨基酸序列不同于天然序列Bv8多肽，如图8、10和12所示人和鼠Bv8的序列(SEQ ID NO：2，4和6)。Bv8变体与天然序列Bv8(如图8的人Bv8(SEQ ID NO：2))的序列同一性通常小于100％。然而，生物学活性Bv8变体的氨基酸序列与天然产生的Bv8(如图8的人Bv8(SEQ ID NO：2))的氨基酸序列通常有至少约70％氨基酸序列同一性，优选至少约75％、更优选至少约80％、再优选至少约85％、再优选至少约90％、进一步优选有至少约95％到至少约99％的氨基酸序列同一性，以1％递增。所述Bv8变体包括保留相应天然序列Bv8多肽生物学活性的至少5个氨基酸的肽片段。Bv8变体还包括在天然Bv8序列的N-或C-末端或者两端加入一个或多个氨基酸残基的Bv8多肽。Bv8变体还包括许多氨基酸残基被删除或任选被一个或多个氨基酸残基取代的Bv8多肽。Bv8变体还可以被共价修饰，例如通过用非天然产生的氨基酸的部分进行取代，或者通过修饰氨基酸残基以产生非天然产生的氨基酸。Bv8变体可包括肝素结合域。
通常，多肽“变体”(即本文所述任何多肽的变体)表示与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。这种变体包括，例如，在多肽的N-和/或C-末端加入或删除了一个或多个氨基酸(天然产生的氨基酸和/或非天然产生的氨基酸)残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约90％氨基酸序列同一性，或者至少约95％或者更高的氨基酸序列同一性。变体还包括通常具有生物学活性的天然序列的多肽片段(例如，亚序列、截短序列，等等)。
“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数，需要将序列进行比对(如需要，还要引入缺口)，以实现最大序列同一性百分数，且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可用本领域已知的各种方法实现旨在测定氨基酸序列同一性百分数的比对，例如使用公开可得到的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定合适的测定比对的参数，包括任何实现对被比序列全长进行最大比对所需的算法。然而为了本文的目的，如下所述使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genetech，Inc.编写的，已与用户记录一起提交给了美国版权局(华盛顿哥伦比亚特区，20559)，注册为美国版权登记号TXU510087，公众可从Genentech，Inc.(南圣弗朗西斯科，加州)获得。ALIGN-2程序应汇编用于UNIX操作系统，例如数字UNIX V4.00。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。
为了本文的目的，给定氨基酸序列A与、或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(也可表述为给定氨基酸序列A对、与或相对于氨基酸序列B具有或包含一定的％氨基酸序列同一性)计算如下：
分数X/Y乘以100
其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，而Y是B中氨基酸残基总数。应理解氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，A对B的％氨基酸序列同一性不等于B对A的％氨基酸序列同一性。
“嵌合Bv8”分子是与异源多肽融合或结合的包含全长Bv8或其一个或多个结构域的多肽。嵌合Bv8分子通常具有至少一种与天然产生的Bv8相同的生物学特性。嵌合Bv8分子的一个实例是为了纯化目的被表位标记的分子。另一种嵌合Bv8分子是Bv8免疫粘附素。
术语“表位标记的”在本文中表示包含与“标记多肽”融合的Bv8嵌合多肽。标记多肽具有足够的残基，可以提供能够产生针对性抗体的表位，但又足够短而不影响Bv8的生物学活性。标记多肽优选是非常独特的以便其抗体基本不与其它表位发生交叉反应。合适的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基，且通常有约8-50个氨基酸残基(优选约9-30个残基)。优选多聚组氨酸序列，该序列与镍结合，从而根据描述能够通过Ni-NTA层析法分离标记的蛋白质(参见，例如，Lindsay等，Neuron17：571-574(1996))。
“分离的Bv8”表示已经从Bv8来源纯化的或者已经通过重组或合成方法制备并纯化的Bv8。纯化的Bv8基本不含其它多肽或肽。“基本不含”在文中表示其它来源蛋白质污染低于约5％、优选低于约2％、更优选低于约1％、再优选低于约0.5％、最优选低于约0.1％。
“基本纯的”蛋白质表示某组合物基于组合物的总重含有至少约90％重量蛋白质，优选至少约95％重量、更优选至少约90％重量、再优选至少约95％重量。“基本同源的”蛋白质表示某组合物基于组合物的总重包含至少约99％重量蛋白质。
术语“拮抗剂”在本文中表示能够中和、阻断、消除、降低或干扰本发明蛋白质活性的分子，如果是配体则包括其与一种或多种受体的结合，或者，如果是受体则包括其与一种或多种配体的结合。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。拮抗剂还包括本发明蛋白质的小分子抑制剂，以及特异性结合所述蛋白质从而阻止该蛋白质与其靶结合的融合蛋白、受体分子和衍生物，所述蛋白质的拮抗剂变体，本发明蛋白质的反义分子，RNA适体，以及针对本发明蛋白质的核酶。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是一种抑制或降低其所结合抗原的生物学活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体充分或完全抑制抗原的生物学活性。
术语“Bv8拮抗剂”在文中表示任何部分或完全阻断、抑制或中和天然序列Bv8在肿瘤发展期间调节骨髓动员和/或促进血管生成的能力的分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗性抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。拮抗剂还包括Bv8的小分子抑制剂，以及特异性结合Bv8从而阻止它与靶标结合的融合蛋白、受体分子和衍生物，Bv8的拮抗剂变体，Bv8的反义分子，RNA适体，以及针对Bv8的核酶。
尤其，Bv8拮抗剂包括但不限于特异性结合天然序列Bv8多肽或天然序列Bv8受体(PKR-1/EG-VEGFR1或PKR-2/EG-VEGFR2)多肽的抗体和抗体片段。鉴定Bv8多肽拮抗剂的方法可包括使Bv8多肽接触候选拮抗剂分子并测量Bv8在调节骨髓细胞动员和/或促进肿瘤血管生成能力方面的可检测改变。
出于本文的目的，“活性”与Bv8或G-CSF一起使用时表示保留了原始或天然形成的Bv8或G-CSF的生物学和/或免疫活性的Bv8或GOCSF形式，其中，“生物学”活性表示由原始或天然形成的Bv8或G-CSF产生的除针对抗原性表位诱导生成抗体的能力之外的生物学功能(抑制性或刺激性)，而“免疫”活性表示由原始或天然形成Bv8或G-CSF产生的针对抗原性表位诱导生成抗体的能力。优选的Bv8生物学活性是调节骨髓细胞动员和/或促进肿瘤血管生成的能力。
“Bv8受体”是被Bv8结合并介导Bv8生物学特性的分子。因此，术语“Bv8受体”的含义包括PKR1/EG-VEGF受体-1和PKR2/KG-VEGF受体-2(LeCouter等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci USA，100：2685-2690；Lin等，2002，J.Biol.Chem.，277：19276-19280；Masuda等，2002，Biochem.Biophys.Res.Commim.，293：396-402)。
术语“VEGF”在文中表示天然序列的血管内皮生长因子及其变体。
术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，表示天然序列165个氨基酸血管内皮细胞生长因子以及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸血管内皮细胞生长因子，描述于例如Leung等，Science，246：1306(1989)，llouck等，Mol Endocrin.，5：1806(1991)，以及Robinson &Stringer，Journal of Cell Science，144(5)：853-865(2001)，以及天然产生的等位形式及其加工形式，以及它们的变体。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF在内的基因家族的一员。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是血管内皮细胞促分裂信号的主要递质。术语“VEGF”或“VEGF-A”还表示来自非人种类如小鼠、大鼠或灵长类的VEGF。该术语有时还表示特定种类来源的VEGF，如hVEGF表示人VEGF，或者mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用来表示多肽的截短形式或片段，包括165个氨基酸人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8-109或1-109。例如，在本申请中可以用“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”表示任何一种此类形式的VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置按照其在原始VEGF序列中的位置编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF对KDR和Flt-1受体的结合亲和力与天然序列VEGF类似。
“VEGF拮抗剂”表示能够中和、阻断、消除、降低或干扰天然序列VEGF活性的分子(肽酰或非-肽酰)，包括结合了一个或多个VEGF受体的分子。VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体及其抗原结合片段、受体分子和衍生物，它们特异性结合VEGF从而阻止VEGF结合一种或多种受体(例如，可溶性VEGF受体蛋白、或者其VEGF结合片段、或者嵌合VEGF受体蛋白)，抗-VEGF受体抗体以及VEGF受体拮抗剂如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂，以及融合蛋白，例如，VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121-白树毒蛋白(Peregine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF的拮抗剂变体、VEGF的反义分子、RNA适体、以及针对VEGF或VEGF受体的核酶。用于本发明方法的VEGF拮抗剂还包括特异性结合VEGF的肽酰或非肽酰化合物，如抗-VEGF抗体以及它的抗原结合片段、多肽或者其特异性结合VEGF的片段；与VEGF多肽编码核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚物；与VEGF多肽编码核酸分子的至少一个片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；VEGF的肽融合蛋白(peptibody)；以及VEGF适体。在一个实施方案中，所述VEGF拮抗剂以至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的水平降低或抑制VEGF的表达水平或生物学活性。在另一个实施方案中，被VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
术语“抗-VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”表示能够以足够的亲和力和特异性结合VEGF的抗体，该抗体被用作靶向VEGF的诊断和/或治疗试剂。例如，本发明的抗-VEGF抗体可用作靶向并干扰涉及VEGF活性的疾病或症状的治疗剂。参见，例如，美国专利6,582,959、美国专利6,703,020、WO98/45332、WO 96/30046、WO94/10202、WO2005/044853、EP 0666868B1，美国专利申请20030206899、20030190317、20030203409、20050112126、20050186208和20050112126；Popkov等，Journal ofImmunological Methods 288：149-164(2004)；以及WO2005012359。选择的抗体对VEGF将通常具有足够强的结合亲和力，例如，抗体结合hVEGF的Kd值可介于100nM-1pM。测定抗体亲和力时可采用，例如，基于表面质子共振的实验(如在PCT申请公开号WO2005/012359中描述的BIAcoreTM实验)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、以及竞争实验(例如RIA)。可对抗体进行其它生物学活性实验，例如评价其治疗功效。这种实验是本领域已知的，同时取决于靶抗原和抗体的目的用途。实例包括HUVEC抑制实验、肿瘤细胞生长抑制实验(如WO89/06692中所述)、依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)实验(美国专利5,500,362)、以及拮抗活性或血细胞生成实验(见WO95/27062)。抗-VEGF抗体通常不结合其它VEGF同源物如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不结合其它生长因子如PIGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗-VEGF抗体包括：与杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗-VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；按照Presta等，(1997)Cancer Res.57：4593-4599所述方法产生的重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，包括但不限于此被称为“贝伐单抗(BV)”的抗体，也称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN”。贝伐单抗包含变异的人IgG1框架区和阻断人VEGF与其受体结合的鼠抗-hVEGF单克隆抗体A.4.6.1来源的抗原结合互补性决定区。大约93％的贝伐单抗氨基酸序列，包括框架区的大部分，来源于人IgG1，而约7％的序列来源于鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗的分子量约为149,000道尔顿，并且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗-VEGF抗体进一步描述于2005年2月26日公开的美国专利6,884,879。其它优选的抗体包括PCT申请公布号WO2005/012359中所述的G6或B20系列抗体(例如，G6-23、G6-31、B20-4.1)。其它优选抗体可参见美国专利7,060,269、6,582,959、6,703,020、6,054,297，WO98/45332、WO96/30046、WO94/10202、EP 0666868B1，美国专利申请公布号2006009360、20050186208、20030206899、20030190317、20030203409和20050112126，以及Popkov等，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。
本发明所述的“G6系列抗体”是衍生自G6抗体或G6-衍生抗体的序列的抗-VEGF抗体，如PCT申请公开号WO2005/012359的图7、24-26和34-35中任一所述。
“造血干/祖细胞”或“原始造血细胞”是一种能够分化成更加定向或成熟的血液细胞类型的细胞。“淋巴血细胞谱系”是那些能够分化形成淋巴细胞(B-细胞或T-细胞)的造血前体细胞。同样，“淋巴细胞生成”表示形成淋巴细胞。“红色血细胞谱系”是那些能够分化形成红细胞(血红细胞)的造血前体细胞，而“红细胞生成”表示形成红细胞。
出于本文的目的，短语“骨髓血细胞谱系”包括除上文定义的淋巴血细胞谱系和红色血细胞谱系之外的所有造血祖细胞，“骨髓生成”包括形成除淋巴细胞和红细胞之外的血液细胞。
骨髓细胞群可富集Gr1+/CD11b+(或CD11b+Gr1+)或Gr1+/Mac-1+骨髓免疫细胞。这些细胞表达巨噬细胞谱系骨髓细胞的标记物CD11b以及粒细胞的标记物Gr1。Gr1+/CD11b+可通过免疫粘附淘选来选择，例如用Gr1+的抗体选择。
“骨髓细胞减少剂”表示减少或消除骨髓细胞群的试剂。通常，骨髓细胞减少剂将减少或消除骨髓细胞、CD11b+Gr1+、单核细胞、巨噬细胞等等。骨髓细胞减少剂的实例包括但不限于：Gr1+拮抗剂、CD11b拮抗剂、CD18拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂、MIP-1α拮抗剂，等等。
术语“Gr1拮抗剂”在本文中表示结合Gr1并抑制或充分降低Gr1生物学活性的分子。Gr1拮抗剂的非限制性实例包括：抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。在本发明的一个实施方案中，所述Gr1拮抗剂是抗体，尤其是结合人Gr1的抗-Gr1抗体。
术语“CD11b拮抗剂”在本文中表示结合CD11b并抑制或充分降低CD11b生物学活性的分子。通常，该拮抗剂将(部分或完全)阻断细胞(例如未成熟的骨髓细胞)在其细胞表面表达CD11b亚单位以结合内皮的能力。CD11b拮抗剂的非限制性实例包括：抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。在本发明的一个实施方案中，所述CD11b拮抗剂是抗体，尤其是结合人CD11b的抗-CD11b抗体。示例性的CD11b抗体包括MY904(美国专利4,840,793)、1B6c(参见Zhang等，Brain Research 698：79-85(1995))、CBRN1/5和CBRM1/19(WO94/08620)。
术语“CD18拮抗剂”在本文中表示结合CD18(优选人CD18)并抑制或充分降低CD18生物学活性的分子。通常，该拮抗剂将(部分或完全)阻断细胞(例如中性白细胞)在其细胞表面表达CD18亚单位以结合内皮的能力。CD18拮抗剂的非限制性实例包括：抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。在本发明的一个实施方案中，所述CD18拮抗剂是抗体。
抗-CD18抗体的实例包括：MHM23(Hildreth等，Eur.J.Immunol，13：202-208(1983))、M18/2(IgG2a；Sanches-Madrid等，J.Exp.Med.158：586-602(1983))、H52(美国模式培养物保藏所(ATCC)保藏号HB10160)、Mas191c和1OT18(Vermot Desroches等，Scand.J.Immunol.33：277-286(1991))、以及NA-8(WO 94/12214)。在一个实施方案中，该抗体是结合被MHM23或1152结合的CD18表位的抗体。在本发明的一个实施方案中，该抗体对CD18多肽具有高亲和力。在某些实施方案中，该抗体可结合与CD11b结合的CD18胞外域内的区域，且该抗体还可解离a和P链(例如，对于MHM23抗体而言，该抗体可解离CD11b和CD18复合体)。
单核细胞趋化蛋白(MCP-1)是一种参与先天免疫和Th2效应物应答以及CD4+T细胞分化的趋化因子。参见，例如，Paul，W.E.，FundamentalImmunology，第五版，Lippincott Williams & Wilkins，(费城，2003)，第801-840页。
术语“MCP-1拮抗剂”在本文中表示结合MCP-1并抑制或充分降低MCP-1生物学活性的分子。MCP-1拮抗剂的非限制性实例包括：抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。在本发明的一个实施方案中，所述MCP-1拮抗剂是抗体，尤其是结合人MCP-1的抗-MCP-1抗体。
巨噬细胞炎性蛋白α和β(MIP-1α和β)是已知的趋化因子。MIP-1α参与先天免疫和Th1效应物应答以及CD4+T细胞分化。参见，例如，Paul，W.E.，Fundamental Immunology，第五版，Lippincott Williams &Wilkins，(费城，2003)，第801-840页。
术语“MIP-1α拮抗剂”在本文中表示结合MIP-1α并抑制或充分降低MIP-1α生物学活性的分子。MIP-1α拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂以及它们的代谢物、转录和翻译对照序列等等。在本发明的一个实施方案中，所述MIP-1α拮抗剂是抗体，尤其是结合人MIP-1α的抗-MIP-1α抗体。
“URCGP”表示在抗-VEGF耐药性肿瘤来源的CD11b+Gr+1细胞中上调的蛋白质。URCGP包括但不限于：嗜中性白细胞弹性蛋白酶、CD14、expi、I1-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、IL-11R、IL-1RII、IFN TM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌载体膜1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、促血管生成素样蛋白-6、Eph-RA7、脑信号蛋白V1b、神经营养蛋白5、密蛋白-18、MDC 15、ECM和ADAMTS7B。在某些实施方案中，URCGP表示IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13和/或IL-4R。
“DRCGP”表示在抗-VEGF耐药性肿瘤来源的CD11b+Gr+1细胞中下调的蛋白质。DRCGP包括但不限于：THBS1、Crea7、水通道蛋白-1、可溶性载体家族蛋白(SCF38)、载脂蛋白E(APOE)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、NCAM-140、III型纤连蛋白、WIP、CD74、ICAM-2、Jagged 1、Itga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFb IEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-选择蛋白、IL-15、细胞因子信号传导蛋白4抑制剂、Cytor4和CX3CR1。在某些实施方案中，DRCGP表示THBS1和/或Crea7。
“URRTP”表示在抗-VKGF耐药性肿瘤中上调的蛋白质。URRTP包括但不限于：Notch2、DMD8、MCP-1、1TGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、A型清除剂受体、巨噬细胞C型凝集素、Pigr3、巨噬细胞SRT-1、G蛋白偶联受体、ScyA7、IL-1R2、IL-1诱导蛋白、IL-1β和ILIX前体。在某些实施方案中，URRTP表示MSCA、MIP2、IL-8R和/或G-CSF。
“DRRTP”表示在抗-VEGF耐药性肿瘤中下调的蛋白质。DRRTP包括但不限于：IL10-R2、Erb-2.1、窖蛋白3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecam1、Tlr3、TGF-B、FIZZ1、Wfs1、TP 14A、EMAP、SULF-2、胞外基质2、CFFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-α、肝配蛋白B1、SPARC-样蛋白1和脑信号蛋白A。在某些实施方案中、所述DRRTP表示IL10-R2、THBSP-4和/或JAM-2。
术语“检测”的含义很广，包括定性和定量测量靶分子。
术语“生物学样品”表示来自任何动物，但优选来自哺乳动物，更优选来自人的身体样品。这种样品包括生物学液体，如血液、血清、血浆、骨髓、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳汁、全血、尿液、脑脊液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液以及组织培养介质、组织提取物如匀浆组织、以及细胞提取物。本文中优选的生物学样品是血清、血浆、尿液和骨髓样品。
术语“抗体”的含义很广，具体包括单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段(见下文)(只要它们具有所需生物学活性)。
除非另有说明，“多价抗体”的表述在本说明书中表示包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体通常被工程化构建成具有三个或更多抗原结合位点且通常不是天然序列IgM或IgA抗体。
“抗体片段”仅包括完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留了结合抗原的能力。该定义包括的抗体片段的实例包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1域的Fab片段；(ii)Fab′片段，它是在CH1域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1域并在CH1域的C-末端有一个或多个半胱氨酸残基的Fd′片段；(v)具有抗体单臂的VL和VH域的Fv片段；(vi)由VH域构成的dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))；(vii)分离的CDR域；(viii)F(ab′)2片段，这是一种包括两个在绞链区通过二硫桥相连的Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等，Science 242：423-426(1988)；和Huston等，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双特异抗体”，其包括与同一多肽链中的轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)(参见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包括一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.8(10)：10571062(1995)；和美国专利5,641,870)。
术语“单克隆抗体”在文中表示从一群基本同源的抗体(即组成该群的单个抗体是相同的，除了可能有少量存在的天然突变)获得的抗体。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。单克隆抗体是高度特异的，可针对单一抗原。在某些实施方案中，单克隆抗体通常包括包含与靶结合的多肽序列的抗体，其中通过包括从众多多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的方法获得靶结合多肽序列。例如，选择过程可以是从众多克隆如从杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆群中选择独特克隆。应理解，选出的靶结合序列可被进一步改变，例如，增强其与靶的亲和力、将靶结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体，等等，且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与多克隆抗体(通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体)不同，各个单克隆抗体针对抗原上的一种决定子。除了它们的特异性，单克隆抗体制品的优点在于，它们通常未被其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是获自基本同源的抗体群体，而不能解释为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过多种技术制备，例如，杂交瘤法(例如，Kohler和Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等，Antibodies：A laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第二版，1988)；Hammerling等，选自：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(参见，例如，美国专利4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu等，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Dci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)、以及在动物中制备人抗体或人样抗体的技术，所述抗体具有部分或全部的人免疫球蛋白基因座或人免疫球蛋白序列编码基因(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、和5,661,016；Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnol 14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体，其一部分重链和/或轻链与衍生自特定抗体种类或属于特定抗体种类或亚类的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与衍生自其它抗体种类或亚类或者属于其它抗体种类或亚类的相应序列相同或同源，还包括这种抗体的片段，只要它们具有所需生物学活性即可(美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人(例如，鼠科)抗体的“人源化”形式属于嵌合抗体，它含有极少衍生自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者超变区的残基被非人种类(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的具有所需特异性、亲和力和能力的超变区的残基替代。一些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。作出这些修饰进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有或者至少一个、通常为两个可变区，其中所有或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白恒定区。更详细描述可见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。也可参见，例如，Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurlehe Gross，Curr：Op.Biotech.5：428-433(1994)；以及美国专利6,982,321和7,087,409。也可参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已被改变以通过响应抗原攻击产生此类抗体，其内源基因座已被失效，例如被免疫的异种小鼠(参见，例如，涉及XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。也可参见，例如，Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中有关通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
