CN102021185A

CN102021185A - 稻瘟菌MoCHS1基因及其编码蛋白的功能与用途

Info

Publication number: CN102021185A
Application number: CN 201010530726
Authority: CN
Inventors: 彭友良; 孔令安; 张燕; 杨俊�; 赵文生; 戚琳璐
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2010-11-04
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2030-11-04
Also published as: CN102021185B

Abstract

本发明公开了稻瘟菌MoCHS1基因及其编码蛋白的功能与用途，该基因控制稻瘟菌的分生孢子形态、产胞量、附着胞形成率与致病力，该基因及其cDNA和编码的蛋白质分别具有序列表中SEQ ID №：1、№：2和№：3的核苷酸或氨基酸序列。MoCHS1基因的敲除导致稻瘟菌分生孢子的形态建成发生改变，分生孢子变小，没有隔膜或者只有一个隔膜，分生孢子产量下降到野生型菌株的2％，附着胞形成率降低为野生型菌株的60％，对水稻叶片的侵染能力显著下降。MoCHS1编码的蛋白或/和其在其它病原真菌中的同源蛋白的表达或修饰均可作为重要候选靶标，用于设计和筛选抗真菌的新型药剂。

Description

稻瘟菌MoCHS1基因及其编码蛋白的功能与用途

技术领域

本发明涉及微生物基因工程和植物保护领域中影响真菌分生孢子形态建成与致病力的基因及其编码蛋白的应用。

背景技术

稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦等多种禾本科植物，导致瘟病。尤其是该菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各个栽培稻区每年均有发生，危害广泛严重。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病在我国曾多次流行，也是我国水稻的主要病害之一。

稻瘟菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。稻瘟菌的分生孢子呈梨形，由三个细胞组成。附着在叶片的分生孢子在适宜的条件下萌发形成芽管，芽管顶端分化形成附着胞，成熟的附着胞进一步形成侵染钉进而刺透植物表皮细胞，侵染钉在植物细胞内形成侵染菌丝，侵染菌丝在植物细胞内和细胞间扩展和定殖，最终叶片上形成直径为2-3毫米的灰色或灰褐色病斑，病斑中的侵染性菌丝穿透植物组织向空中分化形成分生孢子梗，进一步形成分生孢子。分生孢子在风、雨的作用下释放和附着，重新引起植物的再侵染。形态正常且具有潜在侵染功能的分生孢子的产生是稻瘟菌侵染植物所必需的过程，稻瘟病的严重度与形成分生孢子的数量呈正相关。如果能阻断分生孢子的形成和形态建成，就可以控制稻瘟病的发生或者减小稻瘟病的危害程度。因此，研究稻瘟菌分生孢子形成和形态建成的分子遗传机制不仅对于揭示稻瘟菌及相关丝状真菌分生孢子形成和形态建成的分子机制具有重要的理论意义，而且对于研发控制稻瘟病及其它植物病害的药剂具有重要应用价值。

在稻瘟菌分生孢子形成及变异方面：1993年，Shi和Leung报道了稻瘟菌水稻分离物Guy11的con1^-突变体(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis and rapidmapping of a sporulation mutation in Magnaporthe grisea，MPMI，Vol.7，No.1，1993，pp.113-120.)。该突变体与野生型形成分生孢子的形式不同，在每一个分生孢子梗上，只产生一个端生的伸长的三个细胞的分生孢子。con1-突变体在培养基上的生长和分生孢子的形成分别只有野生型的73％和2.3％，在载玻片或洋葱表皮上不能形成正常的附着胞，并且在原来感病的水稻品种上没有致病性。两年之后，他们又运用REMI(Restriction Enzyme-mediated Insertion)技术获得了一系列与分生孢子形成有关的突变体con2^--con7^-(Shi，Z.X.，and Leung，H.Genetic analysis of sporulationin Magnaporthe grisea by chemical and insertional mutagenesis，MPMI，Vol.8，No.6，1995，pp.949-959.)。突变体con5-和con6-完全丧失了分生孢子形成能力；con1-、con 2-、con 4-和con 7-作用于con5-和con6-的下游，影响产孢能力和分生孢子的发育；con4-和con7-产孢量减少约35％。con1-和con7-不能形成附着胞，因而丧失了对水稻的致病性，con2-和con4-附着胞形成率明显减少，因而致病性明显减弱。通过它们之间的遗传关系分析表明，Con1和Con2连锁，Con5和Con6连锁，并且有：Con5＞Con6＞Con7和Con2＞Con1的上位关系。中国农业大学彭友良研究小组通过插入突变途径克隆了稻瘟菌中一个控制分生孢子形成的特异性基因MgCON1，该基因缺失导致不能产生分生孢子并完全丧失致病性；MgCON1为一核蛋白，可能为转录调控因子(彭友良等，国家发明专利ZL200510109447.3)。该研究小组还鉴定了一个控制分生孢子形态建成的基因MgCOM1，该基因的缺失导致分生孢子形态变异并丧失致病性。(Yang et al，2009)。

