CN102002515A - 一种精子的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种精子的处理方法，所述方法包括步骤：(1)将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到单精子显微注射(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)前精子；所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
Description
技术领域
本发明涉及人工辅助生殖技术，尤其涉及一种精子的处理方法。
背景技术
单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技术是20世纪80年代后期发展起来的一项人工辅助生殖技术。它是借助显微操作仪，将一个精子或生精细胞直接注入卵细胞胞质内，使精卵结合完成受精的过程。运用ICSI技术制备转基因动物的效率比雄原核显微注射法要高，因此以精子为载体，结合ICSI技术、为转基因动物的研究开辟了一条简单易行的技术路线。
小鼠精子尾巴长，在ICSI前需使用物理或化学方法将精子尾巴除去才可以顺利地进行ICSI操作。因此，能有效地除去精子尾部，而又不损伤精子DNA的方法显得非常重要。目前所采用的精子去尾的方法有精子冻融、超声、酶消化等，其中精子冻融和使用非离子型去垢剂TritonX-100是最常用的方法。也有报道用低浓度碱溶液处理小鼠精子，使精子头尾分离，但头尾分离的效果不理想，一般断尾率只有10％左右。
因此，本领域迫切需要提供一种新的使精子头尾分离的方法，并且所述方法在断尾率高的情况下，能保持DNA的完整性。
发明内容
本发明旨在提供一种精子处理方法。
本发明的另一个目的是提供一种经上述方法处理得到的头尾分离的精子。
在本发明的第一方面，提供了一种精子的处理方法，所述方法包括步骤：
(1)将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子；
所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
在另一优选例中，孵育时间1-3小时，所述精子悬液中，氢氧化钠浓度为5-20mM。
在另一优选例中，所述精子悬液在0-2℃孵育1.5-2.5小时，所述精子悬液中，氢氧化钠浓度为8-12mM。
在另一优选例中，以精子悬液的总体积计，其中精子密度为5-10×106/mL。
在另一优选例中，所述的精子悬液中含有精子培养液。
在另一优选例中，所述步骤(1)后还包括步骤：
(2)将精子悬液和无机酸混合。
在另一优选例中，所述的精子选自小鼠精子、大鼠精子、牛精子、羊精子、猪精子、或人精子。
在本发明的第二方面，提供一种单精子显微注射(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)前精子，所述ICSI前精子通过如下述步骤的方法得到：
(1)将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子；
所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
在另一优选例中，所述的精子选自小鼠精子、大鼠精子、牛精子、羊精子、猪精子、或人精子。
据此，本发明提供了一种新的使精子头尾分离的方法，并且所述方法在断尾率高的情况下，能保持DNA的完整性。
附图说明
图1显示了NaOH浓度及作用温度对小鼠精子头尾分离效果的影响。
图2显示了NaOH浓度及作用温度对小鼠精子质膜完整性的影响；其中
A是空白对照；
B是50mM NaOH在4℃孵育30min的小鼠精子；
C是NaOH处理前的小鼠精子；
D是0mM NaOH孵育30min后的小鼠精子；
E是5mM NaOH在4℃孵育30min后的小鼠精子；
F是50mM NaOH在4℃孵育30min后的小鼠精子；
A，B是荧光显微镜下看到的精子经Na0H处理前后的细胞状态，C，D，E和F是经流式细胞仪测定得出的定量数据。
图3显示了小鼠精子质膜完整率随NaOH浓度和孵育温度的变化。
图4显示了吖啶橙染色后镜下观察小鼠精子细胞DNA受损情况，及不同处理样品的流式检测图；其中
A是荧光显微镜下观察吖啶橙染色后不同DNA状态的小鼠精子：
a，DNA未受损；b，受损的半解链DNA；c，严重受损完全解链的DNA；
B是正常对照；
C是0℃，50mM NaOH；
D是37℃，50mM NaOH。
图5显示了0℃下NaOH处理浓度和处理时间对小鼠精子断尾率的影响。
图6显示了NaOH浓度及作用温度对人精子质膜完整性的影响；其中
A是10mM NaOH在37℃孵育30分钟后经吖啶橙染色后的人精子；B是NaOH处理前的精子(即新鲜制备待用的人精子)。
图7显示了NaOH浓度及作用温度对人精子DNA完整性的影响；其中
A是0℃，0mM NaOH孵育2小时的人精子；B是0℃，10mM NaOH孵育2小时后的人精子。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现在低温下(0-4℃)将低浓度NaOH(5-30mM)和精子混合，孵育适当的时间(0.5-3小时)可以使精子有效去尾，同时能保持DNA的完整性。
本发明在流式细胞仪上运用精子染色质结构分析技术(sperm chromatinstructure assay，SCSA)分别对NaOH浓度、作用温度和时间进行研究，探索NaOH处理ICSI前精子的最适条件。