“人抗体”是一种包含与人所产生的抗体和/或已经用本文所述任何一种制备人抗体的技术制备的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。需特别指出，人抗体的定义不包括包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可通过本领域已知的各种技术来制备。在一个实施方案中，所述人抗体选自表达人抗体的噬菌体文库(Vaughan等，Nature Biotechnology14：309-314(1996)：Sheets等，PNAS(USA)95：6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol Biol.，222：581(1991))。也可将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来制备人抗体，例如，可将小鼠的内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活。在抗原攻击后观察到产生人抗体，其在包括基因重排、装配和抗体组成在内的所有方面与在人中观察到的现象极其类似。该方法描述于，例如，美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016，以及以下科技文献：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，可使产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化来制备人抗体(这种B淋巴细胞可从个体回收或者可在体外免疫)。参见，例如，Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；以及美国专利5,750,373。
术语“可变”指可变区某些部分的序列在抗体之间变化很大并可用于各特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的可变区中不是均匀分布的。它集中于轻链和重链可变区中称为超变区的三个区段。可变区更保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包含通过三个超变区(形成连接β-片层结构的环，而在某些情况下形成部分β-片层结构)相连的四个FR(多采取β-片层构型)。各链中的超变区通过FR紧密结合在一起，并与其它链的超变区结合，形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health(国立卫生研究院公众健康服务部)，Bethesda，MD(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示出各种效应功能，如抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
术语“超变区”、“HVR”或“HV”当用于本文时是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语“超变区”表示序列超变和/或形成结构限定环的抗体可变区的某些区域。通常，抗体包含6个HVR；三个位于VH(H1、H2、H3)，三个位于VL(L1，L2，L3)。在天然抗体中，H3和L3是6个HVR中最具多样性的，尤其认为H3在赋予抗体精确特异性方面发挥独特作用。参见，例如，Xu等，Immunity 13：37-45(2000)；Johnson和Wu，选自Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。实际上，天然产生的仅由重链构成的骆驼化(camelid)抗体在缺少轻链时具有功能且稳定。参见，例如，Hamers-Casterman等，Nature363：446-448(1993)；Sheriff等，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
本文包括并使用了许多HVR。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列可变性并且是最常使用的(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterst，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health(国立卫生研究院公众健康服务部)，Bethesda，MD(1991))。相反，Chothia表示结构环的位置(Chothia和Lesk，J Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbMHVR表示Kabat HVR和Chothia结构环之间的妥协，并被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件采用。“接触”HVR是基于对可获得的复杂晶体结构的分析。这些HVR中每一个的残基如下所示。
  环   Kabat   AbM   Chothia   接触
  L1   L24-L34   L24-L34   L26-L32   L30-L36
  L2   L50-L56   L50-L56   L50-L52   L46-L55
  L3   L89-L97   L89-L97   L91-L96   L89-L96
  H1   H31-H35B   H26-H35B   H26-H32   H30-H35B(Kabat编号)
  H1   H31-H35   H26-H35   H26-H32   H30-H35(Chothia编号)
  H2   H50-H65   H50-H58   H53-H55   H47-H58
  H3   H95-H102   H95-H102   H96-H101   H93-H101
HVR可包含以下“延伸HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)以及89-97或89-96(L3)；VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)以及93-102、94-102或95-102(H3)。这些定义中每一个可变区残基按照Kabat等(同上)编号。
“框架区”或“FR”残基是除了上文定义的超变区残基之外的那些可变区残基。
术语“Kabat可变区残基编号”或“Kabat氨基酸位置编号”及其变化形式表示Kabat等(同上)采用抗体编码中用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。采用该编号系统，实际上线性氨基酸序列可包含少量或额外与可变区FR或HVR的缩短形式相对应的氨基酸，或在其中包含插入。例如，重链可变区可包含一个位于H2残基52之后的氨基酸插入(根据Kabat，残基52a)和位于重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c，等等)。某给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定。
在本说明书和权利要求书中，通常采用Kaba编号系统表示可变区残基(大约轻链的残基1-107以及重链的残基1-113)(例如，Kabat等，Sequences of Prpteins of Immunological Interest，第五版，Public HealthService，National Institutes of Health(国立卫生研究院公众健康服务部)，Bethesda，MD(1991))。“EU编号系统”或“EU指数”通常用来表示免疫球蛋白重链恒定区内的残基(例如，EU指数报道于Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health(国立卫生研究院公众健康服务部)，Bethesda，MD(1991)，通过引用将其明确地纳入本文)。除非另有说明，提及抗体可变区的残基编号时表示通过Kabat编号系统进行编号的残基。除非另有说明，提及抗体恒定区的残基编号时表示通过EU编号系统进行编号的残基(例如，参见美国临时申请60/640,323，EU编号的图示)。
可根据抗体(免疫球蛋白)重链恒定区的氨基酸序列将它们分成不同种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分成亚类(同种异型)，例如IgG1(包括非A和A同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同种类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，且通常描述于，例如，Abbas等，Cellular and Mol.Immunology，第四版(W.B.Saundcrs，Co.，2000)。抗体可以是该抗体和一种或多种其它蛋白质或肽通过共价或非共价结合所形成的较大融合分子的一部分。
任何灵长类抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区氨基酸序列归类为称为κ和λ的两种可明确区分的类别之一。
术语“Fc区”用来定义可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体产生的免疫球蛋白重链的C-末端区域。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的界限可以不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为大约从位置Cys226，或者从位置Pro230的氨基酸残基开始延伸，直到Fc区的羧基端。例如，可在制备或纯化抗体时，或者通过重组方法工程构建编码抗体重链的核酸，从而除去Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统为残基447)。因此，完整抗体的组成可包括所有K447残基被除去的抗体群、未除去K447残基的抗体群、以及包含有和没有K447残基的抗体混合物的抗体群。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定区，CH2域和CH3域，并任选包含CH4域。
除非另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号是如Kabat等所述的EU指数(同上)。“如Kabat所述的EU指数”表示人IgG1 EU抗体残基编号。
“Fc区链”在文中表示Fc区两条多肽链之一。
人IgG Fc区的“CH2域”(也称为“Cg2”域)通常从大约231位氨基酸残基延伸到大约340位氨基酸残基。CH2域的独特之处在于它与其它区域不是紧密配对的。相反，两个N-连接的分支碳水化合物链可插入在完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。曾经考虑过碳水化合物可取代域-域配对并帮助稳定CH2域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。CH2域在本文中可表示天然序列CH2域或变体CH2域。
“CH3域”包括从C-末端向Fc区CH2域延伸的残基(即从IgG的约341位氨基酸残基到约447位氨基酸残基)。CH3域在本文中可包括天然序列CH3域或变体CH3域(例如，在其一条链中有引入的“突起”并在其另一条链中有相应的引入“空穴”的CH3域；见美国专利5,821,333，通过引用明确纳入本文)。这种变体CH3域可用来制备本文所述的多特异性(例如双特异性)抗体。
“绞链区”通常定义为从人IgG1的约Glu216或约Cys226向大约Pro230的延伸段(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。可将形成重链内S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置以便将其它IgG同型的绞链区与IgG1序列进行比对。本文所述的绞链区可以是天然序列绞链区或变体绞链区。变体绞链区的两条多肽链在每条多肽链上通常保留至少一个半胱氨酸残基，从而变体绞链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的绞链区是天然序列人绞链区，例如天然序列人IgG1绞链区。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应功能”。示例性的“效应功能”包括C1q结合、依赖于补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。这种效应功能通常要求Fc区与结构域(例如抗体可变区)结合，并且可采用本领域已知的评价各种用于这种抗体效应功能的方法来评价。
“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、以及天然序列人IgG4 Fc区，以及天然产生的它们的变体。
“完整”抗体是一种包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)以及重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。所述恒定区可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选地，所述完整抗体具有一种或多种效应功能。
“亲代抗体”或“野生型”抗体是一种与本文所述抗体变体相比包含缺乏一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列的抗体。因此，亲代抗体通常具有至少一个在氨基酸序列上不同于本文所述抗体变体相应超变区的的超变区。亲代多肽可包括天然序列(即天然产生的)抗体(包括天然产生的等位基因变体)，或具有预先存在的天然产生序列的氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或其它改变)的抗体。文中，“野生型”、“WT”、“wt”和“亲代”或“亲代的”抗体可互换使用。
文中，“抗体变体”或“变体抗体”表示具有不同于亲代抗体氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。优选地，所述抗体变体包含具有自然界未发现的氨基酸序列的重链可变区或轻链可变区。这种变体与亲代抗体的序列同一性必须低于100％。在优选的实施方案中，所述抗体变体与亲代抗体重链或轻链可变区氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性从约75％至低于100％，更优选从约80％至低于100％，更优选从约85％至低于100％，更优选从约90％至低于100％，且最优选从约95％至低于100％。所述抗体变体在其一个或多个超变区内或者附近通常包含一个或多个氨基酸改变。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。在某些实施方案中，与天然序列Fc区或与亲代多肽的Fc区相比，所述变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区内具有约1-10个氨基酸取代，优选约1-5个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区内具有约1-10个氨基酸取代，优选约1-5个氨基酸取代。本文所述变体Fc区与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区通常将具有，例如，至少约80％的序列同一性，或者至少约90％的序列同一性，或者至少约95％或更高的序列同一性。
抗体“效应功能”表示归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，并且在抗体同种型之间是可变的。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和依赖于补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(如B细胞受体)的下调、以及B细胞活化。
“依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”表示一种细胞毒性形式，其中，分泌的Ig结合于某些细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞、中性白细胞和巨噬细胞)上呈递的Fc受体(FcR)，使得这些细胞毒效应细胞能够特异性结合带有抗原的靶细胞并在随后通过细胞毒性杀死靶细胞。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的表3中。为评价感兴趣分子的ADCC活性，可进行如美国专利5,500,362或5,821,337所描述的体外ADCC实验。对这种实验有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或除此之外，可在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clyncs等，PNAS(USA)95：652-656(1998)所述的动物模型内。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并显示效应功能的白细胞。在某些实施方案中，所述细胞至少表达FcγRIII并显示ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性白细胞，通常优选PBMC和NK细胞。效应细胞可按照本文所述从其原始来源，例如从血液或PBMC分离。
“Fc受体”或“FcR”描述的是结合抗体Fc区的受体。在某些实施方案中，FcR是原始人FcR。在某些实施方案中，FcR结合IgG抗体(一种γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII受体亚类，包括那些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别位于其胞质区。活化受体FcγRIIA在其胞质区含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质区含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，(参见，例如，Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述见，例如，Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。本文中，术语“FcR”包括其它FcR，其中包括将来鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生受体FcRn，该受体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))以及调节免疫球蛋白内稳态。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward.，Immunol.Taday 18(12)：592-598(1997)；Ghetie等，Nature Biotechnollgy，15(7)：637-640(1997)；Hinton等，J.BiolChem.279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等)。
例如，可在转基因小鼠、或表达人FcRn的转染的人细胞系、或者在施用了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中，测量与人FcRn的体内结合以及人FcRn高亲和力结合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了改进或降低了与FcR结合的抗体变体。也可参见，例如，Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”表示靶细胞在存在补体时的溶胞。经典补体途径的活化开始于补体系统第一补体(C1q)与抗体(合适亚类的补体)的结合，所述抗体与它们的同源抗原结合。为评价补体活化，可进行例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述的CDC实验。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和提高或降低的C1q结合能力的多肽变体描述于，例如，美国专利6,194,551B1和WO1999/51642。也可参见，例如，Idusogie等，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
“亲和力成熟的”抗体是一种在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变从而导致与不具有那些改变的亲代抗体相比抗体对抗原的亲和力得到改善的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体与靶抗原的亲和力为纳摩尔或者甚至皮摩尔。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知方法制备。Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL区改组实现亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变描述于：Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“柔性接头”在文中表示包含两个或多个通过肽键相连的氨基酸残基的肽，并为通过其相连的两个肽(如两个Fd区)提供更多的旋转自由度。这种旋转自由度使得通过该柔性结构相连的两个或更多抗原结合位点各自能够更有效地接触靶抗原。合适的柔性接头肽序列的实例包括：gly-ser、gly-ser-gly-ser(SEQ ID NO：34)、ala-ser、和gly-gly-gly-ser(SEQ ID NO：35)。
“二聚区”是由至少两个氨基酸残基(通常是半胱氨酸残基)或者由至少两个肽或多肽(它们可具有相同或不同的氨基酸序列)相连形成的。所述肽或多肽可通过共价和/或非共价结合相互作用。本文所述二聚区的实例包括：Fc区、绞链区、CH3域、CH4域、CH1-CL对、具有工程构建的“把手”和/或“突起”的“界面”(如美国专利5,821,333所述(通过引用纳入本文))、亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，参见Kostelney等，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)、或酵母GCN4亮氨酸拉链)、异亮氨酸拉链、受体二聚物对(例如，白细胞介素-8受体(IL-8R)、以及整合素蛋白异二聚体如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或者其二聚区、二聚配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VKGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员、以及脑衍生的神经营养因子(BDNF)；参见Arakawa等，J Biol.Chem.269(45)：27833-27839(1994)和Radziejewski等，Biochem 32(48)：1350(1993))或者其二聚区、能够形成二硫键的一对半胱氨酸残基、各自包含至少一个半胱氨酸残基(例如从约1个、2个或3个至约10个半胱氨酸残基)从而可在肽或多肽之间形成二硫键(下文中成为“合成绞链”)的一对肽或多肽、以及抗体可变区。本文中，最优选的二聚区是Fc区或绞链区。
抗体的“功能性抗原结合位点”是一种能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必与衍生得到该抗原结合位点的亲代抗体一样强，但其结合抗原的能力必须是用已知的用来评价抗体抗原结合的各种方法中的任何一种方法能够测量到的。此外，本文中，多价抗体各个抗原结合位点的抗原结合亲和力在数量上不必相同。对于本文的多聚抗体，功能性抗原结合位点的数目可采用超速离心分析来估算。根据该分析方法，将不同比例的靶抗原和多聚抗体混合并假设不同的功能性结合位点数目来计算混合物的平均分子量。将这些理论值与获得的实际实验值比较从而确定功能性结合位点的数目。
具有指定抗体“生物学特性”的抗体是一种具有使该抗体不同于结合相同抗原的其它抗体的生物学特征中的一种或多种的抗体。
为筛选能够结合被感兴趣抗体结合的抗原表位的抗体，可进行常规的交叉阻断实验，如Antibodies，A Laboratoy Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室，Harlow和David Lane编(1988)中所述。
术语“表位”用来表示蛋白质抗原上的(单克隆或多克隆)抗体结合位点。
“Bv8拮抗剂抗体”指是Bv8拮抗剂的抗体，如上文所述，因此能够部分或完全阻断、抑制、或中和肿瘤发展期间Bv8调节骨髓动员和/或促进血管生成的能力。
术语“Bv8免疫粘附素”可与术语“Bv8-免疫球蛋白嵌合体”互换使用，表示包含至少一部分Bv8分子(天然的或变体)和免疫球蛋白序列的嵌合分子。所述免疫球蛋白序列优选但不必须是免疫球蛋白恒定区。免疫粘附素可具有许多有价值的人抗体的化学和生物学特性。由于可从连接于合适的人免疫球蛋白绞链区和恒定区(Fc)序列的具有所需特异性的人蛋白质序列构建免疫粘附素，因此可采用完整的人补体获得感兴趣的结合特异性。这种免疫粘附素对患者有最小的免疫原性，因此对于慢性疾病或反复使用是安全的。
已经用于治疗用途的同多聚免疫粘附素的实例包括用来阻断HIV与细胞表面CD4结合的CD4-IgG免疫粘附素。I期临床(其中，将CD4-IgG施用于分娩前的妊娠妇女)数据显示，这种免疫粘附素可用于预防HIV从母亲向胎儿转移(Ashkenazi等，Intern.Rev.Immunol.10：219-227(1993))。也已经开发了结合肿瘤坏死因子(TNF)的免疫粘附素。TNF是一种已显示作为感染性休克主要介质的前炎性细胞因子。基于感染性休克的小鼠模型，TNF受体免疫粘附素已显示有可能作为临床治疗感染性休克的候选物(Ashkenazi，A.等，(1991)PNAS USA 88：10535-10539)。美国食品药品管理局(FDA)已于1998年11月2日批准
Figure GPA00001140320700571
(依那西普)(一种包含与IgG Fc区融合的TNF受体序列的免疫粘附素)可用于治疗类风湿关节炎。用
Figure GPA00001140320700572
治疗类风湿关节炎的新扩展应用已于2000年1月6日被FDA批准。为了解包括
Figure GPA00001140320700573
在内的TNF阻断剂的最新信息可参见Lovell等，N.Engl.J Med.342：763-169(2000)，以及第810-811页的附论；和Weinblatt等，N.Engl.J.Med.340：253-259(1999)；Maini和Taylor，Annu.Rev.Med.51：207-229(2000)。
如果免疫粘附素结构的两臂具有不同特异性，则该免疫粘附素被称为“双特异性免疫粘附素”，与双特异性抗体类似。Dietsch等，J.Immunol.Methods 162：123(1993)描述了这样一种双特异性免疫粘附素，其包含粘附分子E-选择蛋白和P-选择蛋白的胞外域，自然情况下每种选择蛋白在不同的细胞类型中表达。结合研究显示，如此形成的双特异性免疫球蛋白融合蛋白相比其来源单特异性免疫粘附素具有增强的结合骨髓细胞系的能力。
术语“异粘附素”可与“嵌合异多聚粘附素”互换使用，表示一种嵌合分子(氨基酸序列)复合物，其中每个嵌合分子组合了生物学活性蛋白(如异多聚受体单体中每一个的胞外域)和多聚化区。“多聚化区”促进异多聚复合物内嵌合分子的稳定相互作用。多聚化区可通过免疫球蛋白序列、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、或者在嵌合异多聚体的嵌合分子之间形成的分子内二硫键来与游离硫醇相互作用。多聚化区可包含免疫球蛋白恒定区。此外，多聚化区可被工程构建以使空间相互作用不仅能促进稳定相互作用，而且能进一步促进从单体混合物形成异二聚体而不是同型二聚体。用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)代替第一多肽界面上的小的氨基酸侧链可构成“突起”。可用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)代替大的氨基酸侧链任选在第二多肽的界面上形成与突起尺寸相同或类似的补偿性“空穴”。免疫球蛋白序列优选但不必须是免疫球蛋白恒定区。本发明嵌合物中的免疫球蛋白分子可从IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得，但优选从IgG1或IgG3获得。
文中，“治疗”表示一种获得有益或所需临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于：症状缓解、疾病程度降低、稳定的(即，不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病发展、改善或减轻疾病状况、以及症状缓解(部分或全部)，无论是可检测或不可检测的。“治疗”也可表示与未接受治疗的预期存活率相比延长存活率。“治疗”是一种以防治疾病发展或改变疾病病理为目的的干涉。因此，“治疗”表示治疗性处理以及预防性手段。需要治疗的个体包括那些已经患病的个体以及那些需要预防疾病的个体。具体地说，治疗可以直接预防、减缓或降低细胞退化或损伤的病理学，例如与骨髓细胞动员和/或与肿瘤血管生成相关的疾病或症状的病理学。
术语“有效量”或“治疗有效量”表示有效治疗哺乳动物疾病或病症的药物的量。对于癌症而言，药物有效量可减少癌细胞数目、减小肿瘤体积、抑制(即，减缓到一定程度，通常是停止)癌细胞浸润周围器官、抑制(即，减缓到一定程度，通常是停止)肿瘤转移、在一定程度上抑制肿瘤生长、治疗耐药性肿瘤，和/或在一定程度上缓解与疾病有关的一种或多种症状。在一定程度上，能够防治现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的药物是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，例如，可通过评价存活持续时间、至疾病发展的时间(TTP)、应答率(RR)、应答持续时间、和/或生活质量来测量体内功效。
