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CN102027116A - 利用光合细菌藻及温室蒸馏从二氧化碳和水生产乙醇 - Google Patents

利用光合细菌藻及温室蒸馏从二氧化碳和水生产乙醇 Download PDF

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CN102027116A
CN102027116A CN200980114318XA CN200980114318A CN102027116A CN 102027116 A CN102027116 A CN 102027116A CN 200980114318X A CN200980114318X A CN 200980114318XA CN 200980114318 A CN200980114318 A CN 200980114318A CN 102027116 A CN102027116 A CN 102027116A
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Abstract

本发明公开了一种转基因的设计光合生物及温室蒸馏系统利用二氧化碳和水生产乙醇的方法。转基因的设计光合生物包括产氧光合细菌藻(oxyphotobacteria)，例如转基因的蓝藻通过转基因而驯服其内源光合调节机制，使光合作用所得的还原力(NADPH)和能量(ATP)可直接用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)合成生产乙醇(CH3CH2OH)。通过一对依赖NADPH与依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶的使用，可提供一种特殊的可循环使用的穿梭氧化还原功能，使NADPH能被转换成NADH，增强光合生物乙醇生产。通过转基因生物与温室蒸馏系统的结合使用，光合过程中产生的太阳废热可被用于温室蒸馏收获乙醇。本发明的乙醇光合生产与温室蒸馏相结合的技术具较高的从太阳能到乙醇的能量转换效率，和多种应用包括生产中间代谢产物和从海水产制淡水。

Description

利用光合细菌藻及温室蒸馏从二氧化碳和水生产乙醇
技术领域
本发明涉及生物燃料生产技术。更具体地说，本发明公开了一种设计产氧光合细菌藻及温室蒸馏系统利用二氧化碳和水生产乙醇的方法.本设计所创建的转基因的产氧光合细菌藻使用光合作用获得的氧化还原力(NADPH)和能量(ATP)把二氧化碳(C02)和水(H2O)转化合成乙醇(CH3CH2OH)。
相互参照相关专利申请
这项专利申请要求受益于在2008年2月22日提交申请的美国临时专利申请编号US61/066770和US61/066,771，和在2008年2月23日提交申请的美国临时专利申请编号US61/066,832。这三个美国临时专利申请的全部披露纳入本专利申请的参考。
背景技术
乙醇(CH3CH2OH)可作为液体燃料使用，例如用其于运行汽车引擎。在当前的交通和能源系统中，乙醇作为一种液体燃料已有重要的市场。在美国，目前，乙醇产生主要是使用酵母发酵过程从玉米淀粉产生的。然而，“玉米淀粉酒精生产”过程需要许多消耗能量的步骤，包括：农业玉米作物种植，玉米谷物收获，玉米籽粒淀粉加工，从淀粉到糖，再从糖到酒精发酵。独立研究表明，最近的“玉米淀粉酒精生产”过程中能源净增益非常有限。也就是说，“玉米淀粉酒精生产”过程中的能量成本消耗几乎与其产品乙醇的能量值一样。这并不奇怪，可以理解，因为目前的技术可使用的玉米淀粉，只占玉米作物的生物量(其中包括玉米秸秆，叶子和根部)的一小部分。玉米秸秆(cornstovers)通常被丢弃在农田，它们慢慢被分解为二氧化碳，因为它们主要代表木质纤维素生物质原料，目前的生物炼制行业不能有效地用玉米秸秆于乙醇生产。历来有试图从木质纤维植物生物质生产乙醇的研究工作，一个概念叫“纤维素乙醇”。然而，植物生物体已演变为抗拒其微生物和动物攻击的细胞壁结构糖的有效机制。这就是顽固的木质素纤维素生物质原料自然属性的基础，它为木质素纤维素生物质转化为可发酵糖造就严重路障。因此，有“木质素纤维素顽固”之称的问题是对植物生物量转化为可发酵糖类的一个大技术壁垒。也就是说，由于这个顽固的问题，木质纤维生物量(如玉米秸秆，柳枝草(switchgrass)，和木质材料)不能随时转换为可发酵糖类和乙醇，除非使用一定的预处理，但这常常带来高处理成本。尽管有超过50年的有关木质纤维素生物质预处理和发酵加工的研发努力，木质纤维素的顽固问题仍然是一个严重的技术障碍，到目前为止还没有被功破。此外，木质纤维素生物质种植，收获，加工预处理，纤维素到糖到酒精发酵的一切步骤都有许多能量消耗的代价。因此，任何新技术，可以绕过这些生物技术的瓶颈难题将是有益的。
产氧光合细菌藻(Oxyphotobacteria)是能够以水作为电子源和以二氧化碳作为碳源的产氧光合自养型原核生物。在自然界中，有两类产氧光合自养型原核生物：蓝藻(例如：蓝聚藻Synechococcus elongatus，鱼腥藻Anabaena sp.，蓝藻Synechocystis sp.，发菜藻Nostoc punctiforme，螺旋藻Spirulina platensis，和嗜热蓝聚藻Thermosynechococcus elongatus)和产氧光合绿细菌藻(Oxychlorobacteria)(例如，原绿球藻马里努斯Prochlorococcus marinus，原绿球藻Prochloron didemni，和原绿球藻Prochlorothrix hollandica)。蓝藻(cyanobacteria)通常也被称为“蓝绿藻”，而产氧光合绿细菌藻(Oxychlorobacteria)有时被称为“其它‘蓝藻’”或被科学地划分为原绿藻(Prochlorophytes)，因为它们含有叶绿素-a和叶绿素-b。例如，原绿球藻马里努斯MED4(oxychlorobacterium)具有非正统的色素组成，它包括：叶绿素-a和叶绿素-b，胡萝卜素，玉米黄质二乙烯衍生物，以及藻红蛋白的类型。相比之下，高度相关蓝藻(蓝绿藻)含有叶绿素-a和藻蓝素(phycobilins)是更典型的蓝藻。不过，蓝藻和原绿藻都可在液体培养基中利用光分解水产生氧气，和同化二氧化碳。在理论上，通过该光合过程，从太阳能到生物质的能量转换效率可达约10％，因此，这些产氧光合原核生物具有成为一个干净和可再生能源资源的巨大潜力。但是，野生型产氧光合生物，如野生型蓝藻，不具有从二氧化碳和水直接生产乙醇的能力。野生型光合作用，利用分解水并由类囊体膜质子梯度耦合的电子输运过程所产生的还原力：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶II(NADPH)和能量：三磷酸腺甙，腺三磷(ATP)，通过在细胞质基质中的一系列酶反应称为“卡尔文循环”把二氧化碳远原成碳水化合物。野生型光合作用过程的最终结果是利用光能按照下列总反应把二氧化碳和水转化成碳水化合物(CH2O)n和氧气O2：
nCO2+nH2O→(CH2O)n+nO2        [1]
碳水化合物然后可进一步转化为各种复杂的细胞物质(生物量)材料，包括：蛋白质，脂肪，糖原，纤维素和其它细胞结构材料。
根据目前的科学知识，野生型产氧光合细菌藻(oxyphotobacteria)包括蓝藻[例如：聚球藻7942株(Synechococcus sp.PCC 7942)，发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)，蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)，和嗜热蓝聚藻BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)]，和原绿藻(oxychlorobacteria)[例如：原绿球藻马里努斯麻省理工学院9313株(Prochlorococcus marinus MIT 9313)，原绿球藻马里努斯SS120株(Prochlorococcus marinus SS120)，和原绿球藻马里努斯MED4株(Prochlorococcus marinus MED4)]，都不具有直接从二氧化碳和水光合生产乙醇的能力。产氧光合细菌藻(oxyphotobacteria)的光合作用本性质与真核藻类和高等植物的十分相似。不过，原核生物(oxyphotobacteria)与真核生物(藻类和高等植物)也有一些显着差异。在真核藻类(和高等植物)中，卡尔文循环活动(光合二氧化碳固定过程)发生于一个组织良好的光合作用的细胞器：叶绿体。另一方面，产氧光合细菌藻(oxyphotobacter ia)就没有细胞器叶绿体，它的卡尔文循环活动发生在细胞质中。此外，由于产氧光合细菌藻(oxyphotobacteria)是原核生物，没有细胞核，产氧光合细菌藻的分子遗传组织和机构也与真核生物的有所不同。
本申请公开了一套创造产乙醇的产氧光合细菌藻(desisgner oxyphotobacteria)的方法，并提供一套利用其设计产氧光合细菌藻与温室蒸馏系统从二氧化碳和水生产和收获乙醇的具体方法。本发明的集成技术，可以绕过上述生物质能源产业的瓶颈技术难题，实行光合乙醇生产和温室蒸馏收获，并生产淡水和其它副产品。
发明内容
本发明公开了一套利用转基因的设计光合生物和温室蒸馏系统从二氧化碳和水生产乙醇的方法。设计光合生物，包括转基因的产氧光合细菌藻(designer transgenicoxyphotobacteria)，是通过基因工程技术而创造。通过转基因工程，使设计产氧光合细菌藻，可把由光合作用中获得的氧化还原力(NADPH)和能量(ATP)直接用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)合成乙醇(CH3CH2OH)。通过一对依赖NADPH与依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶的设计使用，还提供了一个特殊的可循环使用的穿梭氧化还原的NADPH/NADH转换功能，使NADPH能被转换成NADH，以增强光合乙醇生产。“NADH”是：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶I。本发明的乙醇光合生产与温室蒸馏相结合的技术具较高的从太阳能到乙醇的能量转换效率，和多种应用包括从海水生产淡水。
这套光合乙醇生产方法的一个基本特点是通过转基因而创造设计产氧光合细菌藻(designer oxyphotobacteria)。其中的核心思想是通过分子遗传手段，导入一套专一性酶，作用于寄主(产氧光合细菌藻)的卡尔文循环反应，从而使该循环反应中的一些中间产物，例如，3-磷酸甘油(3-PGA)，直接转化为乙醇，而不是其它复杂的生物材料。因此，除其他外，本发明公开了如何设计创造可产乙醇的产氧光合细菌藻(des igneroxyphotobacteria)的方法，其中包括：转基因的DNA编码设计结构，光合作用生产乙醇的代谢途径设计，以及设计创建的产氧光合细菌藻(designer oxyphotobacteria)。一方面，本发明公开了光生物乙醇的生产方法，包括在液体培养基中培养一种设计转基因创造的产氧光合细菌藻，例如，设计蓝藻(designer cyanobacterium)，其中的藻细胞具有转基因可表达一套专一的酶，作用于卡尔文循环反应，从而可使卡尔文循环中的一些中间产物，转换成乙醇。
根据本发明，可以选用许多种具有光合能力并可以在液体培养基中生长的产氧光合细菌藻(Oxyphotobacteria)作为寄主生物体，通过设计转基因来创建可光合产乙醇的产氧光合细菌藻(Designer oxyphotobacterium)。在其中的一个实施方案中，可以作为寄主的首选产氧光合细菌藻品种包括(但不限于)：嗜热蓝藻的BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)，发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)，蓝聚藻6301株(Synechococcus elongatus PCC 6301)，蓝藻7942株(Syncechococcus sp.strain PCC 7942)，蓝藻7002株(Syncechococcus sp.strain PCC 7002)，蓝藻6803株(Syncechocystis sp.strain PCC 6803)，原绿球藻马里努斯MED4株(Prochlorococcusmarinus MED4)，原绿球藻马里努斯海峡麻省理工学院的9313株(Prochlorococcusmarinus str.MIT 9313)，原绿球藻马里努斯海峡NATL1A株(Prochlorococcus marinusstr.NATL1A)，原绿球藻SS120株(Prochlorococcus SS120)，螺旋藻(顶螺旋藻)(Spirulina platensis(Arthrospira platensis))，螺旋藻帕西菲卡(SpirulinaPacifica)，蓝藻(Lyngbya majuscule)，鱼腥藻(Anabaena sp.)，蓝藻(Synechocystissp.)，蓝藻拉长(Synechococcus elongates)，蓝藻MC-A株(Synechococcus(MC-A))，束毛藻(Trichodesmium sp.)，蓝藻(Richelia intracellularis)，蓝藻WH7803株(Synechococcus WH7803)，蓝藻WH8102株(Synechococcus WH8102)，发菜藻(Nostocpunctiforme)，蓝藻7943株(Syncechococcus sp.strain PCC 7943)，藻蓝6714藻蓝蛋白缺失的突变体PD 1(Synechocyitis PCC 6714phycocyanin-deficient mutantPD-1)，蓝藻51142株(Cyanothece strain 51142)，蓝藻CCY0110株(Cyanothece sp.CCY0110)，颤利莫萨蓝藻(Oscillatoria limosa)，蓝藻(Lyngbya majuscula)，蓝藻(Symploca muscorum)，杆菌菜藻(Gloeobacter violaceus)，原绿藻(Prochlorondidemni)，原绿藻(Prochlorothrix hollandica)，原绿球藻马里努斯(Prochlorococcusmarinus)，聚蓝藻(Synechococcus bigranulatus)，嗜冷颤藻(cryophilicOscillatoria sp.)，蓝藻(Phormidium sp.)，发菜新种-1(Nostoc sp.-1)，蓝藻(Calothrix parietina)，嗜热聚蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻(Synechococcus lividus)，嗜热蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻6912株(Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912)，聚蓝藻(Synechococcus vulcanus)，聚球藻菌株MA4(Synechococcus sp.strain MA4)，聚球藻菌株MA19(Synechococcus sp.strain MA19)，和嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus)。
较高的寄主(产氧光合细菌藻)对乙醇的耐受性能，通常可转化为一个更有效的乙醇生产技术。本发明的各种体现之一，是在厌氧的和一定的乙醇浓度存在的条件下，通过使用一个特别设计的双或/和多反应器流检测系统从各种光合生物筛选对酒精具有高耐受性的寄主(产氧光合细菌藻)。这特别设计的反应器流检测系统，可用于同时测量光合作用速率，二氧化碳(CO2)的固定效率，乙醇的生产效率，酸碱度pH值，氧气(O2)和氢气(H2)的释放速率，细胞密度，和光的强度。筛选过程包括以下步骤：一)在乙醇浓度范围从0％到20％的存在下，或/和在某些特殊环境条件包括(但不限于)热，寒，或/和盐度的存在下，测量生物体的光合作用速率；二)绘制每种光合生物的光合作用速率与其测试液中的乙醇酒精浓度的曲线；和三)通过分析比较其光合作用速率与乙醇浓度的测试曲线，确定其对的乙醇耐受性能。
在创建产氧光合细菌藻(oxyphotobacterial)生产乙醇的代谢途径设计中，对酶的使用，选择取决于设计从那个卡尔文循环反应(Calvin cycle)的中间产物分叉(枝/支)来建立这一产乙醇途径。在其中的一个实施方案中，其中的一条乙醇生产的代谢设计途径(designer pathway)用了卡尔文循环反应的甘油三磷酸(glyceraldehydes-3-phosphate)作为分叉的关点，并将其转换成乙醇。例如，这从甘油三磷酸分叉(枝/支)的乙醇生产的代谢途径，是由下列所选的一套酶组成：依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，和乙醇脱氢酶。在此乙醇生产代谢设计途径中，当一个甘油三磷酸分子转化为乙醇，就有一个辅酶NADH分子由NAD+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称：氧化型辅酶I)还原产生于，由依赖NAD的甘油-3-磷酸脱氢酶酶所催化的，从甘油三磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate)到1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate)的步骤；同时，有一个辅酶NADH分子在由乙醇脱氢酶催化的从乙醛到乙醇终端步骤，被转换为NAD+分子。也就是说，NADH分子的生成数与消耗数相平衡。因此，这种乙醇生产的设计途径可以连续工作。
在另一个实施方案中，其中的一条乙醇生产设计途径(designer pathway)是从卡尔文循环反应的3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate)分叉建立而来。例如，这条从3-磷酸甘油酸分叉的乙醇生产代谢途径，是由下列所选的一套酶组成：磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，和乙醇脱氢酶。为这条乙醇生产代谢途经的正常工作，其中的乙醇脱氢酶必须能使用可以由光驱动的电子传输过程中产生的NADPH。因此，为这条特定乙醇生产设计途径，一个首选做法是选择使用一个能够用NADPH的或者NADPH和NADH(即NAD(P)H)的乙醇脱氢酶。另外，如果使用了只能够用NADH的乙醇脱氢酶，那么这里最好使用一个可在寄主细胞质工作的NADPH/NADH转换机制，以便更好地通过这设计途径光合产乙醇。
在还有一个实施方案中，其中的一条产氧光合细菌藻乙醇生产代谢设计途径(designer pathway)，是从果糖1，6二磷酸果糖(fructose-1，6-diphosphate)分叉建立而来。例如，这条从果糖1，6二磷酸果糖分叉(枝)的乙醇生产代谢途径，是由下列所选的一套酶组成：果糖二磷酸醛缩酶，丙糖磷酸异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，和乙醇脱氢酶。在另一个实施方案中，其中的一条产氧光合细菌藻乙醇生产代谢设计途径是从果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate)分叉建立而来。例如，这条从果糖-6-磷酸分叉的乙醇生产代谢途径，是由下列所选的一套酶组成：磷酸果糖激酶，果糖二磷酸醛缩酶，丙糖磷酸异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶。可以指出，某些酶的设计系列可允许形成两条或多条的乙醇生产设计途径，即形成两条或多条从卡尔文循环两点或多点分支的乙醇生产代谢途径。
在进一步的更多实施方案中，其中的一条产氧光合细菌藻乙醇生产代谢设计途径的表达，是通过使用一种外部可诱导的启动子来调控的，它使设计产氧光合细菌藻的转基因能在某些特定条件下，可诱导地表达。在一个实施例中，其中的一条可诱导来控制产氧光合细菌藻乙醇生产设计途径的基因表达的启动子是一种可诱导的厌氧启动子；其中包括：例如，亚硝酸盐还原酶基因启动子(nitrite-reductase-gene(nirA)promoters)，双向氢酶基因启动子(bidirectional-hydrogenase-gene hoxpromoters)，光-热响应的启动子(light-and heat-responsive groE promoters)，核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶基因操纵子的启动子(Rubisco-operon rbcL promoters)，金属(锌)可诱导的启动子(metal(zinc)-inducible smt promoter)，铁反应可诱导的启动子(iron-responsive idiA promoter)，氧化还原反应可诱导的crhR启动子(redox-responsive crhR promoter)，热休克基因启动子(heat-shock-gene hsp16promoter)，小热休克蛋白的启动子(small heat-shock protein(Hsp)promoter)，二氧化碳反应的终酸酐酶基因启动子(CO2-responsive carbonic-anhydrase-genepromoters，)，绿色/红色光响应的启动子(green/red light responsive cpcB2A2promoter)，紫外线光响应的启动子(UV-light responsive lexA，recA and ruvBpromoters，)，硝酸还原酶基因启动子(nitrate-reductase-gene(narB)promoters)，和它们的组合。
在本发明的另一个方面，其中的一条产氧光合细菌藻乙醇生产途径基因DNA设计结构，包含一个或多个核苷酸编码序列，以表达一种或多种乙醇生产设计途径的酶，其中每个乙醇生产途径基因都与一个可联动操作的诱导启动子放置在一起。该基因设计结构也可包含其他适当的核苷酸序列，例如一个选择标记基因，以便筛选和鉴定基因转化技术的效果。使用现有的基因转化技术，如电穿孔，基因枪，聚乙二醇诱导吸收，共轭配对和自然DNA吸收转化，可把含有设计转基因的核酸设计结构送入寄主产氧光合细菌藻(host oxyphotobacteria)体内使寄主被转化。
设计产氧光合细菌藻(designer oxyphotobacteria)包括设计蓝藻(designercyanobacteria)和设计原绿藻(designer oxychlorobacteria)，包含一个或多个创建的转基因核酸设计结构，形成本发明的另一个体现。在另一个方面，本发明提供了额外增强光合乙醇生产的方法，及相关的核酸设计结构和设计产氧光合细菌藻。
在另一实施例中，对一种光合产乙醇的产氧光合细菌藻，如上所述，作了进一步修改，以使它包含更多的设计转基因来可诱导地表达一种或多种的酶来促进NADPH/NADH的转换，例如，NADPH氧化磷酸酶和NAD激酶。更重要的是，在光合乙醇生产途径设计中，使用了一对依赖NADPH与NAD的甘油三磷酸脱氢酶，它们的使用赋予了一种可循环应用的(transhydrogenase)穿梭氧化还原的NADPH//NADH转换功能，使NADPH能被转换成NADH，以增强光合生物乙醇生产。另外，也可以选择和修改酒精脱氢酶，以便它可以直接使用NADPH生产乙醇。
在另一实施例中，一种产乙醇的产氧光合细菌藻得到了进一步修改，以抑制其糖原合成活动。在一个具体体现中，这种进一步的修改包括导入一个DNA设计构造，使它能可诱导地表达一种干扰核糖核酸(iRNA)分子，专门用来抑制糖原合成酶，例如：糖原合成酶，葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶，和/或葡萄糖磷酸变位酶的合成途径，从而增强光生物乙醇生产效率。
在还有一个实施例中，一种产乙醇的产氧光合细菌藻得到了进一步的改良，以包含附加的设计基因组，以促进在细胞质中的糖原(淀粉)化解和糖酵解。这种额外的设计基因，包括例如：基因编码可表达淀粉酶，4-α-糖原转移酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖激酶，磷酸葡萄糖变位酶，和葡萄糖-6磷酸异构酶。
本发明还公开了一个使用设计产氧光合细菌藻和光生物反应器系统相结合的从二氧化碳和水直接利用太阳光生产，分离，和收获乙醇的过程。工业二氧化碳源和/或环境中大气二氧化碳都可用于本设计产氧光合细菌藻的乙醇生产过程。
本发明还公开了一个使用一种特殊的太阳能温室蒸馏与设计光合生物相结合的生产和收获乙醇的综合技术。设计光合生物，如转基因设计产氧光合细菌藻，设计转基因藻类，或转基因植物细胞，它可以使用在光合作用过程中所得的还原力(NADPH)和能量(ATP)利用二氧化碳(CO2)和水(H2O)合成乙醇(CH3CH2OH)。集成的太阳能温室蒸馏系统包括一系列蒸馏温室串联和/或并联在一起形成温室蒸馏系统，以利用太阳能，培养设计光合生物，生产光合乙醇，并同时作温室蒸馏采集所产乙醇。其中，阳光被用来驱动光生物乙醇的生产，并同时，在培养基中产生热量。在培养基中的太阳能热被用于蒸发所产的乙醇(和水)，以供温室蒸馏收获。因此，本光生物乙醇的生产和收获方法的基本特点是，利用太阳能来驱动光合作用，又带动温室蒸馏系统来采集所产之乙醇，这样就提高了太阳能利用效率，以最低的成本，实现光合生产和蒸馏收获乙醇和/或生产淡水。在各种体现之一，蒸馏温室包括一个倾斜蒸汽冷凝透明天花板，一个密封的温室光合生物乙醇生产培养反应器，一系列冷凝液收集管位于温室墙上的周围以收集来自天花板的冷凝液，以及尾气冷凝和通风装置。由于阳光驾驶光合作用并在光生物液体培养基产生大量的热，该太阳热能即可用来从液体培养基蒸发相关的产品乙醇(与水)。富含乙醇的水汽然后凝结到温度较低的透明的倾斜天花板上，因为天花板是由外部的较冷空气，风，和热红外线对太空的辐射而冷却。蒸气冷凝用的透明天花板也可以灵活地运行冷水通过天花板水室系统使之冷却。根据天花板材料表面性质的不同而要求有所不同，天花板倾斜角α应至少高于5度，最好是15-30度，最好在所有的天花板内表面，其倾斜角α在30-70度以上，以便使冷凝液滴滑动进入位于温室墙上周围的冷凝液收集管，而不是自由下落掉回到天花板下面培养基中去。这样，当蒸汽凝结后，由于表面张力和地球重力的相互作用，凝结的液滴可以沿着倾斜天花板表面滑动，最后滑到温室的墙上并进入收集管。所收集的冷凝液内含较丰富的乙醇，可通过一输液管逾随重力进入储罐，或进入下一个蒸馏蒸室，进行蒸馏再蒸馏和再冷凝收集的系列过程，直至蒸馏馏分的酒精浓度达到所需的最终高度。
根据不同的实施例中，尾气冷凝和通风装置由一在冷水沐浴室之中的尾气冷凝盘管，气体凝析室，和一个垂直排气管组成。在行动中，尾气冷凝盘管，气冷凝室，和垂直通风管都被贯穿在冷水澡室之中的冷水而却冷，以便使尾气中的蒸气会沿冷凝线管圈与相连的气凝析室而冷凝，然后通过垂直排气管排气。
在另一个实施方案中，从尾气冷凝和排气系统，可收集冷凝液(含乙醇和水)。因此，利用该过程也可从尾气，通过一个或多个尾气冷凝和排气装置的串联或并联运行，来收获乙醇和淡水产品。
在另一实施例中，蒸馏温室包括：光合生物培养反应器和相连接的一系列管子，可调控进道，可调控出道，和/或一系列挡板，以引导液体培养基流动，增强光合生物乙醇生产和收获。
在另一实施例中，蒸馏温室包括一个水室透明天花板倾斜，可以通过运行至天花板水室的冷水，以提高光合生物反应器温室蒸馏冷却过程效果。使用水冷却吊顶系统也可调控蒸馏温室的内温度使之不仅适合于嗜热光合生物的培养生长和温室乙醇蒸馏收获，也可适合于温带光合生物的培养生长和使用。
在另一个实施例中，蒸馏温室包括一层光合生物培养反应器室和一层在此之上的啤酒蒸馏室。在上的蒸馏室与在下的生物反应器室由透明防渗板和/或薄膜(或膜)分开隔离，只允许阳光通过。阳光驱动光合作用并在光合生物反应器细胞培养室产生大量的热量。该太阳废热即用于在生物培养反应室之上的蒸馏室蒸发含有乙醇的啤酒液体。蒸气，然后到天花板表面被冷却凝结。蒸馏室最好是隔离式的，这样在一个蒸馏舱室的蒸汽与其他蒸馏厢分离，而只有那些啤酒液体可以逐渐流动从一个蒸馏厢在串联的管口引导下，通过隔板，可调节进出水管口，或通道和墙孔(孔口沉浸在啤酒液中)流到下一部蒸馏厢。当啤酒液体通过一系列蒸馏厢时，其酒精含量会通过蒸馏被除去。根据不同的需要和加工条件，任何数目的一系列蒸馏室间(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以串联使用。因此，当啤酒液通过一系列蒸馏室时，在啤酒液中乙醇含量可以降低到最低水平，以致使从最后的再蒸馏室出来的残余液基本上成为淡水，可用于再制造液体培养基，或作其他用途的副产品。
在还有一个实施例中，光合生物乙醇生产和太阳能热驱动温室蒸馏系统包括一个有顶空间的光生物培养反应器室和一个氧气体收集系统，以及在生物反应器室上层的蒸馏室。光生物培养反应器室的有顶空间可放便气体交换，例如可用来喂送二氧化碳和灵活地收获或排放氧气。包括工业二氧化碳和/或环境中大气二氧化碳可通过生物反应器管道喂用于产氧光合生物的乙醇生产过程。氧气气体收集系统包括一个氧气分离膜系统，氧气泵，和一个氧气储罐。使用本氧气收集系统可以从顶空间的气体连接系统灵活地收获从光合生物反应器生产的氧气。
根据本发明的许多实施例之一，任何数目的蒸馏温室(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以用串联和/或平行进行。随着再重蒸馏的增加，蒸馏馏分的酒精浓度可增高。通过多重温室蒸馏，最高的乙醇浓度可达96％的乙醇，这是足够高的酒精质量，它可直接作为燃料运行乙醇燃料驱动的和/或灵活燃料驱动的车辆。因此，这种工艺技术的设计以高效率和最大限度地利用太阳能(包括它的可见光和红外辐射)，从二氧化碳和水产生乙醇，同时通过温室蒸馏，以最少的成本，收获生物能源产品乙醇。除了光生物乙醇的生产和收获，使用该技术还可生产淡水，氧气，和大量光合细菌藻生物质材料作为副产品。比现有技术，本发明的光合生物乙醇生产和收获技术可望有较高的从太阳能到乙醇的能量转换效率，也能有助于保护地球环境，防止二氧化碳在大气中的危险积聚。
附图说明
图1展示产氧光合细菌藻乙醇生产代谢设计途径，它与卡尔文循环一起工作，使用光合分解水和质子梯度耦合的电子输运过程所产的还原力(NADPH)和能量(ATP)，在蓝藻细胞质把二氧化碳(CO2)还原合成为乙醇(CH3CH2OH)。
图2A展示产氧光合细菌藻乙醇生产途径基因DNA设计构造。
图2B展示产氧光合细菌藻乙醇生产途径基因DNA具有两重组位点的设计构造。
