CN102021191A - 一种体外进化β-葡聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

定向进化技术是由美国工程院院士、加州理工学院化工系教授FrancesH.Arnold于90年代初期开发出来的一项蛋白质工程技术。它是基因工程、蛋白质结构和计算机技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、耐热性好、pH稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的主要问题。本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T₅₀值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t_1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。

Description

一种体外分子进化β-葡聚糖酶的方法 

技术领域

一种基于易错PCR技术对淀粉液化芽孢杆菌源β-葡聚糖酶进行体外分子进化提高其热稳定性的方法，属于分子生物学领域。 

背景技术

定向进化技术是由美国工程院院士、加州理工学院化工系教授Frances H.Arnold于90年代初期开发出来的一项蛋白质工程技术。它是基因工程、蛋白质结构和计算机技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。分子定向进化技术，简单地说就是在实验室中对达尔文自然进化原理进行模拟，从而对目标蛋白进行改造。随着分子生物学技术的不断发展，特别是PCR和基因重组技术的应用，定向进化已从在体内转为在体外进行，实验方法也变得简便、快速和高效。体外展示技术等高通量筛选方法的发展更进一步拓展了体外定向进化的应用范围，使原本操作起来耗时耗力或难以进行直观筛选的蛋白质分子也能够得到改造。作为可以工业化生产和应用的β-葡聚糖酶，对酶特性的要求是产酶水平高、耐热性好、pH稳定、培养条件简单等，其中耐热性和产酶水平是酶工业化生产和应用的主要问题。 

本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T₅₀值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t_1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。测序结果表明，突变酶2-JF-012-JF-01发生两个氨基酸替代(N36S和G 213R)，突变酶2-JF-03发生另外两个氨基酸替代(E156V和K 105R)，和其他两个突变体不同的是，2-JF-02一共发生三个氨基酸替代(C86R， S115I和N150G)。突变发生位点见附图1和图2。 

发明内容

发明利用易错PCR手段建立了β-葡聚糖酶定向进化策略，见附图3。 

本发明的技术方案： 

(1)β-葡聚糖酶基因的易错PCR扩增 

在易错PCR中以引物PAG1-F：5’-ACATCGGATCCATGAAACGAG TGTTGCTAATTCTTG-3’(划线区域为BamH I酶切位点)和PAG1-R：5’-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3’(划线区域为Xho I酶切位点)分别作为正向和反向引物，以β-葡聚糖酶基因为模板进行扩增。 

PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；4℃保温。 

(2)易错PCR产物的回收纯化 

1％琼脂糖凝胶电泳检测后利用胶回收试剂盒回收PCR产物，-20℃保存。 

(3)易错PCR产物及质粒pET28a(+)的双酶切。 

(4)易错PCR产物及质粒pET28a(+)连接构建重组质粒库。 

表1易错PCR反应方案 

(5)含突变基因文库的构建 

A.从37℃培养16-20h的新鲜平板中挑选一个单菌落(直径2-3mm)转到一个含有10mL LB培养基的三角瓶中。于37℃剧烈振荡培养约3h(旋转摇床，转速200r/min)，每隔20-30min测量OD₆₀₀值来监测培养物的生长状况。当OD₆₀₀约为0.4时收获细胞。 

B.在无菌条件下，取1.8mL菌液转至冰预冷的2mL的聚丙烯离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。 

C.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。 

无菌生理盐水洗涤菌体一次。 

D.以0.9mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，冰上放置30min，5,000r/min离心10min。 

E.每50mL初始培养液用30mL冰预冷的0.1mol/L MgCl₂-CaCl₂重悬沉淀，两只离心管合并成一只，放置于冰上。 

F.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。加入120μL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞。 

G.每份感受态细胞加入连接产物5μL，轻轻旋转，混匀，冰上静置30min。 

H.离心管放至42℃的循环水浴中90s，不要摇动。快速将离心管移至冰浴中，冷却细胞2min。 

I.加入700μLSOC培养基，转移到37℃水浴5min，然后转移到37℃摇床，50r/min温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标志基因。 

J.将适量体积的已转化的感受态细胞涂布含有相应抗生素的SOB平板上。将平板置于室温直至菌液被全部吸收。倒置平板，37℃培养12-16h，可见相应菌落。 

(6)突变文库的高通量筛选 

A.突变体库的复制 

a.从平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有1000μL LB培养基(内含30μg/mL Kan)的96深孔板中，每孔对应一个特定转化子。每块深孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照。37℃，200r/min振摇培养12h。 

b.在无菌条件下，从96深孔板中取出20μL菌液，对应接入含1000uL新鲜LB培养基的另一96深孔板中，并进行37℃，200r/min振摇培养。4℃临时冷藏种子96深孔板。 