“长期”给药表示以不同于急性方式的连续方式施用药剂，从而可在较长时间内维持最初的治疗效果(活性)。“间歇性”给药不是以没有间隔的连续性给药方式进行的治疗，而是本质上为一种循环模式的治疗。
出于治疗目的，“哺乳动物”表示归为哺乳类的任何动物，包括人、其它高级灵长类动物、啮齿类动物、家庭和农场动物、动物园动物、体育动物、或宠物，如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等等，优选是人。
“肿瘤”在文中表示所有的新生细胞的生长和增殖，无论是恶性或良性的，以及所有的癌前和癌变细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性”表示或描述通常以不受控细胞生长为特征的哺乳动物生理状况。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体的实例包括：肾癌或肾癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌和肺部鳞状细胞癌、鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝癌、消化道癌症或者胃癌包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(GIST)、胰脏癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、肝癌、血液恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液恶性肿瘤、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、少突神经瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌症、甲状腺癌、肾母细胞瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级无核裂小细胞NHL、笨重病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病、和移植后淋巴增生症(PTLD)，以及与母斑细胞病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关)、并梅格斯综合征。“肿瘤”在文中表示所有新生细胞生长和增殖，无论是恶性或良性的，以及所有的癌前和癌变细胞和组织。
术语“耐药性肿瘤”表示在癌症治疗期间对包含至少一种VEGF拮抗剂的癌症疗法完全不应答、丧失应答或显示出应答减低的癌症、癌细胞或肿瘤。耐药性肿瘤还指被诊断为本文所述耐药性的肿瘤(文中也称为“抗-VEGF耐药性肿瘤”)。在某些实施方案中，与对包含至少一种VEGF拮抗剂的疗法敏感的肿瘤相比，耐药性肿瘤中CD11b+Gr1+细胞增加。
术语“抗肿瘤组合物”表示包含至少一种活性治疗剂如“抗癌剂”的用于治疗癌症的组合物。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于：化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性制剂、放疗剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗-微管蛋白制剂、毒素、和治疗癌症的其它制剂，如抗VEGF中和抗体、VEGF拮抗剂、抗-HER-2、抗-CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、埃罗替尼、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、细胞因子，与ErbB2、ErbB3、ErbB4或VEGF受体中的一个或多个结合的拮抗剂(如中和抗体)，血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(
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Novartis))，TRAIL/Apo2，以及其它生物活性试剂和有机化学试剂，等等。其组合也包括在本发明之内。
术语“细胞毒性制剂”在文中指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素)，化疗剂，以及细菌、真菌、植物或动物来源的毒素如小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“生长抑制剂”在本文中表示在体外和/或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是一种显著降低S期细胞比例的试剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程的试剂(使其停留在S期之外)，如诱导G1停滞和M期停滞的试剂。典型的M期阻断剂包括：长春花生物碱(长春新碱和长春碱)、
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以及拓扑酶II抑制剂如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷、和博莱霉素。那些G1停滞剂也会造成S期停滞，例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。进一步的信息参见THe MolecularBasis of Cancer(癌症分子基础)，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”(细胞周期调节、癌基因和抗肿瘤药)，Murakami等，(WB Saunders：Philadelphia，1995)，尤其是第13页。
“化疗剂”是通常用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡、和哌泊舒凡；氮丙啶如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷和亚甲基蜜胺(methylamelamine)包括六甲密胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟基甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；Δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康
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CPT-11(伊立替康，
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)，乙酰喜树碱，东莨菪亭和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新，卡折来新，和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素(cryptophycins)(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin)；萨科迪汀(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆汁磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧化双氯乙基甲胺、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀；抗生素如烯二炔类抗生素(enediyne antibiotics)(例如，刺孢霉素，尤其是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ωI1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、奥斯米星(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括
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吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉代(pyrrolino)-阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射剂
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和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链唑霉素、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢药如氨甲喋呤、吉西他滨
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替加氟
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卡培他滨
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埃博霉素、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸，氨甲喋呤，蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫乌嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺素和氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲比新(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依弗米星(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇类如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；根瘤菌剂；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基肼；丙卡巴肼；
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多糖复合物(JHS天然产物公司(JHS Natural Products)，尤金市，俄勒冈州)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素，粘液霉素(verracurin)A，杆孢菌素A和安概丁(anguidine))；乌拉坦；长春地辛
Figure GPA00001140320700645
达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷，例如，紫杉醇
Figure GPA00001140320700651
紫杉醇的白蛋白工程化毫微粒制剂(ABRAXANETM)，和多烯紫杉醇
Figure GPA00001140320700652
瘤可宁(chloranbucil)；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱
Figure GPA00001140320700654
奥沙利铂；leucovovin；长春瑞滨
Figure GPA00001140320700655
诺消灵；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇如维甲酸；上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，如CFIOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙联合治疗的缩写)和FOLFOX(一种将奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和leucovovin联合的治疗方案的缩写)。
该定义还包括调节、降低、阻断或抑制能够促进癌症生长的激素作用的抗-激素药，且通常采取系统或全身治疗形式。它们可以是激素本身。实例包括抗-雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括，例如，他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬
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屈洛昔芬、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、凯昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮、和托瑞米芬
Figure GPA00001140320700658
抗-黄体酮；雌激素受体下调物(ERD)；抑制或切断卵巢功能的试剂，例如，黄体化激素释放激素(LIIRIL)激动剂如醋酸亮丙瑞林
Figure GPA00001140320700659
醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin)；其它抗-雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，它能调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮
Figure GPA000011403207006510
依西美坦福美斯坦(formestanie)、法倔唑、伏氯唑
Figure GPA000011403207006512
来曲唑和阿那曲唑
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此外，化疗剂的定义包括二膦酸盐如氯膦酸盐(例如、
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或
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)、1-羟基-亚乙基-1、1-二膦酸
Figure GPA00001140320700665
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronate)阿伦膦酸盐
Figure GPA00001140320700667
氨羟二磷酸二钠
Figure GPA00001140320700668
替鲁膦酸
Figure GPA00001140320700669
或利塞膦酸盐
Figure GPA000011403207006610
以及曲沙他滨(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是那些抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因表达的反义寡核苷酸，如PKC-α、Raf、H-Ras、和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗如
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疫苗和基因疗法疫苗，例如，
Figure GPA000011403207006612
疫苗，
Figure GPA000011403207006613
疫苗，和
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疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，
Figure GPA000011403207006615
)；rmRH(例如，)；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(一种ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂如塞来考昔(
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4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放的作为胞间介质作用于其它细胞的蛋白质。这种细胞因子的实例有：淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括：生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)、和促黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(例如，VEGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E)；胎盘衍生生长因子(PIGF)；血小板衍生生长因子(PDGF，例如，PDGFA，PDGFB，PDGFC，PDGFD)；整合素蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小板-生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α，-β和-γ，集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-1β、1L-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20到IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宫珠蛋白；抑瘤蛋白M(OSM)；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和试剂盒配体(KL)。文中，术语细胞因子包括天然来源和重组细胞培养物来源的蛋白质以及天然序列细胞抑制剂的生物学活性等价物。
术语“前药”在本申请中表示与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较低且能够经酶活化或转化成更加有效的母体形式的药物活性物质的前体或衍生形式。参见，例如，Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”(癌症化疗中的前药)Biochemical Society Transactions，14，第375-382页，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery”(前药：靶向药物递送的化学方法)，Directed DrugDelivery(定向药物递送)，Borchardt等(编)，第247-267页，HumanaPress(1985)。本发明的前药包括但不限于：含磷酸盐前药、含硫代磷酸盐前药、含硫酸盐前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶或其它5-氟尿嘧啶前药，它们可转化成更具活性的游离细胞毒药物。可衍生成用于本发明的前药形式的细胞毒药物的实例包括但不限于上述那些化疗剂。
“血管生成因子或试剂”是一种刺激血管生长，例如促进血管生成、内皮细胞生长、血管稳定和/或血管发生等等的生长因子。例如，血管生成因子包括但不限于：VEGF和VEGF家族成员、PIGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(促血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等等。还包括加速伤口愈合的因子，如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、以及TGF-α和TGF-β。参见，例如，Klagsbrun和D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53：217-39(1991)；Streit和Detmar，Oncogene，22：3172-3179(2003)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene，22：6549-6556(2003)(例如，表1中列出的血管生成因子)；和Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”表示一种直接或间接抑制血管生成、血管发生或不需要的血管透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离蛋白、重组蛋白、抗体、或者其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管生成剂是上述血管生成试剂的抗体或其它拮抗剂，例如，VEGF的抗体、VHGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如，PTK787/ZK2284，SU6668，SUTENT/SU 11248(苹果酸萨尼替尼(sunitinibmalate))，AMG706)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如制管张素、内皮生长抑制素等等。参见，例如，Klagsbrun和D′Amore，Annu.Rev.Physiol.，53：217-39(1991)；Streit和Detmar，Oncogene，22：3172-3179(2003)(例如，表3中列出的用于恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等，Oncogene，22：6549-6556(2003)(例如，表2列出的抗血管生成因子)；以及Sato，Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)(例如，表1列出的临床实验使用的抗血管生成剂)。
术语“免疫抑制剂”在文中指用来抑制或掩蔽被治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。它包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这种试剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；非甾类抗炎药(NSAID)；更昔洛韦、他克莫司、糖皮质激素类如考的松或醛固酮、抗炎剂如环加氧酶抑制剂、5-脂肪氧化酶抑制剂、或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂如硝基咪唑硫嘌呤或霉酚酸酯(MMF)；烷化剂如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649所述)；MHC抗原和MHC片段的抗-独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如皮质激素或糖皮质激素或糖皮质激素类似物，例如，泼尼松、甲泼尼龙和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂如氨甲喋呤(口服或皮下)；羟氯替平(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体抗体包括抗-干扰素-α、-β、或-γ抗体，抗-肿瘤坏死因子-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)、抗-TNF-α免疫粘附素(依那西普)、抗-肿瘤坏死因子-β抗体、抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；异源抗-淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，优选抗-CD3；含LFA-3结合结构域的可溶性肽(1990/7/26公布的WO 1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T细胞-受体片段(Offner等，Science，251：430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，Nature，341：482(1989)；和WO 1991/01133)；和T细胞-受体抗体(EP340109)如T10B9。
“非甾体抗炎药”或“NSAID”的例子是乙酰水杨酸、布洛芬、萘普生、吲哚美辛、舒林酸、托美汀，包括它们的盐和衍生物等。
疾病“病理”包括损害患者健康状态的所有现象。对于癌症而言，包括但不限于异常或不受控的细胞生长、转移、对邻近细胞增长功能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平的释放、炎症或免疫应答的抑制或恶化，等等。
与一种或多种其它治疗剂“联合”给药包括以任意顺序同时(共同)和连续给药。
“载体”在文中包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，当以采用的剂量和浓度使用时它们对细胞或哺乳动物无毒。生理上可接受的载体通常是pH缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括，例如，磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠离子；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“脂质体”是一种由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的用于递送药物(如Bv8多肽或其抗体)到哺乳动物的小的囊泡。脂质体的组分通常排列成双层，类似于生物膜的脂质排列。
“小分子”在文中定义为具有小于约500道尔顿的分子量。
“氨基酸改变”表示预定氨基酸序列的氨基酸序列变化。示例性的改变包括插入、取代和缺失。“氨基酸取代”表示用另一种不同的氨基酸残基代替预定氨基酸序列中的现有氨基酸残基。
“替代”氨基酸残基表示代替或取代某氨基酸序列中其它氨基酸残基的氨基酸残基。替代残基可以是天然产生的或非天然产生的氨基酸残基。
“氨基酸插入”表示在预定氨基酸序列中引入一个或多个氨基酸残基。氨基酸插入可包括“肽插入”，此时将包含两个或更多通过肽键连接的氨基酸残基的肽引入预定氨基酸序列。当氨基酸插入涉及肽的插入时，插入的肽可通过随机诱变产生，从而其具有自然情况下不存在的氨基酸序列。“邻近超变区”的氨基酸改变表示在超变区的N-末端和/或C-末端引入或取代一个或多个氨基酸残基，从而至少一个插入的或替代的氨基酸残基与上述超变区N-末端或C-末端的氨基酸残基形成肽键。
“天然产生的氨基酸残基”是一种被遗传密码编码的氨基酸残基，通常选自下组：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、和缬氨酸(Val)。
“非天然产生的氨基酸残基”在文中表示除上述那些天然产生的氨基酸残基之外的氨基酸残基，它能够共价结合多肽链中相邻的氨基酸残基。非天然产生的氨基酸残基的实例包括：正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸以及其它氨基酸残基类似物，如Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)所述。为产生这种非天然产生的氨基酸残基，可采用Noren等，Science 244：182(1989)和Ellman等，同上，所述的方法。简言之，其过程包括用非天然产生的氨基酸残基化学激活抑制性tRNA，然后体外转录并翻译RNA。
文中，具有“高亲和力”的抗体具有纳摩尔(nM)级别或更优的KD(解离常数)。“纳摩尔级别或更优”的KD可表示X nM，其中X为小于约10的数目。
术语“丝状噬菌体”表示能够在其表面展示异源多肽的病毒颗粒，包括但不限于f1、fd、Pf1和M13。丝状噬菌体可包含可选择标记，如四环素(例如，“fd-tet”)。各种丝状噬菌体展示系统是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Zacher等，Gene 9：127-140(1980)，Smith等，Science 228：1315-1317(1985)；以及Parmley和Smith，Gene 73：305-318(1988))。
术语“淘选”用来表示在鉴定和分离携带对靶具有高亲和力和特异性的化合物如抗体的噬菌体时所进行的多轮筛选过程。
术语“短干扰RNA(siRNA)”表示干扰基因表达的小的双链RNA。siRNA是RNA干扰(一种双链RNA静默同源基因的过程)的中间体。siRNA通常包含两个长度约15-25个核苷酸的单链RNA以形成双链体，该双链体中可包含单链突出端。可通过酶复合物，例如通过多个聚合酶处理该双链RNA，从而切割该双链RNA产生siRNA。siRNA的反义链被RNA干扰(RNAi)静默复合物用来指导mRNA切割，从而促进mRNA降解。例如，为在哺乳动物细胞内用siRNA静默特定基因，需对碱基配对区域进行选择以避免碰巧与无关mRNA互补。RNAi静默复合物是本领域已知的，例如，Fire等，Nature 391：806-811(1998)和McManus等，Nat.Rev.Genet.3(10)：737-47(2002)。
术语“干扰RNA(RNAi)”在文中表示一种导致特定mRNA催化降解的双链RNA，因此可用来抑制/降低特定基因的表达。
“有效量”是足以产生有益或所需治疗(包括预防)效果的量。有效量可通过一次或多次给药施用。
文中，“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，其含义包括后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代个体细胞以及其中衍生出的培养物，不考虑传代次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不是完全相同的。术语“后代”表示最初转化细胞或细胞系之后的每一代的任何或所有子孙。与最初转化细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代也包括在内。当表示特殊含义时文中会有清楚的说明。
杂交反应的“严格性”是本领域技术人员容易确定的，且通常根据探针长度、洗涤温度以及盐浓度凭经验决定。通常，较长的探针要求较高的温度以实现正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于当互补链处于低于解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的所需同一性程度越高，则可使用的相对温度也越高。因此，相对温度越高则反应条件越严格，而温度越低则越不严格。有关杂交反应严格性的其它细节和解释可参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