图2C展示可转换NADPH/NADH的基因DNA设计构造。
图2D展示可抑制糖原合成酶的DNA设计构造。
图2E展示糖原合成酶的干扰核糖核酸的DNA设计构造。
图2F展示糖原降解-糖酵解基因的DNA设计构造。
图3展示产氧光合细菌藻细胞表达设计的基因以从二氧化碳(CO2)和水(H2O)生产乙醇(CH3CH2OH)。
图4A展示综合的光生物乙醇生产和太阳热驱动蒸馏系统包括多个温室和多级蒸馏组件的前视图。
图4B展示集成的光生物乙醇生产和太阳热驱动蒸馏系统包括多个温室和多级蒸馏组件。
图5A展示光生物乙醇生产与利用太阳废热蒸馏反应器的温室蒸馏系统收获乙醇的例子。
图5B展示尾气冷凝和排气装置包括冷水浴冷却尾气冷凝盘管，蒸气冷凝室和垂直排气管。
图5C展示光生物反应器和太阳热驱动温室蒸馏收获乙醇，并使用水室天花板系统与温室耦合的例子。
图5D展示光生物乙醇生产和太阳热驱动温室蒸馏系统，它包括一个光生物培养反应器室和一个在其上层的蒸馏啤酒的蒸馏室的例子。
图6展示综合的光生物乙醇生产和多个多级串联和并联运行的太阳热驱动温室蒸馏系统的例子。
图7展示光生物乙醇生产和收获的温室蒸馏工艺过程。
图8显示利用硝酸盐诱导设计光生物和温室蒸馏产收乙醇的工艺过程。\
具体实施方式
本发明是针对一系列基于设计产氧光合细菌藻和温室蒸馏的乙醇生产和收获技术。设计产氧光合细菌藻技术是使用基因工程技术，驯服其光合作用调节机制，从而使在分解水的光合和质子梯度耦合的电子输运过程中获得的还原力(NADPH)和能量(ATP)可立即用于，从二氧化碳(CO2)和水(H2O)按下列总反应式合成乙醇(CH3CH2OH)：
2CO2+3H2O→CH3CH2OH+3O2     [2]
本发明的方法，绕过了生物能源“木质素纤维素顽固”的技术瓶颈难题，实行直接利用太阳能作光合乙醇生产和温室蒸馏收获，并生产淡水和其它副产品。如图1所示，设计蓝藻的光生物过程有效使用光合分解水和质子梯度耦合的电子输运过程所得的还原力(NADPH)和能量(ATP)立即用于从二氧化碳(CO2)和水(H2O)合成乙醇(CH3CH2OH)，而不是流入其它不理想的代谢途径产生很难为生物炼制行业有效利用的木质素纤维素材料。这方法与目前的“玉米淀粉酒精生产”过程有很大的不同。根据本发明的许多实施例之一，乙醇将从二氧化碳(CO2)和水(H2O)直接生产而来，再不必通过玉米淀粉乙醇生产要经过的许多能耗步骤，包括玉米作物栽培，玉米籽粒的收获，玉米粒加工制淀粉，从淀粉到糖和最后到酒精的发酵。此外，通过设计光合生物和温室蒸馏系统相结合的综合过程，在光生物乙醇生产过程中产生的太阳废热也被同时有效地应用于乙醇生产收获。因此，本发明的光生物乙醇生产和收获技术，预计将比现有技术有更高(超过10倍)的从太阳能到乙醇的的能量转换效率。假设光生物乙醇生产过程的太阳能转换效率为10％，那么最大理论生产率(产量)将可达到每年每英亩88,700公斤乙醇，这足够可供约140辆汽车的燃料之需(每英亩年)。因此，本发明可带来显著的功效，帮助社会确保能源安全。它也可能有助于保护地球环境和防止大气中的二氧化碳危险的积聚，因为本发明方法能直接将二氧化碳转换成清洁能源乙醇，并同时通过温室蒸馏利用相关的太阳能余热。
本发明方法的另一个基本特点是利用产氧光合细菌藻(如蓝藻)作为一种寄主生物体，而导入转基因核糖核酸编码分子，它可表达一组酶来作用于卡尔文循环的中间产物并将其转化成产品乙醇，如图1所示，而不是象野生型光合途径那样产生糖原和其他复杂的细胞(生物质)材料作为其最终产品。这就是说，本发明其中的一种核心思想是，通过分子遗传手段导入一套专一性酶，作用于卡尔文循环反应，从而使该循环中的一些中间产物，例如，3-磷酸甘油酸(3-PGA)直接转化为酒精之类的生物燃料。因为支撑卡尔文循环的NADPH和ATP来自水光解和质子偶联的电子运输过程，其最终结果是使二氧化碳(CO2)和水(H2O)转化为酒精(CH3CH2OH)和氧气(O2)。因此，本发明公开了，特别的设计产氧光合细菌藻乙醇生产的方法，产氧光合细菌藻乙醇生产途径的基因DNA编码结构设计，以及创建的设计产氧光合细菌藻。本发明的各个方面进一步详细描述于下文。
寄主产氧光合细菌藻
根据本发明的许多实施例之一，光合产乙醇的设计产氧光合细菌藻(designeroxyphotobacterium)可以从许多种产氧光合细菌藻包括蓝藻和原绿藻作为寄主生物体通过分子遗传工程而创建；只要该寄主具有产氧光合能力，即一个活跃的光合机构和其酶催化途径，可通过光合作用捕获光能，利用其能量把无机物质(水和二氧化碳)转化为有机物质。
在其中的一个实施方案中，适宜作为寄主生物的蓝藻(Cyanobacteria；Cyanophyta)属包括(但不限于)藻(Phoridium)属，藻(Synechocystis)属，蓝藻(Syncechococcus)属，颤藻(Oscillatoria)属，和鱼腥藻(Anabaena)属。适宜的原绿藻(Oxychlorobacteria；Prochlorophytes)属包括(但不限于)原绿藻(Prochloron)属，原绿藻(Prochlorothrix)属，和原绿球藻(Prochlorococcus)属。在本发明使用首选的产氧光合细菌藻(oxyphotobacteria)品种包括(但不限于)：嗜热蓝藻的BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)，发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)，蓝聚藻6301株(Synechococcus elongatus PCC 6301)，蓝藻7942株(Syncechococcus sp.strain PCC 7942)，蓝藻7002株(Syncechococcus sp.strain PCC 7002)，蓝藻6803株(Syncechocystis sp.strain PCC 6803)，原绿球藻马里努斯MED4株(Prochlorococcusmarinus MED4)，原绿球藻马里努斯海峡麻省理工学院的9313株(Prochlorococcusmarinus str.MIT 9313)，原绿球藻马里努斯海峡NATL1A株(Prochlorococcus marinusstr.NATL1A)，原绿球藻SS120株(Prochlorococcus SS120)，螺旋藻(顶螺旋藻)(Spirulina platensis(Arthrospira platensis))，螺旋藻帕西菲卡(SpirulinaPacifica)，蓝藻(Lyngbya majuscule)，鱼腥藻(Anabaena sp.)，蓝藻(Synechocystissp.)，蓝藻拉长(Synechococcus elongates)，蓝藻MC-A株(Synechococcus(MC-A))，束毛藻(Trichodesmium sp.)，蓝藻(Richelia intracellularis)，蓝藻WH7803株(Synechococcus WH7803)，蓝藻WH8102株(Synechococcus WH8102)，发菜藻(Nostocpunctiforme)，蓝藻7943株(Syncechococcus sp.strain PCC 7943)，藻蓝6714藻蓝蛋白缺失的突变体PD 1(Synechocyitis PCC 6714phycocyanin-deficient mutantPD-1)，蓝藻51142株(Cyanothece strain 51142)，蓝藻CCY0110株(Cyanothece sp.CCY0110)，颤利莫萨蓝藻(Oscillatoria limosa)，蓝藻(Lyngbya majuscula)，蓝藻(Symploca muscorum)，杆菌菜藻(Gloeobacter violaceus)，原绿藻(Prochlorondidemni)，原绿藻(Prochlorothrix hollandica)，原绿球藻马里努斯(Prochlorococcusmarinus)，聚蓝藻(Synechococcus bigranulatus)，嗜冷颤藻(cryophilicOscillatoria sp.)，蓝藻(Phormidium sp.)，发菜新种-1(Nostoc sp.-1)，蓝藻(Calothrix parietina)，嗜热聚蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻(Synechococcus lividus)，嗜热蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻6912株(Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912)，聚蓝藻(Synechococcus vulcanus)，聚球藻菌株MA4(Synechococcus sp.strain MA4)，聚球藻菌株MA19(Synechococcus sp.strain MA19)，和嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus)。
产氧光合细菌藻可以培养在液体介质中。从水生的产氧光合细菌藻产生的乙醇可扩散到允足的水中去，这样细胞内的乙醇浓度不致太高，以便细胞能保持正常的生长和稳固的乙醇生产。因为所产生的乙醇可容易地从细胞扩散出来到液态水的介质中去，这可使产品乙醇储存于液体培养基中，可然后通过过滤和/或蒸馏技术来收获产品乙醇，所以最好，使用液体培养基来培养产氧光合细菌藻生产乙醇。
所谓的“液体介质”是指液态的水加相对少量的无机营养盐(如氮，磷，钾等，常用于它们的盐形式)用于光合自养培养；有时候，也包括某些有机基质(如蔗糖，葡萄糖，或醋酸)用于光合自-异杂养和/或光合异养培养。使用的产氧光合细菌藻有几个优势。它们可以用低成本在开放的池塘大量培养生长。同时，也可比较容易地通过蒸馏或膜分离从水液相收获和净化乙醇。
对乙醇具高耐受性的光合生物体在乙醇生产中是非常有利可取的，因为较高的对乙醇耐受性常可转换为一个更高效的乙醇生产技术。因此，本发明的各种体现之一，是在厌氧的和一定的乙醇浓度存在的条件下，通过使用一个特别设计的双或/和多反应器流检测系统从各种光合生物筛选对酒精具有高耐受性的寄主(产氧光合细菌藻)。这特别设计的反应器流检测系统，可用于同时测量光合作用速率，二氧化碳(CO2)的固定效率，乙醇的生产效率，酸碱度pH值，氧气(O2)和氢气(H2)的释放速率，细胞密度，和光的强度。筛选过程包括以下步骤：一)在乙醇浓度范围从0％到20％的存在下，或/和在某些特殊环境条件包括(但不限于)热，寒，或/和盐度的存在下，测量生物体的光合作用速率；二)绘制每种光合生物的光合作用速率与其测试液中的乙醇酒精浓度的曲线；和三)通过分析比较其光合作用速率与乙醇浓度的测试曲线，确定其对的乙醇耐受性能。根据本发明的许多实施例之一，以适应某些特定的条件，可以对本筛选过程的任何步骤(一至三)进行适当的调整。在实践中，可灵活地使用这个筛选过程的全部或部分步骤(一至三)，或经调整过的步骤组合，以取得更理想的结果。例如，在其中的一个实施方案中，测量生物光合作用速率的步骤最好是在厌氧条件下进行，以避免因为有氧呼吸消耗乙醇而造成假性对乙醇的耐受力。在厌氧条件下，生物体对乙醇的氧化消耗最小。这将有助于避免造成假性乙醇耐受力，提高对真实乙醇耐性能的筛选，有助于光生物乙醇生产技术的发展。
根据不同的实施例之一，对乙醇和环境压力(如热，冷，盐度)具有耐受性能的光合生物可以从包括蓝藻和原绿藻的有许多产氧光合生物中筛选而来。所选的寄主生物体应该有较高的产氧光合能力，也就是说，须具备光合机构和酶途径，可通过光合作用捕获光能，利用其能量把无机物质(水和二氧化碳)转化为有机物质。最好，光合生物应该有足够的光合作用CO2固定效率，例如，可支持从二氧化碳和水，光合生产乙醇，每年每公顷至少约1780公斤乙醇，优选者每年每公顷8870公斤乙醇，更优选者每年每公顷88700公斤乙醇。
许多光合生物，例如产氧光合细菌藻，可以培养在液体介质中，通常是液体水加相对少量的无机营养盐(如氮，磷，钾等，常用于它们的盐形式)用于光合自养培养生长。根据不同的实施例之一，它们的乙醇耐受性和对其它的环境压力(包括但不限于热，冷和盐度)之抗性，可在液体培养基中存在一定乙醇浓度的，或在不同温度和盐度条件下，通过测量光合作用的速率，例如，对二氧化碳的固定和/或光合产生氧气的测定来确定。使用一个双重和/或多反应器检测系统可以方便地同步测量多个相关参数，包括测量二氧化碳的固定，乙醇生产，酸碱度pH值，氧气和氢气的产生，细胞密度，和光强度。使用双(或多)重反应器检测系统的优势是，它可在相同的条件下同时检测两个或多个不同的样品。通过样品交体转换的双反应器检测系统重复实验，双反应器系统的系统误差可以被消除。因此，这种双反应器流系统类型的实验使用可为筛选乙醇耐受性和/或对其环境因子的抗性进行可靠的测量。在通常情况下，在反应器中，在载流气体中的氧气浓度应低于100ppmv，这样就不会有显着的酒精呼吸消耗的发生。因此，在存在一定浓度的乙醇的厌氧条件下，所测得的光合作用速率将反映该光生物生体的真正酒精耐受性与相关的光生物乙醇生产潜力。有关光生物对其它环境压力(如热，冷和盐度)的耐受性能，也可以用类似的方法进行测量和筛选。
根据不同的实施例之一，对乙醇具有耐受性的光合生物可以通过开发和筛选突(诱)变的过程而获得，这过程包括以下步骤：a)光合生物诱变；b)在一个关键的酒精浓度存在下筛选光合生物诱变体；c)培养入选的诱变体，使致生长菌株作进一步筛选；d)把选择的菌株作液体培养；e)在一系例乙醇浓度范围从1％到20％乙醇的存在下，和/或在其它环境压力(如热，冷，和盐度)的存在下，通过测量光合作用速率作进一步的筛选；和f)重复从a)到e)的各步骤，作为一个多元化的操作运行周期，以取得更理想的结果。
在实践中，重复从a)到e)的各步骤，可根据具体情况全部或部分使用，和/或以任何调整组合的方式是使用，以取得更理想的结果。在各种体现之一，例如，对光合生物诱变第一步a)是进行了一系列的诱变技术，如辐射诱变，插入突变和化学诱变，已知于这些领域的技术人员。筛选步骤b)最好在厌氧条件下，使用一个关键的酒精浓度的存在下，进行光合生物诱变体的筛选，以避免因为有氧呼吸消耗乙醇而得出假性乙醇耐受力的结果。
筛选具有耐受性的光合生物与选择适当的遗传背景和某些特殊功能相结合，也是有利的。例如，从嗜冷产氧光合细菌藻，如，嗜冷的颤藻(Oscillatoria sp.)，嗜冷的藻(Phormidium sp.)，嗜冷的发菜藻新种-1菌株(Nostoc sp.-1)，和嗜冷的藻(Calothrixparietina)，作为寄主而转基因创建的产乙醇的嗜冷产氧光合细菌藻，能在雪和冰上生长，它们的应用使光合乙醇生产即使在寒冷的季节或地区，包括加拿大，也能进行。
同时，从嗜热产氧光合细菌藻，如，嗜热蓝藻(Synechococcus bigranulatus)，和嗜热蓝藻(Synechococcus lividus)(可在温泉，强烈的阳光，高温下生长)，嗜热藻(Mastigocladus laminosus)，嗜热藻6912株(Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912)，嗜热蓝藻(Synechococcus vulcanus)，嗜热聚球藻MA4株(Synechococcus sp.strainMA4)，嗜热聚球藻MA19株(Synechococcus sp.strain MA19)，和嗜热蓝藻BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)，作为寄主而转基因创建的产乙醇的嗜热产氧光合细菌藻，它们的应用使光合乙醇生产，可延伸到炎热的季节或地区诸如墨西哥和美国的西南地区，包括内华达州，加利福尼亚州，亚利桑那州，新墨西哥州和得克萨斯州，那里的天气通常很热。
此外，从海洋来的产氧光合细菌藻，如，藻红蛋白含海洋聚球藻株(Synechococcus sp.strains)(也称为聚球藻Synechococcus(MC-A))，非异形固氮束毛藻(Trichodesmiumsp.)，含异形海藻(Richelia intracellulariis)，原绿球藻马里努斯(Prochlorococcusmarinus)，原绿球藻SS120株(Prochlorococcus SS120)，海蓝藻WH8102株(Synechococcus WH8102)，海藻(Lyngbya majuscule)，和海藻(Symploca muscorum)，作为寄主而转基因创建的海水产乙醇的产氧光合细菌藻，它们的应用使光合乙醇生产能利用海水。
而从淡水来的产氧光合细菌藻，如，淡水蓝藻6301株(Synechococcus sp.strain PCC6301)，淡水蓝藻(Synechococcus elongatus)，淡水蓝藻6803株(Synechocystis sp.strain PCC 6803)，淡水蓝藻(Nodularia spumigena)，铜绿微囊藻(Anabaenaflosaquae)和鱼腥藻(Microcystis aeruginosa)，作为寄主而转基因创建的淡水产乙醇的产氧光合细菌藻，它们的应用使光合乙醇生产可以使用淡水。
产乙醇的氧光合细菌藻的附加可选功能，包括已被证明的通过缩小叶绿素天线尺寸提高光合生产的效益[Lee，Mets，and Greenbaum(2002).“光合效率高光强度改善通过叶绿素天线尺寸减少，”AppliedBiochemistry and Biotechnology，98 100：37-48]，和对乙醇的耐受性，使更有效地从二氧化碳和水产乙醇。在用减少了捕光色素的集胞藻突变体6714株(Synechocystis PCC 6714)的实验中，已证明藻蓝蛋白缺陷体的使用可减少光抑制[中岛，都筑，上田(1999)的内容，“减少光抑制了藻蓝蛋白缺失的突变体的藻宝成6714”，应用藻类10日刊：447-452]。这些可选功能可以被纳入一个设计氧光合细菌藻，例如，通过使用对乙醇耐受的和/或捕光色素天线缺陷突变体(如集胞藻突变体6714株-缺失突变体Pd-1)作为转基因的寄主，这些可选功能便可与乙醇生产途径相结合。
因此，根据不同的实施例之一，寄主(宿主)氧光合细菌藻选自下列集团：海洋的产氧光合细菌藻，淡水的产氧光合细菌藻，单细胞产氧光合细菌藻，多细胞产氧光合细菌藻，耐寒产氧光合细菌藻株，耐热产氧光合细菌藻株，具乙醇耐受性的产氧光合细菌藻菌株，采光色素天线缺失突变体，及其组合。
在寄主中创建乙醇生产途径
选择适当的设计酶
本发明的主要特点之一，是设计创造产氧光合细菌藻乙醇生产途径驯服自然的光合机制，实现从二氧化碳和水立即合成乙醇。自然的光合机制包括：(1)通过细菌藻类囊体膜光合作用分解水的过程和质子梯度耦合电子传递，产生还原力(NADPH氧)和能量(ATP)，及(2)卡尔文循环，它在细胞质中，消耗所产的还原力(NADPH)和能量(ATP)，把二氧化碳还原同化。
根据本发明其中的一个方法，有一系列酶被用于创建一系列产氧光合细菌藻的乙醇生产途径，它(们)取一种卡尔文循环的中间产物，将其转换成产品乙醇。一个“设计乙醇生产途径酶”现定义为一种酶，它至少在乙醇生产途径中的其中一个步骤作为催化剂使用。根据本发明，有许多种卡尔文循环的中间产物可以被用作分叉位点来创建乙醇生产设计途径；选用什么样的酶来构建乙醇生产设计途径取决于从卡尔文循环的那个中间产物作分叉(枝/支)位点来设计建立乙醇生产代谢途径。
举一个例子，一条能取用甘油三磷酸将其转换成乙醇的产氧光合细菌藻设计途径，是通过使用如图1中的数目标签记01-07所示的下列酶创建而来：一种依赖NAD的甘油-3-磷酸脱氢酶(图1标记01)，磷酸甘油酸激酶02，磷酸甘油酸变位酶03，烯醇酶04，丙酮酸激酶05，丙酮酸脱羧酶06，和乙醇脱氢酶07。在这条由甘油三磷酸分枝的设计乙醇生产途径中，当一个甘油三磷酸分子被转化成乙醇时，有一个辅酶NADH分子从甘油三磷酸到1，3-二磷酸甘油酸的步骤，在依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶的催化下，由一个NAD+分子的还原而生成，同时在乙醇脱氢酶的催化下，在还原乙醛生成乙醇的终端反应步骤，有一个NADH分子被氧化转换为NAD+分子。因此，在此乙醇生产途径中，辅酶NADH分子的生成数与消耗数相平衡。因此，从卡尔文循环的甘油三磷酸分枝的设计乙醇生产途径(如图1标记01-07所示)可连续工作。
在另一个例子中，一条能取3-磷酸甘油酸将其转换成乙醇的产氧光合细菌藻设计途径，是通过使用如图1中的数目标签记03-07所示的下列酶创建而来：磷酸甘油酸变位酶03，烯醇酶04，丙酮酸激酶05，丙酮酸脱羧酶06，和乙醇脱氢酶07。从图1可以看出，这五种酶(03-07)与在由甘油三磷酸分枝的由七种酶组成的乙醇生产途径(01-07)中的其中五种酶(03-07)是相同的。换句话说，这七种酶设计酶(01-07)可构成从卡尔文循环的两个中间产物(3-磷酸甘油酸和甘油三磷酸)作为两分叉点而分枝形成的两条乙醇生产代谢途径。这两条途径，然而，有不同的特点。与甘油三磷酸分枝的乙醇生产途径(01-07)不同，由3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径只有五种酶(03-07)的活动，它本身无法产生任何可供从乙醛还原到乙醇的终端步骤使用的辅酶NADH分子。也就是说，如果在3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径中，使用的是严格的依赖辅酶NADH的酒精脱氢酶(它只能用NADH，而不能利用NADPH)，那么就需要有NADH的供应，以使得该乙醇生产途径能够运行。因此，为了3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径的运作，最好，使用能够利用由光驱动电子传递过程所提供的NADPH的乙醇脱氢酶。因此，为3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径(如图1标记03-07所示)的有效运作，其中一个首选做法是使用一个能够利用NADPH或NADPH和NADH(即NAD(P)H)的乙醇脱氢酶。另外，如果在此使用只能够利用NADH的乙醇脱氢酶，那么还有一个有利的选项是在细胞质中使用一个额外的NADPH/NADH的转换机制(更多有关NADPH/NADH转换机制的细节表述在下文)，以使3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径可有效运作。
在还有一个例子中，一条能把果糖二磷酸转换成乙醇的产氧光合细菌藻设计途径，它通过使用下列酶创建而来(如图1中的数目标记15-23所示)：
醛缩酶15，磷酸丙糖异构酶16，依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶17，磷酸甘油酸激酶18，磷酸甘油酸变位酶19，烯醇酶20，丙酮酸激酶21，丙酮酸脱羧酶22，和乙醇脱氢酶23；如图1所示，只有醛缩酶15和磷酸丙糖异构酶16是两个相对于甘油三磷酸分枝的途径(01-07图1)而添加的酶。添加又一种酶，磷酸果糖激酶，形成了又一条从卡尔文循环的果糖-6-磷酸分枝的产乙醇途径。像甘油三磷酸分枝的产乙醇途径(01-07图1)，无论是从果糖1，6二磷酸分枝的产乙醇途径(15-23图1)还是从果糖-6-磷酸分枝的产乙醇途径(14-23图1)，它们都能自己生产NADH，供其在从乙醛还原产生乙醇的终端步骤使用。在这些乙醇生产途径中，辅酶NADH分子的生成数与消耗数相平衡。因此，这些产氧光合细菌藻乙醇生产设计途径都可连续工作。
表1列出了包括以上的设计产氧光合细菌藻乙醇生产途径建设所确认的酶的例子。在本规范中，当提到了一种酶时，例如在表1中列出的任何酶，就包括它和它的同工酶，它的功能类似物和它的设计修改酶及其组合。这些酶可以选择使用于设计产氧光合细菌藻乙醇生产途径的建筑。在此的“同工酶或功能类似物”是指具有相同的催化功能，但可能会或可能不会有完全相同的蛋白质结构的某些酶。例如，在酿酒的酵呣菌(Saccharomyces bayanus)中，有四个不同的基因(登录检索号：AY216992，AY216993，AY216994，和AY216995)编码表达四个醇脱氢酶。这些乙醇脱氢酶基本上有作为乙醇脱氢酶相同的功能，虽然它们的蛋白质序列有一些变化而不同。因此，同工酶或功能类似物也可以选择使用于乙醇生产途径设计建筑和修改。酶的一个最本质的特征是其活性位点的酶催化功能。因此，某些酶蛋白片段或亚单位，包含这样一个有活性的催化部位也可选择使用在这项发明中。
由于种种原因，某些天然酶不仅含有可取的催化基本结构成分，但也含有其它可能不适合于特定应用的成分。通过生物信息学辅助分子设计技术的应用，酶的催化基本结构成分也可以被选择用于创建理想的设计酶。因此，根据不同的实施例之一，设计酶的基因由按生物信息学辅助分子序列设计所创造的DNA设计构造而人工合成。利用电脑辅助合成生物学的方法，任何设计酶DNA序列(因此它的蛋白质的结构)可以有选择地进行修改，以达到更理想的设计结果。因此，术语“设计修改序列”和“设计修饰酶”是指由生物信息学辅助的分子设计改进了的DNA序列和酶蛋白。例如，当从一个线粒体酶的DNA序列，设计一个产氧光合细菌藻乙醇生产途径酶的DNA的构建时，其中的一个首选的做法是通过有选择地削减修改某些蛋白质结构，例如，削除其线粒体转运肽序列，因为其线粒体转运肽序列对细菌藻是不适用的。因此，本发明的各种体现之一，是在产氧光合细菌藻乙醇生产途径的设计建设中，灵活运用酶及其同工酶，功能类似物，设计修改酶和/或其组合。
如表1所示，上文提到的许多来自不同生物体的酶的基因已被克隆和/或测序。许多的基因组DNA和mRNA序列数据都可用于设计和合成转基因的DNA构造，通过转基因技术把寄主细胞转变成“设计产氧光合细菌藻”来实行光合产乙醇(图1)。然而，由于各种源生物及其细胞器组织格构与寄主细胞的要求经常不同，在构建产氧光合细菌藻乙醇生产途径中，某些DNA分子工程设计艺术包括转基因DNA结构(图2)序列的设计和密码子的优化是有必要的。例如，为建立乙醇生产途径的可调控性能，其中很重要的一点是在转基因DNA设计构造(图2A)中应用可诱导的启动子，如，亚硝酸盐还原酶(nirA)或硝酸还原酶(narB)，来控制转基因的表达。此外，如前面提到的，某些酶功能性衍生类似物或这些酶的片段(序列)和可诱导型启动子序列，也可以有选择地，按照本发明的多种方式，灵活应用于产氧光合细菌藻乙醇生产途径的设计建设和使用。下文进一步地描述产乙醇的设计产氧光合细菌藻的创造和使用。
表1列出了可选择用于产氧光合细菌藻乙醇生产途径设计建设的酶的例子。
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产氧光合细菌藻表达乙醇生产设计途径
上面提到的某些酶，如乙醇脱氢酶，丙酮酸脱羧酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸变位酶，和依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶，已知在糖酵解途径中起作用，但它们一般不对卡尔文循环起作用。因此，需要对这些酶的核酸编码通过基因工程进行设计修改，使它们能以某种特定的方式在特定的寄主体内正确表达成酶，使其直接与卡尔文循环互动而形成理想的设计产氧光合细菌藻乙醇生产途径。由于特寄主藻的遗传背景不同，以上讨论的一些酶，可能在某种程度上以其原始遗传背景水平的形式存在于某些野生型寄主产氧光合细菌藻体内。但是，往往由于各种原因取决于遗传背景，例如它们的可控性缺乏，某些酶可能不足以作为设计产氧光合细菌藻乙醇生产途径的一个重要组成部分。因此，对这些酶的基因核酸编码也需要进行适当的设计修改，以用可诱导启动子调控转基因的方式表达酶，建立乙醇生设计途径。图3说明了如何在设计产氧光合细菌藻体内，通过设计基因的转录和翻译表达其酶，使其赋予形成从二氧化碳(CO2)和水(H2O)合成乙醇(CH3CH2OH)的生产途径。
应用基因开关调控产氧光合细菌藻乙醇生产途径
本发明的另一个重要特点是应用适当的基因控制开关来调控设计产氧光合细菌藻乙醇生产途径的表达(图1和图3)。这种可调控基因开关功能是通过在设计基因DNA结构中使用一种可外部诱导的启动子来实现的。因此，设计产氧光合细菌藻的转基因在某些特定条件下，能够可诱导地表达(图2A)。为控制设计基因在寄主内表达，所使用的启动子最好是源于寄主的本身或密切相关的生物体。为测试诱导性启动子的活动和可诱导性能，通常可以通过把启动子放置在一种报告基因的前面，然后把该启动子-报告基因导入寄主细胞内，从而可测试报告基因在宿主内的表达来评估启动子的活动和性能。
应用可控的设计酶表达机制，不仅能使细胞生产乙醇，但也能使细胞，当它们重新回到自己的正常条件下(如在有氧条件下，如果一种氧敏感的双向氢化酶(Hox基因)启动子被用来控制的乙醇生产途径基因的表达)，使乙醇生产途径关闭时，重新回复生长。设计产氧光合细菌藻包含正常呼吸机制，所以当后它们返回有氧条件时，能够立即使用某些有机储备物质(或外源的有机物质，如葡萄糖或醋酸)来驱动细胞恢复生长。因此，当设计氧光合细菌藻在无氧条件下用于光合生产乙醇后，返回到有氧条件下的时候，其细胞就会停止产生产乙醇的酶，并开始合成新的卡尔文循环酶和产生新的细胞而恢复正常的光合自养功能。因此，设计产氧光合细菌藻可以被周期重复地连续使用，它在正常条件下(如在氧条件下)可进行光合自养生长，然而在产乙醇的条件(如在厌氧的条件)下，即高效从二氧化碳和水生产乙醇。
因此，其中一个首选实施例，就是应用一种厌氧可诱导的启动子(它活跃在厌氧条件下，但在有氧条件下则不活动)来控制设计产氧光合细菌藻的基因表达。这样，在好氧条件下，设计产氧光合细菌藻，例如设计蓝藻，可以进行光合作用以二氧化碳为碳源自养生长，而当它们生长好了可开始进行生产乙醇时，就使用厌氧条件激发这启动子表达其基因进行光合乙醇生产。
许多厌氧可诱导的启动子可供本发明的使用。例如，在厌氧反应双向氢发菜藻Hox基因的启动子可从下列生物体来：发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)(GenBank登录号：BA000019)，原绿藻(Prochlorothrix hollandica)(GenBank登录号：U88400；hoxUYH操纵子启动子)，藻6803株(Synechocystis sp.strain PCC 6803)(CyanoBase：sll1220 and sll1223)，聚藻6301株(Synechococcus elongatusPCC 6301)(CyanoBase：syc1235_c)，顶螺旋藻(Arthrospira platensis)(GenBank登录号：ABC26906)，藻(Cyanothece sp.CCY0110)(GenBank：ZP_01727419)和聚球藻7002株(Synechococcussp.PCC 7002)(GenBank登录号：AAN03566)；它们活跃在厌氧条件下，但在有氧条件下则不活动[Sjoholm，奥利维拉和林德布劳德(2007)“中的转录和蓝藻发菜藻株双向调节氢7120。”应用与环境微生物学，73(17)：5435-5446]。它们可作为一种有效的基因开关来控制设计基因在寄主，例如，下列产氧光合细菌藻内的表达：发菜藻(Nostocsp.PCC 7120)，藻6803株(Synechocystis sp.strain PCC 6803)，聚藻6301株(Synechococcus elongatus PCC 6301)，藻(Cyanothece sp.CCY0110)，顶螺旋藻(Arthrospira platensis)，或聚球藻7002株(Synechococcus sp.PCC 7002)。