B.文库的诱导表达 

a.37℃，200r/min振摇培养重组菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40μL以及180g/L乳糖100μL，混匀后于24℃，200r/min振摇培养6h。在酶标仪上测定OD₆₀₀并保存数据后于3000r/min，4℃离心20min。 

b.以每孔一一对应为原则，利用排枪快速移取20μL上清粗酶液至两块96PCR反应板中。 

C.文库上清粗酶液的高温热钝化 

将其中一块含有粗酶液的96PCR反应板经过80℃金属浴处理0.5h，另一对应板4℃冷藏。 

D.文库的酶活表征 

a.将两快96PCR反应板40℃预热10min后(利用酶标仪加热模块)，每孔中加入40℃蓝色葡聚糖底物(使用前和pH 6.5的20mmol/L的磷酸缓冲液1∶19混合)80μL，混匀后40℃反应10min。每孔中加入300μL沉淀液，利用低温离心机于3000r/min，4℃离心20min，利用排枪移上清至两块96反应板中并测定OD₅₉₀吸光值。 

b.利用酶标仪软件计算每个克隆(OD_590未钝化-OD_{590，热钝化})/OD₆₀₀的数值，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行斜面保藏。 

生物材料样品保藏 

一株高产β-葡聚糖酶的重组大肠杆菌，该菌株为大肠埃希氏菌，命名为E.coli BL21(DE3)-Pet28a(+)-bgl，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2470，保藏日期为2008年4月29日。 

附图说明

图1热稳定性提高突变体空间位点定位 

图2野生型β-1，3-1，4-葡聚糖酶与其热稳定性提高突变体2-JF-01，2-JF-02以及2-JF-03氨基酸序列比对 

图3体外分子进化β-葡聚糖酶流程图 

具体实施方式

实例1 

本发明基于易错PCR随机突变技术，对β-葡聚糖酶进行了热稳定性定向进化。利用建立的基于96微孔板的高通量筛选模型筛选热稳定性提高的突变株。经过三轮定向进化，共筛选得到三株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03.突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T₅₀值分别比野生酶53℃提高2.2℃、5.5℃和3.5℃，达到55.2℃、58.5℃和56.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t_1/2，60℃(min)分别比野生酶18提高4、13和17，达到22、31和35。测序结果表明，突变酶2-JF-012-JF-01发生两个氨基酸替代(N36S和G213R)，突变酶2-JF-03发生另外两个氨基酸替代(E156V和K105R)，和其他两个突变体不同的是，2-JF-02一共发生三个氨基酸替代(C86R，S115I和N150G)。 

Claims (1)

1.一种基于易错PCR技术对淀粉液化芽孢杆菌源β-葡聚糖酶进行体外分子进化提高其热稳定性的方法，其特征步骤为：

(1)β-葡聚糖酶基因的易错PCR扩增

在易错PCR中以引物PAG1-F：5’-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3’(划线区域为BamH I酶切位点)和PAG1-R：5’-GTAGTCATCCGATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3’(划线区域为Xho I酶切位点)分别作为正向和反向引物，以β-葡聚糖酶基因为模板进行扩增。

PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性50s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；4℃保温。

(2)易错PCR产物的回收纯化

1％琼脂糖凝胶电泳检测后利用胶回收试剂盒回收PCR产物，-20℃保存。

(3)易错PCR产物及质粒pET28a(+)的双酶切。

(4)易错PCR产物及质粒pET28a(+)连接构建重组质粒库。

表1易错PCR反应方案

(5)含突变基因文库的构建

A.从37℃培养16-20h的新鲜平板中挑选一个单菌落(直径2-3mm)转到一个含有10mL LB培养基的三角瓶中。于37℃剧烈振荡培养约3h(旋转摇床，转速200r/min)，每隔20-30min测量OD₆₀₀值来监测培养物的生长状况。当OD₆₀₀约为0.4时收获细胞。

B.在无菌条件下，取1.8mL菌液转至冰预冷的2mL的聚丙烯离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

C.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。

无菌生理盐水洗涤菌体一次。

D.以0.9mL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀，冰上放置30min，5,000r/min离心10min。

E.每50mL初始培养液用30mL冰预冷的0.1mol/L MgCl₂-CaCl₂重悬沉淀，两只离心管合并成一只，放置于冰上。

F.4℃、3,000g离心10min，回收细胞。倒出培养液，使残留的痕量培养液尽可能流尽。加入120μL冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬细胞。

G.每份感受态细胞加入连接产物5μL，轻轻旋转，混匀，冰上静置30min。

H.离心管放至42℃的循环水浴中90s，不要摇动。快速将离心管移至冰浴中，冷却细胞2min。

I.加入700μLSOC培养基，转移到37℃水浴5min，然后转移到37℃摇床，50r/min温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标志基因。

J.将适量体积的已转化的感受态细胞涂布含有相应抗生素的SOB平板上。将平板置于室温直至菌液被全部吸收。倒置平板，37℃培养12-16h，可见相应菌落。

(6)突变文库的高通量筛选

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