“高严格条件”在文中表示：(1)采用低离子强度和高洗涤温度，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间采用变性剂，50％(v/v)甲酰胺+0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5+750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或者(3)采用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％磷酸钠，5×登哈特溶液，超声过的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％葡聚糖硫酸酯，42℃，在42℃用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗涤并在55℃用50％甲酰胺洗涤，然后在55℃用含EDTA的0.1x SSC进行高严格性洗涤。
“中等严格条件”可按照Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，纽约：冷泉港出版社，1989的描述定义，包括在37℃在含20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×登哈特溶液，10％葡聚糖硫酸酯，和20mg/ml变性的剪切的鲑精DNA的溶液中培育一夜，然后在约37-50℃用1×SSC洗涤滤器。熟练技术人员将知道如何根据探针长度等因素调节温度、离子强度等等。
B.详述
本发明至少部分基于这样的认知，即Bv8在导致肿瘤对包括施用至少一种VEGF拮抗剂(如抗-VEGF抗体)在内的治疗产生耐药性的细胞和分子事件中发挥重要作用。本发明还基于认识到Bv8表达可精确应答G-CSF，因此与涉及调节中性白细胞分化和产生的主要内稳机制有关。
2007年3月28日提交的待决申请11/692681(通过引用将其全文纳入)描述了骨髓衍生造血细胞募集与肿瘤对抗-VEGF治疗的耐药性之间的关系。免疫系统包括造血细胞(其中包括红细胞)、淋巴细胞以及骨髓系细胞。这些细胞类型都来自相同的多能干细胞。在成人中，造血作用发生在骨髓内，其中的干细胞偶尔分化产生更多干细胞(自我更新)和各种定向祖细胞。就是这些定向祖细胞将应答特定调节因子从而产生造血细胞。这些调节因子主要由周围的基质细胞和其它组织产生，包括，例如，集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素3(IL3)、粒细胞/巨噬细胞CSF(GM-CSF)、粒细胞CSF(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)和STEEL因子。已提示，癌症患者免疫系统的改变会破坏或降低免疫系统成功攻击癌症的能力，从而使得肿瘤生长继续。参见，例如，Gabrilovich等，Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cancer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function，Clinical Cancer Research 5：2963-2970(1999)。肿瘤产生的因子可导致异常骨髓生成并且可导致针对肿瘤的免疫应答受到抑制。参见，例如，Kusmartsev和Gabrilovich，Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression.Caner Immunol Immunothera.51：293-298(2002)。
最近的研究直接显示，CD11b+Gr1+骨髓细胞介导对抗-VEGF治疗的难治性。(Shojaei，F.等，Nature Biotechnol 25：911-20(2007)，以及待决申请11/692681)。CD11/CD18家族在结构和基因上与调节细胞粘附相互作用包括胚胎发生、胞外基质粘附和细胞分化的庞大的整合素蛋白受体家族有关(Hynes，R.O.，Cell 48：549-554(1987)；Kishimoto等，Adv.Immnol.46：149-182(1989)；Kishimoto等，Cell 48：681-690(1987)；以及Ruoslahti等，Science 238：491-497(1987))。整合素蛋白是一类跨膜杂二聚体，包括与β亚基非共价结合的α亚基。β亚基通常能够结合一个以上的α亚基，具有共同的β亚基的杂二聚体已被归类为整合素蛋白群体的亚家族(Larson和Springer，Structure and funcion of leukocyte integrins，Immunol.Rev.114：181-217(1990))。
已发现CD11/CD18家族的整合素蛋白分子以及它们的细胞配体能够介导多种细胞-细胞相互作用，尤其在炎症中。已证实这些蛋白质对于免疫系统的粘附功能非常关键(Kishimoto等，Adv.Immunol.46：149-182(1989))。LFA-1的单克隆抗体已显示可阻断白细胞粘附内皮细胞(Dustin等，J Cell.Biol.107：321-331(1988)；Smith等，J.Clin.Invest.83：2008-2017(1989))，并可抑制T细胞活化(Kuypers等，Res.Immunol，140：461(1989))、抗原特异性CTL杀伤所需的偶联物形成(Kishimoto等，Adv.Immunol.46：149-182(1989))、T细胞增殖(Davignon等，J.Immunol.127：590-595(1981))以及NK细胞杀伤作用(Kxensky等，J.Immunol.131：611-616(1983))。
CD11/CD18粘附受体分子家族包括四种高度相关的细胞表面糖蛋白：LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)、p150.95(CD11c/CD18)和(CD11d/CD18)。这些杂二聚体中的每一种具有独特的α-链(CD11a、b、c或d)和不变的β-链(CD18)。白细胞上的CD18整合素蛋白可结合在血管内皮和其它细胞上表达的胞间粘附分子-1(ICAM-1)，从而介导白细胞粘附和经内皮迁移。LFA-1存在于除巨噬细胞亚组之外的所有成熟白细胞表面，并被认为是主要的淋巴整合素蛋白。Mac-1、p150.95和CD11d/CD18的表达主要限于骨髓系细胞(包括中性白细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。CD11b+Gr1+也是在骨髓细胞上发现的标记物。认为成熟和未成熟骨髓细胞之间的平衡是一种癌症标志，在进行性肿瘤生长中，该平衡向未成熟骨髓细胞移动，而树突细胞减少。参见，例如，Kusmartsev和Gabrilovich，Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression.Caner Immunol Immunothera.51：293-298(2002)。例如，通过使肿瘤携带小鼠中未成熟的骨髓细胞分化可改变该平衡，从而提高癌症疫苗的功效。参见Kusmartsev等，All-trans-Retinoic Acid Eliminates ImmatureMyeloidCellsfromTumor-bearing MiceandImprovestheEffect of Vaccination.Cancer Research 63：4441-4449(2003)。在癌症患者中还观察到，循环中的VEGF的水平与未成熟骨髓细胞的数目增加有关。参见Almand等，Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer.Clin Cancer Res 6：1755(2000)。
已知CD11b+Gr1+骨髓细胞的动员和活化可导致对抗-VEGF治疗的耐药性。还显示从肿瘤携带小鼠分离的骨髓衍生CD11b+Gr1+骨髓细胞可导致肿瘤对抗-VEGF治疗产生耐药性，同时抗-VEGF-耐药性(不是抗-VEGF-敏感性肿瘤)的条件培养基刺激CD11b+Gr1+细胞迁移。
本文所披露的实验数据证实，Bv8在肿瘤发展期间能调节骨髓中的CD11b+Gr1+细胞的动员同时局部促进肿瘤血管生成。因此，Bv8是一种治疗对VEGF拮抗剂治疗具有耐药性的肿瘤的有希望的靶点。
本文所披露的数据同时显示，Bv8表达精确应答G-CSF，因此与涉及调节中性白细胞分化和产生的主要内稳机制有关。由于Bv8在非肿瘤型炎性细胞介导的血管生成病理学中的广泛作用，Bv8通常也是一种抑制不希望的炎性细胞介导的血管生成的有希望的靶点。
C.使抗-Bv8抗体成为肿瘤血管生成抑制剂
由本发明的结合实验和活性实验鉴定的抗体可通过本领域已知方法制备，其中包括重组DNA技术。
i)抗原制备
任选与其它分子偶联的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于受体之类的跨膜分子，它们的片段(例如受体的胞外域)可用作免疫原。或者，可将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。这种细胞可源自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。其它抗原及其用于制备抗体的形式是本领域已知的。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过多次皮下或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂从动物中产生。将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质如匙孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联是有用的，偶联采用双官能试剂或衍生剂，例如，马来酰亚氨基苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基偶联)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R′N＝C＝NR，其中R和R′是不同的烷基。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔子或小鼠)和3倍体积的弗氏完全佐剂混合并在多个部位真皮内注射该溶液来用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物。1个月后用最初量1/5到1/10的肽或偶联物(用弗氏完全佐剂配制)通过多个部位皮下注射对动物加强免疫。7-14天后采集动物血液并测定血清的抗体滴度。再次加强免疫动物直到滴度平稳。优选地，用偶联于不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联的相同抗原的偶联物加强免疫动物。偶联物也可作为蛋白质融合物在重组细胞培养物内制备。同时，凝集剂如明矾也适合用来增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体可通过最早由Kohler等，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可通过重组DNA法制备(参见，例如，美国专利4,816,567)。在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物如仓鼠或短尾猴经免疫(如上所述)以激发淋巴细胞，其产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后采用稳定融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原则与实践)，59-103页(学术出版社，1986))。
将如此制得的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中培育，培养基优选含有一种或多种能抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，该杂交瘤细胞的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷(HAT培养基)，其中的物质能阻止HGPRT缺陷性细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些能有效融合，能支持选出的抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体，且对培养基如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，骨髓瘤细胞系的非限制性实例包括鼠骨髓瘤系，如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可从美国加州圣地亚哥的索尔克学院细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)购得)以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可从美国马里兰州罗克维乐(Rockville，Md.USA)的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)获得)。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也用来产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(单克隆抗体产生的技术和应用)，51-63页，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。
检验生长杂交瘤细胞的培养基产生针对抗原的单克隆抗体的情况。优选通过免疫沉淀或通过体外结合实验，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释法对克隆进行亚克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103页(学术出版社，1986))。用于该目的的合适培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可将杂交瘤细胞作为腹水肿瘤在动物体内培养。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，如A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法，可将亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培育基、腹水、或血清中分离出来。
用常规方法(如，采用能与鼠科抗体重链和轻链的编码基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可以容易地将编码单克隆抗体的DNA分离出来并测序。杂交瘤细胞可作为此种DNA的有用来源。一旦分离出来，可将该DNA置入表达载体中，然后转染宿主细胞如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以实现在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。重组制备抗体的方法将在下文中更详细地描述。
在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可分离自采用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库。
Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了如何采用噬菌体文库分离鼠和人抗体。之后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM级别)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及利用组合感染和体内重组来构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
DNA也可被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠科序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价结合。
通常用这种非免疫球蛋白多肽取代某抗体的恒定结构域或取代某抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生一种嵌合二价抗体，该抗体含有一个对某抗原具有特异性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称作“输入”残基，该残基通常取自“输入”可变结构域。实质上可按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))来进行人源化，用超变区序列取代人抗体的相应序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中明显小于一个完整的人可变结构域的区域被非人动物的相应序列所取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体的类似部位的残基所取代。
用来制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是十分重要的。根据所谓的“最佳匹配(best-fit)”法，用已知的人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。与啮齿动物序列接近的人序列是可接受的人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法采用衍生自轻链和重链可变区特定亚组所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更重要的是被人源化的抗体保留了对抗原的高度亲和力以及其它有利的生物学特性。为了达到这一目标，根据一种优选的方法，利用亲代与人源化序列的三维模型，通过分析亲代序列和不同概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可获得且为本领域技术人员所熟悉。可以获得阐述并演示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构型结构的计算机程序。检查这些演示使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析能影响免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。这样，可从受者序列和输入序列中选出FR残基并组合从而获得所需的抗体特性，如对靶抗原的亲和力增加。总之，CDR残基直接并最实质性参与了对抗原结合的影响。
或者，现在已能够产生转基因动物(如小鼠)，免疫接种这些动物能够产生没有内源免疫球蛋白产物的人抗体文库。例如，已有描述说在嵌合和种系突变小鼠中，抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致完全抑制内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中导致了抗原攻击后人抗体的产生。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；以及Duchosal等，Nature 355：258(1992)。也可从噬菌体展示文库获得人抗体(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14：309(1996))。从抗体噬菌体文库产生人抗体将在下文中进一步描述。
(v)抗体片段
已发展了各种技术来制备抗体片段。传统上通过完整抗体的蛋白酶消化衍生出这些片段(参见，例如，Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可用重组宿主细胞直接产生。例如，抗体片段可从上述抗体噬菌体文库分离。或者，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段并化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在下文实施例中所述的另一个实施方案中，F(ab’)2是用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子的装配而形成的。根据另一种方法，F(ab’)2片段可从重组宿主细胞培养物直接分离。制备抗体片段的其它技术将是技术人员显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体对至少两个不同表位具有结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。虽然此类分子通常仅结合两个不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但该表述在文中也包含具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。示例性的BsAb包括那些具有一条针对Bv8的臂和另一条针对VEGF或EG-VEGF的臂的抗体。
本领域已知制备双特异性抗体的方法。传统上，全长双特异性抗体的产生基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生了10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。这种正确分子的纯化(通常以亲和层析法进行)很麻烦且产量低。类似方法公开于WO 1993/08829以及Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与至少含有铰链区、CH2和CH3域部分的免疫球蛋白恒定区融合。优选地，在至少一个融合物中存在含有轻链结合必需位点的重链第一恒定区(CH1)。可将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA和(如果需要的话)编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同的表达载体中，共转染入合适的宿主生物中。当在构建中使用比例不等的三条多肽链以提供最佳得率时，该方法在实施中为调节此三条多肽片段的互相比例提供了很大灵活性。然而，当至少两条多肽链以相同比例表达从而产生高产率或此比例没有特别意义时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
该方法的优选实施方案中，该双特异性抗体的一臂上为具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，而另一臂上为提供第二结合特异性的杂交免疫球蛋白重链-轻链对。已发现，由于免疫球蛋白轻链只存在于该双特异性分子的一半中，从而提供了容易的分离方法，这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链混合物中分离所需的双特异性化合物。该方法描述于WO 1994/04690。产生双特异性抗体的其它细节可参见，例如，Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据WO96/27011中描述的另一种方法，一对抗体分子之间的界面可被工程改造以尽可能提高从重组细胞培养物回收的杂二聚体比例。优选界面包含抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，第一抗体分子界面上的一个或多个小的氨基酸侧链被较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替代。用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，可以在第二抗体分子界面上产生与第一抗体界面上的较大侧链体积相同或类似的补偿性“空穴”。这样相比于其它不需要的终产物如同二聚体，可提高杂二聚体的产量。
双特异性抗体包括交联或“杂偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，杂偶联物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体可与生物素偶联。例如，已有人提出用这种抗体使免疫系统细胞靶向有害细胞(美国专利号4,676,980)，以及治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373)。杂偶联抗体可采用任何常规交联方法制备。合适的交联剂是本领域熟知的，并描述于例如美国专利号4,676,980，其中还描述了许多交联技术。
从抗体片段生成双特异性抗体的技术也已在文献中描述。例如，双特异性抗体可采用化学连接制备。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab′)2片段的方法。在存在二巯基化物络合剂亚砷酸钠时还原这些片段以稳定附近的二硫醇并防止形成分子间二硫键。然后将产生的Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后用巯基乙胺还原将Fab′-TNB衍生物之一再转化成Fab′-硫醇，将其与等摩尔的另一Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。制得的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
Fab’-SH片段也可从大肠杆菌直接回收，或者可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的制备。各Fab’片段是由大肠杆菌单独分泌的并直接进行体外化学偶联以形成双特异性抗体。
已经描述过从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，双特异性抗体可采用亮氨酸拉链制备。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合使来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分连接在一起。在绞链区还原这种抗体同二聚体以形成单体，然后再氧化形成抗体杂二聚体。该方法也可用来制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双链抗体(diabody)”技术是制备双特异性抗体片段的另一种方法。这些片段包含通过接头连接的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)，该接头太短而无法使同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的其它方法也已经报道。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
可以考虑两价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
(vii)效应子功能工程构建
可能需要修饰本发明抗体的效应子功能，以便增强抗体功效。例如，半胱氨酸残基可被引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此生成的同二聚抗体具有改进的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol 148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体也可按照Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)的描述采用异双官能交联接头来制备。或者，可将抗体工程构建成具有双Fc区从而具有增强的补体溶解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
(viii)抗体-补救受体结合表位融合
在本发明的某些实施方案中，可能需要使用抗体片段而不是完整的抗体，以提高例如肿瘤渗透。在此情况下，可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。例如这可通过在抗体片段中掺入补救受体结合表位(如，通过在抗体片段内合适区域进行突变，或在肽标记中掺入该表位，然后例如通过DNA或肽合成与抗体片段末端之一或中间融合)而实现。
补救受体结合表位优选构成一个区域，其中Fc区的一个或二个环上的一个或多个氨基酸残基被转移到该抗体片段的类似位置，甚至更优选Fc区的一个或二个环上的3个或多个残基被转移。更优选地，此表位取自(如IgG)Fc区的CH2结构域并且转移到此抗体的CH1、CH3或VH结构域或1个以上的这些区域中。或者，此表位取自Fc区的CH2结构域并且转移到该抗体片段的CL区或VL区或这二个区。
(ix)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰也包括在本发明范围之内。如果需要，可通过化学合成或抗体的酶裂解或化学裂解制备。用能够与所选侧链或N端或C端残基反应的有机衍生试剂与此抗体的靶氨基酸残基反应，将其它类型的抗体的共价修饰引入此分子中。典型的多肽共价修饰在美国专利5,534,615中有描述(通过引用专门纳入本文)。抗体共价修饰的优选类型包括以美国专利4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述方式将抗体与各种非蛋白性聚合物(如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)中的一种相连。
本发明还涉及包括与细胞毒性制剂如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或者其片段)、或放射性同位素(即，放射性偶联物)偶联的本文所述抗体的免疫偶联物。可利用各种放射性核素来制备放射性偶联物抗体。实例包括但不限于：例如，212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
用来产生这种免疫偶联物的化疗剂已在上文中描述过。例如，BCNU、链佐星、长春新碱、5-氟尿嘧啶，美国专利5,053,394、5,770,710中描述的统称为LL-E33288复合物的试剂家族，埃帕拉米星(esperamicin)(美国专利5,877,296)，等等(也可参见本文关于化疗剂的定义)可与本发明的抗体或其片段偶联。
为选择性破坏肿瘤，抗体中可包含高放射活性原子。各种放射活性同位素可用来制备放射性偶联抗体或其片段。实例包括但不限于：例如，211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、111In、Lu的放射性同位素，等等。当所述偶联物用于诊断时，可包含放射活性原子以进行闪烁研究，例如99mtc或I，或者可包含自旋标记以进行核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