从以上研究报道可以看出，稻瘟菌分生孢子的形成及其形态构建是一个很复杂的过程，需要不少基因的参与。但是目前有关此方面的基因克隆与分子机理的报道仍然较少。鉴定这些基因，解析它们的分子功能及其对稻瘟菌致病性的影响，有可能从中发现可以作为杀菌剂靶标的蛋白，为开发控制稻瘟病及其它植物真菌病害的高效药剂奠定理论和技术基础。

发明内容

本发明的目的旨在提供真菌分生孢子形态建成、分生孢子形成和致病性必需的一个基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的真菌分生孢子形态建成、分生孢子形成和致病性必需的基因来源于稻瘟菌，名称为MoCHS1，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；序列表中的SEQ ID №：1由4462个碱基组成，包括基因的启动子区域和编码区。MoCHS1编码区有3个外显子，分别位于SEQID №：1的5′端第1504位至1587位碱基之间、第1692位至4259位碱基之间、和第4325位至4462位碱基之间；5′端第1位至1503位碱基为启动子序列。

2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质氨基酸序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

MoCHS1基因的cDNA也属于本发明的保护范围，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列，由2790个碱基组成；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

利用MoCHS1基因的启动子、编码区序列构建的表达载体以及通过该载体转化获得的细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

以MoCHS1基因中任一区域的核苷酸序列设计引物，并通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下MoCHS1基因的表达也属于本发明的保护范围之内。

MoCHS1基因编码的蛋白质MoChs1也属于该发明的保护范围，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；其序列由345个氨基酸组成。

2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌菌丝生长或分生孢子产生和致病性相关的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

以MoChs1或与其有40％或以上一致性的同源蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下MoChs 1蛋白的表达也属于本发明的保护范围之内。

本发明证明了MoCHS1基因的突变或缺失导致稻瘟菌分生孢子的形态改变，分生孢子产生能力、附着胞形成率和致病性显著降低。说明MoCHS1基因是稻瘟菌引起水稻稻瘟病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制稻瘟菌分生孢子的产生和水稻稻瘟病的发生，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用。也就是说，本发明所提供的MoCHS1的一个重要用途是，该基因的表达与其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗稻瘟菌药剂)的筛选和设计中。进一步解析该基因参与的分生孢子形态建成和分生孢子产生的信号传导途径，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗稻瘟菌药剂)的筛选和设计中。此外，也可以以该基因核苷酸序列的某一区段作为探针或作为PCR引物设计的基础在稻瘟菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。

附图说明

附图1.MoChs1与其它植物病原真菌中同源蛋白的聚类分析。图示说明：MoChs1来自稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)，MoChs1在其它真菌中的同源蛋白分别为：BC1G04441.1来自灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，FGSG10116.2来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，UM04290.1来自玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，NCU0311.4来自粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，SCRG来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。蛋白聚类分析是用clustalx1.83软件完成的。

附图2.MoCHS1基因的敲除。A)敲除载体构建示意图。左臂正、反向引物分别为P1(5’-TACTAGTCGATGTCCGTCAGCG-3’，5’端含Spe I酶切位点)和P2(5’-AGAATTCCTGAGTGAGATGGCG-3’，5’端含EcoR I酶切位点)，右臂正、反向引物分别为P3(5’-AGTCGACGACTAAGGCTTGGTG-3’，5’端含Sal I酶切位点)和P4(5’-TGGTACCAGGACACCTTCTTCG-3’，5’端含Kpn I酶切位点)。左、右两臂的PCR扩增片段分别用Spe I+EcoR I和Sal I+Kpn I消化，按照上下游顺序分别连接到pKOV21载体中潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的两侧，构成基因置换敲除载体pKOCHS1。EV代表EcoRV。B)敲除转化体的PCR验证。用A)中所示引物out(5’-TTGCGGGTCAAGCGTTCTG-3’)和hygup(5’-GACAGACGTCGCGGTGAGTT3-’)扩增pKOCHS1转化得到的抗潮霉素的转化子基因组DNA，得到1.9kb的扩增片段。P131为野生型菌株，LA11和LA40为2个MoCHS1的敲除转化体。C)敲除转化体的Southern杂交验证。将野生型菌株P131和2个敲除转化体(LA11和LA40)的基因组DNA分别经EcoRV消化，转移到尼龙膜上，以A)中所示的probe为杂交探针(即敲除载体的左臂)进行杂交，野生型P131的杂交带为5049bp，敲除转化体LA11和LA40的杂交带为5935bp。