在本发明的另一实施例中，所使用的诱导型启动子是亚硝酸盐还原酶(尼拉nirA)启动子，它可分被加在培养基中的硝酸盐诱导，而可在含铵但无硝酸盐的培养基中所被抑制[齐浩，吴，斯莱特，Baszis，魏斯，和Valentin(2005)“应用聚尼拉启动子设立工程藻维生素E通路的诱导表达系统，”应用与环境微生物学，71(10)：5678-5684；前田，川口大江，和奥马塔(1998)“顺式序列所需的NtcB依赖，亚硝酸盐反应中的蓝藻聚球藻硝酸盐同化操纵子的正调控应变宝成7942。”细菌学，180(16)2004：40804088]。因此，可以选择尼拉(nirA)启动子的序列使用在许多适当的设计产氧光合细菌藻中，以便能根据培养基中的硝酸盐浓度，调控设计基因的表达。可以选择和使用的尼拉(nirA)启动子和其修改过的序列包括(但不限于)下列产氧光合细菌藻的尼拉(nirA)启动子：蓝聚藻6301株(GenBank登录号：AP008231，区域355890-255950)，蓝聚球藻(GenBank登录号：X67680.1，D16303.1，D12723.1和D00677)，蓝藻6803株(GenBank登录号：NP_442378，BA000022，AB001339，D63999，D64006，D90899-D90917)，鱼腥藻(GenBank登录号：X99708.1)，发菜藻7120株(GenBank登录号：BA000019.2和AJ319648)，蓝藻(Plectonema boryanum)(GenBank登录号：D31732.1)，蓝聚藻7942(GenBank登录号：P39661，CP000100.1)，嗜热蓝聚藻BP-1株(GenBank登录号：BAC08901，NP_682139)，藻(Phormidium laminosum)(GenBank登录号：CAA79655，Q51879)，藻(Mastigocladus laminosus)(GenBank登录号：ABD49353，ABD49351，ABD49349，ABD49347)，鱼腥栎藻ATCC 29413株(GenBank登录号：YP_325032)，原绿球马里努斯海峡藻麻省理工学院9303株(GenBank登录号：YP_001018981)，聚球藻瓦8103株(GenBank登录号：AAC17122)，聚球藻瓦7805株(GenBank登录号：ZP_01124915)和藻CCY0110株(GenBank登录号：ZP_01727861)。
在本发明的另一个体现中，所使用的可诱导型启动子是一种光热响应的伴侣基因groE启动子，它可通过加热和/或加光而被诱导[小岛和中本(2007)“一种新型的光与热反应转录调控的groE在喀耳刻的HrcA或蓝藻的情况下”，FEBS信函581：1871-1880]。有许多groE启动子，例如groES和groEL(伴侣)启动子，可以作为诱导启动子被用来控制的乙醇生产设计途径酶的基因表达。在本发明各种体现之一，以选择和使用的groE启动子及其改装序列包括(但不限于)下列产氧光合细菌藻的groEL基因启动子：蓝藻.(GenBank登录号：D12677.1)，藻蓝6803株(GenBank登录号：BA000022.2)，聚藻6301株(GenBank登录号：AP008231.1)，聚球藻(GenBank登录号：M58751.1)，藻聚7942株(GenBank登录号：CP000100.1)，发菜藻7120株(GenBank登录号：BA000019.2)，鱼腥栎藻ATCC 29413(GenBank登录号：CP000117.1)，鱼腥藻L型31株(GenBank登录号：AF324500)；嗜热蓝聚藻BP-1株(CyanoBase：tll0185，tll0186)，蓝藻(GenBank登录号：D78139)，颤藻NKBG091600株(GenBank登录号：AF054630)，原绿球藻马里努斯MIT9313株(GenBank登录号：BX572099)，原绿球马里努斯海峡麻省理工学院9303株(GenBank登录号：CP000554)，原绿球藻马里努斯海峡麻省理工学院9211株(GenBank登录号：ZP_01006613)，聚球藻WH8102株(GenBank登录号：BX569690)，聚球藻CC9605株(GenBank登录号：CP000110)，原绿球马里努斯亚种马里努斯海峡CCMP1375株(GenBank登录号：AE017126)和原绿球藻马里努斯MED4株(GenBank登录号：BX548174)。另外，还有许为可诱导启动子也可选用于本发明中，它们包括：例如，金属(锌)可诱导的蓝聚藻7942株(Synechococcus PCC 7942)的smt启动子[埃布，亚当斯，泰勒和霍尔(1996)“蓝藻携带的SMT-勒克司的SMT启动转录融合至于重金属离子检测生物传感器“杂志工业微生物，17：80-83]；铁反应可诱导的聚藻7942株(Synechococcuselongatus PCC 7942)的idiA启动子[米歇尔，皮斯托留斯，而黄金(2001)idiA启动子”不寻常的调控元件为使政协基因蓝藻idiA缺铁诱导7942“的细菌，183(17)：50155024]；氧化还原反应可诱导的蓝藻crhR启动子[帕特森-福尔廷，Colvin和Owttrim(2006)“LexA蛋白相关蛋白调节氧化还原敏感的蓝藻RNA解旋酶，crhR表达”，核酸研究，34(12)：3446-3454]；藻6803株热休克基因hsp16.6启动子[方和巴纳姆(2004年)“的热休克基因hsp16.6和蓝藻，藻启动子分析表达6803。”目前的微生物49：192-198]；小热休克蛋白(Hsp)启动子，如聚藻vulcanus的hspA基因启动子[中本，铃木，罗伊(2000)“小热休克蛋白的表达赋予构蓝藻细胞的耐热性及热保护光合作用的仪器，”FEBS信函483：169-174]；二氧化碳可诱导的氧光合细菌藻的酸酐酶基因的启动子(GenBank登录号：EAZ90903，EAZ90685，ZP_01624337，EAW33650，ABB17341，AAT41924，CAO89711，ZP_00111671，YP_400464，AAC44830；及蓝藻数据库CyanoBase的登录号：all2929，PMT1568 slr0051，slr1347和syc0167_c)；硝酸盐还原酶基因(narB)启动子(如基因库GenBank登录号：BAC08907，NP_682145，AAO25121；ABI46326，YP_732075，BAB72570，NP_484656)；绿色/红色光可诱导的启动子，如光调控的藻Fremyella diplosiphon的cpcB2A2启动子[凯西和Grossman(1994)“在体内和体外的光调节cpcB2A2的Fremyella diplosiphont启动表征”细菌学杂志，176(20)：6362 6374]；和紫外线可诱导的蓝藻基因LexA，recA和ruvB的启动子[域，Houot，Chauvat和卡西尔-Chauvat(2004年)“的功能与LexA蛋白，recA和ruvB蓝藻基因表达的调控紫外线光响应启动：LexA蛋白是至关重要的无机碳面临饥饿细胞的生存”，分子微生物学，53(1)：65 80]。
在本发明表述规范中，当提到了诱导型启动子时，比如，在上述的任何诱导型启动子，是指它们和包括它们的类似物，它们的功能模拟衍生物，它们的修改设计序列，及其组合。“功能模拟类似物”或“修改设计序列”在这上下文中指的是在本启动子的基础上经修改(如核苷酸序列替代，适度增加或删除)派生的启动子序列，但保留了或调整了原生的启动子序列的功能。
此外，在本发明的另一实施例中，也可以选择“半可诱导”或常启动子用于产氧光合细菌藻乙醇生产途径的设计建筑。举例来说，如氧光合细菌藻的Rubisco基因操纵子的rbcL启动子(GenBank登录号：X65960，ZP_01728542，Q3M674，BAF48766，NP_895035，0907262A；CyanoBase：PMT1205，PMM0550，Pro0551，tll1506，SYNW1718，glr2156，alr1524，slr0009)，它对光有一定的依赖性，但几乎可以被视为常启动子，也可与其它诱导启动子，如尼拉(nirA)启动子，hox启动子，和/或groE启动子一起，组合用于乙醇生产途径的设计建设。
DNA结构设计和产氧光合细菌藻转化
DNA设计结构的是为了把乙醇生产设计途径的基因导入寄主产氧光合细菌藻细胞。也就是说，一种用来表达一种乙醇生产设计途径的酶的核苷酸序列编码和可联动操作的启动子(最好是可诱导的启动子)一起通常是放置在一种遗传基因载体(vector)中。在一优选的实施例中，核酸的设计结构从上游(5′)至下游(3′)的方向有下列单元组成：一种外部可诱导的启动子，一种乙醇生产途径酶的核酸设计编码，和一种适当的转录终止序列。一个或多个设计基因(DNA结构)可放入同一个基因载体。图2A显示这样的一个DNA设计结构例子。正如图2A所示，乙醇生产途径转基因是一种核酸设计构造，包括：a)前PCR(DNA聚合酶链反应)引导核酸编码；b)外部可诱导型启动子；c)乙醇生产设计途径酶与适当的转录终止序列的核酸编码序列；和d)后PCR引导核酸编码。
在本发明的另一实施例中，上述DNA设计结构从a)至d)的转基因所有组成部分都可进行调整，以适应某些特定的条件和需要。在实践中，从a)到d)的DNA结构组件可以全部或部分，和/或以任何调整组合取用，以取得更理想的结果。例如，当一个氧化还原反应可诱导的Hox启动子作为一个设计乙醇生产通路诱导型启动子用于其DNA的构建，包含这种DNA结构的转基因设计产氧光合细菌藻，在好氧条件下，如在一个开放的池塘，将能够使用环境空气中的CO2作为碳源进行光合作用而自养式地正常生长。当生长好可进行乙醇生产时，可以使用厌氧条件将设计转基因诱导表达，因为该转基因使用厌氧条件可诱导的Hox基因启动子。该基因的表达产生一套乙醇生产设计途径酶作用于寄主细胞质中的卡尔文循环而光合产乙醇(图3)。
为如图2A所示，这两个PCR引物是一个前PCR引物(前PCR引导核酸编码，位于DNA结构开始的5′端)和在另一端的后PCR引物(后PCR引导核酸编码，位于3′端)。这对PCR引物的设计是为对DNA设计构造的复制增生和基因转化验证，提供一定的方便。例如，通过利用电穿孔和标记筛选的基因转化技术，对寄主蓝藻(如Synechococcuselongatus PCC 7942)细胞用设计转基因DNA经过转化处理后，利用这种对PCR引物(PCR引导核酸编码)可对转基因蓝藻细胞体DNA分离物样品作PCR检测，以验证是否整个设计乙醇生产途径的基因(DNA的结构)被成功地转化入宿主蓝藻基因组中。当DNA聚合酶链反应(PCR)检测得到的PCR产物的片段大小与设计预期的DNA序列大小一致时，该设计基因成功地转化纳入宿主蓝藻基因组就得到了一种验证。
因此，不同的实施例还教有关的方法，有效地创建设计光生物(乙醇生产转基因产氧光合细菌藻)。这种方法，按其中的一种体现，包括以下步骤：a)按有关光生物乙醇生产需要的遗传背景和特殊的功能，选择适当的寄主产氧光合细菌藻细胞；b)把设计基因的核酸导入宿主产氧光合细菌藻细胞基因组结构；c)通过利用设计的PCR引物作PCR检测，以核实是否整个设计乙醇生产途径的基因(DNA的结构)被成功转入寄主氧光合细菌藻基因组；d)根据诱导表达光合产乙醇的DNA构造设计特点(图2A)，测量和核实设计产氧光合细菌藻从二氧化碳和水光合生产乙醇的功能，如检测设计的乙醇途径基因表达，光生物乙醇基因的转录(mRNA)，翻译(蛋白质)，和光合乙醇生产特点。
上述设计创造产乙醇转基因产氧光合细菌藻的方法，也可反复应用于多个周期的运作，以取得更理想的结果。也可对上述方法从a)至d)的任何步骤进行调整，以适应某些特定的条件。在不同的体现中，该方法在从a)到d)的步骤，也可全部或部分地应用，及/或以任何调整组合的方式应用。
乙醇生产途径基因的许多设计例子(DNA结构系列设计)显示在序列表中。DNA结构系列(SEQ ID)号：1，例子1，显示一种详细的依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶基因DNA设计构造(1360个碱基对(bp))；它包括：一个PCR引物(碱基编码序列1-20)，一个88-bp的尼拉(nirA)启动子(21-108)选自聚球藻7942株(淡水蓝藻)亚硝酸盐还原酶基因启动子序列，酶编码序列(109-1032)选自绿藻(Cyanidium caldarium)胞浆依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶序列(基因数据库登录号：CAC85917)，一个308-bp的聚球藻7942株rbcS终止子(1033至1340年)，和PCR引物在3′端(1341-1360)。这88-bp的尼拉启动子(21-108)是用来作为一个启动子例子来诱导控制设计乙醇生产途径的甘油-3-磷酸盐脱氢酶基因(DNA编码序列109-1032)的表达。这rbcS终止子(DNA序列1033至1340)是用来正确终止设计途径酶(依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶)基因的转录和翻译。由此产生的甘油三磷酸脱氢酶，作为一个设计乙醇生产途径的活性酶，在细胞质中可与氧光合细菌藻卡尔文循环的酶共同工作。这两个PCR引物(序列1-20和1341-1360)选自人体肌动蛋白基因序列修改，可以互相配对。对氧光合细菌藻基因组使用细菌藻数据库(CyanoBase)和基因数据库(NCBI/BLAST)的检索工具进行检查，发现在基因数据库中没有同源序列。因此，它们可作为PCR引物适当地用于DNA PCR检测技术，以验证在转化了的氧光合细菌藻中的设计基因。
DNA结构系列(SEQ ID)号：2，例2，显示一种磷酸甘油酸激酶的DNA结构设计(1621bp)；它包括：一个前PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚球藻942株的亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，一个磷酸激酶的编码序列(109-1293)选自一种嗜热细菌(Geobacillus kaustophilus HTA426)磷酸激酶序列(基因数据库登录号：BAD77342)，一个308-bp的聚球藻942株的rbcS基因终止子(1294至1601)，和一个后PCR引物(1602-1621)。这种设计的DNA结构与上述例1[DNA结构系列(SEQ ID)号：1]非常类似，除了一磷酸激酶的编码序列(109-1293)从细菌(Geobacilluskaustophilus HTA426)磷酸激酶序列(GenBank：BAD77342)选择而来。因此，这例子也表明，一个外源酶，如嗜热嗜热细菌的磷酸激酶也可与适当的诱导启动子如尼拉子(脱氧核糖核酸序列21-108)组合用于一个设计乙醇生产通路途径基因的建筑。
DNA结构系列(SEQ ID)号：3，例3，显示一种设计师磷酸甘油酸变位酶的DNA结构(1990bp)，它包括：一个前PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株的亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，9bp的XhoI NdeI酶切位点(109-117)，一种磷酸甘油酸变位酶的编码序列(118-1653)选自一种帝斯曼8903菌株(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903)的磷酸甘油酸变位酶(GenBank登录号：ABP67536)，9bp的XbaI酶切位点(1654至1662)，一个308-bp的聚球藻7942株rbcS启动终端(1663-1970)，和一个PCR引物(1971-1990)。这种设计的DNA结构也与例子1(DNA结构系列SEQ ID号1)类似，除了磷酸甘油酸变位酶的编码序列(118-1653)选自一种帝斯曼菌的磷酸甘油酸变位酶序列(GenBank登录号：ABP67536)和添加了酶切位点XhoI，NdeI和XbaI，使关键部件，如酶的序列设计，作为一个模块化单元，可需要时灵活更换，节省基因合成的成本，提高工作效率。请注意，这种酶不一定需要选自帝斯曼菌；有许多种磷酸甘油酸变位酶(如表1所列的)，包括其同功酶，设计师改良的酶，其功能类似物，以及从其他来源的，如：菌(Pelotomaculum thermopropionicum)，菌(Geobacillus kaustophilus)，嗜热链球菌，嗜热脂肪菌，枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，菌(Zymomonas mobilis)，链霉菌，假单胞菌，菌(Clavibacter michiganensis)，烟曲霉，粗球孢子菌，利什曼原虫，菌(Ajellomyces荚膜)，藻(Monocercomonoides)，菌(Crocosphaera watsonii)及菌(Aspergillus clavatu)，也可以选择使用。
DNA结构系列(SEQ ID)号：4，例4，显示一种烯醇化酶的DNA设计结构(1765bp)；其中包括：一个PCR引物(酶编序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株亚的硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，9-bp的XhoI NdeI酶切位点(109-117)，一种烯醇酶编码序列(118-1407)选自藻(Cyanothece sp.CCY0110)的烯醇化酶(GenBank登录号：ZP_01727912)，21-bp的卢米奥(Lumio)标签编码序列(1408至1428)，9-bp的XbaI酶切位点(1429至1437)，一个308-bp的聚球藻7942株的rbcS终止子(1438至1745)，和一个PCR引物在3′端(1746至1765)。这种DNA结构类似于例子3(DNA结构系列SEQ ID号3)，除了烯醇酶编码序列(118-1407)是从蓝藻(Cyanothece sp.CCY0110)烯醇化酶(GenBank登录号：ZP_01727912)选择用来，和21-bp的卢米奥标签(对应的DNA序列1408至1428)是加在烯醇酶序列C-末端。这21-bp的卢米奥标签序列(1408至1428)在这里采用卢米奥肽编码的序列：甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸(编码结构系列SEQ ID号：58a)，当它与现已由Invitrogen公司商业提供的荧光一卢米奥试剂起作用时，它就可以成为发荧光性的[网站https://catalog.invitrogen.com]。卢米奥分子标记技术是基于EDT(1，2-硫醇)耦合双向砷剂衍生荧光素结合到一个精心设计的四半胱氨酸序列[Keppetipola，科夫曼和等人(2003年)。快速的检测(卢米奥试剂)使用体外表达的蛋白质卢米奥(Lumio)技术，基因表达，25.3：7-11]。该四半胱氨酸序列由半胱氨酸-半胱氨酸-Xaa-Xaa-半胱氨酸-半胱氨酸(编码结构系列SEQ ID号：59a)，其中的Xaa是任何非半胱氨酸的氨基酸，如例，脯氨酸或甘氨酸。与EDT挂钩的卢米奥试剂允许荧光素的砷原子自由旋转从而淬灭荧光。而卢米奥的砷团体和四半胱氨酸的硫醇之间的共价键形成防止砷原子自由旋转，从而荧光素释放发荧光[格里芬，亚当斯和钱永健(1998)，“特定共价内的活细胞重组蛋白分子标记的”荧光，科学，281：269-272]。这也允许四半胱氨酸荧光分子标记的蛋白的成像可视化。因此，以这种方式使用该卢米奥标签，也可监测和/或跟踪设计师烯醇酶的表达，以验证是否设计的乙醇生产途径酶是确实为主机生物体所表达。在这个例子中，该卢米奥标签(一个简短的7个氨基酸)，它被连接在烯醇酶蛋白的C-末端，应该对设计的酶的作用影响很小，但它与卢米奥试剂处理后，能使设计酶分子可视化。卢米奥标签是可完全自由选用的。如果卢米奥标签在某种程度上影响了设计酶的功能，可以在DNA序列设计中把此标记删除。
DNA结构序列(SEQ ID)号：5，例5，显示一种设计师丙酮酸激酶的DNA结构(1888bp)；它包括：一个PCR引物(序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株的亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，9-bp的XhoI NdeI酶切位点(109-117)，丙酮酸激酶的编码序列(118-1530)选自菌(Selenomonas ruminantium)的丙酮酸激酶序列(GenBank：AB037182)，21-bp的卢米奥标签序列(1531至1551)，9-bp的XbaI酶切位点(1552至1560)，一个308-bp的聚球藻7942株rbcS启动终端子(1561至1868)，和PCR引物(1869至1888)。这种DNA结构类似于例子4(DNA结构系列SEQ ID号4)，但丙酮酸激酶的编码序列(118-1530)选自菌(Selenomonas ruminantium)的丙酮酸激酶序列(GenBank登录号：AB037182)；这也是另一个例子，表明使用卢米奥荧光分子标签(一个简短的7个氨基酸)可监视一个设计师酶的表达。
DNA结构系列(SEQ ID)号：6，例6，显示一种丙酮酸脱羧酶的DNA设计结构(2188bp)；它包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株的亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，9-bp的XhoI NdeI酶切位点(109-117)，丙酮酸-脱羧酶编码序列(118-1830)选自一个树干毕赤酵母的丙酮酸脱羧酶序列(GenBank：XM_001387668)，21-bp的卢米奥标签序列(1831年至1851年)，9bp的XbaI酶切位点(1852至1860)，一个308-bp的聚球藻7942株rbcS终端子(1861至2168)，和一个PCR引物在3′端(2169至2188)。这种DNA结构也类似于例子四(DNA结构系列SEQ ID号4)，但丙酮酸脱羧酶编码序列(118-1830)从一个树干毕赤酵母丙酮酸-脱羧酶(GenBank：XM_001387668)的序列选择而来。
DNA结构系列(SEQ ID)号：7，例7，显示一种设计师提出的NAD(P)H-依赖的酒精脱氢酶DNA的构造(1441bp)，它包括：一个PCR引物(序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株的亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，一个的NAD(P)H依赖的酒精脱氢酶编码序列(109-1092)从藻6803株的辅酶依赖酒精脱氢酶序列选择/修改而来(CyanoBase：slr0942)，21-bp的卢米奥标签序列(1093至1113)，一个308-bp的聚球藻7942株的rbcS终端子(1114至1421)，和一个PCR引物(1422至1441)。
DNA结构系列(SEQ ID)号：8，例8，显示一种设计师的NAD(P)H-依赖的乙醇脱氢酶DNA的构造(1510bp)；包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株亚硝酸盐还原酶尼拉启动子(21-108)，一个依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶编码序列(109-1161)从一个序列乳酸克鲁维酵母乙醇脱氢酶(ADH3)基因(GenBank登录号：X62766)选择/修改(其线粒体的信号肽序列中删除)而来，一个21-bp的卢米奥标签序列(1162至1182)，一个308-bp的聚球藻7942株rbcS启动终端(1183至1490)，和一个PCR在3′端(1491至1510)。这种DNA结构也类似例4(DNA结构系列(SEQ ID)号4)，除了依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶编码序列(109-1161)选择/修改(其线粒体的信号肽序列中删除)自一种克鲁维酵母乳乙醇脱氢酶(ADH3)基因序列(GenBank登录号：X62766)。这NAD(P)H-依赖的酒精脱氢酶既能NADH也能用NADPH把乙醛还原生成乙醇。DNA结构系列(SEQ ID)号：9，例9，显示一种磷酸果糖激酶的DNA设计结构(1405BP)；它包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚藻elongatus 6301株的尼拉启动子(21-108)，一种磷酸果糖激酶编码序列(109-1077)选自一种帝斯曼8903菌株的磷酸果糖激酶序列(GenBank：YP_001180606)，一个308-bp的的聚藻6301株的rbcS基因终止子(1078至1385)和一个PCR引物(1386至1405)。
DNA结构系列(SEQ ID)号：10，例10，展示了一种果糖二磷酸醛缩酶的DNA设计结构(1408基点)；其中包括：一个PCR引物(序列1-20)，一个88-bp的聚藻6301株的尼拉启动子(21-108)，一种果糖二磷酸醛缩酶编码序列(109-1080)选自一种菌帝斯曼8903株的果糖二磷酸醛缩酶序列(GenBank：ABP66792)，一个308-bp的聚藻6301株的rbcS基因终止子(1081至1388)，和PCR引物可再生能源(1389至1408)。
DNA结构系列(SEQ ID)号：11，例11，展示一种丙糖磷酸盐异构酶DNA的设计构造(1204基点bp)，其中包括：一个PCR引物(序列1-20)，一个88-bp的聚藻6301株的尼拉启动子(21-108)，一丙糖磷酸盐异构酶编码序列(109-876)选自一种菌(Pelotomaculum thermopropionicum)丙糖磷酸异构酶序列(GenBank：YP_001213271)，一个308-bp的聚藻6301株的rbcS基因终止子(877-1184)，并一个PCR引物(1185至1204)。
请注意，DNA结构系列(SEQ ID)号：1-8，代表了一套聚球藻集7942尼拉启动子控制的乙醇生产设计途径的基因，可以在宿主产氧光合细菌藻，如聚球藻7942中使用。因此，在设计产氧光合细菌藻(例如蓝藻)中，它们共同构成一种从卡尔文循环的甘油三磷酸分枝出来的设计乙醇生产途径(如图1数目标记01-07所示)。DNA结构系列(SEQ ID)号：7和/或8都代表一种能利用NAD(P)H的酒精脱氢酶。因此，DNA结构系列SEQ ID号：3-7(或3-6和8)可用于建设从卡尔文循环的3-磷酸甘油酸分枝的乙醇生产途径(如图1数目标记03-07)。同样，DNA结构系列SEQ ID号1-10可用于构建从果糖二磷酸分枝的乙醇生产途径(图1数目标记15-23)，而DNA结构系列(SEQ ID)号1-11可代表由果糖-6-磷酸分枝的乙醇生产途径(图1数目标记4-23)。
DNA结构系列(SEQ ID)号：12，例12，显示了一种用(Hox)启动子控制的辅酶NADP(H)-依赖的酒精脱氢酶DNA的设计构造(1865bp)，它包括：一个PCR引物(序列1-20)，一个172-bp的发菜藻7120株(鱼腥藻7120)(Hox)基因启动子(21-192)，一种辅酶NADP(H)-依赖的酒精脱氢酶编码序列(193-1413)择/修自一个嗜热球菌(Thermococcussp.)的NADP(H)-依赖的醇脱氢酶序列(GenBank登录号：U72646)，一个432bp的发菜藻7120株终止子(1414至1845)，和一个在3′端的PCR引物(1846至1865)。这种设计的DNA结构类似于例子1(DNA结构系列(SEQ ID)号：1)，除了一个172-bp的发菜藻7120株的(Hox)启动子(21-192)和辅酶NADP(H)-依赖的酒精脱氢酶编码序列(193-1413)择/修自嗜热球菌的辅酶NADP(H)-依赖的醇脱氢酶(GenBank登录号：U72646)。设计辅酶NADP(H)-依赖的醇脱氢酶(GenBank登录号：U72646)具有使用NADPH还原乙醛生产乙醇的能力。使用(Hox)基因启动子(21-192)，可通过利用无氧条件诱导设计酶基因的表达。
按照巳显示在DNA结构系列(SEQ ID)12号中的有关使用可诱导启动子的相同原则，DNA结构系列(SEQ ID)号：13-16，展示设计基因例子13-16。简言之，DNA结构系列(SEQID)13号：例13，展示一种由(Hox)启动子控制的丙酮酸脱羧酶的DNA设计构造(2351bp)；它包括：一个PCR引物(碱基编码序列1-20)，一个172-bp的发菜藻7120株的(Hox)启动子(21-192)，丙酮酸脱羧酶编码序列(193-1899)选修自一种发醇细菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶编码序列(基因数据库(GenBank)登录号：AB359063)，一个432-bp的发菜藻7120株的一种基因终止子(1900至2331)，和一个在3′端的PCR引物(2332至2351)。
DNA结构系列(SEQ ID)14号：例14，展示了一种由(Hox)启动子控制的丙酮酸激酶的DNA设计结构(2414个碱基对(bp))；它包括：一个PCR引物(碱基对编码序列1-20)，一个有172碱基对(172-bp)的发菜藻7120株的一种(Hox)启动子(21-192)，一种丙酮酸激酶的编码序列(193-1962)选修自一种鱼腥栎藻ATCC 29413的丙酮酸激酶编码序列(GenBank登录号：YP_322211)，一个有432碱基对(172-bp)的发菜藻7120株的一种基因终止子(1963至2394)，和一个在3′端的PCR引物(2395至2414)。
DNA结构系列(SEQ ID)15号：例子15，展示了一种用(Hox)启动子控制的烯醇化酶的DNA设计构造(1934bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列碱基对1-20)，一个172-bp(碱基对)的发菜藻7120株的一种(Hox)启动子(21-192)，一种丙酮酸激酶的编码序列(193-1482)选修自一种鱼腥栎ATCC 29413烯醇化酶编码序列(GenBank登录号：YP_322211)，一个432-bp的发菜藻7120株的一种(gor)终止子(1483至1914)，和一个在3′端的PCR引物(1915至1934)。