放射性标记或其它标记可通过已知方法掺入偶联物中。例如，肽可以是生物合成的或者用合适的氨基酸前体通过化学氨基酸合成来合成，所述前体包括，例如，用氟-19代替氢。99mtc或123I、186Re、188Re和111In等标记可通过肽内的半胱氨酸残基连接。钇-90可通过赖氨酸残基连接。可采用IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)来掺入碘-123。参见，例如，Monoclonal Antibodies in Immucintigraphy(Chatal，CRC出版社，1989)，其中详细描述了其它方法。
可使用的酶活性毒素或其片段包括白喉A链、白喉毒素的非连接活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素、以及单端孢霉烯(tricothecene)。参见，例如，1993年10月28日公布的WO 93/21232。
抗体和细胞毒性制剂的偶联物可采用各种双功能蛋白偶联试剂来制备，所述试剂例如：N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚酰胺盐酸)、活性酯类(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(p-叠氮基苯甲酰)己二胺)、双-重氮基化合物(如双-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸亚苄酯)、以及双-活性氟化物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可按照Vitetta等，Science 238：1098(1987)的描述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五醋酸(MX-DTPA)是螯合剂的一个实例，它可用来将放射性核苷酸偶联于抗体。参见WO94/11026。接头可以是“可切除的接头”以便在细胞内释放细胞毒药物。例如，可使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等，Canver Research52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
或者，可通过例如重组技术或肽合成方法制备含有抗-VEGF、和/或本发明抗体的抗-蛋白和细胞毒性制剂的融合蛋白。DNA的长度可包含分别编码偶联物两个部分的区域，这两个区域可以是相邻的或者被一个区域分开，该区域编码不会破坏该偶联物所需特性的接头肽。
在某些实施方案中，抗体与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)偶联以用于肿瘤预靶向，其中所述抗体-受体偶联物被施用于患者，然后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，之后再施用与细胞毒性制剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如抗生物素蛋白)。在某些实施方案中，免疫偶联物是在抗体与具有核溶解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的。
本发明提供了与一种或多种类美登醇(maytansinoid)分子偶联的本发明抗体。类美登醇是通过抑制微管蛋白聚合而发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初是从东非灌木Maytenus serrata中分离的(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也产生类美登醇，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。合成美登醇及其衍生物和类似物描述于，例如，美国专利4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663、和4,371,533。
本发明抗体可与类美登醇分子偶联，所述类美登醇分子不会显著削弱抗体或类美登醇分子的生物学活性。每个抗体分子平均偶联3-4个类美登醇分子，显示出能增强靶细胞的细胞毒性且对抗体的功能或溶解性没有负面影响，尽管每个抗体仅偶联一个毒素分子预计也能使细胞毒性高于使用裸抗体。类美登醇是本领域熟知的并可通过已知技术合成或者从天然来源分离。合适的类美登醇披露于，例如，美国专利5,208,020以及上文提到的其它专利和非专利文件中。在一个实施方案中，类美登醇是美登醇以及在美登醇分子的芳环内或者其它部位上有修饰的美登醇类似物，如各种美登醇酯。
本领域已知许多连接基团可用于制备抗体-类美登醇偶联物，其中包括，例如，美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1以及Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)中披露的那些。所述连接基团包括二硫化物基团、硫醚基、酸不稳定性基团、光不稳定基团、肽酶不稳定性基团、或脂酶不稳定性基团，如上述专利所述，其中二硫化物和硫醚基团是优选的。
可采用各种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和类美登醇的偶联物，所述偶联剂例如：N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚酰胺盐酸、活性酯类(如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(p-叠氮基苯甲酰)己二胺)、双-重氮基化合物(如双-(p-重氮基苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸亚苄酯)、以及双-活性氟化物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。典型的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，用于提供二硫键。
根据连接类型，接头可连接于类美登醇分子的各种位置。例如，采用常规偶联技术与羟基反应可形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位、被羟甲基修饰的C-14位、被羟基修饰的C-15位、以及具有羟基的C-20位。在美登醇或美登醇类似物的C-3位形成键。
另一种感兴趣的免疫偶联物包括与一种或多种刺孢霉素分子偶联的本发明抗体。刺孢霉素抗生素家族在亚皮摩尔浓度时能够使双链DNA断裂。有关刺孢霉素家族偶联物的制备可见美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(都属于American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素的结构类似物包括但不限于：γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等，CancerResearch 53：3336-3342(1993)，Lode等，Cancer Research58：2925-2928(1998)以及上述属于American Cyanamid Company的美国专利)。可与抗体偶联的其它抗肿瘤药是QFA，这是一种二氢叶酸拮抗物。刺孢霉素和QFA都具有胞内活化位点且不易穿过质膜。因此，细胞通过抗体介导的内化作用摄取这些药剂将大大增强它们的细胞毒效应。
(x)从合成抗体噬菌体文库产生抗体
在优选的实施方案中，本发明提供了一种用独特的噬菌体展示法生成并选择新型抗体的方法。该方法包括基于单个框架模板产生合成抗体噬菌体文库，在可变区内设计出充足的衍生物，展示具有各种可变区的多肽，选择对靶抗原具有高亲和力的候选抗体，以及分离选出的抗体。
有关噬菌体展示方法的细节可参见，例如，2003/12/11公布的WO03/102157，其完整内容通过引用纳入本文。
一方面，用于本发明的抗体文库可通过使抗体可变区的至少一个CDR内的溶剂可接触位点和/或高变异位点发生突变而产生。部分或全部CDR可用本文提供的方法突变。在某些实施方案中，优选通过突变CDRH1、CDRH2和CDRH3内的位点以形成单个文库、或者通过突变CDRL3和CDRH3内的位点以形成单个文库、或者通过突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3内的位点以形成单个文库，来生成不同的抗体文库。
例如，可生成在CDRH1、CDRH2和CDRH3的溶剂可接触位点和/或高变异位点具有突变的抗体可变区文库。可生成的另一种文库在CDRL1、CDRL2和CDRL3内具有突变。这些文库也可相互结合使用以获得所需亲和力的结合体(binder)。例如，根据与靶抗原的结合对重链文库进行一轮或多轮选择之后，轻链文库可被置换入重链结合体群用于进一步的筛选以提高结合体的亲和力。
优选地，可用变体氨基酸取代重链序列可变区CDRH3区中的原始氨基酸来产生文库。所得文库具有多种抗体序列，其中的序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区。
一方面，形成了人源化抗体4D5序列或者人源化抗体4D5序列框架氨基酸序列的文库。优选地，用DVK密码子组编码的氨基酸至少取代重链残基95-100a来产生文库，其中的DVK密码子组被用来为这些位点中的每一个位点编码一组变体氨基酸。用来产生这些取代的寡核苷酸组的实例包括序列(DVK)7。在某些实施方案中，用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸取代残基95-100a来产生文库。用来产生这些取代的寡核苷酸组的实例包括序列(DVK)6(NNK)。在另一个实施方案中，用DVK和NNK密码子组编码的氨基酸取代残基95-100a来产生文库。用来产生这些取代的寡核苷酸组的实例包括序列(DVK)5(NNK)。用来产生这些取代的寡核苷酸组的另一个实例包括序列(NNK)6。合适的寡核苷酸序列的其它实例可有本领域技术人员根据本文所述标准确定。
在另一个实施方案中，采用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合体以及分离各种表位的结合体。该文库中产生的CDRH3的长度范围为11-13个氨基酸，尽管也可产生不同的长度。H3多样性可用NNK、DVK和NVK密码子组放大，同时N和/或C-末端的多样性更加有限。
也可在CDRH1和CDRH2内产生多样性。按照以下方法设计CDR-H1和H2的多样性：与之前的设计相比，通过更加紧密匹配天然多样性的修饰来模拟天然抗体的所有功能。
至于CDRH3多样性，可用不同长度的H3单独构建多个文库，然后组合以选择靶抗原的结合体。可采用之前以及下文中描述的固体支持物选择以及溶液分选方法来收集和分选多个文库。可采用多重分选策略。例如，一种变化涉及在结合于固体的靶上进行分选，然后对可能存在于融合多肽上的标签(如抗-gD标签)进行分选，之后在结合于固体的靶上进行另一次分选。或者，可首先在结合于固体表面的靶上对文库进行分选，然后用结合递减浓度靶抗原的液相对洗脱的结合体进行分选。利用不同分选方法的组合能够提供仅针对高度表达序列的最简化的选择，并提供对众多不同高亲和力克隆的选择。
可从文库中分离靶抗原的高亲和力结合体。限制H1/H2区的多样性使简并降低了约104-105倍，并为更多高亲和力结合体提供更多H3多样性。利用具有不同类型CDRH3多样性的文库(例如，利用DVK或NVT)能够分离可能与靶抗原不同表位结合的结合体。
在从上述文库集合中分离的结合体中发现，通过提供有限的轻链多样性能进一步提高亲和力。在该实施方案中，如下产生轻链多样性：在CDRL1中，氨基酸位点28由RDT编码、氨基酸位点29由RKT编码、氨基酸位点30由RVW编码、氨基酸位点31由ANW编码、氨基酸位点32由THT编码、任选地氨基酸位点33由CTG编码；在CDRL2中：氨基酸位点50由KBG编码、氨基酸位点53由AVC编码、任选地氨基酸位点55由GMA编码；在CDRL3中：氨基酸位点91由TMT或SRT或这两者编码、氨基酸位点92由DMC编码、氨基酸位点93由RVT编码、氨基酸位点94由NHT编码、氨基酸位点96由TWT或YKG或这两者编码。
在另一个实施方案中，产生了在CDRH1、CDRH2和CDRH3区具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，CDRH3多样性是用各种长度的H3区以及主要采用密码子组XYZ和NNK或NNS产生的。可用单独的多核苷酸形成文库且之后将文库收集，或者可收集寡核苷酸以形成子文库。可用与固体结合的靶分选该实施方案的文库。可采用ELISA实验按照特异性和亲和力筛选从多重分选中分离的克隆。对特异性而言，可用所需靶抗原以及其它非靶抗原筛选克隆。然后可在溶液结合竞争性ELISA实验或斑点竞争实验中对那些靶抗原结合体的亲和力进行筛选。可利用如上制备的XYZ密码子组从文库中分离高亲和力结合体。这些结合体可作为抗体或抗原结合片段，在细胞培养物中以高产率方便地制备。
在某些实施方案中，可能需要产生在CDRH3区域长度内具有更高多样性的文库。例如，可能需要产生具有约7到19个氨基酸的CDRH3区的文库。
从这些实施方案的文库中分离的高亲和力结合体可以方便地在细菌和真核细胞内以高产率生产。可对载体进行设计以方便地除去诸如gD标签、病毒包衣蛋白组成序列之类的序列，和/或加入恒定区序列以高产率产生全长抗体或抗原结合片段。
CDRH3突变的文库可与含有其它CDR，例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2变体形式的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，CDRH3文库与用预定密码子组在第28、29、30、31和/或32位具有变体氨基酸的基于人源化4D5抗体序列产生的CDRL3文库组合。在另一个实施方案中，CDRH3发生突变的文库可与包含变体CDRH1和/或CDRH2重链可变区的文库组合。在一个实施方案中，用在第28、30、31、32和33位具有变体氨基酸的人源化4D5抗体序列形成所述CDRH1文库。可用使用预定密码子组在第50、52、53、54、56和58位具有变体氨基酸的人源化4D5抗体序列形成CDRH2文库。
(xi)抗体变体
从噬菌体文库产生的新型抗体可被进一步修饰以产生相比亲代抗体具有改进的物理、化学和/或生物学特性的抗体变体。当使用的实验是生物学活性实验时，所述抗体变体在所选实验中表现出的生物学活性是亲代抗体在该实验中的生物学活性的优选至少约10倍、优选至少约20倍、更优选至少约50倍，且有时为至少约100或200倍。例如，抗-Bv8抗体变体对Bv8的结合亲和力是亲代抗体结合亲和力的优选至少约10倍、优选至少约20倍、更优选至少约50倍、且有时为至少约100或200倍。
为产生抗体变体，可在亲代抗体的一个或多个超变区内引入一个或多个氨基酸改变(例如取代)。可替代的，或者此外，可在亲代抗体中引入一个或多个框架区残基改变(例如取代)，这将导致抗体变体对来自另一种哺乳动物种类的抗原的结合亲和力有所改善。被修饰的框架区残基的实例包括那些与抗原直接非共价结合的残基(Amit等，(1986)Science233：747-753)、影响CDR构象的残基(Chothia等，(1987)J.Mol.Biol196：901-917)、和/或参与VL-VH界面的残基(EP 239 400B1)。在某些实施方案中，对一个或多个此类框架区残基的修饰导致抗体对来自另一种哺乳动物种类的抗原的结合亲和力有所改善。例如，在本发明的该实施方案中可对约1-5个框架残基进行改变。有时，即便一个超变区残基都未被改变，这样仍可有效产生适用于临床实验的抗体变体。然而，抗体变体通常将包含其它超变区改变。
被改变的超变区残基可以随机改变，尤其是当亲代抗体的起始结合亲和力使得可方便地筛选这样随机产生的抗体变体。
制备这种抗体变体的一种有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085)。这里，一个或多个超变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基替代以影响氨基酸与来自不同哺乳动物种类的抗原的相互作用。然后，通过在取代位点进一步引入其它突变而优化那些对于取代表现出功能敏感性的超变区残基。这样，虽然预先确定了引入氨基酸序列突变的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。按照本文的描述对用这种方法产生的ala-突变体的生物学活性进行筛选。
通常我们将从保守性取代开始，如“优选取代”中列出的那些。如果这些取代导致生物活性(例如结合亲和力)改变，则可引入更实质性的变化并筛选产物，这些变化在表1中叫做“示例性取代”，或如下文在氨基酸分类中更详细描述。
优选取代：
Figure GPA00001140320700991
Figure GPA00001140320701001
对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对于维持以下几方面的效果明显不同的取代来完成：(a)取代区域多肽主链的结构，例如，呈片层或螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。可根据氨基酸侧链特性的相似性将天然产生的残基分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性：cys，ser，thr，asn，gln；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：his，lys，arg；
(5)影响链定位的残基：gly，pro；和
(6)芳香性：trp，tyr，phe。
非保守性取代是将这些类别之一的一个成员换成另一类别的成员。
在另一个实施方案中，所选修饰位点采用噬菌体展示实现亲和力成熟(见上文)。
通过本领域已知的各种方法制备编码氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于：对之前制备的亲代抗体的突变体或者非突变形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、以及盒式诱变。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，抗体变体将仅具有一个被取代的超变区残基。在其它实施方案中，亲代抗体的两个或多个，例如约2-10个，超变区残基将被取代。
通常，具有改进的生物学特性的抗体变体所具有的氨基酸序列与亲代抗体的重链或轻链可变区氨基酸序列有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。该序列的同一性或相似性在文中被定义为，与亲代抗体残基相同(即，相同残基)或类似(即，基于上述常见侧链特性来自相同组的氨基酸残基)的候选序列中氨基酸残基的百分数，需要将序列进行比对，如需要还要引入缺口，以实现最大序列同一性百分数。在抗体序列可变区之外的无论是N-末端、C-末端、或者内部的延伸、删除或插入都不会影响序列同一性或相似性。
在产生抗体变体之后测定该分子相对于亲代抗体的生物学活性。如上所述，可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。在本发明的优选实施方案中，制备了一组抗体变体并根据对抗原或其片段的结合亲和力进行筛选。可任选对从这种初步筛选中选出的一个或多个抗体变体进一步进行一种或多种生物学活性实验以证实这种具有增强的结合亲和力的抗体变体例如在临床前研究中确实是有用的。
可对如此选出的抗体变体进行进一步修饰，这通常取决于抗体的用途。这种修饰可涉及进一步改变氨基酸序列，与异源多肽融合和/或共价修饰，如下文所述。就氨基酸序列改变而言，示例性的修饰如上文所述。例如，任何不参与维持抗体变体正确构象的半胱氨酸残基也可被取代，通常用丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性以及防止异常交联。反之，也可在抗体中加入半胱氨酸键以提高其稳定性(尤其当抗体是抗体片段如Fv片段时)。另一种类型的氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体内的一个或多个糖部分，和/或加入一个或多个抗体内不存在的糖基化位点而实现。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接指糖部分结合于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是糖部分与天冬酰胺侧链酶促结合的识别序列。这样，当多肽中存在这些三肽序列之一时就产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种糖结合于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以是5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。通常可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述的三肽序列而实现在抗体中加入糖基化位点(对于N-连接糖基化位点)。也可在原抗体序列中加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行这种改变(对于O-连接糖基化位点)。
当抗体包含Fc区时，其所连接的糖可被改变或除去。例如，U.S.2003/0157108(Presta，L.)描述了具有不结合岩藻糖的Fc区的成熟糖类结构的抗体。也可参见U.S.2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.)。Jean-Mairet等的WO 2003/011878和Umana等的美国专利号6,602,684中提到了在结合于抗体Fc区的糖中具有平分型N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的抗体。在结合于抗体Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体报道于Patel等的WO 1997/30087，也可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO1999/22764(Raju，S.)，它们涉及Fc区结合被改变的糖的抗体。也可参见US 2005/0123546(Umana等)以了解具有修饰的糖基化的抗原结合分子。
本文中，优选的糖基化变体包含Fc区，其中结合于Fc区的糖不含岩藻糖。这种变体具有改进的ADCC功能。任选地，Fc区还包含一个或多个氨基酸取代以进一步改进ADCC，例如，在Fc区第298、333和/或334位(残基的Eu编号)进行取代。涉及“脱岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108、WO 2000/61739、WO2001/29246、US 2003/0115614、US 2002/0164328、US 2004/0093621、US2004/0132140、US 2004/0110704、US 2004/0110282、US 2004/0109865、WO 2003/085119、WO 2003/084570、WO 2005/035586、WO 2005/035778、WO2005/053742、Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。制备脱岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖化的Lec13 CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；U.S.2003/0157108，Presta，L；和WO 2004/056312，Adams等，尤其是实施例11)，以及敲除细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8-敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
(xii)重组制备抗体
为重组制备抗体，分离其编码核酸并插入可复制载体以进一步克隆(扩增DNA)或表达。采用常规方法(例如，采用能够特异性结合抗体重链和轻链编码基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。可获得许多载体。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、以及转录终止序列(如美国专利5,534,615所述，通过引用将其专门纳入本文)。
用于在本文所述载体内克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母、或上述高级真核生物细胞。用于此目的的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，埃希氏杆菌属(Escheriachia)如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽胞杆菌属如枯草杆菌和地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266710中所公开的地衣芽胞杆菌41P)、假单胞菌属如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是E.coli 294(ATCC 31446)，但其它毒株如E.coli B、E.coli X 1776(ATCC 31537)和E.coil W3110(ATCC27325)也是合适的。这些实例仅用于列举而非限制。
除了原核细胞，真核微生物如丝状真菌或酵母也是合适的抗体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的烘焙酵母常用的低级真核宿主微生物。然而，许多其它属、种和菌株在本文中通常是可用的，例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、沃尔特氏克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)，耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗威亚酵母属(yarrowia)(EP402226)；巴士德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP 183070)；假丝酵母属；里西亚木霉(Trichoderma reesia)(EP 244234)；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别了各种杆状病毒株和变体以及来自宿主的相应的容许昆虫宿主细胞，所述宿主例如：草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。各种转染用病毒株是公众可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾的L-1变体NPV以及家蚕的Bm-5株NPV，这些病毒可用作本文所述的病毒，尤其用于转染草地贪夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛话、西红柿以及烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，更感兴趣的是脊椎动物细胞，在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已成为惯用方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆的悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CCL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(HepG2，HB 8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TR1细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞、以及人肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以制备抗体，并在适当改变的常规营养培养基内培养，所述培养基经过合适的改良以诱导启动子、选择转化体、或扩增编码所需序列的基因。
用来制备本发明抗体的宿主细胞可在各种培养基内培养。市售培养基如Ham’s F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM)，Sigma)、RPM-1640(Sigma)和Dulbecco改进的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，如Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、或者5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195、或者美国再颁布专利Re.30985所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。可视需要在任意这些培养基中添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁、以及磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GentamycinTM)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的有机化合物)、以及葡萄糖或等同的等量源。还可以以本领域技术人员所知的适当浓度包含其它所需补充物。培养条件，如温度、pH值等等，之前已经用于所选表达宿主细胞，并且对普通技术人员而言很清楚的。
当采用重组技术时，抗体可在细胞内产生、在周质空间内产生、或者直接分泌到培养基中。如果抗体是在胞内产生的，第一个步骤是除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解细胞)，可通过例如离心或超滤进行。当抗体分泌到培养基时，通常首先用市售蛋白质浓缩滤器如Amicon或MilliporePellicon超滤单元从这种表达系统浓缩上清液。上述步骤可任意包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并可包括抗生素以防止外来污染物生长。
可采用，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，优选亲和层析，纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A是否适合作为亲和配体取决于抗体内存在的免疫球蛋白Fc区的种类和同型。蛋白A可用来纯化基于人γ、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质大多是琼脂糖，但也可使用其它基质。相比琼脂糖，机械稳定的基质如可控孔径的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯允许较快的流动速率和较短的通过时间。当抗体包含CH3域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可用于纯化。根据要回收的抗体的性质，也可使用其它蛋白质纯化技术，如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