附图3.野生型菌株与MoCHS1基因的敲除体及其互补体分生孢子形态的比较。上图为光学显微镜下各稻瘟菌菌株的分生孢子形态。下图为扫描电子显微镜下各稻瘟菌菌株的分生孢子形态。P131、LA40和GC30分别代表野生型、敲除体和互补体。

附图4.野生型菌株与MoCHS1基因的敲除体及其互补体产孢量的比较。按照涂断产孢法，使用6cm的培养皿进行产孢，洗菌产孢48小时后，将各菌株在培养皿(直径6cm)内产生的分生孢子用同样体积水洗下，用血球计数板计数。P131、LA40和GC30分别代表野生型、敲除体和互补体。

附图5.野生型菌株与MoCHS1基因的敲除体及其互补体附着胞形成率的比较。上图为稻瘟菌各菌株的分生孢子在疏水盖玻片上形成附着胞的显微照片。中图为稻瘟菌各菌株的分生孢子在盖玻片上的附着胞形成率的比较。下图为稻瘟菌各菌株菌丝顶端形成附着胞的显微照片。P131、LA40和GC30分别代表野生型、敲除体和互补体。

附图6.野生型菌株与MoCHS1基因的敲除体及其互补体对水稻、大麦致病性的比较。左图为稻瘟菌各菌株的分生孢子悬浮液(浓度为5×10⁴个/毫升)喷雾接种水稻叶片5天后的典型照片。右图为稻瘟菌各菌株的新生菌丝块离体接种未划伤和划伤的大麦叶片5天后的典型照片。P131、LA40和GC30分别代表野生型、敲除体和互补体；In代表未划伤叶片，W代表划伤叶片。

图7.MoChs1在稻瘟菌中的表达动态与亚细胞定位。MoCHS1-GFP在稻瘟菌的气生菌丝、分生孢子、附着胞和侵染性菌丝中的动态表达谱。图示说明：左列照片为明视场下拍摄，右列照片为暗视场下拍摄。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过实施例给以进一步的说明，但并非对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、MoChs1与其它真菌中同源蛋白的聚类分析

用稻瘟菌MoChs1蛋白的氨基酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blastp检索，得到其在不同物种间的同源类似物：NCU0311.4(Neurosporacrassa，XP_961338)，FGSG10116.2(Fusarium graminearum，XP_390292)，BC1G04441.1(Botrytis cinerea，XP_001557191)，UM04290.1(Ustilago maydis，XP_760437)，SCRG(Saccharomyces cerevisiae，NP_009594)。其中，Fusariumgraminearum中MoChs1同源蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，Botrytis cinerea中MoChs1同源蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，Ustilago maydis中MoChs1同源蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。用clustalx1.83软件对上述氨基酸序列进行比对分析，并构建MoChs1及其同源蛋白间的系统进化树，如附图1所示。通过比对发现，MoChs1及其同源蛋白都具有一个几丁质合成酶核心区域，该结构参与几丁质的合成，而几丁质是真菌细胞壁的重要组成部分，因此可以推断MoChs1类蛋白是真菌中普遍存在的一个保守蛋白。

实施例2、MoCHS1基因在稻瘟菌分生孢子形态建成与分生孢子产生中的作用

1)敲除载体的构建

基因敲除采用同源重组的方法，用潮霉素磷酸转移酶基因替换野生型P131中MoCHS1基因的编码区，具体策略见附图2A。以野生型P131的基因组DNA为模板，用引物P1(5’-TACTAGTCGATGTCCGTCAGCG-3’，5’端含SpeI酶切位点)和引物P2(5’-AGAATTCCTGAGTGAGATGGCG-3’，5’端含EcoRI酶切位点)扩增出的片段作为左臂；用引物P3(5’-AGTCGACGACTAAGGCTTGGTG-3，5’端含SalI酶切位点)和引物P4(5’-TGGTACCAGGACACCTTCTTCG-3’，5’端含KpnI酶切位点)扩增出的片段作为右臂。左臂用SpeI和EcoRI双酶切，右臂用SalI和KpnI双酶切，按照上下游顺序分别连接到载体pKOV21中潮霉素磷酸转移酶基因的两侧，得到基因MoCHS1的敲除载体pKOCHS1。