DNA结构系列(SEQ ID)16号：例16，展示了一种用(Hox)启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(2243bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列碱基对1-20)，一个172-bp(碱基对)的发菜藻7120株的一种(Hox)启动子(21-192)，一种磷酸甘油酸变位酶的编码序列(193-1791)选择/修改自一种海洋藻[Crocosphaerawatsonii WH 8501(Synechocystis sp.WH 8501)]的磷酸甘油酸变位酶的编码序列(GenBank登录号：ZP_00518183)，一个432-bp的发菜藻7120株的一种(gor)终止子(1792至2223)，和一个在3′端的PCR引物(2224至2243)。
请注意，DNA结构系列(SEQ ID)号12至16(例12-16)，代表了一种用(Hox)启动子控制的乙醇生产途径的一套基因设计，它们可以在寄主产氧光合细菌藻(例如发菜藻7120株)细胞体内表达使用。它们的共同表达就构成另外一条乙醇生产设计途径，例如，在被这套设计基因转化了的寄主发菜藻7120株细胞中的，一条从3-磷酸甘油酸分枝而设计构成的乙醇生产途径(如图1标记03-07)。
DNA结构系列(SEQ ID)17号：例17，展示了一种用(groE)启动子控制的依赖NADPH的酒精脱氢酶的DNA设计构造(1663bp)；其中包括：一个PCR引物(碱基对序列1-20)，一个241-bp的聚球藻7942株的光热响应(groE)启动子(21-261)，一个NADPH依赖的酒精脱氢酶编码序列(262-1335)选择/修改自一种树干毕赤酵母6054菌株(Pichia stipitis CBS 6054)的依赖NADPH的乙醇脱氢酶编码序列(GenBank登录号：XM_001384263)，一个308-bp的聚球藻7942株的(rbcS)终止子(1336至1643)，和一个PCR引物(1644至1663)。这种设计的DNA结构类似于例子1(DNA结构系列(SEQ ID)1号)，除了一个241-bp的光热响应的(groE)启动子(21-261)和一种依赖NADPH的酒精脱氢酶编码序列(262-1335)选自一种树干毕赤酵母的依赖NADPH的乙醇脱氢酶(GenBank登录修改：XM_001384263)。所设计的依赖NADPH的乙醇脱氢酶(GenBank登录号：XM_001384263)具有利用NADPH使乙醛还原成乙醇的能力。所使用的(groE)启动子(21-261)，使得其设计基因可通过应用在培养基中的光和热被诱导而表达。
按照巳显示在DNA结构系列(SEQ ID)17号中的有关使用可诱导(groE)启动子的相同原则，DNA结构系列(SEQ ID)号：18-21，展示设计基因例子18-21。简言之，DNA结构序列(SEQ ID)18号：例18，展示一种由(groE)启动子控制的丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2326个碱基对)；其中包括：一个PCR引物(碱基对序列1-20)，一个241-bp的聚球藻7942株光热响应的(groE)启动子(21-261)，一种丙酮酸脱羧酶编码序列(262-1998)选择/修改自一种真菌(Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239)的丙酮酸脱羧酶编码序列(GenBank登录号：XM_001526215)，一个308-bp的聚球藻7942株的(rbcS)终止子(1999至2306)，和一个PCR引物(2307至2326)。
DNA结构系列(SEQ ID)19号：例19，展示了一种由(groE)启动子控制的丙酮酸激酶的基因设计；其中包括：一个PCR引物(碱基对编码序列1-20)，一个134-碱基对(bp)的聚球藻7942株光热响应的(groE)启动子(21-154)，一种丙酮酸激酶的编码序列(155-1591)选择/改进自一种热球菌(Thermococcus kodakarensis)的丙酮酸激酶(GenBank登录号：AB098541)，一个308-bp的聚球藻7942株的(rbcS)终止子(1592至1899)，和一个PCR引物(1900至1919)。
DNA结构系列(SEQ ID)20号：例20，展示了一种用(groE)启动子控制的烯醇酶的DNA设计结构(1778bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134bp的聚球藻7942株光热响应的(groE)启动子(21-154)，一个烯醇编码序列(155-1450)选择/改进自一种嗜热菌(Geobacillus kaustophilus HTA426)的烯醇化酶(GenBank登录号：BAD77339)，一个308bp的聚球藻7942株的(rbcS)终止子(1451至1758)，和一个PCR引物(1759至1778)。
DNA结构系列(SEQ ID)21号：例21，展示了一种用(groE)启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(1178bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的聚球藻7942株的光热响应的(groE)启动子(21-154)，一个磷酸甘油酸变位酶编码序列(155-850)选择/修改自一种嗜热链球菌株18311的磷酸甘油酸变位酶(GenBank登录号：AF442555)，一个308-bp的聚球藻7942株的(rbcS)终止子(851-1158)，和一个PCR引物(1159至1178)。
请注意，DNA结构系列(SEQ ID)号数17至21(例17-21)，代表了一种用(groE)启动子控制的一套乙醇生产途径的设计基因，它们可以在宿主产氧光合细菌藻(例如，聚球藻7942株)细胞体内表达使用。它们的共同表达就构成一条乙醇生产设计途径，例如，在用这套设计基因转化了的聚球藻株7942宿主细胞中的，一条用(groE)启动子控制的从3-磷酸甘油酸分枝而设计构成的乙醇生产途径(如图1标记03-07)。
DNA结构系列(SEQ ID)号数22至26(例22-26)，展示了另一套使用聚球藻7002的rbcL基因启动子与尼拉(nirA)启动子相结合而调控的产乙醇途径酶DNA设计结构。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)22号：例22，展示了一种用(rbcL)启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(2361bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个621-bp的rbcL基因启动子(21-641)选择/修改自一种聚球藻株7002的rbcL基因启动子区域(GenBank登录号：D13971的区域345-962)，一个磷酸甘油酸变位酶编码序列(642-2177)选修自一种嗜热细菌(Geobacillus stearothermophilus)的磷酸甘油酸变位酶的编码序列(GenBank登录号：AF120091)，一个164-bp的聚球藻7002的rbcS基因终止子(2178至2341)，和一个PCR引物(2342至2361)。
DNA结构系列(SEQ ID)23号：例23，展示了一种用(rbcL)基因启动子控制的烯醇酶的DNA设计结构(2124BP)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个621-bp的聚球藻株7002的rbcL基因启动子(21-641)，一个烯醇酶编码序列(642-1940)选修自一种嗜热细菌(Aeropyrum pernix K1)的烯醇化酶(GenBank登录号：BAA81473)，一个164bp的聚球藻7002株的rbcS基因终止子(1941至2104)，和一个PCR引物(2105至2124)。
DNA结构系列(SEQ ID)24号：例24，展示了一种用(rbcL)基因启动子控制的丙酮酸激酶的DNA设计结构(2577bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个621-bp的聚球藻株7002的rbcL基因启动子(21-641)，一种丙酮酸激酶的编码序列(642-2393)选修自一种嗜热细菌帝斯曼菌株8903(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus DSM 8903)的丙酮酸激酶序列(GenBank：ABP67416)，一个164-bp的聚球藻株7002的rbcS基因终止子(2394至2557)，和一个PCR引物(2558至2577)。
DNA结构系列(SEQ ID)25号：例25，展示了一种用尼拉(nirA)启动子控制的丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2083基点)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的来自一种蓝藻(Plectonema boryanum)尼拉启动子(21-108)，一种丙酮酸-脱羧酶编码序列(109-1899)选择/修改自一种树干毕赤酵母菌的丙酮酸-脱羧酶编码序列(GenBank：XM_001387532)，一个164bp的聚球藻株7002的rbcS基因终止子(1900至2063)，和一个PCR引物(2064至2083)。
DNA结构系列(SEQ ID)26号：例26，展示了一种用(rbcL)基因启动子控制的依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的DNA设计构造(1950bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个621-bp的聚球藻株7002的rbcL基因启动子(21-641)，一个依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的编码序列(642-1766)选择/修改自一种克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140)的依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的编码序列(GenBank：XM_451932)，一个164bp的聚球藻株7002的rbcS基因终止子(1767至1930)，和一个PCR引物(1931至1950)。
由于DNA结构系列(SEQ ID)号22至26代表了一套用rbcL基因启动子与尼拉(nirA)启动子相结合而调控的产乙醇途径酶DNA设计结构，它们在宿主蓝藻(如聚球藻株7002)细胞体内表达使用，也构成一条，例如，从3-磷酸甘油酸分枝而来的乙醇生产设计途径(如图1标记03-07)。
DNA结构系列(SEQ ID)号数27至33(例27-33)，展示了另一套使用一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的groE基因启动子与尼拉(nirA)启动子相结合而调控的产乙醇途径酶DNA设计结构。由于这一套用groE基因启动子与尼拉(nirA)启动子相结合而调控的产乙醇途径酶DNA设计结构，可在宿主蓝藻(如蓝藻6803株)细胞体内表达使用；它们在宿主蓝藻(如蓝藻6803株)细胞体内表达使用，作为又一种设计蓝藻的体现，也构成一条由甘油三磷酸分枝而来的乙醇生产设计途径(如图1标记01-07)。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)27号：例27，展示了一种用(groE)启动子控制的依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶DNA设计结构(1521bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一个辅酶(NAD)依赖的甘油-3-磷酸盐脱氢酶编码序列(158-1092)选择/修改自一种光合细菌(Blastochloris viridis)的依赖辅酶(NAD)的甘油三磷酸-脱氢酶序列(GenBank登录号：CAC80993)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1093至1501)，和一个PCR引物(1502至1521)。
DNA结构系列(SEQ ID)28号：例28，展示了一种用(groE)启动子控制的磷酸甘油酸激酶的DNA设计结构(1768bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一种磷酸甘油酸激酶的编码序列(158-1339)选择/修改自一种嗜热细菌(Pelotomaculum thermopropionicum SI)磷酸甘油酸激酶序列(GenBank：BAF60903)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1340至1748)，和一个PCR引物(1749至1768)。
DNA结构序列(SEQ ID)29号：例29，展示了一种用(groE)启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(1225bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一种磷酸甘油酸变位酶编码序列(158-796)选自一种嗜热细菌(Geobacillus kaustophilus HTA426)磷酸甘油酸变位酶序列(GenBank：BAD75751)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子，和一个PCR引物(1206至1225)。
DNA结构系列(SEQ ID)30号：例30，展示了一种用(groE)启动子控制的烯醇酶的DNA设计结构(1885bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一种烯醇酶编码序列(158-1456)选自一种嗜热细菌(Aeropyrum pernix K1)的烯醇酶(GenBank登录号：BAA81473)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1457 1865)，和一个PCR引物(1866至1885)。
DNA结构系列(SEQ ID)31号：例31，展示了一种用(groE)启动子控制的丙酮酸激酶的DNA设计结构(2350bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一种丙酮酸激酶的编码序列(158-1921)选自一种嗜热细菌(Geobacilluskaustophilus HTA426)丙酮酸激酶序列(GenBank：BAD77024)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1922至2330)，和一个PCR引物(2331至2350)。
DNA结构系列(SEQ ID)32号：例32，展示了一种用(groE)启动子控制的丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2245bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的蓝藻6803株(Synechocystis sp.PCC 6803)的热和光响应的groE基因启动子(21-157)，一种丙酮酸脱羧酶编码序列(158-1816)选自一种细菌(Sarcinaventriculi)丙酮酸-脱羧酶序列(GenBank：AAL18557)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1817至2225)，和一个PCR引物(2226至2245)。
DNA结构系列(SEQ ID)33号：例33，展示了一种用尼拉(nirA)启动子控制的依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的DNA设计构造(1594bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个89bp的蓝藻6803株的亚硝酸盐还原酶基因(nirA)尼拉启动子(21-109)，一个依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的编码序列(110-1165)选自一种乳酸克鲁维酵母菌的依赖NAD(P)H的酒精脱氢酶的编码序列(GenBank登录号：X62767)，一个409-bp的蓝藻6803株的rbcS基因终止子(1166至1574)，和一个PCR引物(1575至1594)。
DNA结构系列(SEQ ID)号数34至38(例34-38)，展示了另一套使用嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的groE启动子与rbcS终止子的产乙醇途径酶DNA设计结构。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)34号：例34，展示了一种用groE启动子控制的耐热性磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(2212bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)光与热响应的(groE)基因启动子(21-154)，一个耐热磷酸甘油酸变位酶编码序列(155-1792)选自一种嗜热细菌(Pelotomaculum thermopropionicum SI)磷酸甘油酸变位酶(GenBank登录号：YP_001213270)，一个400-bp嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1793至2192)，和一个PCR引物(2193至2212)。
DNA结构系列(SEQ ID)35号：例35，展示了一种用groE启动子控制的烯醇酶的DNA设计结构(1882bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)光与热响应的(groE)基因启动子(21-154)，一个耐热丙酮酸激酶的编码序列(155-1462)选择/修改自一种嗜热帝斯曼细菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903)丙酮酸激酶(GenBank登录号：ABP67535)，一个400-bp嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1463至1862)，和一个PCR引物(1863至1882)。
DNA结构系列(SEQ ID)36号：例36，展示了一种用groE启动子控制的耐热丙酮酸激酶的DNA设计结构(1918bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)光与热响应的(groE)基因启动子(21-154)，一个耐热丙酮酸激酶的编码序列(155-1498)选择/修改自一种嗜热细菌(Thermoproteus tenax)丙酮酸激酶编码序列(GenBank：AF065890)，一个400-bp嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1499至1898)，和一个PCR引物(1899至1918)。
DNA结构系列(SEQ ID)37号：例37，展示了一种用groE启动子控制的耐热丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2281bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)光与热响应的(groE)基因启动子(21-154)，一个耐热丙酮酸-脱羧酶编码序列(155-1861)选择/修改自一种耐热细菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶编码序列(GenBank登录号：BAF76067)，一个400-bp嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1862至2261)，和一个PCR引物(2262至2281)。
DNA结构系列(SEQ ID)38号：例38，展示了一种用groE启动子控制的耐热和依赖NADP H的酒精脱氢酶DNA设计构造(1795bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个134-bp的一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)光与热响应的(groE)基因启动子(21-154)，一个依赖NADPH的酒精脱氢酶编码序列(155-1375)选择/修改自一种嗜热细菌(Thermococcus sp.)依赖辅酶(NADPH)的醇脱氢酶(GenBank登录号：U72646)，一个400-bp嗜热蓝藻(Thermosynechococcuselongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1376至1775)，和一个PCR引物(1776至1795)。
由于DNA结构系列(SEQ ID)号数34至38代表了一套耐热的用groE基因启动子调控的产乙醇途径酶DNA设计结构，它们在宿主嗜热蓝藻(如嗜热聚藻株BP-1)细胞体内表达使用，也构成一条耐热的，例如，从3-磷酸甘油酸分枝而来的乙醇生产设计途径(如图1标记03-07)。这也就形成一种可在高温下产乙醇的嗜热蓝藻，作为本发明的各种体现之一。
核酸(DNA)结构，如在上面提出的那些例子，可能包括其他适当的编码序列，例如，一个选择标记基因，以及一个可选的标签生物分子编码序列序列(如，卢米奥标签在核酸(DNA)结构系列(SEQ ID)4号：例4中所述)。可选用的抗菌素选择标记基因的核酸序列结构已经有许多，它们包括对下列抗菌素能给宿主授予抗性的选择标记基因：卡那霉素，新霉素，潮霉素，大观霉素，链霉素，博莱霉素，红霉素，磺酰尿素，和其他的抗菌素。另外的是某些可以补充宿主产氧光合细菌藻营养能力不足的标记基因，有时也可作选择性标记基因使用。
使用现有的基因转化技术，如电穿孔，基因枪，聚乙二醇诱导吸收，共轭配对和自然DNA吸收转化，可把含有设计师转基因的核酸结构送入产氧光合细菌藻(hostoxyphotobacteria)宿(寄)主体内。其基因转化体也可通已有的常规技术得到检别和测试。
各种设计的基因既可以分步按次序被转入宿主细胞，也可以同时一步到位地被导入到宿主细胞中。例如，由于DNA结构系列(SEQ ID)数号12至16所代表的产乙醇途径的五个酶(如图1数值标记03-07所示：磷酸甘油酸变位酶03，烯醇酶04，丙酮酸激酶05，丙酮酸脱羧酶06，和乙醇脱氢酶07)的基因DNA设计结构，可以被放入同一个基因载体，诸如，pCER20，pPT6803-1，pECAN8，或pMA4。因此，通过这种使用载体的方式，可以把所有五个DNA结构(设计基因)一同转入产氧光合细菌藻宿主细胞使之转变成一种具有一条3-磷酸甘油酸分枝的光合产乙醇途径(如图1标记03-07所示)的产氧光合细菌藻。必要时，巳被转化的含有五个产乙醇途径酶基因的宿主产氧光合细菌藻，被导入更多的设计DNA结构(可用额外选择标记基因，如链霉素选择标记基因等)使之转化成具有更丰富多彩的产乙醇途径。
通过使用不同的产乙醇途径酶DNA设计结构的组合，例如DNA结构系列(SEQ ID)号数1至38所代表的，用于转化适当的宿主产氧光合细菌藻，包括蓝藻(如：聚球藻7942株，聚藻6301株，发菜藻7120株，聚球藻7002株，蓝藻6803株，和嗜热聚藻株BP-1)和原绿藻(如：原绿球马里努斯MED4株，和原绿球马里努斯MIT9313株)，多种多样的产乙醇途径可以构建于多种宿主产氧光合细菌藻。如前所述，DNA设计结构系列(SEQID)号1至7(或8)可选用于建设由甘油三磷酸分枝的产乙醇途径(图1标记01-07)；DNA设计结构系列(SEQ ID)号1至10可选用于建设由果糖-1，6-二磷酸分枝的产乙醇途径(图1标记15-23)；和DNA设计结构系列(SEQ ID)号1至11可选用于建设由果糖-6-磷酸分枝的产乙醇途径(图1标记14-23)。
其他修改增加光生物乙醇生产
产氧光合细菌藻辅酶设计转换
根据图1所示的光合作用乙醇生产途径，从两个二氧化碳分子(2 CO2)和三个水分子(3 H2O)生产每一个乙醇分子，可能需要8个ATP分子和6NADPH分子，这两者都是可由产氧光合细菌藻类囊体中进行的光合作用水分解和光合磷酸化过程产生。为了使3-磷酸甘油酸分枝的光合产乙醇途径(03-07图1)正常运作，一个首选做法是使用一种能够利用从光驱动电子传递过程中产生的辅酶NADPH的酒精脱氢酶07。通常，一些依赖辅酶NADPH的酒精脱氢酶(NCBI的GenBank登录号：XM_001384263，ABN66271，EAZ62840，XM_001386628，U72646，M88600，Q04894和P25377)是可利用NADPH的乙醇脱氢酶的可能例子。乳酸克鲁维酵母(KlADH)线粒体的第三乙醇脱氢酶(GenBank登录号：XM_451932)是一种具有能力接受辅酶NAD(P)H的乙醇脱氢酶的例子。这样的乙醇脱氢酶，可以同时使用NADPH和NADH(即NAD(P)H)，可被选用于建设由3-磷酸甘油酸分枝的光合产乙醇途径(如图1标记03-07所示)及其他任何乙醇生产设计途径(如图1标记01-07和/或15-07)。应用依赖NADPH和/或NAD(P)H的酒精脱氢酶于设计乙醇生产途径，使乙醇生产途径能够直接利用光合电子运输过程可产生的还原能力NADPH，而有利于取更高乙醇产量。
在某种情况下，如果被使用的是一种只能利用NADH(但不能用NADPH)的乙醇脱氢酶，那么就需要一种的能从NADPH转换到NADH的NADPH/NADH转换机制，使得由3-磷酸甘油酸分枝的光合产乙醇途径(如图1标记03-07所示)能有效运作。这原因是光合作用水分解电子运输系统只能产生NADPH，而不产NADH。如果专一要求NADH的乙醇脱氢酶[如，一种酿酒酵母依赖NADH的酒精脱氢酶1(GenBank登录号：CAA99098)，一种阿米巴细菌的依赖NADH的醇脱氢酶(GenBank登录号：D49910)，或一种耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇脱氢酶II(GenBank登录号：M15394，NADH的依赖)]，被使用在3-磷酸甘油酸分枝的产乙醇途径，它就将无法利用由光合作用水分解电子运输系统可直接提供的还原能力NADPH。根据遗传背景的不同，产氧光合细菌藻宿主，在光合作用期间，不一定会有可把NADPH转换成NADH的机制。虽然它们的发酵代谢可能会从有机储备物产生一些NADH，野生型产氧光合细菌藻包括蓝藻和原绿藻通常没有巳知的机制可有效地把从光合作用过程中生成的NADPH转换成NADH。野生型发酵代谢过程往往缓慢并会受到产氧光合作用的抑制。因此，根据这一认识，可以预测，如果被使用的是专一要求NADH的乙醇脱氢酶例如专一要求NADH的耐热发酵细菌的乙醇脱氢酶II，那么一个由3-磷酸甘油酸分枝的产乙醇途径(图1中03-07)就会由于有限的NADH供给效率，而不能有效工作(或工作非常慢)。这个预言，在一定程度上，被实验报道证实。利用穿梭基因载体(pCB4)，丙酮酸脱羧酶和耐热发酵细菌的乙醇脱氢酶II被成功地在聚球藻宝成7942株细胞中得到表达[邓和科尔曼(1999)“合成乙醇的蓝藻基因工程，”应用与环境微生物学，65(2)：523 528]，但是，正如所料，通过丙酮酸脱羧酶与耐热发酵细菌乙醇脱氢酶II，生产乙醇的速度确实相当有限(约1.7μmol乙醇每小时每毫克叶绿素，见美国专利6699696 B2)。经过5天的培养发酵，在其转基因的聚球藻7942株细胞培养液中所积累浓度乙醇是0.047％乙醇(PCT公布：WO07084477)，明显低于某些野生型绿色藻类培养发酵可以达到的最高为1％的乙醇浓度[平野，上田，平山，和Ogushi(1997)“固定CO2和乙醇生产与微藻光合作用和细胞内的厌氧发酵”能源22(2/3)：137 142]。
因此，为了使3-磷酸甘油酸分枝的产乙醇途径(03-07图1)能有效地工作，至关重要的是需要使用一种从NADPH至NADH的转换机制，或可以使用能直接用NADPH的乙醇脱氢酶。在本发明各种体现之一，因此，是通过使用一对依赖NADPH的和依赖NAD的依赖性甘油三磷酸脱氢酶，建立一个有效的NADPH/NADH的转换机制。由依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶催化下列反应[3]，用NADPH把还原1，3-二磷酸甘油酸(1，3-DiPGA)至三磷酸甘油醛(3-PGAld)和无机磷酸盐(Pi)而产生NADP+：
1，3-DiPGA+NADPH+H+→3-PGAld+NADP++Pi    [3]
在依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶催化下，使用NAD+把三磷酸甘油醛(3PGAld)氧化成1，3-二磷酸甘油酸(1，3DiPGA)从而把NAD+转换成NADH：
3-PGAld+NAD++Pi→1，3-DiPGA+NADH+H+    [4]
上述酶反应[3]和[4]的净结果是把辅酶NADPH转换成NDAH。也就是说，是通过使用一对依赖NADPH的和依赖NAD的依赖性甘油三磷酸脱氢酶在产氧光合细菌藻宿主细胞质，构成一个可循环使用的穿梭氧化还原功能(transhydrogenase)作为一个有效的NADPH/NADH的转换机制，把NADPH转换成NADH，以供耐热发酵细菌的乙醇脱氢酶II之用，还原乙醛产乙醇。因此，在各种体现之一，设计的NADPH/NADH的转换功能基因的DNA构造(图2B)是一个设计的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶基因，以及一个设计的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶基因，以在产氧光合细菌藻宿主表达，赋予这种辅酶(NADPH/NADH)转换机制，增强乙醇生产。