D.Bv8拮抗剂的应用
本发明的Bv8拮抗剂可单独使用或与抑制血管生成尤其是炎性细胞依赖性血管生成和/或肿瘤发生的其它治疗剂联合使用。
本发明治疗方法的主要目标是已显示出或者已知对VEGF拮抗剂尤其是抗-VEGF抗体治疗有耐药性的肿瘤。
用本发明方法治疗的疾病和病症的实例包括肿瘤性疾病，如术语“癌症”和“癌性”中所述的那些。能够用本发明拮抗剂治疗的非肿瘤性症状包括但不限于：例如，不希望的或异常增生、关节炎、类风湿关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、心肌梗塞造成的水肿、糖尿病性和其它增生性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管、角膜移植新生血管形成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新生血管形成、眼角新生血管形成(发红)、眼部新生血管疾病、血管狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、肺恶性胸腔积液、脑水肿(例如、与急性中风/闭合性颅脑损伤/创伤相关)、滑膜发炎、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三间隙液体疾病(胰腺炎、隔综合征、烧伤、肠道疾病)、子宫肌瘤、早产、慢性炎症如IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肾移植排斥、炎性肠病、肾病综合症、不希望的或异常肿块增长(非癌症)、肥胖、脂肪组织大规模增长、血友病性关节、肥厚性疤痕、头发生长受抑、毛细血管扩张症、化脓性肉芽肿、晶状体后纤维增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(如与心包炎相关的心包积液)、和胸腔积液。
本发明提供了联合治疗，其中本发明的Bv8拮抗剂与另一种疗法联合施用。联合治疗具体包括与VEGF拮抗剂如抗-VHGF抗体联合施用本文所述的Bv8拮抗剂。此外，抑或或者，本文所述的Bv8拮抗剂可与一种或多种其它药剂联合施用，例如，骨髓细胞减少剂、抗癌剂或疗法、抗-血管生成剂、或者抗-新生血管形成治疗剂，从而治疗各种肿瘤性或非肿瘤性症状如炎性细胞依赖性血管生成或肿瘤发生。
在一个实施方案中，所述肿瘤性或非肿瘤性症状的特征为对VEGF拮抗剂治疗具有耐药性的与异常或不希望的血管生成相关的病理症状。本发明的拮抗剂可连续施用，或者与对于治疗目的有效的其它试剂组合在相同组合物中或作为单独组合物施用。可替代地，或此外，也可施用本发明的多重拮抗剂、试剂和/或激动剂。
拮抗剂和/或试剂的施用可同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或多种采用相同或不同施用途径的独立组合物。可替代地，或此外，给药可采取任何顺序依次完成。在某些实施方案中，两种或多种组合物之间的施用间隔可以是数分钟、数天、数周、数月。例如，可先施用VEGF拮抗剂，然后施用不同拮抗剂或试剂，如本发明的骨髓细胞减少剂(除VEGF拮抗剂)。然而，也可考虑同时施用或者先施用本发明的不同拮抗剂或试剂。
所施用的治疗剂的有效量将由医生或兽医决定。施用和调节剂量以实现对待治疗疾病的最大控制。剂量还将取决于诸如使用的治疗剂类型和被治疗的特定患者等因素。合适的VEGF拮抗剂剂量是目前使用的剂量，并且，由于VEGF拮抗剂和本发明不同拮抗剂的联合作用(协同效应)可适当降低该剂量。在某些实施方案中，所述抑制剂的联合加强了单个抑制剂的功效。术语“加强”表示提高常规剂量或批准剂量的治疗剂的功效。也可参见本文题为“药物组合物”的章节。
与癌症有关的抗血管生成疗法是以抑制为支持肿瘤生长提供营养所需的肿瘤血管的发展为目标的癌症治疗方法。由于血管生成同时涉及原发性肿瘤生长和转移，因此，本发明提供的抗血管生成治疗能够抑制原发位点的肿瘤瘤性生长以及防止肿瘤转移到二级部位，从而允许肿瘤被其它疗法攻击。在本发明的一个实施方案中，抗癌药或治疗是抗血管生成剂。在另一个实施方案中，抗癌药是化疗剂。
许多抗血管生成剂已被鉴定并且是本领域已知的，包括本文中列出的那些，例如，定义中所列出，以及下述文献中列出的，例如，Carmeliet和Jain，Nature 407：249-257(2000)；Ferrara等，Nature Reviews：DrugDiscovery，3：391-400(2004)；和Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。也可参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂与抗-VEGF中和抗体(或片段)和/或其它VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂联合使用，其中包括但不限于：例如，可溶性VEGF受体(例如，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，神经营养蛋白(例如，NRP1，NRP2))片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、抗-VEGFR中和抗体，VEGFR酪氨酸激酶(RTK)低分子量抑制剂、VEGF反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF拮抗剂变体，以及它们的任意组合。可替代地，或此外，除了VEGF拮抗剂和本发明的其它试剂，可任选将两种或多种血管生成抑制剂共施用于患者。在某些实施方案中，一种或多种额外的治疗剂，例如，抗癌药，可与本发明试剂、VEGF拮抗剂、和/或抗-血管生成剂联合施用。
在本发明的某些方面，用于与本发明的Bv8拮抗剂联合治疗肿瘤的其它治疗剂包括其它癌症疗法，例如，手术、放疗(例如，辐照或施用放射性物质)、化疗、用文中列出的且本领域已知的抗癌药治疗，或者它们的联合。可替代地，或此外，结合相同的本文所述抗原或者两种或多种不同的本文所述抗原的两种或多种抗体可共施用于患者。同时，向患者施用一种或多种细胞因子可能也是有益的。
在某些方面，本发明提供了一种通过给疑似患有癌症或被诊断有癌症的患者施用有效量的VEGF拮抗剂和本发明拮抗剂以及一种或多种化疗剂，来阻断或降低耐药性肿瘤生长或癌细胞生长的方法。许多化疗剂都可用于本发明的联合治疗。化疗剂的示例性、非限制性列表提供于本文的“定义”章节。
本领域熟练技术人员将了解，化疗剂的合适剂量通常接近其在临床疗法中已经使用的剂量，在所述临床疗法中，化疗剂单独施用或与其它化学疗法联合施用。可根据要治疗的症状改变剂量。进行治疗的医生将能够确定适合特定个体的剂量。
本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长描述的是以下情况，即患者正在经历或已经接受的一种或多种现有疗法(例如，癌症疗法，如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法、抗-VEGF抗体治疗，尤其是特定癌症的标准治疗方案)在临床上不足以治疗该患者，或者患者从治疗中无法再获得任何有益效果，从而这些患者需要其它有效疗法。文中，该短语还表示“无应答/难治”患者的症状，例如，它描述了对治疗有应答但遭受副作用的患者、产生耐药性的患者、对治疗无应答的患者，对治疗没有满意应答的患者，等等。在不同实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞的数目没有显著降低，或有增加，或者肿瘤体积没有显著降低，或有增加，或者癌细胞的体积或数目不再降低。对于癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，可通过本领域已知的用来检测治疗对癌细胞的功效的任何体内或体外方法，并采用本领域接受的关于“复发”或“难治”或“无应答”的含义进行确定。对抗-VEGF治疗有耐药性的肿瘤是复发性肿瘤生长的一个实例。
本发明提供了通过施用一种或多种用于阻断或降低个体复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的本发明拮抗剂，来阻断或降低个体中复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法。在某些实施方案中，所述拮抗剂可在癌症治疗后施用。在某些实施方案中，本发明拮抗剂是与癌症治疗如化疗同时施用的。可替代地，或此外，拮抗剂疗法可与其它癌症治疗交替进行，并且可以任意顺序进行。本发明还包括施用一种或多种拮抗性抗体以防止有癌症倾向的患者发生或复发癌症的方法。通常，所述个体曾经或正在接受癌症治疗。在一个实施方案中，所述癌症治疗是用抗-血管生成剂，例如，VEGF拮抗剂治疗。所述抗-血管生成剂包括本领域已知的那些以及本文在定义中列出的那些。在一个实施方案中，所述抗-血管生成剂是抗-VEGF中和抗体或片段(例如，人源化A4.6.1，
Figure GPA00001140320701131
(Genentech，South San Francisco，CA)，Y0317，M4，G6，B20，2C3，等等)。参见，例如，美国专利6,582,959、美国专利6,884,879、美国专利6,703,020、WO98/45332、WO 96/30046、WO94/10202、EP0666868B1，美国专利申请20030206899、20030190317、20030203409和20050112126，Popkov等，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)，和WO2005012359。其它试剂可与VEGF拮抗剂或本发明拮抗剂联合施用以阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如，参见“联合治疗”章节。
在一个实施方案中，本发明的Bv8拮抗剂可与一种或多种骨髓细胞减少剂联合施用，其中包括但不限于：降低Gr1、中性白细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP或URRTP表达的疗法。与本发明Bv8拮抗剂联合使用的骨髓细胞减少剂具体包括Gr1拮抗剂、Cd11B拮抗剂、CD18拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂、MIP-1α拮抗剂、氯膦酸盐，它们可单独使用或采取任意组合。
此外，本发明的Bv8拮抗剂可与激素、放疗和化疗剂联合施用，从而使癌细胞对这些试剂中的一种或多种重新敏感，然后施用(或继续施用)这些试剂以治疗或管控制癌症，包括防止转移。
为评估肿瘤对VEGF拮抗剂治疗的敏感性，可从个体获得一个或多个待测细胞群，包括能够表达一种或多种与URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP编码核酸同源的核酸序列的细胞。将序列的表达与参比细胞群进行比较。可采用任何参比细胞群，只要参比细胞群中细胞的VEGF拮抗剂敏感性状态是已知的即可。可在相同或不同时刻测量的测试样品和参比样品之间进行比较。不同时刻的一个实例是使用编译过的表达信息，例如序列数据库，其将已知序列在敏感状态已知的细胞内的表达水平信息进行了汇编。在本发明的某些实施方案中，参比细胞群富含CD11b+Gr1+骨髓细胞。在本发明的某些实施方案中，参比细胞群富含肿瘤细胞。
VEGF拮抗剂耐药性肿瘤也可用2007/3/28提交的待决申请序列号11/692682中提供的诊断标记组来鉴定。例如，标记组可包括两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多、七个或更多、八个或更多、九个或更多、十个或更多、十一个或更多、十二个或更多、十三个或更多、十四个或更多、十五个或更多、二十个或更多、或者整组的分子。所述分子是编码蛋白质或具有改变的表达和/或活性的蛋白质的核酸，并选自下组：Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IL10-R1、Erb-2.1、窖蛋白3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecam1、Tlr3、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、CD14、expi、IL-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、水通道蛋白-1、SCF38、APOE、FABP、IL-11R、IL-1RII、IFN TM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌载体膜1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、促血管生成素样蛋白-6、Eph-RA7、脑信号蛋白V1b、神经营养蛋白5、密蛋白-18、MDC15、ECM、ADAMTS7B、NCAM-140、III型纤连蛋白、WIP、CD74、ICAM-2、Jagged1、Itga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFb 1EP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-选择蛋白、IL-15、细胞因子信号传导抑制剂4、Cytor4、CX3CR1、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、A型清除剂受体、巨噬细胞C-型凝集素、Pigr3、巨噬细胞SRT-1、G蛋白偶联受体、ScyA7、IL-1R2、IL-1诱导蛋白、IL-1β、ILIX前体、TGF-B、FIZZ1、Wfs1、TP 14A、EMAP、SULF-2、胞外基质2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-α、肝配蛋白B1、SPARC-样蛋白1和脑信号蛋白A。在本发明的一个实施方案中，提供的抗体能检测蛋白质。在一个实施方案中，所述分子衍生自CD11b+Gr1+细胞，并包括，例如，IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1和Crea7。在另一个实施方案中，所述分子衍生自耐药性肿瘤，并包括，例如，MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、ILlO-R2、THBSP-4、和JAM-2。
E.药物组合物和施用
本发明的Bv8拮抗剂，如抗-Bv8抗体，可按照已知方法，如静脉内推注施用或在一段时间内连续输注、肌内施用、腹膜内施用、脑脊髓内施用、皮下施用、关节内施用、滑膜内施用、鞘内施用、口服施用、表面施用或吸入途径施用、和/或皮下施用，单独地或与其它治疗剂联合施用于人类患者。
在某些实施方案中，本发明的治疗涉及联合施用Bv8拮抗剂和VHGF拮抗剂和/或一种或多种骨髓细胞减少剂或化疗剂。在一个实施方案中，存在其它抗癌药，例如，一种或多种不同的抗-血管生成剂，一种或多种化疗剂，等等。本发明还考虑使用多重抑制剂，例如，针对相同抗原的多重抗体或者针对不同蛋白质的多重抗体。在一个实施方案中，与Bv8拮抗剂一起施用不同化疗剂的混合物。联合给药包括利用不同制剂或单个药物制剂共给药、和/或以任意顺序连续给药。例如，VEGF拮抗剂可在Bv8拮抗剂之前、之后施用，或与Bv8拮抗剂交替施用，或者可与之同时施用。在一个实施方案中，有一段时间两种(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性。
为预防或治疗疾病，本发明试剂的合适剂量将取决于要治疗疾病的类型(如上所述)、疾病的敏感性和病程、抑制剂是出于预防还是治疗目的而施用、之前的治疗、患者的临床史和对抑制剂的应答，以及主治医师的判断。抑制剂可一次性施用或在一系列治疗中施用。在联合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。文中，治疗有效量为，施用的本发明组合物和/或共施用的VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂能减轻或抑制目标疾病或症状的量。施用药剂联合的效果可以是加成性的。在一个实施方案中，所述给药结果是协同效果。治疗协同量为，VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂，如Bv8拮抗剂和任选的骨髓细胞减少剂、化疗剂和/或抗癌药协同地或显著地减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的量。
根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)Bv8拮抗剂、VHGF拮抗剂、骨髓细胞减少剂、化疗剂或抗癌药是最初施用于患者的候选剂量，与该剂量是否通过一种或多种单独给药或通过连续输注施用的无关。取决于上述因素，典型的日剂量可以从约1μg/kg至约100mg/kg或更高。对于在数天或更长时间内重复给药，根据症状，治疗可持续到疾病症状被抑制。然而，其它剂量方案也是有效的。通常，临床医生将施用本发明的分子直到剂量达到能提供所需生物效应。本发明的治疗过程容易通过常规技术和实验监测。
例如，血管生成抑制剂(例如抗-VEGF抗体，如
Figure GPA00001140320701171
(Genentech))的制备和剂量方案可按照制备商的说明书进行，或者由熟练技术人员凭经验确定。在其它实施例中，这种化疗剂的制备和剂量方案可按照制备商的说明书进行，或者由熟练技术人员凭经验确定。化疗的准备和剂量方案也描述于Chemotherapy Service，MC.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
可通过评价肿瘤性和非肿瘤性疾病时通常采用的各种终点来测量本发明治疗的功效。例如，癌症治疗可通过以下终点评价，其中包括但不限于：肿瘤消退、肿瘤重量或体积缩小、进展的时间、存活期、无发展存活率、整体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性。由于本文所述的抗血管生成剂靶向肿瘤脉管系统而不必然是肿瘤性细胞本身，它们是一类独特的抗癌药，因此可能需要独特的有关药物临床应答的测量方法和定义。例如，二维分析中肿瘤缩小超过50％是表明有应答的标准截断值。然而，本发明的抑制剂可能会抑制转移传播但不会使原发性肿瘤缩小，或者可能仅具有肿瘤抑制效应。因此可采用测量治疗功效的方法，其中包括，例如，测量与血管生成有关的血浆或尿液标记物以及通过放射成像测量应答。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗疾病或诊断疾病的材料的制成品。该制成品包含容器、使用说明的包装插页。合适的容器包括，例如，药瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料，如玻璃或塑料制成。在一个实施方案中，所述容器装有或含有能有效治疗症状的组合物，并具有无菌存取口(例如，所述容器可以是具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物的至少一种活性剂是VEGF调节剂，至少第二活性剂是骨髓细胞减少剂和/或化疗剂。标签或包装插页显示该组合物可用来治疗所选症状。所述制备品还可包含第二容器，其中装有药学上可接受的稀释缓冲剂，如磷酸盐缓冲溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。
本发明的其它细节通过以下非限制性实施例阐述。
实施例1
材料和方法
Taqman TM 基因表达分析
用RNeasy Mini
Figure GPA00001140320701181
(Qiagen)制备组织或细胞的RNA。进行实时PCR(TaqmanTM)分析，每次反应使用50ng总RNA。对于小鼠/人Bv8和EG-VEGF/Bv8受体1(PKR-1/EG-VEGFR1，R2)，采用睾丸RNA(BDBiosciences)作为对照。对于小鼠/人EG-VEGF/Bv8受体2(PKR-2/EG-VEGFR2，R2)，采用下丘脑或全脑(BD Biosciences)作为对照组织。在实时PCR系统(9600 Emulation mode of 7500 Real(PerkinElmer)time PCR system)(Applied Biosystems)上进行反应，将具有标准曲线的绝对量化用于序列检测系统(SDS)软件分析。用持家基因RPL19进一步量化同一样品中各基因的表达水平。为证实VEGFR-1、VEGFR-2、EG-VEGF/Bv8 R1和EG-VEGF/Bv8 R2在肿瘤相关内皮细胞内的表达，用Titan One TubeTM RT-PCR系统(Roche)进行标准RT-PCR，在2％琼脂糖凝胶(Invitrogen)上检测终产物的正确大小。TaqmanTM引物序列如下：
小鼠Bv8正向：GCA TGA CAG GAG TCA TCA TTT T(SEQ ID NO：7)，反向：AAATGG CAG GAT ATC AGG AAA(SEQ ID NO：8)，探针：AAACTT TAT TTG TAA CCC AAA GG I CTA ATG I AA ATG GA(SEQ ID NO：9)；
人Bv8正向：ATG GCA CGG AAG CTA GGA(SEQ ID NO：10)，反向：GCA GAG CTG AAG TCC TCT TGA(SEQ ID NO：11)，探针：TGC TGCTGG ACC CTT CCT AAA CCT(SEQ ID NO：12)；
小鼠Bv8 R1正向：CAG CGC ACA TGA AGA CTT G(SEQ ID NO：13)，反向：GTC ATC TTC GGT TTC CTG AGT(SEQ ID NO：14)，探针：TCC AGG CAG CAC CCC TGATG(SKQ ID NO：15)；
小鼠Bv8 R2正向：GAA CTC CAC GTG AGC GCA(SEQ ID NO：16)，反向：GGG TCC CAT GTT GAT GAT GC(SEQ ID NO：17)，探针：CTCCCT GAT ACA CAC CAG CCC ACC TG(SEQ ID NO：18)；
人Bv8 R1正向：CTG GAA GGC TTC TTA CAA TGG(SEQ ID NO：19)，反向：GGC ATC CCA ATT GTC TTG A(SEQ ID NO：20)，探针：TCCAGG TCT GCA CTG GAC TTA CCG(SEQ ID NO：21)；
人Bv8 R2正向：TCA CCA TCG TTC GTG ACT TC(SEQ ID NO：22)，反向：AGA AGG CAG TGA GG T AGT GCT T(SEQ ID NO：23)，探针：TCC TTC ACG AAC ACA GTG GGG AA(SEQ ID NO：24)；
小鼠RPL19正向：AGG TCA AAG GGA ATG TGT TCA AA(SEQ IDNO：25)，反向：CCT TGT CTG CCT TCA GCT TGT(SEQ ID NO：26)，探针：ACA AGC GCA TCC TCA TGG AGC ACA TC(SEQ ID NO：27)；
人RPL19正向：CGC AAG CGC CGT GAA(SEQ ID NO：28)，反向：GGT CTC TTC C rC CTT GGA TAA ACT C(SEQ ID NO：29)，探针：CCAGGC CAA GAA GGA GGA GAT CAT CA(SEQ ID NO：30)；
流式细胞术
从移植了各种肿瘤类型的小鼠收获BM单核细胞(BMMNC)、PB和肿瘤细胞。血红细胞用Ack(Cambrax，MA)裂解缓冲液裂解，然后用偶联于APC的大鼠抗-小鼠CD11b(Myletnyi Biotech，CA)和偶联于PE的大鼠抗-小鼠Gr1(BD Biosciences，CA)染色。为除去死细胞，在所有样品中加入7AAD(aminoactiomycin D；BD Biosciences CA)，之后在FACSCalibur仪器内获取数据。
迁移实验
从初次接受实验的灰褐色裸鼠分离BMMNC并用CD11b微珠(Miltenyi Biotech，CA)按照制备商提供的方法分选CD11b+Gr1+群。取等分量的分选细胞，用抗-CD11bAPC和抗Gr1-PE染色以确保CD11b+Gr1+细胞的纯度(100％)。进行迁移实验时将2.0×105细胞铺在穿孔(CorningIncorporated，NY)的上室内。每个孔的下室有600μL培养基(IMDM(GibcoBRL，CA)，补加有BIT(Stem Cell Technologies，BC，Canada)，其中含有人Bv8、对照抗体和鼠重组VEGF。细胞在37℃和5％CO2下培育9小时，并通过计数下室内的细胞评价CD11b+Gr1+细胞的迁移。
在培养的BMMN细胞内调节Bv8基因表达
重组小鼠MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、bFGF、VEGF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1和TNFα购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。重组小鼠KC、IFNγ、Bv8(前动力蛋白-2)、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β获自PeproTechInc.(Rocky Hill，New Jersey)。所有细胞因子以10ng/ml使用，但VEGF和Bv8为50ng/ml。使用1∶3稀释的条件培养基(最终FBS浓度为0.17％)。用总细胞数将数据标准化。用含10％FBS的DMEM从小鼠腿骨冲洗出BM细胞。细胞1200rpm离心5分钟并重悬于含0.2％BSA的HBSS培养基(低内毒素，Serologicals Corp.Norcross，GA)。将2,000,000细胞与各种细胞因子一起在24孔板内在37℃5％CO2培养箱内培育4小时。然后将细胞转移到离心管内，离心并用RNA裂解缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)裂解。Bv8表达用TaqmanTM评价，以RPL19(核糖体蛋白L19)作为内部对照基因。有些情况下，CD11b+Gr1+或CD11b-Gr1-BM细胞通过FACS分选获得。
为检测抗-G-CSF抗体对肿瘤环境诱导的Bv8基因表达的影响，用已经植入小鼠24-36小时的HM7肿瘤的裂解产物或用对照缓冲液将分离自Balb c/裸鼠的BMMNC处理4小时。肿瘤裂解产物用各种浓度的山羊抗-G-CSF中和多克隆IgG(AF-414-NA，R&D Systems)或对照山羊IgG(R&DSystems)预处理45分钟，然后加入到BMMNC。验证抗-G-CSF IgG阻断小鼠和人G-CSF的能力。随后用TaqmanTM分析评价Bv8在BMMNC中的表达。研究使用了9只动物并对三次独立研究的数据进行分析。
收集用肿瘤细胞调节的培养基
A673、HM7、HPAC和Calu6细胞在生长培养基内培养直到达到约90％汇合。然后将生长培养基换成含0.5％FBS的DMEM∶F12(50∶50)培养基。将密度为5×105/ml的指数生长的TIB42细胞转移到含0.5％FBS的DMEM∶F12培养基中。培育3天后收集调节过的培养基。用Vi-CellTM细胞活力分析仪(Beekman Coulter)测量细胞活力和总细胞数。
肿瘤细胞增殖实验
A673、HM7、HPAC和Calu6细胞用胰蛋白酶处理并用含0.5％FBS的培养基洗涤，然后接种到96孔黑色板(Packard Bioscience Company.Meriden.CT)。细胞与不同量的Bv8(PeproTech Inc.，Rocky Hill，NJ)培育3天。将含10％FBS的培养基作为阳性对照。采用细胞增殖ELISA试剂盒(Roche)通过BrdU掺入评价细胞增殖。
体内G-CSF和抗-G-CSF研究
连续8天每天给8周龄Balb/c小鼠皮下注射10μg重组人G-CSF(Neupogen，Amgen)。对照动物接受PBS。在研究结束时选取BM、全血和脾样品进行分析。一组动物在停止注射G-CSF后维持2天。用基于流式细胞术的自动化高分辨率血液分析仪(CellDyn 3000)对中性白细胞计数。血清和BM Bv8水平通过ELISA测量。
为确定Bv8在G-CSF-诱导的CD11b+Gr1+细胞动员中的作用，给Balb/c裸鼠施用两份剂量抗-Bv8抗体(5+5mg/kg)，两次间隔12小时，施用第二份剂量单克隆抗体4小时后施用小鼠G-CSF(R&D Systems；2μg/小鼠)。对于阳性对照，我们采用大鼠抗-小鼠G-CSF Mab(Mab414，R&DSystems；10μg/小鼠)，间隔时间与抗-Bv8相同，然后施用小鼠G-CSF。6小时后对小鼠采血并按照描述测定CD11b+Gr1+细胞的频率。为确定在没有肿瘤时G-CSF在调节Bv8表达中的作用，连续8天每天给Balb/c裸鼠i.p.注射对照大鼠IgG(Genentech)或大鼠抗-G-CSF Mab(Mab414，R&DSystems，10μg/小鼠)。对动物实施安乐死并从BMMNC提取总蛋白。如上所述通过ELISA测定Bv8水平。为评价G-CSF调节肿瘤中Bv8表达的显著性，用10μg大鼠抗-G-CSF Mab或大鼠IgG按照上文所述预处理Balb/c裸鼠，12小时后植入HM7细胞(5×106/小鼠)。对照植入空白MatrigelTM。之后两天每天给动物施用抗体。植入MatrigelTM或肿瘤48小时后将小鼠安乐死，并如上所述测量BMMNC的Bv8水平。
抗-Bv8中和抗体的产生和筛选
产生针对重组人Bv8蛋白的小鼠单克隆抗体。用两次独立实验筛选抗体。一个实验基于Bv8蛋白诱导牛肾上腺皮质衍生的内皮细胞增殖的能力，如上所述(LeCouter等，2003，同上)。第二个实验关注Bv8诱导稳定表达其各种受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中信号传导级联的能力。简言之，使稳定表达受NFAT启动子(Invitrogen)控制的β内酰胺酶基因的CHO细胞在添加10％胎牛血清的DMEM内生长。pMSCV-潮霉素中的人PKR1或PKR2 cDNA(Masuda，Y.等，同上，和Lin，D.C.等，同上)被转导。表达转基因的细胞在500mg/ml潮霉素上选择2周。随后根据制造商的说明，在hBv8刺激16小时后根据切割FRET-基荧光底物CCF4的能力通过FACS分选表达转基因的细胞。鉴定中和抗体阻断Bv8-诱导的β-内酰胺酶表达的能力。在存在或不存在各种浓度纯化的小鼠单克隆抗-Bv8抗体时，用100-200ng/ml hBv8刺激CHO-NFAT β-内酰胺酶PKR1或PKR2十六小时。刺激之后将细胞与CCF4培育1小时，然后用96孔板阅读器EnvisionTM(Perkin Helmer)测量荧光。
为直接确定Bv8在肿瘤发生期间的作用，我们利用了中和抗-Bv8单克隆抗体(Mab)。我们采用了与小鼠和人Bv8交叉反应的鼠Mab 3F1和2B9。根据这些Mab抑制Bv8-刺激的肾上腺皮质内皮细胞增殖(LeCouter等，Nature 412：877-884(2001))以及抑制被Bv8 GPCR转染的CHO细胞信号传导的能力进行选择。Mab 2B9最大抑制约70％的人或小鼠Bv8蛋白的促分裂作用，而Mab 3F1抑制最多50％。然而，两种Mab(各自的浓度为5-10μg/ml)的联合能完全阻断由100ng/ml人或小鼠Bv8引发的促分裂作用。经单独或联合检测，所述抗体在基础条件下或在用结构上无关的VEGF-A或相关的EG-VHGF刺激之后对内皮细胞增殖没有影响。同时，抗-Bv8Mab或Bv8本身在较宽浓度范围内对该研究中检测的肿瘤细胞系的增殖没有任何可检测影响(数据未显示)。