2)互补载体的构建

根据基因MoCHS1的核苷酸序列，分别设计了正向引物5’-CGTATCGATAGCCACCACTGCCTTGTTGTT-3’(5’端含ClaI酶切位点)和反向引物5’-TTAATCGATGCGACGGGCAATGCAGCACAT-3’(5’端含ClaI酶切位点)。以野生型P131的基因组DNA为模板，用保真LA-Taq酶扩增出一条4459bp的DNA片段，该片段包含MoCHS1基因起始密码子ATG上游1503bp的序列。该片段经ClaI单酶切后，与经ClaI单酶切的载体KNTG连接，酶切鉴定，并经测序验证正确后，得到包含有融合基因MoCHS1-GFP和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的质粒载体pKNTG-CHS1。该载体不仅可以用作互补载体，也可用作亚细胞定位载体。

3)稻瘟菌的转化

在本发明中，稻瘟菌的转化采用CaCl₂/PEG介导的转化真菌原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法具体如下：

a.原生质体的制备

500毫升三角瓶装入200毫升液体CM培养基(酵母提取物0.6％，酶水解干酪素0.3％，酸水解干酪素0.3％，蔗糖1％)，接入所需稻瘟菌菌株的适量菌丝、孢子混和体，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-36小时。三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中。每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20mg/ml崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，弃上清。先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mMTris-Cl，pH7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后，用STC溶解原生质体并将浓度调至0.5-1×10⁸个/毫升。

b.稻瘟菌的转化

将待转化菌株(在发明中，敲除转化的菌株为P131，互补转化的菌株为LA40)的原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管300微升，加入等体积的用NotI线性化的载体(约2微克)和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴加入2毫升/管PTC溶液(60％聚已二醇3350，10mM Tris，pH7.5，50mM氯化钙)，冰上静置20分钟，加入25毫升/管预冷的STC，缓慢混匀后，4000转/分、4℃离心15分钟，弃上清，每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，26-28℃培养12-18小时，转入培养皿，加入15毫升冷却至50℃左右的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固后，上面铺15毫升的0.7％琼脂(冷却至50℃，含300微克/毫升的潮霉素(敲除实验)或400微克/毫升的新霉素(互补实验))。28℃培养4-6天，将出现的转化体转至固体CM培养基(酵母提取物0.6％，酶水解干酪素0.3％，酸水解干酪素0.3％，蔗糖1％，琼脂1.6％，含300微克/毫升的潮霉素(敲除实验)或400微克/毫升的新霉素(互补实验))，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。

4)野生型、敲除体、互补体分生孢子形态的比较

采用涂菌产孢法对野生型P131、MoCHS1的敲除体LA40和互补体GC30进行产孢，用灭菌蒸馏水分别洗脱其分生孢子，三层擦镜纸过滤后，6000rpm，25℃离心浓缩分生孢子悬浮液，分别取20微升分生孢子悬浮液制备简易玻片，Nikon Eclipse 800显微镜10×40倍镜下观察分生孢子的形态。野生型P131和MoCHS1的敲除体LA40的分生孢子分别用2.5％的戊二醛固定后，磷酸缓冲液清洗两次，用2％的饿酸进行二次固定。逐级脱水后，将样品放置在铜网上经二氧化碳液体临界点干燥，喷金粉后用电子扫描显微镜观察分生孢子的形态。结果发现，MoCHS1的敲除体LA40的分生孢子的形态发生了变异，分生孢子比野生型P131小，只有一个隔膜或者没有隔膜，而互补体的分生孢子的大小与形态则恢复至野生型P131的水平，有2个隔膜(附图3)。

5)野生型、敲除体、互补体产孢量的比较

按照涂菌产孢法，将野生型P131、MoCHS1的敲除体LA40和互补体GC30在燕麦西红柿培养基(每升含150ml西红柿汁、50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上于28℃光照培养5天后，用涂菌环将其菌丝充分打断，均匀地涂布到新的西红柿汁燕麦片培养基上，28℃光照培养。当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于28℃光照培养48小时后，在培养基表面即可见大量的稻瘟菌孢子。用50ml无菌水分多次洗下全部分生孢子，并用血球计数板计数。每皿菌洗脱的孢子液计数3次，每个菌株重复3次，产孢量实验独立重复3次。结果发现，MoCHS1的敲除体LA40的产孢量下降为野生型P131的2％，而互补体GC30的产孢量恢复至野生型水平的70％(附图4)。