当使用这种辅酶(NADPH/NADH)穿梭氧化还原转换机制时，设计的3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途径(03-07图1)现在也就可以使用专一要求NADH的乙醇脱氢酶，诸如耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇脱氢酶II。在这种情况下，设计3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途径可以包括以下7种酶：依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶，依赖辅酶NAD的甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，以及依赖NADH的酒精脱氢酶。
正如反应[3]和[4]解释，依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶和依赖辅酶NAD的甘油三磷酸脱氢酶一起作为可循环使用的穿梭氧化还原机制把NADPH转换为NADPH，以供专一要求NADH的乙醇脱氢酶，如耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇脱氢酶II使用于3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途(03-07图1)。请注意，这里不需要磷酸甘油酸激酶。因此，这种与穿梭氧化还原的辅酶(NADPH/NADH)转换机制耦合的3-磷酸甘油酸分枝的产乙醇途(03-07图1)，不同于包含磷酸甘油酸激酶的从甘油三磷酸分支的乙醇生产途径(01-07图1)。
在某些产氧光合细菌藻宿主细胞，有本宿主内源的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶的活性功能，作为卡尔文自然循环的一部分存在，如果它的存在量水平足够高，那就没有必要增设依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶。因此，在某些宿主产氧光合细菌藻细胞，用时利用其内源的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶和一种设计的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶，也可赋予一种可循环的穿梭氧化还原的辅酶(NADPH/NADH)转换机制。因此，在本发明各种体现之一中，一种与可循环的穿梭氧化还原的辅酶(NADPH/NADH)转换机制耦合的3-磷酸甘油酸分支的产乙醇设计途径可以包括以下六种酶：依赖辅酶NAD的甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，以及依赖NADH的酒精脱氢酶。这里的新颖体现是本宿主内源性的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶与一种设计转基因的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶01一起工作授予一种所需要的可循环的穿梭氧化还原的辅酶(NADPH/NADH)转换机制与3-磷酸甘油酸分支的产乙醇设计途径(03-07图1)耦合，以增强光生物乙醇生产。
在大多数情况下，由于本宿主内源的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶作为卡尔文循环的一部分的存在量水平足够高，关键是设计基因表达可与本宿主的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶配对的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶，以提供所需的NADPH/NADH转换功能而增强光生物乙醇生产。这种需要，也可以通过在设计乙醇生产途径时从卡尔文循环选择适当分支点来解决满足。为了赋予所需的NADPH/NADH的转换机制，其中的一个首选做法，是选择卡尔文循环的甘油三磷酸或之后的中间产物(如图1所示的果糖二磷酸)，作分枝(支)点来设计光合乙醇生产途径。在这些乙醇生产途径的设计中，其NADPH/NADH的转换可由一个两步骤的机制实现：1)利用卡尔文循环其中的一步骤，通过其依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶，使用NADPH，把1，3-二磷酸甘油酸还原成甘油三磷酸；及2)使用设计途径中的由依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶催化的一步，把甘油三磷酸氧化成1，3-二磷酸甘油酸，而产生辅酶NADH。这两步反应(如，以上反应式[3]和[4]所示)的净结果是将辅酶NADPH的转换成NADH，以提供乙醇生产途径所需的还原力(NADH)。对于第1步的功能，宿主生物体自然卡尔文循环的甘油三磷酸脱氢酶一般是足够了。赋予这两步反应的NADPH/NADH转换机制，重要的是在设计乙醇生产途径中，使用依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶。因此，在本发明各种体现之一中，一个首选的做法是，在如图1所示的乙醇生产设计途径中，使用依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶，其同工酶，其功能衍生物，其类似物，其设计修改酶和/或其组合。
DNA结构系列(SEQ ID)39和40号，例39和40，显示了一对具有辅酶(NADPH/NADH)转换功能的酶DNA设计结构(图2B)：一个依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶的DNA设计构造(DNA结构系列SEQ ID号：39)和一个设计者依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶的DNA设计构造(DNA结构序列SEQ ID号：40)。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)39号：例39，展示了一种用尼拉启动子控制的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶DNA的计师构造(1983bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个400-bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的尼拉(nirA)启动子(21-420)，一个依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶编码序列(421-1563)选择/修改自聚藻7942株的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶编码序列(GenBank登录号：D61379)，一个400-bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1564至1963)，和一个PCR引物(1964至1983)。
DNA结构系列(SEQ ID)40号：例40，展示了一种用尼拉启动子控制的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶DNA的设计构造(1793pb)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个400-bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的尼拉(nirA)启动子(21-420)，一个依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶编码序列(421-1373)选择/修改自一种光合细菌(Heliobacterium chlorum)依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶序列(NCBI的登录号：AJ252110，CAC80992)，一个400-bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1374至1773)，和一个PCR引物(1774至1793)。
当使用有图2B所示的辅酶(NADPH/NADH)转换功能酶的设计基因(例如，DNA结构系列(SEQ ID)39号和40号)时，一种依赖NADH的酒精脱氢酶的DNA设计构造，例如，DNA结构系列(SEQ ID)41号所显示的，现在也可以被选用于建设一条由3-磷酸甘油酸分支的产乙醇设计途径(03-07图1)。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)41号：例41，展示了一种用尼拉启动子控制的耐热的和依赖NADH的酒精脱氢酶DNA的设计构造(1992bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个400bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的尼拉(nirA)启动子(21-420)，一个依赖NADH的酒精脱氢酶编码序列(421-1572)选择/修改自一种耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇脱氢酶的核苷酸序列(GenBank登录号：M15394)，一个400-bp的选自一种嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的rbcS基因终止子(1573至1972)，和一个PCR引物(1973至1992)。
DNA结构系列(SEQ ID)号数42至47(例42-47)，展示了一套用一个原绿球藻马里努斯(Prochlorococcus marinus MED4)基因(groE)启动子控制的3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途径(03-07图1；DNA结构系列(SEQ ID)42-45和47号；例42-45和47)的DNA设计结构，其中包括一种依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶的DNA设计结构(图2C；如DNA结构序列(SEQ ID)46号，例46)。使用这种依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶(DNA结构序列(SEQ ID)46号)与宿主原绿球藻马里努斯细胞本身的依赖NADPH的甘油-3-磷酸盐脱氢酶赋予所需的可循环穿梭氧化还原机制把NADPH转换成NADH(图2C)，这使一条由3-磷酸甘油酸分支的产乙醇设计途径(03-07图1；DNA结构系列(SEQ ID)42-45和47号)，能用其依赖NADH的乙醇脱氢酶(DNA结构系列(SEQID)47号，例47)而生产乙醇。″
简言之，DNA结构系列(SEQ ID)42号：例42，展示了一种用groE启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(1265bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯(海表面的原绿藻株Prochlorococcusmarinus MED4)热和光响应的groE启动子(21-158)，一个磷酸甘油酸变位酶编码序列(159-845)选自一种耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的磷酸甘油酸变位酶编码序列(GenBank登录号：L09651)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(846-1245)，和一个PCR引物(1246至1265)。
DNA结构系列(SEQ ID)43号：例43，展示了一种用groE启动子控制的烯醇化酶的DNA设计结构(1877bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯的热和光响应的groE启动子(21-158)，一个烯醇酶编码序列(159-1457)选自一种嗜热细菌(Aeropyrum pernix K1)的烯醇酶序列(GenBank：NP_148623)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(1458至1857)和一个PCR引物(1858至1877)。
DNA结构系列(SEQ ID)44号：例44，展示了一种用groE启动子控制的丙酮酸激酶的DNA设计结构(2093bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯的热和光响应的groE启动子(21-158)，一个丙酮酸激酶的编码序列(159-1673)选自一种树干毕赤酵母菌株6054的丙酮酸激酶序列(GenBank：XM_001384591)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(1674-2073)，和一个PCR引物(2074至2093)。
DNA结构系列(SEQ ID)45号：例45，展示了一种用groE启动子控制的丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2369bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯的热和光响应的groE启动子(21-158)，一个丙酮酸-脱羧酶编码序列(159-1949)选自一种树干毕赤酵母菌的丙酮酸-脱羧酶顺序(GenBank登录号：U75310)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(2350至49)，和一个PCR引物(2350至2369)。
DNA结构系列(SEQ ID)46号：例46，展示了一种用groE启动子控制的依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶DNA的设计构造(1586bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯的热和光响应的groE启动子(21-158)，一个依赖辅酶NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶编码序列(159-1166)选自一种樟子松(Pinussylvestris)的甘油三磷酸脱氢酶序列(GenBank登录号：L32560)，一个400bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(1167至1566)，和一个PCR引物(1567至1586)。
DNA结构系列(SEQ ID)47号：例47，展示了一种用groE启动子控制的依赖NADH的酒精脱氢酶DNA设计构造(1730bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个138-bp的原绿球藻马里努斯的热和光响应的groE启动子(21-158)，一个依赖NADH的酒精脱氢酶编码序列(159-1310)选自一种耐热发酵细菌(Zymomonas mobilis)的酒精脱氢酶序列(GenBank登录号：M15394)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯rbcS基因终止子(1311至1710)，和一个PCR引物(1711至1730)。
由于DNA结构系列(SEQ ID)42-47号代表了一种原绿球藻马里努斯的groE启动子控制的乙醇生产的设计途径，可使用于原绿球藻马里努斯等海洋原绿藻宿主的一套设计基因，它们也代表了一种被转化了的原绿藻宿主中的乙醇生产设计途径的体现，例如，一种设计原绿球藻利用海水进行光合产乙醇的体现之一。
使用原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)的groE启动子和尼拉(nirA)启动子相结合，DNA结构系列(SEQ ID)48-53号(例子48-53)代表了一套3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途径(03-07图1；DNA设计构建例子48-52)的DNA设计结构和依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶DNA的设计构造(DNA设计构建例子53)。利用这种DNA设计结构所表达的依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶与宿主原绿球藻马里努斯细胞本身内源的依赖NADPH的甘油-3-磷酸盐脱氢酶一起，也形成了所需的一个从NADPH到NADH的穿梭氧化还原机制，而有利于3-磷酸甘油酸分支的产乙醇途径(03-07图1)的运行。
简言之，DNA结构系列(SEQ ID)48号：例48，展示了一种用groE启动子控制的依赖NADH的酒精脱氢酶的DNA设计构造(1630bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinusMIT9313)的热和光响应groE启动子(21-157)，一个依赖NADH的酒精脱氢酶编码序列(158-1210)选自一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的酒精脱氢酶序列(GenBank登录号：X62766)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1211至1610)，和一个PCR引物(1611至1630)。
DNA结构系列(SEQ ID)49号：例49，展示了一种用groE启动子控制的丙酮酸-脱羧酶DNA的设计构造(2272bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)的热和光响应groE启动子(21-157)，一个丙酮酸-脱羧酶编码序列(158-1852)选自一种酿酒酵母(Saccharomyces kluyveri)的丙酮酸-脱羧酶编码序列(GenBank：AY245517)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1853至2252)，和一个PCR引物(2253至2272)。
DNA结构系列(SEQ ID)50号：例50，展示了一种用groE启动子控制的丙酮酸激酶的DNA设计结构(2092bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)的热和光响应groE启动子(21-157)，一个丙酮酸激酶的编码序列(158-1672)选自一种真菌(Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239)的丙酮酸激酶编码序列(GenBank：XM_001528210)，一个400bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1673至2072)，和一个PCR引物(2073至2092)。
DNA结构系列(SEQ ID)51号：例51，展示了一种用groE启动子控制的烯醇酶的DNA设计结构(1897bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)的热和光响应groE启动子(21-157)，一个烯醇酶编码序列(158-1477)选自一种真菌(Lodderomyceselongisporus NRRL YB-4239)的烯醇酶编码序列(GenBank：XM_001528071)选择，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1478至1877)，以及一个PCR引物(1878至1897)。
DNA结构系列(SEQ ID)52号：例52，展示了一种用groE启动子控制的磷酸甘油酸变位酶的DNA设计结构(2113bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)的热和光响应groE启动子(21-157)，一个磷酸甘油酸变位酶编码序列(158-1693)选自一种巨大芽孢杆菌磷酸甘油酸变位酶的编码序列(GenBank登录号：AF120090)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1694至2093)，和一个PCR引物(2094至2113)。
DNA结构系列(SEQ ID)53号：例53，展示了一种用nirA启动子控制的依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶DNA的设计构造(1776bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinusMIT9313)的nirA启动子(21420)，一个辅酶依赖NAD的甘油-3-磷酸盐脱氢酶编码序列(421-1356)选自一种栅藻(Scenedesmus vacuolatus)细胞质的依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶序列(GenBank选择：CAC81012，AJ252209)，一个400-bp的原绿球藻马里努斯MIT9313株的rbcS基因终止子(1357至1756)，和一个PCR引物(1757至1776)。
由于DNA结构系列(SEQ ID)48-53号(例子48-53)也代表了一套用原绿球藻马里努斯MIT9313牛株的groE启动子和尼拉(nirA)启动子相结合调控的乙醇生产设计途径，它们可被表达于又一寄主，例如，原绿球藻马里努斯MIT9313株(Prochlorococcus marinus MIT9313)及相关原绿藻物种，因此，在本发明各种体现之一中，它们也代表又一可利用海水光合生产乙醇的原绿藻。
此外，吡啶核苷酸辅助因子辅酶NADP和NAD的作用，在许多产乙醇的产氧光合细菌藻，由其是那些使用专一要求NADH的乙醇脱氢酶的寄主细胞中，至关重要。确保这两种辅酶NADP和NAD的提供，为利于光生物乙醇生产。据知，辅酶NADP可以，通过一种磷酸酶活性，被转化为NAD[Pattanayak和Chatterjee(1998)“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸磷酸酶有助于减少暗硝酸盐：硝酸盐和氨的法规，”Biologia Plantarium 41(1)：75-84]；并且，NAD，通过另一种辅酶NAD激酶活性，也可被转换成NADP  [武藤宫地，Usuda，爱德华兹和Bassham(1981)“光致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸高等植物叶子，”植物生理学68(2)：324-328；松村，卡多塔，武藤宫地(1982)“光诱导转化的NAD+的小球藻细胞辅酶，”生化生物物理学兽类679(2)：300300]。
所以，当需要时，可以进一步利用转基因技术，提高寄主的NADPH-磷酸酶和/或NAD激酶的活动，以增强NADPH/NADH的相互转换。因此，在本发明的各种体现之一中，产乙醇的产氧光合细菌藻，进一步包含其他设计的转基因(图2C)，以可诱导地表示一种或多种酶，来促进的NADPH/NADH的相互转换，如：NADPH磷酸酶和NAD激酶，(GenBank登录号：P83576，P83575，A59480XM，_001609395，ZP_00519346，EAM47569，ZP_01632610，XM_001324239)。
干扰核糖核酸调控产氧光合细菌藻
DNA结构系列(SEQ ID)54和55号：列54和55，展示了一类可干扰糖原合成的干扰核糖核酸(iRNA)的DNA设计构造(图2e)。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)54号：例54，展示了一种用nirA启动子控制的糖原合成酶干扰核糖核酸DNA的设计构造(934bp基点)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的聚球藻7942株(淡水蓝藻)亚硝酸盐还原酶尼拉(nirA)启动子(21-108)，一个糖原合成酶干扰核糖核酸的DNA编码设计序列(109-606)采用自根据两个独特的蓝藻7942株的糖原合成酶编码序列片段(GenBank登录号：NC_007604)的逆向反义互补片段设计，一个308bp的聚球藻7942株的(rbcS)基因终止子(607-914)，和一个PCR引物(915-934)。由于使用尼拉启动子(21-108)，此设计糖原合成干扰核糖核酸基因，在需要时，可通过在培养基中加肥料硝酸盐(NO3 -)被诱导表达，以提高其特定的光生物乙醇生产。糖原合成酶干扰核糖核酸序列(109-606)的一个功能是与寄主本身的糖原合成酶基因转录的mRNA结合而绑定在一起，从而阻断其原糖合成酶的翻译合成。以这种方式抑制糖原合酶活性的作用是引导更多的光合卡尔文循环产物到乙醇生产途径，例如甘油三磷酸分支的乙醇生产途径(如图1标记01-07所示)。
DNA结构系列(SEQ ID)55号：例55，展示了一种用groE启动子控制的糖原合成酶干扰核糖核酸DNA的设计构造(1408bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个137-bp的光与热反应的嗜热蓝藻BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的groE基因启动子(21-157)，一个糖原合成酶干扰核糖核酸基因设计编码序列(158-988)[它由下列片段组成：的一个300-bp的正义互补设计片段(158-457)，一个231bp的设计编码序列内含子状圈(458-688)，和一个300-bp的反义互补设计片段(689-988)，它根据嗜热蓝藻BP-1株的糖原合成酶的编码序列(GenBank中唯一的序列：BA000039地区：789655..791079)的第一个300-bp的片段而设计]，一个400-bp的光与热反应的嗜热蓝藻BP-1株的rbcS基因终止子(989-1388)，和一个PCR引物(1489至1508)。这糖原合成酶干扰核糖核酸设计序列(158-988)是以下两个机制抑制糖原合成酶的合成。首先，300-bp的干扰核糖核酸反义互补序列(对应DNA序列的689-988)的一个功能是与寄主产氧光合细菌藻本身的糖原合成酶基因转录的mRNA结合而绑定在一起，从而阻断其原糖合成酶的翻译合成。除此之外，300-bp的干扰核糖核酸反义互补序列(对应的DNA设计序列689-988)也可与在同一干扰核糖核酸分子上对应300-bp的正义互补序列(对应DNA序列158-457)结合而绑定在一起，形成一个内含231-bp的类似发夹环状子的双链RNA结构(对应DNA设计序列458-688)，从而阻断其原糖合成酶的翻译(合成)。实验研究已经表明，这种发夹状双链RNA结构类型也可以触发转录后的基因沉默[Fuhrmann，Stahlberg，Govorunova，等级，和Hegemann(2001年)114：3857-3863细胞科学杂志]。由于一种groE启动子(21-157)的使用，此糖原合成干扰核糖核酸设计基因，在需要时候，主要表达于有光和/或热存在的条件下，以引导更多的光合卡尔文循环产物到各种乙醇生产设计途径(如图1标记01-07，03-07，和15-23所示)。
糖原降解和糖酵解设计基因
糖原降解设计基因的例子展示在明细列表中的DNA结构设计系列(SEQ ID)56-61号。简言之，DNA结构系列(SEQ ID)56号：例56，展示了一种淀粉酶的DNA设计结构(2470bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种淀粉酶编码序列(109-2142)选自一种原绿球藻马里努斯的异淀粉酶的编码序列(GenBank登录号：YP_001091732)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(2143至2450)，和一个PCR引物(2451至2470)。
DNA结构系列(SEQ ID)57号：例57，展示了一种4-α-葡聚糖转移酶的DNA设计结构(1993bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种4-阿尔法-葡聚糖转移酶编码序列(109-1665)选自一种嗜热蓝藻BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的4-α-葡聚糖转移酶编码序列(GenBank：BAC08259)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(1666至1973)，和一个PCR引物(1974至1993)。
DNA结构系列(SEQ ID)58号：例58，展示了一种糖原-磷酸酶的DNA设计结构(2965bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种糖原-磷酸酶编码序列(109-2637)选自一种嗜热蓝藻BP-1株(Thermosynechococcus elongatus BP-1)的糖原-磷酸酶编码序列(GenBank：BAC09631)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(2638至2945)，和一个PCR引物(2946至2965)。
DNA结构系列(SEQ ID)59号：例59，展示了一种磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase)DNA的设计结构(2119bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种磷酸葡萄糖变位酶编码序列(109-1791)选自一种树干毕赤酵母6054株的磷酸葡萄糖变位酶序列(GenBank：XM_001383281)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(2092至2099)，和一个PCR引物(2100至2119)。