为确定最有效的体内治疗方案，在最初的实验中我们在A673模型内单独和联合使用Mab 3F1和2B9进行了剂量应答研究。如体外数据所预测的，两种Mab的联合比一种Mab更加有效。每周施用两次5mg/kg每种Mab对肿瘤生长实现了最大抑制效应。因此，该方案被用于所有随后的概念证实实验。除了A673横纹肌肉瘤，我们检测了其它模型，包括人HM-7、Jurkat、HPAC和Calu-6细胞系以及小鼠EL-4和TIB42淋巴瘤。
体内肿瘤研究
人肿瘤细胞系Calu-6、A-673、JURKAT、HPAC和HM7以及小鼠淋巴瘤细胞系EL4和TIB42生长于Ham′s F12低葡萄糖DMEM 1∶1，补充有10％v/v FBS、1％v/v青霉素/链霉素、2mM L-Gln和1μg/mlFungizoneTM(InvitrogenTM，CA)。所述细胞在95％空气/5％CO2气氛下于37℃培育。为进行小鼠异种移植实验，将肿瘤细胞以1×108个细胞/ml悬浮并皮下注射(100μl/小鼠)到Balb-c小鼠或灰褐色XID免疫缺陷裸鼠(Harlan Sprague Dawley，IN)的背侧。在接种肿瘤细胞24或48小时时开始i.p.施用抗-Bv8 mAb 2B9和3F1，总剂量为10mg/kg(每种Mab 5mg/kg)(n＝10)。作为对照，我们采用了抗-Ragweed Mab和抗-VEGF MabG6.31或B20(Liang，W.C.等，J Biol Chem 281，951-961(2006))。之后每周处理小鼠两次。每隔一天用椭圆体体积公式(6×L×W×H，其中L＝长度，W＝宽度，H＝高度)计算肿瘤体积(Tomayko，M.M.和Reynolds，C.P.，Cancer Chemother Pharmacol 24，148-154(1989))。为统计分析各组之间的差异，进行单向ANOVA，之后用JMP软件(SAS Institute Inc.)进行Tukey USD配对分析。P值＜0.005被认为是显著的。
组织学分析和免疫组织化学
肿瘤在中性缓冲的福尔马林中固定24小时，之后石蜡包埋。按照之前的描述进行H&E染色和免疫组织化学分析(参考资料)。简言之，在99℃，然后在室温，用靶抗原修复液(DAKO)分别对大鼠抗-小鼠PLVAP单克隆MECA-32(BD-Pharmingen)进行20分钟免疫组化染色。随后用生物素化的第二抗体(载体)和VcctastainABC EliteTM试剂检测第一抗体。用金属增强DAB(Pierce Chemical，IL)显示反应产物。切片用苏木精轻微复染、脱水并盖上盖玻片。
构建腺病毒载体
编码LacZ和mVEGF164的腺病毒载体之前已描述过(LeCouter等，2001，同上)。用AdEasy XLTM腺病毒载体系统(Stratagene)生成腺病毒mBv8。用AdEasy XLTM腺病毒载体系统(Stratagene)生成腺病毒mBv8。将C-末端有6×His标签的mBV8 cDNA(SEQ ID NO：36)克隆在pShuttle-CMV载体的XhoI和Hind III位点之间。所得pShuttle-CMV-mBV8质粒用pAdEasy-1TM在BJ5183-AD-1(一种用腺病毒主链预转化的电穿孔感受株)中重组。重组腺病毒Bv8质粒然后转染入AD-293细胞以包装病毒颗粒。腺病毒原液通过CsCl梯度纯化。用Adeno-X rapidTM滴定试剂盒(Clontech)测量腺病毒效价。
肿瘤相关内皮细胞的分离和定性
用磁珠分选系统(Miltenyi Biotech)分离肿瘤相关内皮细胞(TAEC)，过程基本如之前的描述(Hida等，Cancer Res 64：8249-8255(2004))。简言之，将TIB42小鼠淋巴瘤细胞注射入雌性灰褐色裸鼠的背外侧。当肿瘤直径达到约1000mm3时将其切离，切碎，然后用胶原酶II(WorthingtonBiochemical Corporation)消化。然后用100μm到40μm目滤器过滤细胞悬浮液。最后用FITC-CD31抗体(BD Biosciences)按照制备商的说明分选CD31+细胞。将CD31+细胞接种于含EGM-2MV培养基(Cambrcx)的明胶包被平板。培育24小时后用PBS洗涤数次以除去CD31+非贴壁细胞。
对于RT-PCR，用RNeasyTM minikit(QIAGEN)从培养的细胞提取RNA。对于所示实验，每50ul反应物采用80ng RNA并将cDNA扩增28轮。按照需要获得引物序列。将TIB42-TAEC细胞在添加0.5％BSA的基础培养基中饥饿6小时。
细胞然后用人重组Bv8(200ng/ml；PeproTech)、完全培养基(CM)、VEGF(100ng/ml；PeproTech)或BSA(0.5％)刺激。在规定的时间点收集细胞提取物。用PhosphoPlus p44/42 MAPKTM抗体试剂盒(Cell signaling)对TIB42-TAEC细胞提取物进行Western印迹分析。为评价该结果的一致性和再现性，每种条件以复份检验，且实验进行三次，获得了类似的结果。
对于体外管道形成，将TIB42-TAEC细胞(6-8代)在无血清培养基内饥饿5小时。之后收集细胞并重悬于添加了5％BSA和VEGF-A(100ng/ml)、Bv8(200ng/ml)或无添加物(对照)的无血清培养基。为进行特异性检测，在存在抗-Bv8 Mab(10μg/ml)时培育Bv8。在24孔MatrigelTM(BDBiosciences)预包被平板的每个孔内接种5×103个细胞并在36小时后评价管道形成。
微机断层扫描血管造影术
给HM7-肿瘤携带动物i.p.注射50ul肝素，10分钟后通过吸入二氧化碳安乐死。打开胸腔，在心尖制备切口，使聚乙烯插管(id 0.58mm，od0.96mm)穿过左心室并用5-0丝缝线固定于升主动脉。以6毫升/分钟的速率灌注17ml用0.9％盐水配制的0.1mM硝普钠溶液以提供最大血管舒张状态并除去血液。
Figure GPA00001140320701281
(Carver，MA)(一种市售铬酸铅乳胶)按照制备商的建议准备并以2ml/min的速率灌注17ml。使注入的乳胶混合物室温聚合60分钟，然后分离感兴趣的组织。切离的肿瘤用10％中性缓冲的福尔马林浸泡。
肿瘤用μCT40TM(SCANCO Medical，Basserdorf，Switzerland)X射线微机断层摄影(Micro-CT)系统成像。以大豆油作为背景介质进行肿瘤成像。以45kV能级、177μA电流和300毫秒积分时间操作X射线管以生成Micro-CT图像。在各向同性分辨率为16μm时获得轴向图像。
通过一系列图像处理步骤提取血管网和肿瘤。对容积Micro-CT图像数据采用1195Houndsfield单位(HU)的强度阈和形态过滤(腐蚀和扩张)以提取血管体积(VV)。以类似方式用8HU的强度阈从背景提取肿瘤体积(TV)。用VV和TV的比值计算血管密度(VV/TV)。通过目测样品亚组的切片结果来确定血管和肿瘤的强度阈。通过采用AVW图像处理软件包(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS)的C++和Python语言编写的内部图像分析算法进行计算。利用Analyze 6.0(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS)(一种图像分析软件包)从Micro-CT数据生成三维(3D)表面透视图。用JMP软件包(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)进行统计分析。用多重比较Dunnett检验评价Micro-CT值(VV，TV，VV/TV)的组间比较。P值低于0.05被认为是显著的。
Bv8蛋白的部分纯化和BMMNC裂解产物的Western印迹分析
每天给Balb/c小鼠(n＝20)皮下注射人G-CSF(10μg/天，Amgen)，同时腹膜内注射mGM-CSF(0.5μg/天，PeproTech)，持续4天，以增大CD11b+Gr1+群。在第5天，分离BM细胞并将细胞团重悬于2ml 0.5％Triton X-100TM。然后使细胞裂解产物通过25号针头四次，然后将盐浓度调至50mM NaCl。将粗提取物施加于用20mM Tris pH 7.2，50mM NaCl预平衡的肝素-琼脂糖
Figure GPA00001140320701291
柱(Hi-Trap，1ml)。该柱用两步线性梯度洗脱：50mM到1M NaCl，然后1M到2M NaCl，用20mM Tris，pH 7.2配制。流速为1ml/min。在280nm监测吸光度。收集1ml馏分并用ELISA和Western印迹检测mBv8。进行Western印迹分析时用Microcon
Figure GPA00001140320701292
旋转柱(MILLIPORE)将100μl馏分浓缩4倍，然后加样于4-20％SDS-PAGE(Invitrogen)。印迹用三种抗mBv8d的仓鼠抗体(2D3、3B8和4E10)的组合染色一夜，封闭液(PBST，0.1％Tween 20的PBS溶液和5％脱脂奶)中抗体终浓度为10μg/ml。洗涤三次之后将印迹与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-仓鼠IgG(ImmunoResearch Laboratories)培育，然后用增强的化学发光+Western印迹检测系统TM(GE Healthcare Bio-Science)显色。
小鼠Bv8ELISA
Figure GPA00001140320701293
96孔微板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6配制的1.0mg/ml 3F1抗体(小鼠抗-人BV8抗体，还结合小鼠Bv8)在4℃包被过夜。平板用含0.05％聚山梨酯20的PBS洗涤并用PBS配制的0.5％牛血清白蛋白、10ppm Proclin 300TM(Supelco，Bellefonte，PA)室温封闭1小时。将平板洗涤之后在其中加入用含0.5％牛血清白蛋白、0.05％聚山梨酯20、10ppm Proclin
Figure GPA00001140320701294
(Supelco，Bellefonte，PA)和0.35N NaCl(样品缓冲液)的PBS配制的小鼠BV8标准品(0.039-2.50ng/ml，2倍连续稀释，Genentech)和样品(最小1∶10稀释液)。将平板室温培育2小时。通过洗涤步骤除去未结合的抗体。加入生物素化4E10抗体(一种仓鼠抗-小鼠BV8抗体，Genentech)，然后加入链霉抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare，Buckinghamshire，英国)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)作为底物来检测与平板结合的抗体。加入1M磷酸终止反应。在TitertekTM堆栈阅读器(ICN，Costa Mesa，CA)上读取450nm的吸光度。用四参数回归曲线拟合程序(Genentech)对标准物的滴定曲线进行拟合。用落入标准曲线范围内的数据点来计算样品中小鼠BV8的浓度。
该实验可允许10％小鼠血清和10％裂解缓冲液，并对血清和组织裂解产物样品的敏感性为0.39ng/ml。该实验对BV8具有特异性。至多达30mg/ml的抗-VEGF G6-31人IgG1、人G-CSF和人VEGF，或者至多达5mg/ml的人EG-VEGF仅给出背景信号。该ELISA还可检测出人BV8，但仅有26％或更低的有效性。多达14ng/ml的抗-BV83F1和多达124ng/ml的抗-BV82B9的存在不会显著影响样品缓冲液中0.5ng/ml BV8的检测结果。
结果
为确定Bv8在BM中的表达是否受远端生长肿瘤的影响，将A673和HM7肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠。如图1a所示，通过ELISA发现，与植入空白MattigelTM相比，植入这两种肿瘤导致BM内的Bv8水平显著升高。
为表征BM中产生的Bv8蛋白以及验证我们的ELISA，对小鼠骨髓单核细胞(BMMNC)裂解产物进行肝素-琼脂糖亲和力层析。如补充(以后称为S)图1a所示，Bv8强烈结合该柱并在存在约0.4MNaCl时作为单峰洗脱。Western印迹分析也证实了这一点，印迹分析证明免疫反应性馏分中存在预期的约9kDa的条带(S图1b)。
BMMNC包含若干细胞亚组，主要是骨髓系和淋巴系。为阐明Bv8中富含哪种BMMNC亚组，将包括A673、Calu-6、HM7、HPAC和Jurkat在内的若干肿瘤细胞系植入小鼠。TaqmanTM分析表明，相比CD11b-Gr1-细胞(大多数是非骨髓亚组)，Bv8在CD11b+Gr1+骨髓细胞(主要由中性白细胞构成，但还包括巨噬细胞系细胞)中高度表达(图1b)(Yang等，CancerCell 6：409-421(2004)；Dahl等，Nat Immunol 4：1029-1036(2003)；Lagasse和Weissman，J Immunol Methods 197：139-150(1996))。
为鉴定可能参与调节Bv8表达的分子，检测了细胞因子/趋化因子诱导Bv8在未经TaqmanTM分选的BMMNC中表达的能力。大多数细胞因子不引发Bv8在BMMNC中的任何显著的上调(图1c)。然而，G-CSF(10ng/ml)导致Bv8显著上调(＞27倍，图1c)。所检测的细胞因子都不导致VEGF-A显著上调(数据未显示)。
对不同BMMNC亚组进行分析显示，G-CSF导致纯化的CD11b+Gr1+细胞中Bv8上调超过背景100倍(图1d)。在全BM或CD11b-Gr1-组分中检测到显著较低的G-CSF介导的Bv8上调。奇怪的是，GM-CSF没有影响Bv8表达(图1c和d)，因此强调了对该因子的调节的高选择特性。有趣的是，IL-6和SDF-1在未分选的BM细胞上检测时未显示出任何显著刺激性，而当在纯化的CD11b+Gr1+细胞上检测时导致Bv8显著上调2-3倍(图1c和d)。
为进一步表征CD11b+Gr1+细胞对G-CSF的应答，我们检测了较低(与生理更相关)浓度的细胞因子是否能诱导Bv8表达。同时，之前的研究显示，缺氧可提高Bv8基因表达(LeCouter等，2003，同上)，因此我们希望检测缺氧是否能调节Bv8对G-CSF的应答。如图1e所示，在低含氧条件下，低至20pg/ml的G-CSF导致Bv8表达受到约10倍刺激。这种刺激明显高于含氧正常条件下检测的结果(约5倍)。除了体外研究，在体内也证实G-CSF上调Bv8。给Balb/c小鼠施用重组G-CSF导致BM(图11)和血清(图2a)中Bv8蛋白水平呈时间-和剂量-依赖性上升，与外周血(PB)中性白细胞(图2b)中的升高一致。在Balb-c裸鼠中获得类似结果(数据未显示)。早在施用G-CSF 24小时后，BM中的Bv8水平就相比背景显著地升高了约30倍。血清水平也急剧上升。在停用G-CSF 48小时后BM和血清Bv8水平回到接近基线水平，表明Bv8受到BM中的G-CSF密切调控。然而，施用G-CSF对肾脏、脑和肝脏内的Bv8水平没有任何影响(数据未显示)。
G-CSF是粒细胞生成、成骨髓/成粒细胞前体细胞分化成中性白细胞的主要调节物。G-CSF还在中性白细胞响应各种环境应激而从BM动员中发挥关键作用，并由包括内皮细胞和成纤维细胞在内的若干细胞类型分泌(Christopher，M.J.& Link，D.C，Curr Opin Hematol 14，3-8(2007))。此外，G-CSF与其它造血细胞因子包括IL-6和SDF-1一起，由肿瘤和/或恶性肿瘤基质细胞持续表达(在Mueller，M.M.& Fusenig，N.H.，Differentiation 70，486-497(2002)中进行了综述)。为检测G-CSF、IL-6或SDF-1是否在我们的肿瘤模型中表达，我们测量了肿瘤细胞或肿瘤相关成纤维细胞调理培养基中这些细胞因子的水平。如S表1所示，尽管浓度不同，它们在两个隔室内都是可检测的。因此，G-CSF(和/或其它细胞因子)介导的Bv8在BM中上调可能有助于骨髓细胞动员。加入其它细胞因子有可能调节肿瘤中这些细胞的随后归巢，肿瘤相关骨髓细胞分泌的Bv8可能也可以调节肿瘤中这些细胞的随后归巢。
为确定G-CSF对于调节肿瘤微环境内Bv8表达的潜在作用，在存在抗-G-CSF或对照抗体时将培养的BMMNC与等分量的HM7肿瘤裂解产物一起培育(图1g)。分析Bv8转录物证实，与对照IgG处理的孔相比，用抗-G-CSF处理的BMMNC中Bv8表达有显著的剂量依赖性降低。有趣的是，当存在抗-G-CSF时，Bv8的表达水平低于未刺激水平，表明肿瘤匀浆内存在的Bv8表达抑制剂没有相反作用。体内研究证实了G-CSF在调节Bv8表达中的关键作用。与对照相比，用抗-G-CSF处理的非肿瘤携带小鼠体内Bv8蛋白显著降低(图1h)。
然后检测了G-CSF对于介导肿瘤携带小鼠的BM内Bv8上调是否发挥作用。如图1i所示，单克隆抗-G-CSF抗体基本上消除了肿瘤植入后不久在BM中出现的Bv8蛋白峰值，但对照IgG没有这种作用。用多克隆山羊抗-G-CSF IgG获得了类似的结果(数据未显示)。抗-G-CSF处理还导致非肿瘤携带小鼠和肿瘤携带小鼠体内循环的以及骨髓内的CD11b+Grl+细胞的频率显著减少(S图2c-f)。因此，尽管我们无法消除其它因素的影响，但我们的发现表明，无论是体外还是体内，Bv8的表达都依赖于G-CSF。
考虑到G-CSF强烈上调Bv8，我们希望确定Bv8对于重组G-CSF诱导的中性白细胞的动员是否有贡献(图1j)。亚最大剂量的G-CSF(2μg)在6小时内诱导CD11b+Gr1+显著动员到小鼠外周血中。抗-G-CSF抗体能完全阻断G-CSF的作用。抗-Bv8抗体(下文称为抗-Bv8)还抑制G-CSF-介导的CD11b+Gr1+细胞的动员(图1j)。然而，抗-Bv8对最大剂量G-CSF(10μg)诱导的动员几乎没有作用。因此，Bv8的功能可能是调节或增大G-CSF刺激的中性白细胞动员。
在体外，Bv8在穿孔实验中促进BM CD11b+Gr1+细胞迁移，其程度与SDF-1类似(S图3a)。抗-Bv8完全抑制Bv8-刺激的骨髓细胞迁移，但对于SDF-1诱导的迁移没有任何影响，从而证实了这种作用的特异性。在BM中对Bv8受体R1和R2进行TaqmanTM分析显示(S图3b和3c)，R2的表达高于R1。然而，R1和R2在介导BMMNC内Bv8信号传导中的精确作用仍有待确定。这些发现提示，Bv8及其受体的细胞类型特异性上调是肿瘤植入后骨髓基因激活程序的一部分。为进一步表征Bv8对造血系统细胞的作用，从初次接受实验的小鼠BM中分离了两种谱系(不含CD11b+Gr1+细胞的Lin-谱系和CD11b+Gr1+细胞)并用重组Bv8处理。对Lin-谱系进行分析显示，与对照相比，经Bv8处理的细胞有较高的CD11b+Gr1+细胞表达，表明Bv8改变了骨髓系细胞前体细胞群的命运(S图3d)。此外，分析细胞活力显示，Bv8处理孔中死细胞的数目显著低于对照，表明Bv8是原始造血细胞的潜在存活因子(S图3d)。为在功能上评价Bv8对Lin-细胞的影响，我们对经Bv8处理的细胞进行了CFU分析，分析结果显示与对照处理细胞相比有更多数量的集落(p＜0.05)(S图3e)。由于Bv8处理细胞中的死细胞少于对照，因此CD11b+Gr1+细胞的分析进一步支持了Bv8作为存活因子的作用(S图3f)。最后，用Bv8处理CD11b+Gr1+细胞导致MAPK途径以时间依赖性方式活化(数据未显示)。
为阐述Bv8在正常血细胞生成中的作用，在非肿瘤携带小鼠内检测了抗-Bv8或抗-Ragweed(下文称为对照)抗体。抗-Bv8或对照对于Balb/c裸鼠的正常血细胞生成以及血液参数均未显示出任何显著作用(S图4)。这些数据说明，在稳态、生理条件下，Bv8对于调节血细胞生成的作用非常有限。
为研究Bv8在体内肿瘤生长中的重要性，我们测试了施用抗-Bv8或对照抗体是否会以影响植入免疫缺陷小鼠的若干肿瘤细胞系的生长。如图2所示，在检测的所有肿瘤模型中，施用抗-Bv8导致肿瘤体积和最终肿瘤重量相比对照处理动物显著减小。在A673模型中，生长抑制为约80％，与用阻断小鼠和人VEGF-A的抗-VEGF Mab G6.31(下文称为抗-VEGF)或B20(数据未显示)获得的结果接近(Liang等，J Biol Chem281：951-961(2006))(图2a)。HM7肿瘤模型还证实了抗-Bv8治疗产生的显著生长抑制作用(图2b)。还在衍生自人HPAC(图2c)和Jurkat(图2d)细胞系的肿瘤中观察到显著的抑制作用。所示肿瘤植入实验在Balb/c裸鼠内进行。类似结果还在灰褐色裸鼠内观察到(数据未显示)。除了人异种移植，单独的或与抗-VEGF抗体联合的抗-Bv8也显示显著减小TIB-42抗-VEGF难治肿瘤的肿瘤体积(图2f)。终止治疗导致A673(S图3g)和HM7肿瘤(S图3h)携带小鼠中的肿瘤快速生长。此外，肿瘤分析显示浸润性CD11b+Gr1+细胞的数目增加(S图3i和j)。
为监测肿瘤发生不同阶段的骨髓细胞，我们研究了不同时间点上A673模型内BM、PB和肿瘤中CD11b+Gr1+细胞的动力学(S图5)。BM分析未显示抗-Bv8和对照处理小鼠之间的CD11b+Gr1+细胞频率有任何显著差异(S图5a)。然而，在所有检测时间点上，与对照处理小鼠相比，抗-Bv8处理导致PB中CD11b+Gr1+细胞的数目(数据未显示)和频率显著降低(S图5b)。此外，我们发现，在一些时间点上，与对照相比，抗-Bv8处理的A673肿瘤中CD11b+Gr1+细胞数目显著降低(S图5c)。采用流式细胞术(典型FACS曲线示于S图6)，还研究了植入Calu-6、HM7、HPAC和Jurkat细胞的小鼠的PB、肿瘤、BM和脾脏中CD11b+Gr1+细胞群的动力学(图3a&b，同时示于S图7d和e)。与A673肿瘤内进行的时程研究一致，用抗-Bv8处理导致PB中CD11b+Gr1+细胞频率显著降低，在上述所有肿瘤模型中亦是如此(图3a)。还观察到抗-Bv8处理动物肿瘤中CD11b+Gr1+数目显著降低(图3b)。这些发现表明，Bv8调节动员并潜在调节CD11b+Gr1+细胞归巢于肿瘤。此外，中性白细胞(主要通过Gr1表达鉴定(Okazaki，T.等，Int Immunol 18，1-9(2006))似乎是受抗-Bv8处理影响的主要群体。
之前的研究显示，移植骨髓细胞，包括CD11b+Gr1+细胞，能促进肿瘤生长，而将它们耗尽会降低生长。为直接评价骨髓亚组在Bv8-调节肿瘤生长中的作用，我们在植入肿瘤7天后从携带A673或HM7肿瘤的小鼠分离了BM CD11b+Gr1+细胞并将它们注入肿瘤。这导致抗-Bv8处理动物中肿瘤更加迅速地生长(图3c和d)。因此，过量CD11b+Gr1+细胞可能超过抗-Bv8处理引发的肿瘤生长抑制作用。为进一步表征骨髓和肿瘤中的骨髓亚组，我们用F480作为CD11b亚组中巨噬细胞浸润的标记物。我们发现，用抗-Bv8处理导致植入A673的小鼠的骨髓和肿瘤内的巨噬细胞(CD11b+F480+)数量少量减少(数据未显示)。因此，抗-Bv8似乎主要影响粒细胞亚组，同时以更加温和的程度影响肿瘤中的巨噬细胞亚组。
与MatrigelTM植入小鼠相比，在肿瘤携带小鼠的BM和脾脏中观察到CD11b+Gr1+频率显著升高(S图7a和b)。然而，与在PB和肿瘤中观察到的减少不同，抗-Bv8处理未明显影响BM和脾中的CD11b+Gr1+细胞频率。对从A673和HM7肿瘤携带小鼠分离的BM和脾细胞进行CFU分析显示(S图7c)，抗-Bv8处理小鼠中集落数目相比对照处理小鼠显著降低。这些发现说明，Bv8体内中和作用削弱了脾细胞和BM细胞在体外分化和形成集落的能力。
仅通过肿瘤中CD11b+Gr1+细胞数目的减少未必能够解释抗-Bv8抗体的抗肿瘤作用大小，预计这种作用还导致MMP-9和VEGF-A水平降低(Yan等，Cancer Cell 6：409-421(2004)；Nozawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：12493-12498(2006))。Bv8活性的局部中和有可能是抗-Bv8的抗肿瘤作用的主要机制。Bv8和相关EG-VEGF已被定性为特定内皮细胞类型的选择性促分裂原(Bergers，G.等，Nat Cell Biol 2，737-744(2000)；Lin，R.等，J Biol Chem 277，8724-8729(2002))。因此，我们希望确定Bv8是否影响肿瘤脉管系统。我们建立并表征了从异种移植肿瘤获得的肿瘤相关内皮细胞(TAEC)培养物。TAEC在MatrigelTM中响应VEGF-A形成管道，而对照孔显示极少管道形成或没有管道形成(S图8a)。加入Bv8蛋白能促进管道形成，其程度与VEGF-A类似(S图8a)。抗-Bv8抗体阻断Bv8-诱导的管道形成，但不抑制VEGF诱导的管道形成。这些发现证实了这种作用的特异性，同时表明，Bv8和VEGF采用不同途径在TAEC中诱导管道形成。PCR分析证实了在TAEC中内皮细胞标记物的表达，但未证实上皮细胞标记物如CD31、VEGFR2和Tie2的表达，从而证实了TAEC的内皮性质(S图8b)。与这些发现一致，Bv8或VEGF-A强烈诱导TAEC中MAP激酶磷酸化(S图8c)。TaqmanTM分析显示EG-VEGF/PKR-1和-2都在TAEC中表达(数据未显示)。然而，重组Bv8不能刺激某些肿瘤细胞系体外增殖(S图8d)，这进一步支持了Bv8主要靶向肿瘤环境内的内皮细胞的假说。
为证实Bv8可能局部促进肿瘤血管生成的假说，将编码mBv8的重组腺病毒(Av-Bv8)肿瘤内递送到HM7肿瘤携带小鼠。Av-EacZ和Av-VEGF分别作为阴性和阳性对照。为使重组蛋白的协同作用最小化，我们施用低效价病毒(10pfu)。与对照Av-LacZ相比，Av-Bv8导致肿瘤体积增加，其程度与Av-VEGF诱导的程度类似(图4a)。与体外观察结果一致，施用Av-Bv8导致CD11b+Gr1+动员增强，其程度与Av-LacZ和Av-VEGF类似(图4b)。较高效价(109pfu)的Av-Bv8还增强肿瘤生长并导致PB和肿瘤内CD11b+Gr1+细胞动员水平较高(数据未显示)。
为评价肿瘤脉管系统，采用了X射线微机断层摄影术(Micro-CT)(Garcia-Sanz，A.等，Hypertension 31，440-444(1998)；Maehara，N.，Eur radial 13，1559-1565(2003)；Kwon，H.M.等，J Clin Invest 101，1551-1556(1998))。Micro-CT提供了整个肿瘤中肿瘤脉管系统的整体分析，因此可克服其它方法如免疫组织化学(IHC)的一些固有限制。该分析证实，Av-Bv8和Av-VEGF的效果几乎不可区分，因为它们都导致血管体积比Av-LacZ组增加(p＜0.05)(图4c)。各治疗组全部肿瘤体的典型图像示于图45e。通过图像处理算法生成选取的血管网(红色)和肿瘤(灰色)的表面表现，该算法定义了分析中使用的容积区。MECA-32的IHC证实，相对于对照Av-LacZ，在施用Av-Bv8后HM7肿瘤的血管表面积显著增加(S图9a)。
为进一步研究Bv8在肿瘤血管生成中的作用，我们采用功能丧失方法分析了用抗-Bv8、抗-VEGF或对照抗体处理的HM7肿瘤中的肿瘤脉管系统。与图2所示实验一致，抗-Bv8处理导致肿瘤体积(图4f)和循环CD11b+Gr1+细胞(图4g)相比对照处理小鼠显著降低。采用与上述相同的Micro-CT血管造影法分析肿瘤脉管系统，结果显示，与对照处理肿瘤相比，抗-Bv8和抗-VEGF组的血管体积都显著降低(图4h)。与对照相比，抗-Bv8和抗-VEGF组的血管密度(VV/TV)也显著降低(图4i)。Micro-CT数据支持肿瘤血管受抑导致抗-Bv8处理小鼠中肿瘤生长受抑的假说。完整肿瘤体的典型图像示于图4j。因此，采用功能获得和功能丧失法获得的数据表明，Bv8主要通过诱导肿瘤血管生成促进肿瘤生长。组织检测结果也与Bv8促进肿瘤血管生成的作用一致(S图9b)。分析Jurkat肿瘤中的内皮细胞显示，与抗-VEGF类似，施用抗-Bv8抗体显著抑制肿瘤血管形成。
为表征Bv8在各种组织内以时间依赖性方式表达(图5)，我们测量了携带HM7肿瘤并用对照或抗-VEGF处理的小鼠的BM(图5a)、PB(图5b)、脾(图5c)和肿瘤(图5d)内的Bv8蛋白水平。分析对照处理小鼠的Bv8蛋白水平显示，在肿瘤植入后不久就在BM、PB和脾中出现峰值。然而，抗-VEGF处理小鼠显示在这种早期阶段Bv8表达极低，这可能是由于处理引发了有效的肿瘤抑制作用。然而，在较晚的时间点，与不依赖于VEGF的肿瘤生长的开始一致，抗-VEGF处理小鼠内的Bv8水平显著升高，尤其是在PB、脾和肿瘤中(图5b-d)。与这些发现一致，在用抗-VEGF处理了15或21天的A673-和HM7-肿瘤的坏死区域内观察到较多的Gr1+细胞浸润(图5e)。一个可能的解释是，长期缺氧和/或抗-VEGF引发的肿瘤坏死触发了BM活化和中性白细胞募集。这些发现与早期实验结果一致，显示出在若干鼠肿瘤模型内，抗-VEGF治疗导致Bv8 mRNA上调，提示Bv8可能促成对抗-VEGF治疗的耐药性(数据未显示)。为进一步确定肿瘤中Bv8的来源，我们将A673、Calu-6、HM7、HPAC和Jurkat肿瘤内的细胞群进一步分为CD11b+和CD11b-。TaqmanTM分析显示，与阴性部分相比，mBv8转录物在CD11b+部分中显著上调(图5f)。然而，当采用人Bv8引物时，PCR未在任一群细胞(即肿瘤相关的CD11b+和CD11b-群)中鉴定出任何人Bv8(图5f)，说明肿瘤基质，尤其是骨髓细胞，是所有检测肿瘤中Bv8的主要来源。与这些发现一致，体外ELISA没有发现检测的肿瘤细胞系产生可检测水平的Bv8蛋白(数据未显示)。
因此，抗-Bv8处理当与抗-VEGF联合时可能是最有效的。为验证该假说，我们给小鼠植入HM7(图6a)或A673细胞(图6b)并在肿瘤体积达到约400mm3后开始处理。与存在较低的瘤内Bv8水平一致，与早期处理相比，抗-Bv8处理对HM7和A673肿瘤产生更小的肿瘤生长抑制作用(图2)。抗-VEGF提供更加完全的抑制作用，但肿瘤最终逃脱了。然而，相比每种单一疗法，抗-VEGF和抗-Bv8的联合处理显著抑制肿瘤生长(p＜0.05)。同样，在对抗-VEGF治疗难治的TIB42(图2e)和EL4鼠淋巴瘤(图6c)中，联合治疗导致肿瘤体积和重量显著减小。因此，我们的数据说明，抗-Bv8处理对于抗-VEGF治疗难治性肿瘤是一种潜在的联合治疗。
为验证抗-Bv8的功效不仅限于免疫缺陷小鼠，我们将鼠抗-VEGF耐药性EL4细胞系植入免疫缺陷小鼠和免疫活性小鼠，并检测抗-Bv8或抗-VEGF单一治疗以及联合治疗的功效。如图6c和6d所示，在两种品系中这些治疗的效果几乎无法分辨。这些发现表明，即便当存在完整免疫系统时抗-Bv8也能抑制肿瘤生长。支持该结论的其它理由是，在免疫活性小鼠中，抗-Bv8处理能抑制Rip-Tag多阶段癌发生模型的血管生成开关(未公布观察结果)。
已知细胞毒性制剂会导致造血细胞从BM动员(Neben，S.等，Blood81，1960-1967(1993))。此外，化疗-诱导的肿瘤坏死可能导致趋化因子如G-CSF的释放，然后导致中性白细胞的代偿性增加(Kavgaci，H.等，J ExpClin Cancer Res 21，475-479(2002))。因此，我们试图研究用单独的或与抗-VEGF联合的细胞毒性制剂处理是否会影响抗-Bv8处理的功效。为达到该目的，给小鼠植入A673细胞并单独用顺铂、与抗-Bv8或抗-VEGF联合使用顺铂、或者同时与抗-Bv8或抗-VEGF联合使用顺铂的处理。在单独使用或与抗-VEGF联合使用的顺铂处理的小鼠中，血清Bv8水平显著升高(p＜0.05)(图6e)。抗-Bv8和抗-VEGF都能增强顺铂的抗-肿瘤活性。然而，顺铂+抗-VEGF和抗-Bv8的联合导致A673中的肿瘤生长几乎被完全抑制(p＜0.05；图6f)。因此，抗-Bv8处理可用作添加剂与抗-VEGF或细胞毒性制剂联合。S图8为Bv8在肿瘤发生中的作用的模型。