实施例3、MoCHS1基因在稻瘟菌附着胞形成中的作用

1)分生孢子附着后形成附着胞

分别吸取20ul野生型P131、敲除体LA40和互补体GC30的孢子悬浮液(浓度为50000个孢子/毫升)滴加在疏水盖玻片上，25℃，黑暗保湿培养24小时后，显微镜下观察并统计附着胞的形成率。按照附着胞形成率＝萌发形成附着胞的分生孢子数/萌发的孢子数统计，结果发现，野生型P131、敲除体LA40和互补体的附着胞形成率分别为96％、61％和95％(附图5)，敲除体的附着胞形成率相对于野生型显著降低，而互补体的附着胞形成率则能恢复到野生型水平。

2)菌丝顶端形成附着胞

将野生型P131和敲除体LA40分别在燕麦西红柿培养基上，25℃，光照，培养5天左右，切取包含菌丝顶端的菌丝块并置于盖玻片上，菌丝面朝下，25℃，黑暗保湿培养48小时后，显微镜下观察附着胞的形成情况。结果发现，敲除体LA40的菌丝顶端能够形成附着胞，但其附着胞形成率明显低于野生型P131(附图5下图)。

实施例4、MoCHS1基因在稻瘟菌致病性中的作用

1)喷雾接种水稻叶片

将野生型P131、敲除体LA40和互补体GC30的分生孢子悬浮液(浓度为5×10⁴个孢子/毫升)均匀地喷雾接种到生长28天的丽江新团黑谷水稻叶片上。28℃黑暗保湿培养24小时后，明暗交替继续保湿培养5天，观察发病情况。接种结果表明，野生型P131和互补体GC30均大量出现典型的稻瘟菌病斑，而敲除体LA40仅有个别的病斑，致病力显著降低(附图6左图)。

2)菌丝块接种离体大麦叶片

用手术刀片分别切取野生型P131和敲除体LA40的新生菌丝块，菌丝块大小约为2mm×2mm，菌丝面朝下，分别接种划伤和未划伤的大麦叶片，黑暗保湿24小时后，明暗交替培养5天后，观察发病情况。如附图6右图所示。在未划伤和划伤的叶片上，敲除体LA40的致病力都比野生型P131显著降低。

实施例5、MoChs1的表达动态分析及亚细胞定位

1)MoChs1的表达动态分析

将互补体GC30含有新生菌丝顶端的菌丝块置于载玻片上，菌丝面朝下，保湿培养48小时后，荧光显微镜下观察气生菌丝中MoCHS1-GFP的表达。用无菌水洗脱GC30的分生孢子，并点接到载玻片上制备简易玻片，荧光显微镜下观察分生孢子中MoCHS1-GFP的表达。将GC30的分生孢子悬浮液点接到盖玻片上，黑暗保湿培养24小时后，荧光显微镜下观察附着胞中MoCHS1-GFP的表达。将孢子悬浮液(浓度为10⁶个孢子/毫升)灌入水稻的第二个叶鞘，黑暗保湿培养48小时后，荧光显微镜下观察侵染性菌丝中MoCHS1-GFP的表达。结果发现，在GC30的气生菌丝、分生孢子、附着胞和侵染菌丝中均能观测到GFP绿色荧光(附图7)，说明MoCHS1在稻瘟菌的整个侵染过程中均有表达。。

2)MoChs1的亚细胞定位

荧光显微镜下观察互补体GC30中MoCHS1-GFP在分生孢子内的分布，结果表明该融合蛋白可能定位在液泡。

Claims

1.稻瘟菌中控制致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需基因MoCHS1，其特征在于具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列，或者编码序列表中SEQ ID №：3的蛋白质序列的多核苷酸序列。

2.权利要求1所述的稻瘟菌致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需基因MoCHS1的编码蛋白具有序列表中的SEQ ID №：3所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的稻瘟菌致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需基因MoCHS1的cDNA，其特征在于具有序列表中SEQ ID №：2所示的DNA序列。

4.利用权利要求1所述的稻瘟菌致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需基因MoCHS1构建的表达载体。

5.利用权利4所述的表达载体转化所得的细胞系和宿主菌。

6.根据权利要求2所述，通过将稻瘟菌致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需蛋白MgChs1进行缺失或突变或修饰而使其分生孢子形态或/和附着胞形成率或/和产孢量或/和致病力发生缺陷中的应用。

7.根据权利要求6所述，以稻瘟菌致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需蛋白MgChs1作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。

8.权利要求2所述的稻瘟菌中控制分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需蛋白MgChs1，在其它植物病原真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)中的同源蛋白分别为FGSG10116、BC1G04441和UM04290，其特征分别具有序列表中SEQ ID №：4，5，6所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述，稻瘟菌中控制致病性、分生孢子形态建成和分生孢子产生的必需蛋白MgChs1在其他植物病原真菌中的同源蛋白FGSG10116、BC1G04441和UM04290作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。