DNA结构系列(SEQ ID)60号：例60，展示了一种葡萄糖激酶的DNA设计结构(1852bp)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种葡萄糖激酶编码序列(109-1524)选自一种树干毕赤酵母6054株的葡萄糖激酶编码序列(GenBank：XM_001386035)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(1525至1832)，和一个PCR引物(1833至1852)。
DNA结构系列(SEQ ID)61号：例61，展示了一种葡萄糖六磷酸盐异构酶的DNA设计构造(2101BP)；其中包括：一个PCR引物(编码序列1-20)，一个88-bp的蓝聚藻6301株的尼拉(nirA)启动子(21-108)，一种葡萄糖六磷酸异构酶编码序列(109-1773)选自一种酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸异构酶编码序列(GenBank：M21696)，一个308-bp的蓝聚藻6301株的rbcS基因终止子(1774-2081)，和一个PCR引物(2082至2101)。
糖原降解的设计基因，如DNA结构系列(SEQ ID)56-61号，可以被选用在不同的乙醇生产设计途径(如图1)，而建设成与其糖原降解途径相结合的乙醇生产组合途径。例如，DNA结构系列(SEQ ID)56-61号，可与DNA结构系列(SEQ ID)1-11号一起使用于构建一套组合的由尼拉启动子控制的糖原对乙醇的生产途径(如图1标记12-23所示)；它包括下列酶：淀粉酶(amylase，)，4-α-葡聚糖转移酶(4-alpha-glucanotransferase，)，糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)，葡萄糖激酶(glucokinase)，磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)，葡萄糖-6磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)，磷酸果糖激酶(phosphofructose kinase)，磷酸果糖醛缩酶(fructose diphosphate aldolase)，磷酸丙糖异构酶(triose phosphateisomerase)，甘油三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase)，磷酸甘油酸变位酶(phosphoglyceratemutase)，烯醇酶(enolase)，丙酮酸激酶(pyruvate kinase)，丙酮酸脱羧酶，和乙醇脱氢酶。这一套组合的从糖原至乙醇的途径(12-23图1)既可单独使用，也可与其他的乙醇生产途径，例如与由3-磷酸甘油酸分枝的产乙醇途径(03-07图1)，组合使用。
″利用设计产氧光合细菌藻生物反应器生产收获乙醇″
本发明进一步公开了如何使用设计产氧光合细菌藻(图3)与生物反应器和乙醇分离收集系统，利用太阳光，二氧化碳和水，生产收获乙醇(CH3CH2OH)。设计师产氧光合细菌藻可按多种方法用于光生物乙醇生产。首选的体现之一，是使用设计师转基因产氧光合细菌藻和光生物反应器的一个乙醇生产收获(蒸馏)过程，从二氧化碳和水直接光合生产收获乙醇；其中包括一个具体的运作过程包括一系列如下所述的步骤：一)使用无机培养液(如，BG-11)在好氧(正常的)条件下，以空气二氧化碳作为碳源，光合自养地培养转基因的产氧光合细菌藻；二)当设计者产氧光合细菌藻细胞培养生长成熟可生乙醇时，把产氧光合细菌藻细胞培养液密封或放置到一个特定的条件，如厌氧条件下，可以通过清除光生物反应器的氧气，诱导乙醇生产途径基因的表达，；三)当设计生物体细胞表达了乙醇生产途径酶时，提供太阳光，使用乙醇生产途径酶表达的细胞作为催化剂，从二氧化碳和水光合生产乙醇；四)用已知的本领域技术，收获乙醇产品。例如，由膜过滤和酒精蒸馏技术和灵活的反应器收集氧气产品的组合方法，从光生物反应器收获乙醇产品。
上述设计产氧光合细菌藻与反应器产物分离收集系统的过程，可反复循环使用，实现从二氧化碳和水光合生产乙醇(CH3CH2OH)和氧气(O2)的更理想结果。也可以根据本发明，对上述过程的任何步骤一)到四)作调整以适应某些特定条件。在实践中，上述过程的步骤一)至四)，可全部或部分地，和/或以任何调整组合的方式，根据本发明应用于提高光生物乙醇生产。
在这个过程中，可以使用的二氧化碳的来源，包括(但不限于)：工业二氧化碳，碳酸氢盐碳酸盐，和大气二氧化碳。举个例子，从化石燃料发电厂和/或生物量为燃料的工业设施烟气二氧化碳可以通过管道进入此过程中的光生物反应器。其中，能够为设计者光合作用乙醇生产过程提供二氧化碳的工业设施包括(但不限于)：燃煤电厂，铁和炼钢业，水泥生产厂，石油精炼设施，化肥生产厂，生物质燃煤和/或化石燃料的乙醇蒸馏/分离设施，生物质热解过程，烟囱，发酵生物反应器，生物燃料的炼油设施，及其组合。
另外，这个设计师光生物乙醇的生产过程也可以用在环境和大气中的二氧化碳。气体二氧化碳，溶解二氧化碳，碳酸氢盐，和碳酸盐都可被用于该产氧光合细菌藻乙醇生产技术。
有关这产氧光合细菌藻乙醇生产技术的细节，在这里用设计师蓝藻为例作更多说明体现。如上所述，本发明的设计师产氧光合细菌藻例如包含了设计Hox-启动子控制的乙醇生产途径基因组(DNA结构系列(SEQ ID)号：12-16)的设计师蓝藻，可利用空气中的二氧化碳作碳源，通过自养光合作用，按类似于野生型蓝藻方式，在有氧的条件下正常生长。设计师产氧光合细菌藻，如设计师蓝藻，也可利用有机基质进行异养生长。
在优选实施例中，设计师产氧光合细菌藻在包含必需矿物质(无机)营养物的培养液(例，BG-11)中，利用空气中的二氧化碳作为碳源，在好氧条件下进行光合自养生长。在正常情况下，它们的生长不需要例如葡萄糖或醋酸那样的有机基质。只要有充足的矿物营养素，大多数产氧光合细菌藻可以在水中，利用空气中的二氧化碳迅速通过光合作用自养成长。在常用于产氧光合细菌藻生长所需的营养元素有：氮，磷，钾，约在1-10毫摩尔浓度，镁，钙，硫，氯和在约0.5至1.0毫摩尔浓度，加上一些微摩尔浓度水平的微量元素：锰，铁，铜，锌，硼，钴，钼，及其他微量元素。矿物营养素都可以在液体水质基本培养基(如BG-11)介质中提供；液体培养基配制可按已知的行之有效的配方，采用水(对于设计师淡水产氧光合细菌藻，采用淡水；为设计师海洋产氧光合细菌藻，采用海水)和相对便宜的肥料，如碳酸氢铵(碳铵)矿物盐(或硝酸铵，尿素，氯化铵)，钾磷酸盐(磷酸氢二钾和磷酸二氢钾)，七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)，氯化钙(氯化钙)，硫酸锌亚铁(ZnSO4.7H2O)，铁(二)硫酸亚铁(FeSO4.7水)和硼酸(H3BO3)，等等。也就是说，设计师产氧光合细菌藻细胞可以廉价地大量培养，因为在有氧条件下在短时间内，如在一个开放的池塘，设计者产氧光合细菌藻可像野生型那样，光自养地自行使用空气二氧化碳作迅速成长。这是本发明其中的一个显着特征，它可为可再生能源生产提供一个代有效益的光生物催化剂(光合产乙醇生的设计产氧光合细菌藻)。
当产氧光合细菌藻生长成熟可产乙醇时，产氧光合细菌藻培养液可被封闭或放入某些特定的条件，例如，可以通过清除光生物反应器中的氧气，产生的密封(图4)厌氧条件，，诱导表达由设计的Hox-启动子控制的产乙醇途经的基因(例如，DNA结构系列(SEQ ID)号：12-16)。当设计师乙醇生产途径酶表达后，提供可见光，利用诱导了的产氧光合细菌藻细胞作为从二氧化碳和水光合生产乙醇的催化剂，。当设计的乙醇生产途径基因表达后，产氧光合细菌藻细胞基本上可以成为高效稳健“蓝绿色机器，从二氧化碳和水光合生产乙醇。产氧光合细菌藻产生的乙醇产品可通过膜过滤和乙醇蒸馏相结合的技术而收获。
按照本发明，直接从二氧化碳和水光合生产CH3CH2OH和O2在原则上，可以有较高的量子效率。从理论上讲，通过这一机制，它仅需要24光子，从水和二氧化碳产生乙醇(CH3CH2OH)和氧气(3O2)。从二氧化碳和水光合乙醇生产过程中的最大理论能源效率约为10％，这是所有生物方法中最高的可能值。因此，这种光合产乙醇的方法具有很大潜力。
上述利用产氧光合细菌藻从二氧化碳和水产乙醇过程可周期重复使用以取得更理想的结果。
另一个特点是，由于设计诱导启动子(如Hox基因启动子)的使用，设计者可调控的产乙醇产氧光合细菌藻如设计蓝藻(图3)提供了可周期重复使用的能力：在好氧的正常条件下，能像野生型那样光合自养生长；在某些特定的诱导条件下(如在厌氧条件下)，设计师乙醇生产的途径可被诱导开通而高效生产乙醇。例如，具有设计Hox启动子控制的乙醇生产途径基因的产氧光合细菌藻，包含正常呼吸机制，当其细胞返回有氧条件时，它立即使用有机储备物(和/或外源性底物如葡萄糖或醋酸)供细胞代谢生长。因此，当产氧光合细菌藻培养物返回到有氧条件后，在厌氧条件下使用过的产氧光合细菌藻细胞将停止产生乙醇途径的酶而开始合成卡尔文循环酶，恢复光合自养能力，产生正常功能的新细胞。因此，可周期重复使用这种经基因改造的生物类型，在好氧条件下正常光合自养生长，在厌氧反应器的厌氧条件下，高效生产乙醇。也就是说，这个光生物乙醇生产技术可通过在有氧条件下恢复振兴用过的产氧光合细菌藻细胞的活力而多次重复周期使用，以取得更理想的结果。另外，这个光生物乙醇生产技术也可连续运作，把在氧反应器重新焕发活力的产氧光合细菌藻培养物循环送入厌氧反应器产乙醇，而将在厌氧反应器使用过的产氧光合细菌藻培养物循(使用于乙醇生产后)，循环送入好氧反应器以恢复振兴其光合自养的活力。
有些设计产氧光合细菌藻甚至还可与乙醇生产途径的运行同时进行生长。设计师产氧光合细菌藻是否或以何速可进行生长，取决于其生长的遗传背景和乙醇生产条件，以及如何分配卡尔文循环的产品，在供乙醇生产途径使用后，有多少产物仍然可用于设计细胞生长。在乙醇生产条件下，能同时保持基本细胞功能和适当生长速度的设计师产氧光合细菌藻，也可用于连续光合乙醇生产。
还有使用产氧光合细菌藻的其他方法。例如，在乙醇生产光生物反应器使用过的产氧光合细菌藻细胞，不一定需要被分发回培养生长反应器。相反，使用过的产氧光合细菌藻细胞可取出来作为肥料或者作为生物质原料用于其他处理使用，因为设计师可诱导的产氧光合细菌藻可在培养生长反应器不断光合自养地不断增长提供产氧光合细菌藻细胞给光生物乙醇生产反应器用于生产生物燃料乙醇。这功能特别有利于使用只能在乙醇生产途径接通之前(而不是之后)才能光合自养地生长的设计师产氧光合细菌藻。例如，通过在不断光合自养增长的培养反应器保持一个设计师产氧光合细菌藻(即只在乙醇生产途径打开前，才可光合自养增长)，可以连续为光生物乙醇生产反应器提供产氧光合细菌藻细胞培养物。这种方法使得这些设计师产氧光合细菌藻也能被用于乙醇生产。
由于各种原因，有些设计光合产乙醇的细菌藻仅可光异养，或光-异杂养，而不能光自养增长。通过使用生长培养反应器.也能光异养，或光-异杂养地培养这类设计师乙醇生产产氧光合细菌藻，它们可使用下列有机基物质(包括但不限于)：葡萄糖，果糖，蔗糖，醋酸，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，丙酮，淀粉，半纤维素，纤维素，脂肪，蛋白质，有机酸，生物材料和组合。如此培养的产氧光合细菌藻，也可供给光生物乙醇生产反应器用于乙醇生产。
对于某些具体设计尼拉启动子控制的乙醇生产基因的产氧光合细菌藻，上述的光生物反应器过程可进一步被调整，以取得更有利的结果。例如，其中一个设计师产氧光合细菌藻包含那些尼拉启动子控制乙醇生产途径的基因DNA序列，如设计的DNA序列例子1-7(DNA结构系列(SEQ ID)号：1-7)所示，可以生长在通常含铵(但不含硝酸盐)的培养基，由类似于野生型产氧光合细菌藻的自养方式，使用空气二氧化碳进行光合作用。这是因为使用了尼拉启动子控制设计途径的基因，在此产氧光合细菌藻中的乙醇生产途径基因只会根据需要在拥有硝酸盐时被表达。具有尼拉启动子控制的乙醇生产途径基因的显着特点是，该乙醇生产设计途径的表达可通过操纵在培养基中相对于铵(铵离子)的硝酸盐浓度，而被诱导调控，无需任何厌氧条件。也就是说，者该乙醇生产设计途径的表达在好氧和/或厌氧条件下，都可以根据硝酸盐浓度被诱导调控。这使设计师光生物乙醇的生产工艺，在好氧条件下，即使用大气二氧化碳，也可进行操作使用。同样，这类具有设计尼拉启动子控制乙醇生产途径的产氧光合细菌藻，在有氧和/或无氧条件(都可光自养生长。因此，作为进一步的体现，对使用具有亚硝酸盐还原酶(尼拉)启动子控制的乙醇生产设计基因的产氧光合细菌藻，其作业流程调整如下：一)在诱导设计师乙醇生产途径基因的表达前，用含铵但没有硝酸盐(NO3-)的培养基(如BG-11)，光自养地培养设计师转基因产氧光合细菌藻；二)当设计师产氧光合细菌藻培养生长成熟可产乙醇时，在培养基中加硝酸盐，以提高硝酸盐(NO3 -)浓度，诱导乙醇生产设计途径基因的表达式；三)当乙醇生产设计途径酶表达后，提供可见光如太阳光，利用被诱导的设计师产氧光合细菌藻细胞作为催化剂从二氧化碳和水光合作用生产乙醇；四)用膜过滤和乙醇蒸馏技术相结合，从光生物反应器收获乙醇产品。
对于某些具有groE启动子控制的乙醇生产设计途径基因(举例来说，DNA结构系列(SEQ ID)号：17-21)的产氧光合细菌藻，其乙醇生产途径活动可以利用光线和/或温度条件来控制。例如，当该产氧光合细菌藻在一个密封的透明塑料反应器中时，其groE启动子控制乙醇生产途径的基因，可随着太阳照射和塑料反应器的温室效应(热)，而被诱导。对于一些具有rbcL基因启动子控制的乙醇生产设计途径基因(举例来说，DNA结构系列(SEQ ID)号：：22～24和26)的产氧光合细菌藻，其乙醇生产途径的表达，与核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶氧化酶(Rubisco)操纵子的表达活动同时进行。
根据季节和地理位置的不同，在一个密封的塑料生物反应器中的温度可以高达约30-70oC。从嗜热产氧光合细菌藻寄主创造而来的，具有耐热的groE(Thermosynechococcuselongatus-BP-1groE)启动子控制的乙醇设计途径基因(例如，DNA结构系列(SEQ ID)号：34-38)的嗜热产氧光合细菌藻，特别适合于在这样的高温度(30-70℃)条件下，光合生产乙醇。
除了乙醇生产之外，同时，还可以利用设计师产氧光合细菌藻-或其乙醇生产的部分设计途径产生一定的中间产品，包括：乙醛，丙酮，磷酸，二磷酸甘油酸，1，3二磷酸甘油酸，甘油-3-磷酸，二羟丙酮磷酸，果糖1，6二磷酸，果糖-6-磷酸，葡萄糖六磷酸盐，和葡萄糖-1-磷酸盐。因此，进一步体现还包括一个额外步骤，收获由设计师产氧光合细菌藻的可诱导转基因产生的中间产品，。通过有选择性地关掉催化一个中间产品消费的酶活动，该中间产品的生产可以被选择性地增强。通过从产氧光合细菌藻酶乙醇生产设计途径中，有选择性地省略一个特定的设计师酶，也可以加强一个中间产品生产。例如，一个从乙醇生产设计途径(图1)中省略了(或关闭)丙酮酸脱羧酶，或乙醇脱氢酶的设计师产氧光合细菌藻可用于生产乙醛和丙酮酸盐。举例来说，从寄主藻6803株建立而来的设计产氧光合细菌藻包括DNA结构系列(SEQ ID)号：27-33，当其尼拉启动子控制的醇脱氢酶基因(DNA结构系列(SEQ ID)号：33)被省略，或通过加铵肥料，关闭其诱导表达时，利用由阳光(及其相关热)可诱导的groE启动子控制的设计基因(如，DNA结构系列(SEQ ID)号：27-32)可产生丙酮酸等一些中间产品。
乙醇光生物生产和温室蒸馏收获
本发明还公开了一个综合的光生物乙醇生产和收获技术，它包括一种特殊的太阳能温室蒸馏系统(图4-8)和与其结合使用的可产乙醇的光生物(如图3所示)，例如，转基因的具有产乙醇功能(图1)的产氧光合细菌藻。
综合集成的太阳能温室蒸馏系统(图4A和4B)包括一系列多种多样的培养光生物和生产与收获乙醇的多个温室和温室蒸馏单元系统(图5A-5D)，在一起以串联和/或平行的方式工作，有效利用太阳能生产和收获乙醇。在本发明不同的体现中，阳光被用来驱动光生物的生长和乙醇生产，并同时在培养基中产生热能，并且这种热能被同时用于温室蒸馏收获乙醇(图4A)。按最大约10％的理论光合作用太阳能转换效率计算，接近90％的太阳能在光生物反应器过程中转化成为热能。在本发明其中的一个实施方案中，该太阳能废热被用于蒸发在液体培养基中的乙醇(和水)进行温室蒸馏分馏收获(图4)。因此，本方法的基本特点是，充分有效地利用太阳能来同时驱动光合作用和温室蒸馏，以较高的太阳能利用效率和最低的成本，生产和收获光生物乙醇。
在光生物(光合作用)的基本过程中，光合有效的阳光辐射光子(波长400-700纳米(nm))可被光合生物(例如，产氧光合细菌藻)的光合色素，如叶绿素，吸收。光合作用，在一般情况下，是一根本的生物化学过程，把阳光的电磁能量转换成可存储的化学能，支持几乎地球上的所有生命。简单来说，光合色素(如，叶绿素)吸收光子而产生其激发能态，然后，其激发能态再由一个在色素P680和P700等反应中心的矢量电荷分离光化学捕获。由此捕获的光的能量，可通过在类囊体膜中的一系列电子与质子结合运输传递过程，分解水产生一种具有还原能力的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶)(NADPH)和一种具有化学能的三磷酸腺苷(ATP)。它们(NADPH，和ATP)可用于卡尔文循环(一系列酶反应)把二氧化碳还原成为糖和其它产物。这就是野生型产氧光合作用的简要说明。
在转基因的可产乙醇的光合生物(如藻类)，又可称“设计产氧光合细菌藻”的细胞中，由于设计建立的乙醇生产途径，可与卡尔文循环一起工作，以便把卡尔文循环的产物立即转化成产品乙醇(图1)。通过这一机制，从水(3H2O)和二氧化碳(2CO2)产生一个乙醇(CH3CH2OH)分子和三个氧气分子(3O2)，理论上仅需24个光子。通过这种从二氧化碳和水直接光合生产乙醇的机制，其最大的从太阳能到乙醇的能量转换效率，可达约10％；这是，在所有生物方法中，最高理论值的上限。
请注意，最大约10％的从太阳能到乙醇的能量转换效率理论值，也意味着，近90％的阳光能量被转化成为热能(分子振动和热红外辐射)消散在光生物过程。此外，某些不可见的太阳辐射的一部分，如红外光辐射也可以被在培养基中的液体吸收产生热量。因此，在光生物培养基(图4A所示)，阳光驱动光合作用，并在同时，产生大量的热量。事实上，大部分(近90％)太阳光的能量，在光生物过程，被转化成为热能。在本发明中，这些太阳能废热被原地利用于驱动一个特殊的温室蒸馏系统过程，从光生物(转基因的产氧光合细菌藻)液体培养基收获产品乙醇。
如图5A所示，在各种体现之一，蒸馏温室包括一个倾斜蒸汽冷凝透明天花板，一个密封的温室光合生物乙醇生产培养反应器，一系列冷凝液收集管位于温室墙上的周围以应收集来自的天花板冷凝液，以及尾气冷凝和通风装置。蒸馏温室可以用许多种材料，包括玻璃，塑料(plastic)和高分子材料(polymer materials)来建立。蒸馏温室的形式和/或形状也可多种多样，包括各种形式的光生物生长室和/或生长袋的形式和多种形状；它们可以从不同的合成材料制成的，如某些乙醇耐受宽容的(ethanol-tolerant)塑料和/或(但不限于)高分子材料。由于阳光驾驶光合作用并同时在光生物液体培养基中产生大量的热，在本发明各种体现之一，该太阳热能即被用于蒸馏温室，从其液体培养基蒸发相关的产品乙醇(与水)。富含乙醇的水汽然后凝结到温度较低的透明的倾斜天花板上，因为天花板是由外部的较冷空气，风，和热红外线对太空的辐射而冷却。蒸气冷凝用的透明天花板也可以灵活地运行冷水通过天花板水室系统使之冷却。
如图4A所示，对天花板材料表面性质的不同而要求有所不同，倾斜天花板角α应至少高于5度，最好是15-30度，最好在所有的天花板内表面，其倾斜天角α在30-70度以上，以便使冷凝液滴滑动进入位于温室墙上周围的冷凝液收集管道，而不是自由下落掉回到天花板下面的培养基中去。这样，当蒸汽凝结后，由于表面张力和地球重力的相互作用，凝结的液滴可以沿着倾斜天花板表面滑动，最后滑到温室的墙上进入收集管道。所收集的冷凝液内含较丰富的乙醇，通过一输液管逾随重力进入储罐，或进入下一个蒸馏蒸室，使之实行蒸馏再蒸馏和再冷凝收集的系列过程，直至最终达到所期望的蒸馏馏分酒精浓度结果。
图4A还说明，如何把通过管道收集到的冷凝液从第一温室用冷凝液输送管转移入下一个蒸馏温室作再蒸馏。根据本发明不同的体现之一，它的一个首选的做法是通过设计，让第一温室的冷凝液收集输液管部位适当的高于下一个蒸馏温室的啤酒液位，以便使收集到的冷凝液可通过输送管利用重力将其流入下一个蒸馏温室而无需使用任何抽泵。如图4A所示，该冷凝输送管的管口未端应插入(沉浸)在下一个蒸馏温室的液体中，以便阻塞蒸馏温室之间的任何不可取的气体交流。
第二个温室(图4A(中)所示)是一个把光生物(转基因的产氧光合细菌藻)液体培养基放置于下部的光生物反应器室的例子。从第一个温室(左边，图4A)，冷凝液通过管子输送到第二个温室蒸馏室(图4A中(上))作再蒸馏。第二个蒸馏室(图4A中(上))与第二个生物反应器温室(图4A中(下))上/下之间由一个透明和防渗板和/或薄膜(或膜)将其分开，只允许阳光通过。利用阳光驱动光合作用和在下部的光合细胞培养器室产生热量。太阳能的废热用于在光生物培养反应器上面的蒸馏室中重新蒸发其含有乙醇的液体(啤酒)。蒸气，然后重新上到第二个蒸馏温室天花板表面上被冷却凝结。通过类似第一蒸馏温室的冷凝液收集方式，在第二次蒸馏温室的冷凝液，通过使用一个倾斜的天花板表面与在天花板下的温室墙体系统周围的冷凝液收集管道，而被收集。在从第二蒸馏温室(图4A，中)收集到的冷凝液乙醇浓度(取决于源啤酒和蒸馏工作条件而定，通常在一个约1-70％乙醇的浓度范围)现在高于在第一蒸馏温室(图4A，左)收集的冷凝液的浓度(约0.5-40％的乙醇)。使用第三(图4A，右)和/或更多的蒸馏温室进一步蒸馏再蒸馏，可达到更高的乙醇浓度。因此，这也是一个可以把阳光的能量(包括其光合有效的光子和相关的太阳能的废热)同时有效地用于光合作用和温室蒸馏同时收获乙醇的例子。
图5B说明了尾气冷凝和排气装置，其中包括：一个冷水浴室，尾气冷凝盘管，气体凝析室，和一个垂直排气管。在使用中，尾气冷凝盘管，气冷凝室，和垂直通风管都在冷水澡室中被贯穿的冷水冷却，使尾气中的水蒸气会沿着冷凝线圈管与气体凝析室凝结，然后通过排气管垂直排气。本装置用于处理光生物乙醇生产温室的尾气。“尾气”是指的残余气体，如光生物反应过程期间所积累的氧气和氮气，需要从光生物反应器被除去，以便其进程可继续下去。如图5A所示，当如烟气二氧化碳(通常包含大约15％的二氧化碳，6％O2，和79％N2)的工业二氧化碳送入光生物反应器，光生物可把其中的二氧化碳和水转化成乙醇和氧气。其残余气体最终将大多为N2和O2(加上一些乙醇蒸汽)-尾气。为了使光生物进程继续下去，尾气必须被除去，使更多的烟道气二氧化碳可被送入反应器。由于尾气含有乙醇蒸汽，未经处理直接排出会造成乙醇蒸汽随尾气排放排入大气。利用尾气冷凝和排气系统(图5B)可以解决这个问题。当尾气(从温室)通过被冷水冷却的冷凝盘管时，其蒸气(包括乙醇蒸汽)将会沿着冷凝线圈管与气体凝析室凝结，冷凝液会流动积聚在底部的冷凝水收集室，而蒸气被除去的尾气然后可以通过一个与气体凝析腔室上部连接的垂直排气管排出。冷凝液(含乙醇和水)，可以通过使用冷凝液出口收集(图5B)。因此，根据不同的体现之一，通过一种尾气冷凝和排气装置或多个尾气冷凝数量和排气单元系统串联和/或并行的使用，也可从尾气收获乙醇和淡水产品。
图5A也代表了一个光生物乙醇的生产与收获，使用相关的太阳能废热耦合乙醇光生物反应器温室蒸馏系统的例子。在这个例子中，工业二氧化碳/或碳酸氢盐可作为光生物乙醇生产过程的二氧化碳的来源。在光生物过程中，近90％的阳光能量通常以热消散。取决于所在地理位置和季节，太阳废热量可以提高光生物反应器蒸馏温室中的培养基温度高达约30-70℃。这种热(温度)足以从培养液中蒸发汽化产品乙醇与水(通常含0.1-6％乙醇)。蒸气，然后走上蒸馏温室的透明的天花板内表面，可以由周围的空气(风)冷却，和/或它的热红外线辐射到太空中，而冷却凝结。由于蒸汽凝结，凝析成小水滴，利用表面张力(天花板表面与冷凝水滴相互作用)和向下地球重力的拉力可以沿着一个倾斜的天花板内表面滑动，最终流进入绕温室墙上的收集管道。冷凝液的乙醇浓度明显高于培养液中的(通常0.1-6％乙醇)，因为在蒸气中乙醇与水的比例通常比液体培养基中的为多。因此，使用这种技术，能够用最低的成本和利用太阳的废热，收获来自光生物液体培养基中的乙醇。
如前所述，取决于所在地理位置和季节，用太阳废热可以提高光生物反应器蒸馏温室中的培养基温度高达约30-70℃。因此，根据本发明不同的体现之一，它的一个首选做法是使用嗜热的转基因设计光生物(如可以容忍高温的转基因蓝藻)和温室蒸馏系统生产和收获乙醇。
在另一实施例中，蒸馏温室包括，光生物反应器，一系列引导液体培养基流动的挡板，培养液管，可调进出口。例如，由于液体培养基的使用，适当引导液体培养基的流动，一般有利于增强光生物乙醇生产和收获效率。尤其是在集成多温室光生物乙醇生产和收获的运作情况下(图4和6)，液体培养基引导流通是必不可少的。
在另一实施例中，蒸馏温室包括：一个有水腔透明天花板(图5C)，它可被通行的冷水而冷却，以提高光却蒸馏过程的效率。建立一个水冷却吊顶系统的使用也使温室内的温生物反应器冷度适中，不仅可使嗜热的，而且非嗜热的光生物也可用于光合乙醇生产和温室蒸馏。
在另一个体现中，如图5D所示，蒸馏温室包括一层光合生物培养生长反应器室和一层在此之上的啤酒蒸馏室。在上的蒸馏室与在下的生物反应器室由透明防渗板和/或薄膜(或膜)分开隔离，只允许阳光通过。阳光驱动光合作用并在光合生物反应器细胞培养室产生大量的热量。该太阳废热即用于在生物培养反应室之上的蒸馏室蒸发含有乙醇的啤酒液体。蒸气，然后到天花板表面被冷却凝结。这种蒸馏系统可在一批次和/或连续模式下运行。当它在太阳能热驱动温室蒸馏一批次处理模式下运行，在上蒸馏厅中的蒸馏啤酒残液，将逐渐变成较纯净的水(含没有或很少乙醇)，然后可以作为淡水收获。
如图4和6所示，蒸馏室最好是隔离式的，这样在一个舱室的蒸汽与其他蒸馏厢分离，而只有那些啤酒液体可以逐渐流动从一个蒸馏厢在串联的管口引导下，通过隔板，可调节进出水管口，或通道和墙孔(沉浸在啤酒液)流到下一个蒸馏室。当啤酒液体通过蒸馏车厢时，其酒精含量会通过蒸馏被除去。根据不同的需要和加工条件，任何数目的蒸馏室(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以串联使用。因此，当啤酒液通过一系列蒸馏室时，在啤酒液中乙醇含量可以降低到最低水平，以致使从最后的再蒸馏室出来的残余液基本上成淡水可用于再制造液体培养基，和/或用作其他用途的副产品。另一方面，从第一蒸馏舱所得的馏分乙醇含量通常比从下一个蒸馏室所得馏分的高。在还有一个实施例中，如图5D所示，光合生物乙醇生产和太阳能热驱动温室蒸馏系统包括一个有顶空间的光生物培养反应器室和一个氧气体收集系统，以及在生物反应器室上的蒸馏室层。光生物培养反应器室的有顶空间可放便气体交换，例如可用来喂送二氧化碳和灵活地收获氧气。包括工业二氧化碳和/或环境中大气二氧化碳可通过生物反应器管道喂用于产氧光合生物的乙醇生产过程。氧气气体收集系统包括一个氧气分离膜系统，氧气泵，和一个氧气储罐。使用本氧气收集系统可以从顶空间的气体连接系统灵活地收获从光合生物反应器生产的氧气。
根据本发明的许多实施例之一，任何数目的蒸馏温室(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以用串联和/或平行进行(图4和6)。随着再重蒸馏的增加，蒸馏馏分的酒精浓度可增高。通过多重温室蒸馏，最高的乙醇浓度可达96％的乙醇，这是足够高的酒精质量，它可直接作为燃料运行乙醇燃料驱动的和/或灵活燃料驱动的车辆。因此，这种工艺技术的设计以高效率和最大限度地利用太阳能(包括它的可见光和红外辐射)，从二氧化碳和水产生乙醇，同时通过温室蒸馏，以最少的成本收获生物能源产品乙醇。请注意，有时候，在某中情况下，在一些光生物液体培养基中的大批量产乙醇浓度可能会低至0.1％以下。这样的低浓度乙醇，很难用传统的乙醇分离技术，如锅炉的蒸馏技术，来收获。然而，随着温室蒸馏技术(图4-8)的使用，就有可能收获浓度如此低的乙醇；例如，可通过使用温室蒸馏技术，从含低浓度乙醇(0.1％乙醇以下)的光生物培养液，作温室蒸馏收获其含乙醇的冷凝液，而先产生一种啤酒液(其中可包含超过3％的乙醇)。这样，然后，既可继续用温室蒸馏再蒸馏而获取更高浓度的乙醇，也可以使用某些传统的乙醇分离技术包括锅炉蒸馏获得更高浓度的酒精。在这种情况下，温室蒸馏技术(图4-8)就可与传统乙醇分离技术包括锅炉蒸馏结合使用。
此外，除了光生物乙醇的生产和收获，使用该技术还可以生产淡水，氧气，和大量使用过的光生物(产氧光合细菌藻)物质材料作为副产品。因此，本发明的光生物乙醇生产和收获技术可望有较高的从太阳能到乙醇的能量转换效率和多种应用包括生产中间代谢产物。
图4B提出了一个综合光生物乙醇生产和太阳能热驱动系统，包括多个蒸馏再蒸馏温室例子。在这个例子中，在第一蒸馏温室生物反应器，设计师生物体培养物(图4B，上)利用水和二氧化碳产生乙醇。该产品乙醇从光生物培养基由太阳能热驱动蒸馏而收获。从这个蒸馏温室(图4B，上)收集的冷凝液(水)被输送到下一个温室(图4B，中)，在那里冷凝液(水)用蒸馏车厢系列作重新蒸馏。根据不同的体现之一，任何数目的蒸馏间(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以用串联和/或并行使用。如前所述，当啤酒液推移通过串联的蒸馏车厢(或蒸馏温室)，在啤酒液体中的乙醇含量可以被蒸发提取，使剩余的液体最后主要成为纯淡水从再蒸馏室(蒸馏温室)流出，可用于制作培养基和/或其他用途。也就是说，这个光生物乙醇的生产工艺技术的使用也产生淡水作为副产品。
冷凝液从再蒸馏室转移到第三个蒸馏温室(图4B，底部)，这也包括重新蒸馏再蒸馏多个车厢。从第三次蒸馏温室的最后馏分通常含有10-90％的乙醇，在很大程度上由源啤酒中乙醇含量而定。进一步重新蒸馏可达到更高的乙醇浓度。根据本发明的许多实施例之一，任何数目的蒸馏车厢和/或温室(如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可用于串联和/或平行操作。随着重新蒸馏次数的增加，由此产生的凝聚液的酒精浓度通常也可增加。通过这种分馏类型蒸馏可实现的最大乙醇浓度为96％乙醇(4％的水)，因为在此浓度(96％的乙醇，这也被称为一个共沸混合物)，在水蒸气中的乙醇浓度不再比在液相中的高，从而达到了极限。