越来越多的证据表明，影响肿瘤募集或骨髓细胞的血管特性可能是一种新的抗癌策略(Shojaei，F.等，Nature Biotechnol 25：911-20(2007))。然而，介质的复杂性和潜在冗余性会影响实现该目的的进程。我们的发现表明，不考虑这种复杂性，阻断单一细胞因子Bv8的作用会显著影响多种肿瘤类型的生长。因此，这些数据显示，Bv8或其受体有可能成为将来抗血管生成疗法的治疗靶。需要进行其它研究来进一步明确该信号传导系统在不同肿瘤类型和肿瘤发展不同阶段的作用。有趣的是，最近的研究显示，施用G-CSF可能加速肿瘤生长(Okazaki，T.等，同上；Hirbe，A.C.等，Blood 109，3424-3431(2007))。需要进一步研究Bv8上调是否有助于这种作用。相反，抗-G-CSF抗体通过降低Bv8表达有可能抑制肿瘤生长。我们的实验室正在研究这种可能性。
最后，Bv8表达密切响应G-CSF表明，Bv8是参与调节中性白细胞分化和生成的主要内稳机制。因此，Bv8有可能发挥更广泛的病理生理作用，包括非肿瘤类型炎性细胞介导的血管生成。
实施例2
材料和方法
从新鲜骨髓收集物中分离全部人骨髓细胞
新鲜骨髓样品获自ALLCELLS(Emeryville，CA)。首先用含10％FBS的DMEM稀释骨髓，然后通过40μm细胞滤器(BD Biosciences，Bedford，MA)以除去组织碎片。将细胞1200rpm离心5分钟并在存在冰冷的0.2％NaCl时将血红细胞裂解30秒，然后加入冰冷的1.6％NaCl。
从外周血分离中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞
如之前的描述进行分离(Kulczycki A，Jr.J Immunol133：849-854(1984))，仅进行微小调整。简言之，将新鲜的肝素化健康人血(Health Services，Genentech Inc.)施加于CAPPEL LSM淋巴细胞分离介质(MP Biomedicals，Solon，Ohio)。以3000rpm不间断离心15分钟后除去血浆并在间期收集单核细胞。用单核细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)和FACS分选进一步纯化单核细胞。利用FACS以CD14+CD16-表达评价细胞群的纯度。收集与柱结合的细胞以收获淋巴细胞，并通过CD3表达测定T淋巴细胞纯度，通过CD19表达测定B淋巴细胞纯度。小心除去位于血红细胞之上的层以收集中性白细胞，然后加入HBSS(不含Ca2+和Mg2+)和用0.9％NaCl制备的6％Dextran 500(GEHealthcare Bio-sciences AB，Sweden)。让血红细胞室温静置30-60分钟，除去上清液中的中性白细胞。进一步除去任何残余的血红细胞直到＞90％被除去。通过FACS分析以确定细胞作为CD15+CD16+群的纯度。通过FACS和形态学分析测得来自外周血的所有三个群(中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞)的纯度＞95％。使用前用含0.2％BSA的HBSS(低内毒素，Serologicals，Corp.Norcross，GA)将细胞洗涤一次。
Taqman TM 基因表达分析
用RNeasy(Qiagen)制备RNA。进行实时PCR(Taqman)分析，每次反应使用50ng总RNA。以人Bv8、睾丸RNA(BD Biosciences)作为对照。在实时PCR系统(9600 Emulation mode of 7500 Real time PCRsystem)(Applied Biosystems)上进行反应，并采用序列检测系统(SDS)软件分析用标准曲线进行绝对量化。各基因的表达水平在相同样品中用持家基因RPL19进一步量化。Taqman引物序列如下：人Bv8正向：ATG GCACGG AAG CTA GGA(SEQ ID NO：10)，反向：GCA GAG CTG AAG TCCTCT TGA(SEQ ID NO：11)，探针：TGC TGC TGG ACC CTT CCT AAACCT(SEQ ID NO：12)；人RPL19正向：CGC AAG CGC CGT GAA(SEQ IDNO：28)，反向：GGT CTC TTC CTC CTT GGA TAA AGT C(SEQ ID NO：29)，探针：CCA GGC CAA GAA GGA GGA GAT CAT CA(SEQ ID NO：30)。人特异性VEGF正向：AAT GAC GAG GGC CTG GAG T(SEQ ID NO：31)，反向：TTG ATC CGC ATA ATC TGC ATG(SEQ ID NO：32)，探针：TGT GCC CAC TGA GGA GTC CAA CAT CA(SEQ ID NO：33)。
用于人PKR1/EG-VEGFR1和PKR2/EG-VEGFR2的Taqman试剂获自Applied Biosystems。
调节Bv8基因在培养的血红细胞内的表达
重组人MCP-1、MIP-1a、MIP-1β、MIP-2、bFGF、VEGF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1α、M-CSF、促红细胞生成素(EPO)和TNFα购自R&DSystems(Minneapolis，MN)。重组人IL-8、IFNγ、Bv8(前动力蛋白-2)、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β来自PeproTech Inc.(Rocky Hill，新泽西)。SCF(干细胞因子)来自Invitrogen Biosource(Carlsbad，CA)。有些情况下采用来自Amgen的G-CSF(Neupogen/非格司亭)。所有细胞因子以10ng/ml使用。洗涤新鲜纯化的细胞并重悬于含0.2％BSA的HBSS培养基(低内毒素，Serologicals Corp.Norcross，GA)。将2,000,000细胞与各种细胞因子一起在24孔板内在37℃5％CO2培养箱内培育4小时。然后将细胞转移到离心管内，离心并用RNA裂解缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)裂解。Bv8表达用Taqman评价，以RPL19(核糖体蛋白L19)作为内部对照基因。
从外周血中性白细胞中部分纯化Bv8蛋白
如上所述从500ml新鲜人血分离中性白细胞。将细胞团悬浮于10ml0.5％Triton X-100(含蛋白酶抑制剂(Roche))，并在摇床上4℃裂解10分钟。然后使细胞裂解产物通过25号针头四次，然后将盐浓度调至50mMNaCl，20mM Tris HCl(pH 7.3)。将粗提取物施加于用20mM Tris pH 7.2，50mM NaCl和0.5％Triton X-100预平衡的肝素-琼脂糖柱(AmershamBiosciences，Sweden)。该柱用线性梯度洗脱：20mM Tris，pH 7.3中50mM到2M NaCl，含0.5％Triton X-100。流速为1ml/min。在280nm监测吸光度。收集1ml馏分并用ELISA检测人Bv8。然后收集峰Bv8馏分和若干非峰值馏分，用微浓缩离心过滤装置(Microcon Centrifugal FilterDevices，Ultracel YM-3)(Millipore，Bedford，MA)浓缩最多10倍并检测其生物学活性。
人Bv8 ELISA
96孔微孔板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6配制的1.0μg/ml 3F1小鼠单克隆抗体(Genentech Inc.)在4℃包被一夜。平板用含0.05％聚山梨酯20的PBS洗涤，并用PBS配制的0.5％牛血清白蛋白、15ppm(百万分之一)Proclin300(Supelco，Bellefonte，PA)室温封闭1小时。将平板洗涤之后在其中加入用含0.5％牛血清白蛋白、0.05％聚山梨酯20、15ppm Proclin300(Supelco，Bellefonte，PA)和0.35N NaCl(样品缓冲液)的PBS配制的人Bv8标准品(0.020-2.5ng/ml，2倍连续稀释，PeproTech，Rocky Hill，NJ)和样品(最小1∶10稀释液)。将平板室温培育2小时，然后进行洗涤步骤。加入第二抗体：生物素化仓鼠抗-Bv8抗体克隆3B8(Genentech Inc.)，然后加入链霉抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare，Buckinghamshire，英国)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)作为底物来检测结合的Bv8。加入1M磷酸终止反应。在Titertek堆栈阅读器(ICN，Costa Mesa，CA)上读取450nm的吸光度。用四参数回归曲线拟合程序(Genentech公司)对标准物的滴定曲线进行拟合。用落入标准曲线范围内的数据点来计算样品中人Bv8的浓度。Bv8 ELISA能够测量最高10％裂解缓冲液，并且在检测裂解产物中低至0.20ng/ml的Bv8时具有灵敏性。由于对最高达到30□g/ml的人EG-VEGF、VEGF-A、VEGF-C和G-CSF(R&D Systems，Minneapolis，MN)仅给出背景信号，因此针对Bv8特别开发并优化了这种ELISA；使得存在最高达30□g/ml的这些分子和抗-VEGF(Genentech Inc.)时不会影响对样品缓冲液中100pg/ml人Bv8的检测。这种ELISA还能够检测小鼠Bv8，但灵敏度小于7％。
Bv8生物活性实验
Figure GPA00001140320701461
NFAT-CHO细胞获自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。细胞用PKR1/EG-VEGFR1稳定转染并培养于含10％透析血清、0.1mMNEAA、2mM GlutaMaxTM(Gibco)、1mM丙酮酸钠、10μg/ml零霉素、500μg/ml潮霉素的DMEM(高葡萄糖)中。将细胞铺入96孔观测板(Packard)，每孔2.5×104个细胞，含80ml 1％DMEM，5％CO2，37℃过夜。第二天用Millipore公司的微浓缩离心过滤装置(Ultracel YM-3)收集的各种柱馏分处理细胞。制备在1％DMEM中的0.2-0.02ng/mlhBv8(Peprotech Inc.)被用作阳性对照。1小时后除去培养基并更换为80ml汉克斯液，其中含0.1％BSA和含1mM CCF4的6×加样缓冲液(InvitrogenCorporation)。平板在黑暗中室温培育1.5小时并在Wallac平板阅读器上以410nm激发波长和450/520nm发射波长阅读。阴性对照为未添加配体且仅含对照培养基的细胞。CHO细胞用重组人Bv8或合并的馏分刺激1小时后添加β-内酰胺酶底物CCF4。为评价柱馏分的特异性，加入20mg/ml抗-Bv8抗体2B9和3F1。
分析来自G-CSF处理供体的白血细胞
通过血浆分离置换法(细胞疗法和细胞处理实验室(Cellular Therapyand Cell Processing Facilities)，FH癌症研究中心(Fred Hutchinson CancerResearch Center)，Seattle，WA)从用G-CSF处理4-5天的正常供体获得外周血白细胞。用相同方法收集未处理个体的白细胞并作为非配对对照。然后将细胞浓缩并重悬于含人血清白蛋白+10％DMSO的防冻培养基。在37℃水浴解冻，之后通过台盼蓝分离实验测得细胞活力＞95％。细胞用含0.2％BSA的HBSS缓冲液简单冲洗并用RNA裂解缓冲液(Qiagen)或含蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液裂解以进行RNA提取或蛋白质测定。
外周血中性白细胞趋化性
用含0.2％BSA的HBSS洗涤106个细胞，之后将其放入孔径为5μm的细胞培养插入皿(Corning Incorporated，Lowell，MA)。在下室中仅加入培养基或者培养基和各种浓度(最高200ng/ml)的各种细胞因子。37℃培育3小时后转移下室内的细胞，与9ml ZPAK溶液混合，并在Z2库尔特颗粒计数和大小分析仪(Z2 Coulter Particle Count and SizeAnalyzer)(Beckman Coulter，Fullerton，CA)上计数。
人白血病细胞培养物
U937、HL-60、THP-1、Hel 92.1.7、KG-1、K562、Jurkat细胞获自
Figure GPA00001140320701481
(Manassas，VA)。大部分细胞在含10％FBS的RPMI上生长。KG-1细胞在含20％FBS的Iscove改进的Dulbecco培养基上生长。对THP-1细胞采用含10％FBS的RPMI和丙酮酸钠、HEPBS和β-巯基乙醇。为进行调节研究，使用1,000,000个活力高于95％的细胞。在含氧正常和缺氧条件下在含0.2％BSA的1ml HBSS培养基中进行4小时调节研究。
统计分析
用学生t检验计算统计学显著性。
结果
调节人骨髓和各种血液细胞中的Bv8
之前报道称，G-CSF导致小鼠骨髓细胞和外周中性白细胞中Bv8表达强烈上调(＞30倍)(Shojaei等，Nature 450：825-831(2007)和实施例1)。
在本研究中，评价了在分离的人外周中性白细胞和全骨髓细胞中G-CSF是否也是Bv8表达的诱导物。10ng/ml G-CSF导致Bv8表达在4小时内平均为7倍(范围为6-12)。与小鼠中性白细胞相比，增加倍数较低至少部分是由于人细胞中基础Bv8表达较高(数据未显示)。时程研究表明，G-CSF在4小时内诱导Bv8 mRNA，且效果持续最多达24小时(数据未显示)。我们认为GM-CSF是人骨髓细胞和中性白细胞中Bv8表达的额外正调节物(图14A和B)。用10ng/ml GM-CSF观察到Bv8表达明显提高约2.5倍。这不同于小鼠中性白细胞，其显示GM-CSF未诱导Bv8。检测的其它细胞因子，包括IL-6、IL-1β和EPO(促红细胞生成素)，对中性白细胞或骨髓细胞中人Bv8表达没有刺激作用。
不同于中性白细胞，单核细胞和淋巴细胞未显示Bv8表达有任何响应G-CSF的改变(图14C和D)。奇怪的是，用GM-CSF处理4小时使得人单核细胞中的Bv8表达降低约75％。IL-10上调单核细胞和淋巴细胞中的Bv8表达，而SDF-1α仅对单核细胞显示出显著的刺激作用(图14C和D)。与中性白细胞或骨髓细胞相比，单核细胞和淋巴细胞中的基础Bv8表达水平较低(数据未显示)。
总之，G-CSF和GM-CSF对中性白细胞中Bv8基因表达的作用非常独特，因为两种相关的细胞因子M-CSF和SCF没有影响。
调节人骨髓细胞和中性白细胞中的Bv8受体
不同于能表达PKR1/EG-VEGFR1和PKR2/EG-VEGFR2的小鼠中性白细胞，分离的人中性白细胞仅表达可检测水平的PKR2/EG-VEGFR2。体外培育4小时后，GM-CSF显著上调PKR2/EG-VEGFR2表达(平均4倍诱导)，但G-CSF不行(图15A)。在人骨髓中，G-CSF和GM-CSF似乎都能显著调节PKR2/EG-VEGFR2(图15B)。
从G-CSF处理供体获得的被动员的外周单核细胞中Bv8和 PKR2/EG-VEGFR2的上调
通过血浆分离置换法从11名未处理个体和12名经G-CSF-处理的个体获得外周血单核细胞。我们通过Taqman检测Bv8基因表达，并通过ELISA测量Bv8蛋白水平。与来自未处理供体的单核细胞相比，检测到G-CSF动员的单核细胞中Bv8表达提高到约4.5倍，同时蛋白质水平提高10倍(图16)。类似的，当患者用G-CSF处理4-5天时在临床收集的白细胞中可检出PKR2/EG-VEGFR2，但无法检出PKR1/EG-VEGFR1。从G-CSF处理个体获得的单核细胞显示，PKR2/EG-VEGFR2表达相比未处理对照样品显著升高(约2倍)(图16B)。
人中性白细胞产生的Bv8具有生物学活性
为表征Bv8蛋白，我们将外周人中性白细胞细胞团溶于0.5％
Figure GPA00001140320701501
X-100。然后如“材料和方法”章节中所述对中性白细胞裂解产物进行肝素-琼脂糖亲和层析。如图14A所示，Bv8与柱结合，并在存在约0.4M NaCl时被洗脱，与小鼠Bv8蛋白类似。ELISA进一步证实馏分9、10和11中存在Bv8(图17A)。
由于在增殖实验中发现即便痕量的
Figure GPA00001140320701502
X-100对内皮细胞也具有明显的细胞毒性，我们试图在需要较短刺激时间的实验中检测中性白细胞衍生的Bv8蛋白的活性。如“材料和方法”章节中所述，我们采用PKR1/EG-VEGFR1稳定转染的CHO细胞。如所预料的，重组人Bv8(0.2-200ng/ml)引发剂量依赖性刺激作用(数据未显示)。如图17B所示，含免疫反应性Bv8的柱馏分相比
Figure GPA00001140320701503
X-100缓冲液对照显示出显著刺激作用。然而，不含免疫反应性Bv8的侧馏分显示没有刺激效应。同时，抗-Bv8抗体阻断了收集的含Bv8馏分的刺激作用。VEGF-A(最高检测浓度为200ng/ml)未引发任何反应，进一步证实了这种效应的特异性。
Bv8对中性白细胞迁移的影响
我们检测了Bv8对人中性白细胞产生趋化作用的可能性。如图18所示，Bv8诱导显著的趋化性刺激作用，最大效果为对照的约3倍。有趣的是，最大刺激作用发生在Bv8浓度非常低的时候(约2pM)。在6名独立供体中观察到类似模式(图18)。其它趋化因子如SDF-1α、IL-8和G-CSF需要较高浓度(20nM)才能刺激中性白细胞迁移。VEGF和MCP-1在所有检测浓度下未显示任何效应(数据未显示)。
Bv8在各种人白血病细胞系中表达并受G-CSF调节
为确定白血病细胞是否表达Bv8，我们检测了一组人细胞系。在Jurkat和K562细胞系中Bv8表达不可检测(数据未显示)。然而，在HL-60、KG-1、Hel 92.1.7和U937细胞系中发现可检测的Bv8 mRNA水平。10ng/mlG-CSF诱导数种细胞系中Bv8表达增加(2-3倍)(补充表2)。然而，在任何检测细胞系中未观察到GM-CSF有显著诱导作用。G-CSF或GM-CSF都不影响急性前髓细胞性白血病细胞系HL-60中的Bv8表达。
讨论
已经熟知中性白细胞和其它骨髓细胞在先天免疫中的作用是提供抗病原体的第一道防线(Bendelac和Fearon，Curr Opin Immunol 9：1-3(1997)。同时还知道这些细胞参与各种急性和慢性炎性过程(O′Shea和Murray，Immunity 28：477-487(2008)。此外，早在19世纪就提出的炎性细胞和癌症之间的关系最近获得了大量实验和临床支持(在Coussens和Werb，Nature420：860-867(2002)中进行了综述；Lin和Karin，J Clin Invest117：1175-1183(2007))。各种促炎性细胞因子和趋化因子的分泌可直接促进肿瘤生长和血管生成。此外，肿瘤浸润性骨髓细胞能够下调T细胞亚型(包括CD4+和CD8+细胞)的免疫应答，从而可能有助于肿瘤生长，因此骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的至少一个亚组被命名为CD11b+Gr1+细胞(在Talmadge JE，Clin Cancer Res 3：5243-5248(2007)进行了综述)。
最近的研究还证实了骨髓细胞在肿瘤模型中在介导对VEGF阻断剂难治方面可能也有作用的假说(Shojaei等，Nature Biotechnology 25：911-920(2007))。与对抗-VEGF敏感的肿瘤相比，抗-VEGF难治性肿瘤中浸润性CD11b+Gr1+细胞频率显著升高(Shojaei等，同上)。在评价CD11b+Gr1+细胞介导的不依赖于VEGF的血管生成机制时，分泌蛋白Bv8的同源物被鉴定为重要调节物(Shojaei等，Nature 450：825-831(2007))。这些研究，包括实施例1提供的数据，不仅在异种移植物中(Shojaei等，Nature，2007，同上)，而且在癌症发展的转基因小鼠模型中(Shojaei等，Proc Natl AcadSci USA 105：2640-2645(2008))，为Bv8是肿瘤发展期间骨髓细胞动员和血管生成的调节物提供了证据。
本研究的目的在于表征人骨髓和成熟血液细胞中的Bv8表达。我们的分析表明，各种细胞因子对人血液细胞中Bv8表达的调节是细胞类型特异的。与小鼠类似，最高Bv8表达出现在骨髓细胞和中性白细胞中，而在单核细胞和淋巴细胞中检出较低水平。为验证Bv8蛋白具有生物学活性，从人中性白细胞部分纯化Bv8并在生物实验中检测其活性。此外，在本研究中，鉴定了一种新的Bv8活性，即在浓度非常低时能够促进中性白细胞体外迁移，表明Bv8(也可能来自除中性白细胞以外的其它来源)可能在生理上调节中性白细胞迁移。此外，该结果显示，在两种Bv8受体中，只有PKR2/EG-VEGFR2在分离的人中性白细胞和G-CSF动员的细胞中表达，表明它确实是Bv8造血作用所需的主要受体。
G-CSF是中性白细胞和骨髓细胞中Bv8表达的主要诱导物，尽管它对单核细胞和淋巴细胞没有任何影响。重要的是，经G-CSF处理的供体的外周血中的表达增加可以证明Bv8上调。G-CSF可由肿瘤微环境中的基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。有趣的是，GM-CSF上调人中性白细胞和骨髓细胞中的Bv8，但该因子在小鼠单核细胞中不能引发这种效应。实际上，已知G-CSF和GM-CSF都能调节骨髓来源的中性白细胞和单核细胞的增殖、分化、存活和成熟。同时，这两种因子都能由包括成纤维细胞、内皮细胞、角质形成细胞和肿瘤细胞在内的各种非造血细胞产生。此外，一些报道提示，集落刺激因子可促进恶性肿瘤生长，至少在实验系统中如此(Karcher等，Int J Cancer 118：2182-2189(2006)；Morales-Arias等，Cancer 110：1568-1577(2007)；Okazaki等，InternationalImmunology 18：1-9(2006))。
IL-10和SDF-1α都显著上调人单核细胞中的Bv8表达。在淋巴细胞中，IL-10是Bv8表达的主要诱导物。有趣的是，许多证据支持肿瘤浸润性巨噬细胞和淋巴细胞在分泌血管生成因子如VEGF中的作用(Freeman等，Cancer Res 55：4140-4145(1995)；Lewis和Murdoch，Am J Pathol167-627-635(2005))。因此，这些细胞类型产生的Bv8可能有助于血管生成并且可能具有仍待确定的其它调节作用。IL-10最初被描述为由辅助T细胞2(Th2)产生的细胞因子(Boyman等，Curr Opin Immunol19：320-326(2007))，它也参与血管生成(Silvestre等，Circ Res.87：448-452(2000)；Sakamoto等，Int J Cancer 118：1909-1914(2006))。
总之，我们的研究证实，相对于小鼠，Bv8在人造血细胞中的表达和调节基本是保守的，这为进一步研究Bv8在人类肿瘤和炎性疾病中的病理生理作用以及Bv8抑制剂的治疗性应用提供了基础。
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在本申请中，包括权利要求书中，术语“包括”、“包含”为开放式术语，它不排除其它未指明的要素或方法步骤。
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Claims (41)

1.一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向之前用血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂治疗过的患有肿瘤的人类个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是所述VEGF拮抗剂治疗难治的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体或其片段。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐单抗或其片段或变体。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述Bv8拮抗剂是抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述Bv8受体是PKR2/EG-VEGFR2。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段是嵌合的、人源化的或人的。
8.如权利要求1所述的方法，该方法还包括向所述人类个体施用抗-VEGF抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐单抗或其片段或变体。
10.如权利要求1所述的方法，该方法还包括对所述人类个体进行化疗或放疗。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述化疗包括施用细胞毒性制剂。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤是结肠癌、直肠癌或肺癌。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症是转移性结肠癌或转移性直肠癌。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述癌症是非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
15.如权利要求1所述的方法，该方法还包括通过测定所述人类个体的肿瘤细胞或外周血样品中CD11b+Gr1+细胞相对于治疗前的数目或频率变化来监测所述治疗的功效的步骤。
16.一种肿瘤治疗方法，所述方法包括：
(a)向患有肿瘤的人类个体施用有效量的Bv8拮抗剂，和
(b)通过测定所述人类个体的肿瘤细胞或外周血样品中CD11b+Gr1+细胞相对于治疗前的数目或频率变化来监测所述治疗的功效，其中数目或频率降低表示治疗有效。
17.一种抑制人类个体中炎性细胞介导的血管生成的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述拮抗剂是抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
20.如权利要求18所述的方法，还包括施用其它血管生成抑制剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述其它血管生成抑制剂是血管生成因子的抗体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述血管生成因子选自下组：血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、肝细胞生长因子(HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
23.一种鉴定可用Bv8拮抗剂治疗患有肿瘤的人类个体的方法，该方法包括确定所述个体是VEGF拮抗剂治疗难治的。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体或其片段。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗或其片段或变体。
26.一种治疗肿瘤的方法，该方法包括向患有肿瘤的人类个体施用有效量的G-CSF拮抗剂。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述G-CSF拮抗剂是抗-G-CSF抗体。
28.如权利要求27所述的方法，该方法还包括施用其它抗肿瘤药。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述其它抗肿瘤药是抗-Bv8抗体和/或抗-VEGF抗体。
30.一种抑制人类个体中性白细胞迁移的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述拮抗剂是抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
33.一种治疗受益于抗血管生成治疗的非肿瘤性症状的方法，该方法包括向之前被诊断患有所述非肿瘤性症状并用血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂治疗过的人类个体施用有效量的Bv8拮抗剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述非肿瘤性症状是所述VHGF拮抗剂治疗难治的。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述非肿瘤性症状选自：不希望的或异常的增生、关节炎、类风湿关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、心肌梗塞造成的水肿、糖尿病性和其它增生性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管、角膜移植新生血管形成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新生血管形成、眼角新生血管形成(发红)、眼部新生血管疾病、血管狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、肺恶性胸腔积液、脑水肿(例如，与急性中风/闭合性颅脑损伤/创伤相关)、滑膜炎、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三间隙液体疾病(胰腺炎、隔综合征、烧伤、肠道疾病)、子宫肌瘤、早产、慢性炎症如IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、肾移植排斥、炎性肠病、肾病综合症、不希望的或异常肿块增长(非癌症)、肥胖、脂肪组织大规模增长、血友病性关节、肥厚性疤痕、头发生长受抑、毛细血管扩张症、化脓性肉芽肿、晶状体后纤维增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液、和胸腔积液。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述非肿瘤性症状选自：糖尿病性和其它增生性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新生血管形成、角膜移植新生血管形成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新生血管形成、眼角新生血管形成(发红)和眼部新生血管形成疾病。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述拮抗剂是抗-Bv8单克隆抗体或抗-Bv8受体单克隆抗体或它们的片段。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
39.一种抗-Bv8中和抗体，该抗体与鼠抗-Bv8抗体3F1或2B9实质上结合相同表位。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
41.如权利要求40所述的组合物，其中所述抗体是抗体片段。
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