图6给出另外一个集成的光生物乙醇生产和太阳能热驱动蒸馏系统，包括串联和并联运行多个蒸馏温室，增强全过程效率的例子。该系统是类似于图4B的例子，除了由6个蒸馏再蒸馏温室大棚，其中的第一个蒸馏温室采用了具水腔的天花板，可以运行冷水通过天花板水室而冷却。如前所述，冷却水的使用，不仅可以提高蒸馏效率，而且也使欠耐热的设计师生物体可用于光生物乙醇生产。此外，当水蒸汽上升凝结到温室天花板上，它释放的热量给冷却水，从而逐步提高了冷却水的温度。因此，从水室天花板出口1(或出口2)退出的水是相对温暖的，可用于热回收等工艺。其他操作都类似于图4B的例子。概括而言，利用太阳光的驱动由水和二氧化碳光生物生产乙醇，并产生热量。太阳能热驱动的蒸馏从光生物培养基收获所生产的乙醇(图6左上)。从第一个蒸馏温室蒸馏被输送到二次蒸馏温室(图6，左中)在那里冷凝液通过蒸馏车厢系列作重新蒸馏。冷凝液从第二蒸馏温室转移到第三蒸馏温室再次重新蒸馏(图6，右下)。从第三蒸馏温室输出的冷凝液通常含有10-90％的乙醇，这取决于源啤酒中乙醇含量。进一步蒸馏，可达到更高的乙醇浓度，最高可达到约96％乙醇浓度，可用于运行乙醇动力和/或灵活燃料汽车。必要时，96％的乙醇，也可用于通过共沸蒸馏和/或分子筛分离技术，消除其剩余4％的水，生产100％乙醇(200度)。
此外，如前面提到的，这个光生物乙醇的生产工艺技术(图6)的使用也可以产生一种副产品淡水。当海水在培养基中使用，这个光生物乙醇的生产工艺技术可以有效地产生一种副产品，以及从海水制淡水。因此，在各种体现之一，利用从海洋光合生物转化制成的设计耐盐光合生物，最好应用这种集成光生物乙醇生产和太阳能热驱动温室蒸馏系统(图6)。这种设计耐盐光合生物体和温室蒸馏技术(图4-6)的使用可以以最低的成本，用海水生产出乙醇和淡水。
如前所述，处决于季节和地理位置，在一个密封的塑料光生物反应器和/或蒸馏温室内温度能高达约30-70℃。在这样的高温度(30-70℃)条件下，某些含耐热诱导型启动子控制的乙醇生产设计途径基因的嗜热产氧光合细菌藻特别适用于使用本发明的综合光生物乙醇生产和温室蒸馏乙醇采收技术。本发明进一步公开了如何使用设计产氧光合细菌藻包括转基因蓝藻与集成光生物乙醇生产和太阳能热驱动温室蒸馏系统(图4-6)。有多种方法可应用，设计师光合生物和温室蒸馏系统(图4B及6)。在这里，设计师蓝藻被用作展示如何使用集成光生物乙醇生产和设计师光合生物太阳能热驱动温室蒸馏系统的例子。首选的体现之一就是使用转基因的产氧光合细菌藻与光生物反应器和一个乙醇蒸馏温室，直接从二氧化碳和水光合生产收获乙醇(图4和6)，其中包括一个具体的操作过程(图7相结合的制度)描述为以下一系列步骤：一)，在无机培养液(如BG-11)中，培养转基因的设计产氧光合细菌藻，在有氧(正常)的条件下，光合自养地利用空气中二氧化碳作为碳源进行生长；二)当设计产氧光合细菌藻细胞培养生长成熟和可产乙醇时把其封入或放置到一个特定的诱导条件，如厌氧条件下，可以通过清除光生物反应器中的氧气，促使诱导设计师乙醇生产途径基因的表达；三)当产氧光合细菌藻细胞表达乙醇生产设计途径酶后，提供利用二氧化碳和阳光来驱动光合作用从二氧化碳和水生产乙醇和在培养基产生热；四)利用培养基中的太阳能废热蒸发其产品乙醇(和水)；五)蒸气凝聚到一个倾斜的透明天花板；六)收集沿倾斜天花板系统的内表面流动进入围绕温室的墙上冷凝收集管的冷凝液；及七)输送收集的冷凝液到下一个蒸馏温室(或存储罐)作重新蒸馏，直到达到预期的冷凝液乙醇浓度。
上述过程中使用二氧化碳和水光合生产乙醇和氧气的设计光生物反应器和乙醇蒸馏温室组合收获系统(图4和6)可以多元化反复循环使用，以实现更理想的结果。上述过程的步骤一)到至七)，这个)也可以按本发明作相应调整以适应某些特定条件。例如，当一个水冷式蒸汽冷凝天花板温室蒸馏系统(图5c)作为如图6的光生物反应器和乙醇蒸馏温室收获组合系统，步骤五)蒸汽冷凝可以通过在蒸馏温室顶部的水室吊顶系统运行冷水加强冷却效果。在实践中，按照本发明，步骤一)到至七)的过程，可以全部或部分应用，和/或以任何调整组合应用以加强光生物乙醇生产和收获。
在这个过程中，可以使用的二氧化碳来源，包括(但不限于)：工业二氧化碳，碳酸盐，与大气二氧化碳。举个例子，从化石燃料发电厂和/或生物量为燃料的工业设施的烟气二氧化碳可以通过管道送入这个过程中的如图4和6所示的光生物反应器。能够为该光生物乙醇生产和收获过程提供二氧化碳的工业设施包括(但不限于)：燃煤电厂，铁和炼钢业，水泥生产厂，石油精炼设施，化肥生产厂，生物质为燃料和/或化石燃料的乙醇蒸馏/分离设备，生物质热解过程，烟囱，发酵生物反应器，生物燃料的炼油设施，及其组合。另外，这个设计光生物乙醇生产收获过程也可以使用环境的二氧化碳。气体的二氧化碳，溶解的二氧化碳，碳酸氢盐，和碳酸盐都可以被应用于综合的设计光生物乙醇生产收获技术(图4-8)。
如前所述，某些设计师产氧光合细菌藻例如包含Hox-启动子控制的乙醇生产途径基因组的设计师蓝藻，可利用空气中的二氧化碳作碳源，通过自养光合作用，按类似于野生型蓝藻方式，在有氧的条件下正常生长。设计师产氧光合细菌藻，如设计师蓝藻，也可利用有机基质进行异养生长。
在优选实施例中，设计师产氧光合细菌藻在包含必需矿物质(无机)营养物的培养液(例，BG-11)中，利用空气中的二氧化碳作为碳源，在好氧条件下进行光合自养生长。在正常情况下，它们的生长不需要例如葡萄糖或醋酸那样的有机基质。只要有充足的矿物营养素，大多数产氧光合细菌藻可以在水中，利用空气中的二氧化碳迅速通过光合作用自养成长。在常用于产氧光合细菌藻生长所需的营养元素有：氮，磷，钾，约在1-10毫摩尔浓度，镁，钙，硫，氯和在约0.5至1.0毫摩尔浓度，加上一些微摩尔浓度水平的微量元素：锰，铁，铜，锌，硼，钴，钼，及其他微量元素。矿物营养素都可以在液体水质基本培养基(如BG-11)介质中提供；液体培养基配制可按已知的行之有效的配方，采用水(对于设计师淡水产氧光合细菌藻，采用淡水；为设计师海洋产氧光合细菌藻，采用海水)和相对便宜的肥料，如碳酸氢铵(碳铵)矿物盐(或硝酸铵，尿素，氯化铵)，钾磷酸盐(磷酸氢二钾和磷酸二氢钾)，七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)，氯化钙(氯化钙)，硫酸锌亚铁(ZnSO4.7H2O)，铁(二)硫酸亚铁(FeSO4.7水)和硼酸(H3BO3)，等等。也就是说，设计师产氧光合细菌藻细胞可以廉价地大量培养，因为在有氧条件下在短时间内，如在一个开放的池塘，设计者产氧光合细菌藻可像野生型那样，光自养地自行使用空气二氧化碳作迅速成长。这是本发明其中的一个显着特征，它可为可再生能源生产提供一个代有效益的光生物催化剂(光合产乙醇生的设计产氧光合细菌藻)。利用综合的设计光生物乙醇生产收获技术(图4-8)可以最大限度地发挥效益。
例如，在第二个或第三蒸馏温室中的光生物反应器/(图4B，中和/或底部)可以用于培养，例如可诱导的设计产氧光合细菌藻，利用二氧化碳作为碳源生长。如图4A所示，在光合作用中产生的太阳能废热用于驱动在光生物反应器上的蒸馏室中的啤酒液汽化，使阳光能量用于光合作用和乙醇蒸馏温室收获而提高能源效率。当产氧光合细菌藻生长可产乙醇时，把其放入某些特定的诱导条件，例如，可以通过使用灵活的氧气气体收集系统清除光生物反应器中的氧气而产生密封厌氧的条件(图5D)，设计师厌氧Hox基因启动子控制的光合乙醇生产的途径基因的表达。当设计师乙醇生产途径的酶基因被诱导表达，诱导了的设计产氧光合细菌藻细胞可以被发送到第一个蒸馏温室光生物反应器(图4B，上)作为催化剂，进行光合作用从二氧化碳和水生产乙醇。利用光合生产乙醇过程中产生的太阳能废热蒸发培养液中产品乙醇。蒸气从产氧光合细菌藻光生物培养液到蒸气冷凝天花板系，它由空气，风(图4B)和/或通过运行在天花板(图5c和6)冷水冷却而凝结。如前所述，凝结液从第一蒸馏温室(图4B，上)通过冷凝液管使用重力运送到二次蒸馏温室反应器上的啤酒液馏温室作重新蒸馏(图4B，中)，以提高馏分液乙醇浓度。从第二蒸馏温室的馏分(凝结液)是通过冷凝导管使用的重力自动输送进入第三次蒸馏温室液反应器上的啤酒液馏温室作再蒸馏(图4B，底部)，以再次提高馏分的酒精浓度水平。
必要时，从第三蒸馏温室(图4B，底部)的馏分液可运到第四，第五，第六，并更多再蒸馏温室，直到最终实现预期馏分油中的更高的乙醇浓度。根据本发明的许多实施例之一，任何数目的蒸馏温室(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，等)可以串联和/或平行运行。随蒸馏次数的增加，在馏分液的酒精浓度一般会增加。通过多次温室再蒸馏的最高酒精浓度可达到约96％的乙醇，这是足够好，可以用来作为燃料乙醇运行车辆。因此，这种工艺技术(图4-8)可最大限度地利用太阳能(包括它的可见光和红外线辐射)，通过光生物和蒸馏温室，以低成本从二氧化碳和水高效生产收获。
上述使用设计师光合生物产乙醇和蒸馏温室集成系统收获乙醇产品(图4和6)的过程可重复多元化地周期运作，实现更理想的结果。除了乙醇产品，工艺技术的使用也可以产生淡水作为副产品，因为通过重新蒸馏提取乙醇后出来的啤酒液体残存液大部份主要是纯净水。此功能也是有益的，尤其是当海水是培养的媒介来源时，从海水制淡水是可取的。
对于某些具有设计师亚硝酸盐还原酶的(尼拉)启动子控制的乙醇生产途径基因的产氧光合细菌藻，上述的光生物反应器过程可进一步调整，以取得更有利的结果。例如，一种设计产氧光合细菌藻包含尼拉启动子控制的乙醇生产途径基因，在含铵(但不含硝酸盐)的培养液中可以相似于野生型的方式，使用空气中的二氧化碳为碳源，正常自养光合生长。这是因为在此设计产氧光合细菌藻的乙醇生产途径基因，只会在根据需要在培养液中加硝酸盐时被诱导表达，由于该设计使用了亚硝酸盐还原酶的(尼拉)启动子控制乙醇生产途径基因的表达。如前所述，具有尼拉启动子控制的乙醇生产途径基因的设计产氧光合细菌藻的显着特点是该乙醇生产途径的表达可通过操纵在培养基的硝酸盐(NO3 -)相对于铵(铵离子)的浓度而被诱导，无需任何厌氧条件。也就是说，设计的乙醇生产途径的表达，无论在有氧还是无氧的条件下，如在第一蒸馏温室的光生物反应器中(图4B，上)，都可通过操纵在培养基的硝酸盐(NO3 -)相对于铵(铵离子)的浓度而被诱导。这使设计师光生物乙醇的生产工艺操作，在好氧条件下，即在使用大气二氧化碳的条件下，也可进行。同样，一个光生物培养反应器的使用，如在第二的和/或第三次蒸馏温室(图4B，中和/或底部)，其培养基含铵(但不含硝酸盐)，可用于培养这类具尼拉启动子控制的乙醇生产设计途径基因的产氧光合细菌藻，在有氧和厌氧条件下以二氧化碳作为碳源进行生长。因此，作为本发明进一步的体现，对于具有尼拉启动子控制的乙醇生产途径基因的产氧光合细菌藻的使用运作过程，作如下调整(如图8所示)：一)在含铵(但不含硝酸盐)的培养液(如BG-11)中，培养设计师转基因产氧光合细菌藻；二)当设计产氧光合细菌藻生长成熟和可产乙醇时，在培养基中加入硝酸盐肥料，以提高硝酸盐(NO3 -)相对于该铵(铵离子)的浓度，促使诱导乙醇生产设计途径基因的表达；三)当乙醇生产设计途径酶基因表达后，提供二氧化碳(CO2)和利用太阳光来驱动光合作用从二氧化碳和水生产乙醇，并在培养基产生热；四)利用在光生物乙醇反应器培养基中的太阳废热蒸发产品乙醇(和水)；五)蒸气凝聚到一个透明的倾斜天花板；
六)收集沿倾斜天花板系统的内表面流动进入围绕温室的墙上冷凝收集管的冷凝液；和七)输送收集的冷凝液到下一个蒸馏温室(或存储罐)作重新蒸馏，直到达到预期的冷凝液乙醇浓度。
在各种体现之一，这个过程还包括以下步骤：八)收获由温室蒸馏和重蒸馏的结合技术的从反应器环境收获乙醇；九)收获乙醇后，收获剩余啤酒液体(主要是纯淡水)；十)通过使用尾气冷凝和排气装置，从尾气收获乙醇和淡水；十一)收获使用过的设计转基因生物体；和，十二)重复步骤一)至十一)为持续光生物乙醇的生产和收获。
另一个特点是，设计者可诱导的产乙醇产氧光合细菌藻，如设计蓝藻，提供了可反复循环生产使用的能力：在正常好氧条件下，以类似于野生型的方式，光合自养地生长为高效率的光生物乙醇生产(图1和3)作准备；当在生物反应器，如在第一个蒸馏温室光生物反应器(图4B，上)中加硝酸盐时，由尼拉启动子调控的乙醇生产设计途径基因就被诱导表达，作光合乙醇生产。例如，具有设计师尼拉启动子控制的乙醇生产途径基因的设计产氧光合细菌藻，包含正常呼吸机制，当它返回到在铵存在(但不存在硝酸盐)的正常有氧条件时，它可使用有机储备物(和/或外源性底物如葡萄糖或醋酸)产生的NADH作细胞生长。因此，当产氧光合细菌藻培养物返回其含硫酸铵(但不含硝酸盐)培养基介质中，在有氧正常情况下，产氧光合细菌藻培养物将停止产生乙醇生产途径的酶，并开始恢复光合自养能力，通过其正常合成功能，合成卡尔文循环酶和产生新细胞。因此，这类转基因的产氧光合细菌藻可被周期重复使用，在含铵介质中正常好氧条件下，光合自养地生长，而在含硝酸盐的介质中，则高效生产乙醇(图3)。也就是说，这个光生物乙醇生产技术可以多元化周期性地重复使用，在有氧含铵培养基条件下，恢复产氧光合细菌藻的细胞生长活力，而在含硝酸盐培养基条件下，光合生产乙醇，来实现较为理想的使用结果。另外，这个光生物乙醇生产技术也可连续操作运行，例如，可把从第二次蒸馏温室光生物培养反应器(图4B，中)连续光合自养地生长振兴的产氧光合细菌藻细胞，送入第一蒸馏温室的光生物反应器(图4B，上)生产乙醇；同时把在第一蒸馏温室的光生物反应器用过的产氧光合细菌藻细胞送入一个光生物培养反应器(图4B，中间或底部)，在那里有氧和存在铵的条件下，通过合成正常功能卡尔文循环酶，恢复光合自养生长振兴，以被送往第一蒸馏温室的光生物反应器(图4B，上)连续再用。
有些设计产氧光合细菌藻甚至还可与乙醇生产途径运行的同时进行生长。设计师产氧光合细菌藻是否或以何速可进行生长，取决于其生长的遗传背景和乙醇生产条件，以及如何分配卡尔文循环的产品，在供乙醇生产途径使用后，有多少产物仍然可用于设计细胞生长。在乙醇生产条件下，能同时保持基本细胞功能和适当生长速度的设计师产氧光合细菌藻，也可用于连续光合乙醇生产与温室蒸馏系统(图4-6)收获产品乙醇。
还有使用产氧光合细菌藻的其他方法。例如，在乙醇生产光生物反应器使用过的产氧光合细菌藻细胞(图4B，上)，不一定需要被分发回培养生长反应器(图4B，中)。相反，使用过的产氧光合细菌藻细胞可取出来作为肥料或者作为生物质原料用于其他处理使用，因为设计师可诱导的产氧光合细菌藻可在培养生长反应器(图4B，中)不断光合自养地不断增长提供产氧光合细菌藻细胞给光生物乙醇生产反应器(图4B，上)用于生产生物燃料乙醇。这功能特别有利于使用只能在乙醇生产途径接通之前(而不是之后)才能光合自养地生长的设计师产氧光合细菌藻。例如，通过在不断光合自养增长的培养反应器(图4B，中和/或底部)保持一个设计师产氧光合细菌藻(即只在乙醇生产途径打开前，才可光合自养增长)的光合自养增长，可以连续为光生物乙醇生产反应器(图4B，上)提供产氧光合细菌藻细胞培养物。这种方法使得这些设计师产氧光合细菌藻也能被用于乙醇生产和温室蒸馏收获产品乙醇。
由于各种原因，有些设计光合产乙醇的细菌藻仅可光异养，或光-异杂养，而不能光自养增长。通过使用生长培养反应器(图4B，中间或底部)，也能光异养，或光-异杂养地培养这类设计师乙醇生产产氧光合细菌藻，它们可使用下列有机基物质(包括但不限于)：葡萄糖，果糖，蔗糖，醋酸，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，丙酮，淀粉，半纤维素，纤维素，脂肪，蛋白质，有机酸，生物材料和组合。如此培养的产氧光合细菌藻，也可供给光生物乙醇生产反应器(图4B，上)用于乙醇生产。此方法使这类仅可光异养，或光-异杂养，而不能光自养增长的设计光合产乙醇的细菌藻，也能被用于乙醇光合生产和温室蒸馏乙醇产品收获。这套温室蒸馏方法(图4-8)可应用于多种转基因的乙醇生产设计光生物，包括设计产氧光合细菌藻，藻类，植物，或植物细胞。
虽然本发明已说明了几个实施例的描述和说明其化身体现，而已经相当详细描述，它不是申请人的意愿来限制或以任何方式限制了附加的权利要求等细节。其他优势和修改将对本领域的技术人员随时显现出来。在其更广泛的方面，因此不局限于发明的具体内容，代表仪器和方法，并显示和描述的例子。
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Claims (118)

1.本发明公开了一种光合生产和收获乙醇的方法，其中包括在液体中培养具有转基因的产氧光合细菌藻(transgenic designer oxyphotobacterium)或其细胞(transgenicdesigner oxyphotobacterial cells)，使其表达一组酶作用于卡尔文循环的中间产物，将其转换成乙醇；并用室体蒸馏系统从液体介质回收乙醇和/或生产淡水。
2.根据权利要求1的方法，其中说的转基因的产氧光合细菌藻(transgenic designeroxyphotobacterium)是从以下产氧光合细菌藻类(oxyphotobacteria)包括蓝藻和原绿藻集团选择而来；它们是：嗜热蓝藻的BP-1株(Thermosynechococcus elongatusBP-1)，发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)，蓝聚藻6301株(Synechococcuselongatus PCC 6301)，蓝藻7942株(Syncechococcus sp.strain PCC 7942)，蓝藻7002株(Syncechococcus sp.strain PCC 7002)，蓝藻6803株(Syncechocystis sp.strainPCC 6803)，原绿球藻马里努斯MED4株(Prochlorococcus marinus MED4)，原绿球藻马里努斯海峡麻省理工学院的9313株(Prochlorococcus marinus str.MIT 9313)，原绿球藻马里努斯海峡NATL1A株(Prochlorococcus marinus str.NATL1A)，原绿球藻SS120株(Prochlorococcus SS120)，螺旋藻(顶螺旋藻)(Spirulina platensis(Arthrospiraplatensis))，螺旋藻帕西菲卡(Spirulina Pacifica)，蓝藻(Lyngbya majuscule)，鱼腥藻(Anabaena sp.)，蓝藻(Synechocystis sp.)，蓝藻拉长(Synechococcuselongates)，蓝藻MC-4株(Synechococcus(MC-A))，束毛藻(Trichodesmium sp.)，蓝藻(Richelia intracellularis)，蓝藻WH7803株(Synechococcus WH7803)，蓝藻WH8102株(Synechococcus WH8102)，发菜藻(Nostoc punctiforme)，蓝藻7943株(Syncechococcus sp.strain PCC 7943)，藻蓝6714藻蓝蛋白缺失的突变体PD 1(Synechocyitis PCC 6714 phycocyanin-deficient mutant PD-1)，蓝藻51142株(Cyanothece strain 51142)，蓝藻CCY0110株(Cyanothece sp.CCY0110)，颤利莫萨蓝藻(Oscillatoria limosa)，蓝藻(Lyngbya majuscula)，蓝藻(Symploca muscorum)，杆菌菜藻(Gloeobacter violaceus)，原绿藻(Prochloron didemni)，原绿藻(Prochlorothrix hollandica)，原绿球藻马里努斯(Prochlorococcus marinus)，聚蓝藻(Synechococcus bigranulatus)，嗜冷颤藻(cryophilic Oscillatoria sp.)，蓝藻(Phormidium sp.)，发菜新种-1(Nostoc sp.-1)，蓝藻(Calothrix parietina)，嗜热聚蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminnosus)，蓝藻(Synechococcus lividus)，嗜热蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻6912株(Chlorogloeopsisfritschii PCC 6912)，聚蓝藻(Synechococcus vulcanus)，聚球藻菌株MA4(Synechococcus sp.strain MA4)，聚球藻菌株MA19(Synechococcus sp.strain MA19)，和嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus)。
3.根据权利要求2，其中说的转基因的产氧光合细菌藻(transgenic designeroxyphotobacterium)是从以下产氧光合细菌藻类集团选择而来.它们是：海洋的产氧光合细菌藻(marine oxyphotobacteria)，淡水的产氧光合细菌藻(freshwateroxyphotobacteria)，耐盐度的产氧光合细菌藻小种/株(salinity-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐寒的产氧光合细菌藻小种/株(cold-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐热的产氧光合细菌藻小种/株(heat-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐乙醇的产氧光合细菌藻小种/株(ethanol-tolerantoxyphotobacterial strains)，捕光天线色素缺失的产氧光合细菌藻变异体(light-harvesting-pigment-antenna-deficient mutants)，及它们的组合。
4.根据权利要求3，其中说的设计师产氧光合细菌藻(oxyphotobacterium)是嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus)。
5.根据权利要求3，其中说的设计师产氧光合细菌藻是原绿球藻马里努斯。
6.根据权利要求3，其中说的设计师产氧光合细菌藻是发菜藻。
7.根据权利要求3，其中说的设计师产氧光合细菌藻是蓝藻。
8.根据权利要求3，其中说的设计师产氧光合细菌藻是蓝藻(Syncechocystis)。
9.根据权利要求1的方法，其中说的酶组由磷酸变位酶，烯醇丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，及其组合。
10.权利要求9的方法，其中说的乙醇脱氢酶是一种酒精脱氢酶，可以使用NADPH，或NADPH和NADH。
11.根据权利要求1的方法，其中说的酶组是甘油三磷酸脱氢酶，磷酸激酶，磷酸变位酶，烯醇丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，及其组合。
12.根据权利要求1的方法，其中说的酶组是醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸激酶，磷酸变位酶，烯醇丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，及其组合。
13.根据权利要求1的方法，其中说的酶组是磷酸果糖激酶，磷酸果糖醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸激酶，磷酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，和组合单位。
14.根据权利要求1的方法，其中说的酶组由淀粉酶，4-α-葡聚糖转移酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖激酶，磷酸葡萄糖变位酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，磷酸果糖激酶，磷酸果糖醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油-3-磷酸脱氢酶，磷酸激酶，磷酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，及其组合。
15.根据权利要求1的方法，其中说的设计师产氧光合细菌藻细胞利用设计师循环(transhydrogenase)氧化还原穿梭机制转换，增强辅酶NADPH的以光生物乙醇生产。
16.根据权利要求15的方法，其中说的循环(transhydrogenase)的NADPH/NADH的转换机制是一个设计师所赋予的甘油三磷酸脱氢酶对：一种依赖NADPH，另一种依赖辅酶NAD。
17.根据权利要求16的方法，其中说的可循环施用的穿梭氧化还原的NADPH/NADH转换机制是通过两步反应的机制来实现的：
1)由依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶(NADPH-dependentglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化使用NADPH把1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate)还原成为甘油三磷酸(glyceraldehydes-3-phosphate)而产生NADP+；
2)而由依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶(NAD+-dependentglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化使用NAD+把甘油三磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate)来氧化成为1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate.)而产生NADH。
18.根据权利要求15的方法，这设计依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶能与寄主本身的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶(NADPH-dependent glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)形成一种可循环施用的穿梭氧化还原机制(transhydrogenase)，使NADPH转换成NADH，以便加强光生物乙醇生产。
19.根据权利要求18的方法，可循环施用的设计师氧化还原穿梭机制(transhydrogenase)，其中说的可循环施用的穿梭氧化还原的NADPH/NADH的转换机制是通过两步反应的机制来实现的：
1)由寄主本身的依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶(NADPH-dependentglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化使用NADPH把1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate)还原成为甘油三磷酸(glyceraldehydes-3-phosphate)而产生NADP+；
2)而由依赖NAD+的甘油三磷酸脱氢酶(NAD+-dependentglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)催化使用NAD+把甘油三磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate)来氧化成为1，3-二磷酸甘油酸(1，3-diphosphoglycerate.)而产生NADH。
20.根据权利要求1的方法，其中说的酶的表达是由一种可诱导启动子调控。
21.根据权利要求20的方法，其中说的可诱导启动子可由厌氧诱导。
22.根据权利要求20的方法，其中说的可诱导启动子是一种双向氢化酶基因(Hox)的启动子。
23.根据权利要求20的方法，其中说的可诱导启动子是通过操纵培养液中的硝酸盐与铵的相对浓度来诱导。
24.根据权利要求20的方法，其中说的启动子是一种亚硝酸盐还原酶尼拉启动子。
25.根据权利要求20的方法，其中说的启动子是由光和/或热量诱导。
26.根据权利要求20的方法，其中说的启动子是一种groE启动子。
27.根据权利要求20的方法，其中说的启动子是一种rbcL基因启动子。
28.根据权利要求1的方法，其中的产氧光合细菌藻细胞包含了至少一个酶的基因工程的DNA编码结构有利于NADPH/NADH的转换增强光生物乙醇生产。
29.根据权利要求28的方法，其中说的酶是一种NADPH氧化酶磷酸或NAD激酶，或两者兼而有之。
30.根据权利要求28的方法，其中说的酶是一种辅酶NAD+依赖的甘油三磷酸脱氢酶。
31.根据权利要求28的方法，其中的酶表达，是一个可诱导启动子控制。
32.根据权利要求1的方法，其中的产氧光合细菌藻细胞也通过基因工程抑制糖原合成活动。
33.根据权利要求32的方法，其中说的糖原合成活动抑制包括抑制下列酶的表达或活性：糖原合酶，葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶，己糖磷酸异构酶，或磷酸葡萄糖变位酶。
34.根据权利要求33的方法，其中包括导入一个DNA编码构造使可诱导地表达一个干扰核糖核酸(iRNA)分子。
35.根据权利要求34的方法，这种可抑制糖原合成酶的干扰素(iRNA)选自一组干扰素核糖核酸(iRNA)包括：糖原合成酶干扰核糖核酸(glycogen-synthase iRNA)，葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶干扰核糖核酸(glucose-1-phosphate-adenylyltransferaseiRNA)，己糖磷酸异构酶干扰核糖核酸(hexose-phosphate-isomerase iRNA)，磷酸葡萄糖变位酶干扰核糖核酸(phosphoglucomutase iRNA)，及它们的组合。
36.根据权利要求1的方法，其中的产氧光合细菌藻细胞通过基因工程也可诱导地表达一套分解糖原和糖糖酵解的设计师酶。
37.根据权利要求36，其中的一组设计师设计师酶包括：淀粉酶，4-α-葡聚糖转移酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖激酶，磷酸葡萄糖变位酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，磷酸果糖激酶，磷酸果糖醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油醛-3磷酸脱氢酶，磷酸激酶，磷酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，及其组合。
38.脱氧核糖核酸(DNA)的设计结构(designer DNA construct)，其结构从5′始端到3′终端包括：可诱导启动子(inducible promoter)和光合乙醇生产途径酶的设计基因核酸编码序列(nucleotide sequence).
39.根据权利要求38的DNA构造，其中说的酶是从以下的酶集团选择而来：磷酸果糖激酶(phosphofructose kinase)，果糖二磷酸醛缩酶(fructose diphosphatealdolase)，磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase)，甘油三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)，磷酸变位酶(磷酸甘油酸变位酶)，烯醇酶(enolase)，丙酮酸激酶(pyruvatekinase)，丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase)，乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase)，及它们的组合。
40.脱氧核糖核酸(DNA)的设计结构，其结构从5′始端到3′终端包括：可诱导启动子和至少一种有利于的NADPH/NADH转换的酶的基因核苷酸序列。
41.根据权利要求40，其中说的NADPH/NADH转换酶是一种依赖辅酶NAD的甘油三磷酸脱氢酶。
42.根据权利要求40，其中说的NADPH/NADH转换酶是一种依赖NADPH的甘油三磷酸脱氢酶。
43.根据权利要求40，其中说的NADPH/NADH转换酶是一种NADPH磷酸化酶或NAD激酶，或两者兼而有之。
44.一种DNA的设计结构，其DNA结构从5′到3′包括一种可诱导启动子和一种可表达产生一种可抑制糖原合成酶的干扰素(iRNA)的设计基因核酸编码序列(nucleotidesequence).
45.根据权利要求44的构造，其中说的糖原合成酶选自下列酶组：糖原合酶，葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶，磷酸葡萄糖变位酶，和己糖，磷酸异构酶。
46.其DNA结构从5′到3′包括：一种可诱导启动子和一种有利于糖原酵解酶的设计基因核苷酸序列编码.
47.根据权利要求46的方法，其中说的酶从以下的酶集团选择而来：淀粉酶(amylase，)，4-α-葡聚糖转移酶(4-alpha-glucanotransferase，)，糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase)，葡萄糖激酶(glucokinase)，磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)，葡萄糖-6磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)，磷酸果糖激酶(phosphofructose kinase)，磷酸果糖醛缩酶(fructose diphosphatealdolase)，磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase)，甘油三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)，磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)，烯醇酶(enolase)，丙酮酸激酶(pyruvate kinase)，和它们的组合。
48.根据权利要求38，40，44，46，其中说的启动子是从以下的启动子集团选择而来：亚硝酸盐还原酶基因启动子(nitrite-reductase-gene(nirA)promoters)，双向氢酶基因启动子(bidirectional-hydrogenase-gene hox promoters)，光-热响应的启动子(light-and heat-responsive groE promoters)，核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶基因操纵子的启动子(Rubisco-operon rbcL promoters)，金属(锌)可诱导的启动子(metal(zinc)-inducible smt promoter)，铁反应可诱导的启动子(iron-responsive idiApromoter)，氧化还原反应可诱导的crhR启动子(redox-responsive crhR promoter)，热休克基因启动子(heat-shock-gene hsp16.6 promoter)，小热休克蛋白的启动子(small heat-shock protein(Hsp)promoter)，二氧化碳反应的终酸酐酶基因启动子(CO2-responsive carbonic-anhydrase-gene promoters，)，绿色/红色光响应的启动子(green/red light responsive cpcB2A2 promoter)，紫外线光响应的启动子(UV-lightresponsive lexA，recA and ruvB promoters，)，硝酸还原酶基因启动子(nitrate-reductase-gene(narB)promoters)，和它们的组合。
49.转基因的产氧光合细菌藻细胞包含任何一种根据权利要求38，40，44或46核酸(DNA)的设计结构。
50.转基因的产氧光合细菌藻细胞经过基因工程可诱导地表达磷酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，使之与细胞质中的卡尔文循环一起工作而光合生产乙醇。
51.根据权利要求50，其中的转基因产氧光合细菌藻还可诱导地在其细胞质中表达甘油三磷酸脱氢酶和磷酸激酶。
52.根据权利要求51，其中的转基因产氧光合细菌藻还可诱导地在其细胞质中表达二磷酸果糖醛缩酶和磷酸丙糖异构酶。
53.根据权利要求52，其中的转基因产氧光合细菌藻还可诱导地表达磷酸果糖激酶。
54.根据权利要求53，其中的转基因产氧光合细菌藻还可诱导地表达淀粉酶，糖原磷酸化酶，4-α-葡聚糖转移酶，葡萄糖激酶，磷酸葡萄糖变位酶，葡萄糖-6磷酸异构酶。
55.根据权利要求49-54的方法，其中说的转基因产氧光合细菌藻或其细胞表达至少一种酶或设计基因选自以下的集团包括：淀粉酶，糖原磷酸化酶，4-α-葡聚糖转移酶，葡萄糖激酶，磷酸葡萄糖变位酶和葡萄糖六磷酸异构酶，磷酸果糖激酶，磷酸果糖醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶，依赖NAD的甘油三磷酸脱氢酶；NADPH磷酸酶；NAD激酶；一种干扰素分子(iRNA)可抑制下列酶的表达：糖原合成酶，葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶，己糖磷酸异构酶，或磷酸葡萄糖变位酶；或一组可以部分或全部有助于淀粉降解和糖酵解的酶：淀粉酶，4-α-葡聚糖转移酶，糖原磷酸化酶，葡萄糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，磷酸果糖激酶，磷酸果糖醛缩酶，磷酸丙糖异构酶，甘油三磷酸脱氢酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，烯醇酶，丙酮酸激酶，和它们的组合。
56.一种乙醇光合生产过程，这个过程包括以下步骤：一)在水液体介质中，培养转基因设计师产氧光合细菌藻细胞，其转基因产氧光合细菌藻细胞包括至少一个外源基因，可在其细胞质中表达至少一条设计师乙醇生产途径；二)诱导转基因产氧光合细菌藻产生出被诱导的转基因产氧光合细菌藻细胞具有至少一个激活的转基因，赋予至少一条设计师乙醇生产途径；和三)提供二氧化碳和光能，使用被诱导的转基因产氧光合细菌藻把二氧化碳，水和光能量转换为某些中间产品并最终转换成乙醇和氧气。
57.根据权利要求56，转基因设计师产氧光合细菌藻使用二氧化碳为主要碳源，进行光合自养型细胞生长。
58.根据权利要求56个，其中的转基因设计师产氧光合细菌藻细胞也可光异养或光自-异杂养地进行生长，使用有机基物质选自下列有机基物集团：葡萄糖，果糖，蔗糖，醋酸，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，丙酮，淀粉，半纤维素，纤维素，脂肪，蛋白质，有机酸，生物材料和组合。
59.根据权利要求56，其中的含有Hox基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻的培养过程步骤一)，在有氧环境下进行。
60.根据权利要求56，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻的培养过程步骤一)，在存在铵氮肥但没有硝酸盐的有氧环境下进行。
61.根据权利要求56，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻的培养步骤一)，在存在铵氮肥但没有硝酸盐的环境下进行。
62.根据权利要求56，其中的含有Hox基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤二)在没有氧气的厌氧环境下进行。
63.根据权利要求56，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤二)，在有氧环境中，加硝酸盐形式的氮肥而进行。
64.根据权利要求56，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤二)，在厌氧环境中，加硝酸盐形式的氮肥而进行。
65.根据权利要求56，其中的二氧化碳来源是从化石燃料和/或生物质为燃料的工业设施的烟气二氧化碳。
66.根据权利要求56，其中的烟气二氧化碳从化石燃料和/或生物质为燃料的工业设施通过一个管道而导入一个生物反应器。
67.根据权利要求56，其中二氧化碳的来源是从环境和大气中空气的二氧化碳。
68.根据权利要求56，所提供的其他二氧化碳来源选自：溶解的二氧化碳，碳酸氢盐，碳酸盐和二氧化碳气体，及其组合。
69.根据权利要求65个过程，其中的产生供应二氧化碳的化石燃料和/或生物质燃料工业设施选自下列组团：燃煤电厂，铁和炼钢业，水泥生产厂，石油精炼厂设施，化肥生产厂，生物质为燃料和/或化石燃料的乙醇蒸馏/分离设备，生物质热解过程，烟囱，发酵生物反应器，生物燃料的炼油设施，及其组合。
70.根据权利要求56过程中，还包括以下步骤：四)由膜过滤和酒精蒸馏技术的结合从反应器环境收获乙醇。五)收获使用过的转基因产氧光合细菌藻细胞细胞。六)重复权利要求56中的步骤一)至三，和步骤四)和五)连续光生物乙醇生产)。
71.权利要求70的过程，还包括一个采收转基因设计师产氧光合细菌藻乙醇生产途径所产生的中间产品的步骤。
72.根据权利要求71的过程，其中可从二氧化碳和水由转基因产氧光合细菌藻乙醇生产设计途径产生的中间产品选自下列集团：乙醛，丙酮，磷酸，二磷酸甘油酸，1，3二磷酸甘油酸，甘油-3-磷酸，磷酸二羟丙酮，果糖1，6二磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖六磷酸盐，葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖，及其组合。
73.根据权利要求72的过程，其中的中间产品的生产，可以通过有选择地关掉设计途径中消耗该中间产品的酶的活性而增强。
74.根据权利要求72的过程，其中的中间产品的生产，可以通过有选择地省略设计途径中消耗该中间产品的酶而增强。
75.一种用于筛选和开发耐乙醇光合生物方法，其中筛选耐乙醇光合生物的方法是，在含有一定乙醇浓度的液体介质中，通过测量光合作用速率来检查该光合生物的耐乙醇能力；
其中发展耐乙醇光合生物的方法是通过诱变和从所述液体培养基筛中选耐乙醇光合生物。
76.根据权利要求75，其中说的转基因的产氧光合细菌藻(transgenic designeroxyphotobacterium)是从以下产氧光合细菌藻类(oxyphotobacteria)包括蓝藻和原绿藻集团选择而来；它们是：嗜热蓝藻的BP-1株(Thermosynechococcus elongatusBP-1)，发菜藻7120株(Nostoc sp.PCC 7120)，蓝聚藻6301株(Synechococcuselongatus PCC 6301)，蓝藻7942株(Syncechococcus sp.strain PCC 7942)，蓝藻7002株(Syncechococcus sp.strain PCC 7002)，蓝藻6803株(Syncechocystis sp.strainPCC 6803)，原绿球藻马里努斯MED4株(Prochlorococcus marinus MED4)，原绿球藻马里努斯海峡麻省理工学院的9313株(Prochlorococcus marinus str.MIT 9313)，原绿球藻马里努斯海峡NATL1A株(Prochlorococcus marinus str.NATL1A)，原绿球藻SS120株(Prochlorococcus SS120)，螺旋藻(顶螺旋藻)(Spirulina platensis(Arthrospiraplatensis))，螺旋藻帕西菲卡(Spirulina Pacifica)，蓝藻(Lyngbya majuscule)，鱼腥藻(Anabaena sp.)，蓝藻(Synechocystis sp.)，蓝藻拉长(Synechicoccuselongates)，蓝藻MC-A株(Synechococcus(MC-A))，束毛藻(Trichodesmium sp.)，蓝藻(Richelia intracellularis)，蓝藻WH7803株(Synechococcus WH7803)，蓝藻WH8102株(Synechococcus WH8102)，发菜藻(Nostoc punctiforme)，蓝藻7943株(Syncechococcus sp.strain PCC 7943)，藻蓝6714藻蓝蛋白缺失的突变体PD 1(Synechocyitis PCC 6714 phycocyanin-deficient mutant PD-1)，蓝藻51142株(Cyanothece strain 51142)，蓝藻CCY0110株(Cyanothece sp.CCY0110)，颤利莫萨蓝藻(Oscillatoria limosa)，蓝藻(Lyngbya majuscula)，蓝藻(Symploca muscorum)，杆菌菜藻(Gloeobacter violaceus)，原绿藻(Prochloron didemni)，原绿藻(Prochlorothrix hollandica)，原绿球藻马里努斯(Prochlorococcus marinus)，聚蓝藻(Synechococcus bigranulatus)，嗜冷颤藻(cryophilic Oscillatoria sp.)，蓝藻(Phormidium sp.)，发菜新种-1(Nostoc sp.-1)，蓝藻(Calothrix parietina)，嗜热聚蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻(Synechococcus lividus)，嗜热蓝藻(thermophilic Mastigocladus laminosus)，蓝藻6912株(Chlorogloeopsisfritschii PCC 6912)，聚蓝藻(Synechococcus vulcanus)，聚球藻菌株MA4(Synechococcus sp.strain MA4)，聚球藻菌株MA19(Synechococcus sp.strain MA19)，和嗜热蓝藻(Thermosynechococcus elongatus)。
77.根据权利要求76，其中说的转基因的产氧光合细菌藻(transgenic designeroxyphotobacterium)是从以下产氧光合细菌藻类集团选择而来.它们是：海洋的产氧光合细菌藻(marine oxyphotobacteria)，淡水的产氧光合细菌藻(freshwateroxyphotobacteria)，耐盐度的产氧光合细菌藻小种/株(salinity-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐寒的产氧光合细菌藻小种/株(cold-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐热的产氧光合细菌藻小种/株(heat-tolerantoxyphotobacterial strains)，耐乙醇的产氧光合细菌藻小种/株(ethanol-tolerantoxyphotobacterial strains)，捕光天线色素缺失的产氧光合细菌藻变异体(light-harvesting-pigment-antenna-deficient mutants)，及它们的组合。
78.根据权利要求75的方法，其中表示，乙醇宽容光合生物筛选是一个过程包括以下步骤：一)在乙醇浓度范围从0％到20％的存在下，和/或在一定的其它环境压力包括(但不限于)热，寒，盐度的存在条件下，测量生物光合作用速率；二)绘制乙醇浓度和光合生物光合速率图；三)通过比较其光合作用速率与乙醇酒精浓度曲线确定光合生物的乙醇耐受能力。
79.根据权利要求78的方法，其中步骤一)测量出生物的光合作用是在厌氧条件下进行，以避免通过机体的乙醇氧化呼吸途径而形成假乙醇耐受性。
80.根据权利要求75的方法，其中说，乙醇耐受宽容的光合生物的发展是一个过程包括以下步骤：一)光合生物诱变；二)在一个关键的酒精浓度的存在下，选择诱变光合生物的乙醇耐受能力；三)培养选定的乙醇耐受诱变体作进一步转化和筛选；
81.根据权利要求权80的方法，其中的选择光合生物诱变步骤二)是在厌氧条件下，在一个关键的酒精浓度存在下进行。
82.根据权利要求80，过程中还包括以下步骤：四)种植一成液体文化选择的殖民地；五)为进一步筛选，通过测量在光合作用中的浓度范围内对乙醇的存在率从1％到20％和/或乙醇耐受光合生物一定的环境条件，包括(但不限于)耐热，耐寒，盐度应力；六)重复权利要求80中的步骤一)至三)和步骤四)和五)作为一周期，多次行使，以取得更理想的结果。
83.一种光生物乙醇的生产和收获方法，包括在液体介质中使用设计师转基因光合生物温室蒸馏系统的方法，其中使用阳光驾驶光合乙醇生产和产生热量，通过蒸发蒸馏生产收获乙醇。
84.根据权利要求83，其中说的温室蒸馏系统包括：一个光生物反应器与二氧化碳源，反应器入口及出口，一个倾斜的水汽凝结透明天花板，一个尾气冷凝和通风装置，和可收集冷凝液的在天花板以下位于内墙周围的收集管道。
85.根据权利要求84，该方法利用阳光，二氧化碳(CO2)和水(H2O)在光生物反应器内生产乙醇(CH3CH2OH)和氧气(O2)，并利用这过程中产生的太阳热使乙醇和水从液体介质蒸发蒸汽上升到反应器蒸馏温室倾斜的吊(拱)顶天花板，在那里由温室蒸馏系统外部冷空气和/或对外层空间辐射而被冷却和冷凝，而实行乙醇回收。
86.根据权利要求的方法86，当蒸汽冷凝时，凝结成小液滴，可以沿着倾斜的天花板向下滑动，这个过程使用液滴与表面相互作用和地球重力的向下拉力，从而使液滴滑流入位于绕温室内墙面周围的收集道管，且所收集的冷凝液最后通过输送管利用重力被输送到储罐或下一个蒸馏温室。
87.根据权利要求86的方法，其中收集的冷凝水是通过使用一个冷凝运输管从收集管运输到下一个储存罐蒸或馏温室。
88.根据权利要求84，其中说的光生物反应器包含一个挡板系统指导培养基流动。
89.根据权利要求84的方法，其中的透明天花板是一个通冷却水的透明天花板腔室，在水腔室的顶部和底部有管道入口与出口。
90.根据权利要求84，其中说的尾气冷凝和排气装置包括一个冷水浴室，尾气冷凝盘管，气体凝析室，和一个垂直排气管。
91.根据权利要求90，其中说的尾气冷凝和排气装置包括一个冷水浴室，尾气冷凝盘管，气体凝析室，和一个垂直排气管；且其中，通过贯穿的冷水来冷却尾气冷凝盘管，气体冷凝室，和通风管，使尾气中的蒸气在通过垂直排气管排出之前，沿冷凝盘管冷却与凝析，而实行乙醇回收，和/或生产淡水。
92.根据权利要求83，其中说的温室蒸馏系统包括一个上层多间蒸馏舱与其相联的有液管，可调进口管道，可调出口管道，孔和/或蒸馏室挡板，以引导啤酒液流动；位于蒸馏室下层是一个光生物反应器，它与一个二氧化碳源向联接。
93.根据权利要求92，其中说的上层多间蒸馏室与下一层的光生物反应器以透明薄膜或板相隔离，只允许太阳光经过上层多间蒸馏舱到达下层的光生物反应器；
94.根据权利要求84，在下层的光生物反应器利用太阳光进行光合作用和产热，而上层的多间蒸馏舱则利用所产之太阳热蒸馏啤酒液，而实行乙醇回收。
95.根据权利要求92，其中说的蒸馏产物(冷凝物)是通过蒸馏舱内壁周围的收集管道被收集后，由输送管利用重力将其输送到储存罐.
96.根据权利要求92，其中说的下层的光生物反应器有一顶空间，以便二氧化碳的喂送和氧气的灵活除去。
97.根据权利要求96，其中氧气是灵活地从光生物反应器的氧气气体收集系统，包括使用一个氧气分离膜系统，氧气气体泵顶收获，以及氧气储罐。
98.根据权利要求83的方法，其中说的蒸馏系统包括多个温室馏系统以系列/并行方式运行，以增强乙醇生产和收获，和/或生产淡水.
99.该方法根据权利要求98，其中说的多蒸馏温室是从权利要求84-97中的生物反应器和蒸馏温室组团中选出。
100.根据权利要求98，其中说的蒸馏系统包括多个温室馏系统以系列/并行方式运行增强乙醇生产和收获，和/或生产淡水；其中，光生物生产的乙醇，利用太阳废热从生物培养基进行多温室蒸馏与再蒸馏(重新蒸发，冷凝，再蒸发和再冷凝)的系列过程，直至达到所需的最终蒸馏馏分的酒精浓度。
101.根据权利要求98，其中，凝析液(蒸馏产物)从一个蒸馏温室，通过一个冷凝运输管使用重力以最小的能源成本运送到下一个蒸馏温室。
102.一种光生物乙醇的生产和收获的过程，这个过程包括以下步骤：一)在水液体介质中，培养转基因的设计生物体，其中如设计师产氧光合细菌藻，设计藻类，设计转基因的植物细胞生物体，包括至少一个设计师乙醇生产途径的外源基因；二)诱导转基因的设计生物体，它具有至少一个转基因可被激活，赋予至少一个设计师乙醇生产的途径；三)提供利用二氧化碳和阳光，使其能从二氧化碳和水，光生物乙醇生产，并在培养基产生太阳热能；四)利用太阳热能汽化液体介质(水)乙醇产品；五)凝结蒸汽到一个倾斜的透明的由空气，风，和/或热辐射到太空而冷却的天花顶板；六)通过使用倾斜天花板和温室墙上周围的冷凝液收集管，收集冷凝液；七)通过使用冷凝液运输管，利用重力把收集的冷凝液运输到下一个蒸馏温室(或存储罐)，作重新蒸馏，直到实现预期馏分液乙醇浓度。
103.根据权利要求102中的过程，其中，使用二氧化碳作为主要碳源。
104.根据权利要求102中的过程，其中的设计师转基因生物体也可光异养或光自-异杂养地进行生长，使用有机基物质选自下列有机基物集团：蔗糖，葡萄糖，醋酸，乙醇，甲醇，丙醇，丁醇，丙酮，淀粉，半纤维素，纤维素，脂肪，蛋白质，有机酸，生物材料和组合。
105.根据权利要求102中的过程，其中一个生长步骤，含氢启动子控制设计基因的生物体在有氧环境中进行的。
106.根据权利要求102中的过程，其中一个生长步骤，含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻，在存在铵氮肥但没有硝酸盐的有氧环境下进行。
107.根据权利要求102中的过程，其中一个生长步骤，含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻，在存在铵氮肥但没有硝酸盐的厌氧环境下进行。
108.根据权利要求102的过程，其中含有Hox基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤在没有氧气的厌氧环境下进行。
109.根据权利要求102中的过程，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤，在有氧环境中，加硝酸盐形式的氮肥而进行。
110.根据权利要求102中的过程，其中的含有尼拉(或narB)基因启动子控制基因的产氧光合细菌藻诱导步骤，在厌氧环境中，加硝酸盐形式的氮肥而进行。
111.根据权利要求102中的过程，其中凝结的步骤五)是通过在天花板水室运行冷水提高了蒸汽冷凝吊顶系统冷却效果。
112.根据权利要求102中的过程，其中二氧化碳的来源是从化石燃料和/或生物质为燃料的工业设施的烟气二氧化碳。
113.根据权利要求102中的过程，其中的烟气二氧化碳从化石燃料和/或生物质为燃料的工业设施通过一个管道而导入一个生物反应器。
114.根据权利要求102中的过程，其中二氧化碳的来源是从环境和大气中空气的二氧化碳。
115.根据权利要求102中的过程，其中所提供的其他来源的CO2选自：溶解二氧化碳，碳酸氢盐，碳酸盐和二氧化碳气体，及其组合。
116.根据权利要求102中的过程，其中产生供应二氧化碳的化石燃料和/或生物质燃料工业设施选自下列组团：燃煤电厂，铁和炼钢业，水泥生产厂，石油精炼厂设施，化肥生产厂，生物质为燃料和/或化石燃料的乙醇蒸馏/分离设备，生物质热解过程，烟囱，发酵生物反应器，生物燃料的炼油设施，及其组合。
117.根据权利要求102的过程，还包括以下步骤：八)收获，从一个温室蒸馏和重乙醇蒸馏技术相结合的环境；九)收获后的残余液体收获啤酒的啤酒酒精液体产品(主要是纯淡水)；十)条乙醇和收获的产品从尾气淡水通过使用尾气冷凝和通风装置；十一)的收获设计师所使用的转基因生物体也就是从诱导转基因生物转化；十二)重复根据权利要求102的过程步骤一)到七)和步骤八至十一实行连续的光生物乙醇生产和收获。
118.根据权利要求117的过程，其中的步骤十)是通过使用一种或数个尾气冷凝和排气装置系列和/或平行处理尾气，收获乙醇和淡水产品。
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