处理方法
本发明提供的精子处理方法是将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到ICSI前精子；所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
所述的精子悬液中含有精子和精子培养液。精子的活力需大于80％，优选大于90％；精子的密度以精子悬液的总体积计为5-10×106/mL，优选7-8×106/mL；可以使用本领域熟知的精子培养液，例如但不限于，L 108培养液、HTF、BWW等。
本发明可以使用无机酸中止反应，所述的无机酸选自盐酸、硫酸、磷酸、或其混合，优选盐酸(HCl)。用于中止反应的无机酸优选同NaOH等当量。
ICSI前精子
如本文所用，“ICSI前精子”是指在进行ICSI前经过处理、有利于进行ICSI的精子，所述的处理包括精子头尾分离、精子制动，优选使精子头尾分离的精子。
ICSI除了单纯的使精子-卵子授精外，ICSI方法还是建立转基因动物模型的一种方法。
本发明提供的ICSI前精子断尾率达到20％以上，较佳地为30％以上，更佳地达到40％以上。本发明提供的ICSI前精子的DNA没有显著损伤。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的精子处理方法简单易操作。
2、本发明提供的精子处理方法可达到头尾分离的理想效果，且对DNA的完整性影响不显著。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提供的实施例中使用的材料如下：
实验动物
成熟(3-6月龄)ICR雄鼠购自上海西普-必凯实验动物有限公司，并饲养于上海市计划生育科学研究所SPF级啮齿类实验动物房(22℃，每天14小时光照)。
主要试剂与仪器
Transgreen/PI荧光复染液：Transgreen购自上海淦峰生物技术有限公司。碘化丙啶PI(Propidium lodide)、丫啶橙AO(Acri dine Orange)、NaOH(1mol/L)、HCL(1mol/L)及Hepes-CZB配制所用试剂购自美国Sigma公司，流式细胞仪为美国Beckman公司产品、倒置荧光显微镜为日本Nikon eclipse 50i，恒温器为德国Eppendorff公司产品。
本发明提供的实施例中使用的方法如下：
小鼠精子的处理：
取1-2只雄性ICR小鼠，颈部脱臼法处死，取其附睾尾部，除去脂肪与血迹，放人事先制备的Hepes-CZB液滴中，剪碎组织，稍加振荡后使精子游出，37℃、5％CO2培养箱静置10min，获得活动力＞90％的精子，调整密度至5-10×106/mL。分装至EP管中，分别加入1M NaOH至终浓度为0mM、5mM、10mM、20mM、30mM、50mM，轻弹管壁混匀，在预设温度的恒温器中孵育0.5-3小时。反应结束后，每管中分别加入等当量的HCl中止反应，得到ICSI前精子，并置于冰上待测。
人精子的处理：
1、取1ml新鲜液化正常生育的人的精液(来自于上海计生所医院不孕不育门诊)，放入一支15ml的无菌锥形离心试管内，然后在上方轻轻加入增补的Earle精子培养液(组成：Earle平衡盐溶液46ml，代血清4ml，焦丙酮酸钠1.5mg，乳酸钠(60％糖浆)0.18ml，碳酸氢钠100mg)1-2ml；
2、离心试管倾斜45度，置于37℃、5％CO2培养箱孵育1小时；
3、再将试管轻轻竖直，取出最上层的1ml液体，然后用8倍量增补Earle精子培养液稀释，500g离心5min；
4、最后在悬于0.5ml增补的Earle精子培养液中，尽量轻轻摇匀，待用。
精子头尾分离效率的检测
精子悬液用HCl中和后每管取出10μl于Macro精子计数板，显微镜下直接观察统计无尾精子及总的精子数量，每个样品计数至少200个精子。
Transgreen/PI检测精子质膜完整性
用Transgreen/PI复染精子的方法(见赵洪鑫，袁瑶，华敏敏，张慧琴，施惠娟.用Transgreen/PI荧光复染法检测精子的存活率.中国男科学杂志.2008：22(4)：1-4)。在40μl的精子悬液(即ICSI前精子)中，加入Hepes-CZB培养液稀释五倍至密度为1-2×106/mL，各加2μl浓度为0.5μM Transgreen溶液(溶于DMSO)和2μl浓度为1.2mM的PI溶液(溶于ddH2O)混合，室温静置20min后，用流式细胞仪(Beckman，USA)检测精子的质膜完整性。流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mW。于波长为520nm条件下检测Transgreen的荧光(FL1)，于610nm条件检测PI的荧光(FL3)。
SCSA方法检测精子DNA完整性
40μl精子悬液(即ICSI前精子)中，加入160μl TNE buffer(0.01MTris-Cl，0.15M NaCl，1mM disodium EDTA，pH 7.4)，稀释精悬液至体积为200μ1，密度为1-2×106/mL。立刻加入400μl酸处理液(0.08M HCl，0.15MNaCl，0.1％(w/v)Triton X-100，pH 1.2)振荡混匀。30s后，加入1.2mL的A0染液(6μg/ml AO溶于0.037M citric-acid，0.12M Na2HPO4，1.1mM disodiumEDTA，0.15M NaCl，pH 6.0)，3分钟内，样品上流式细胞仪测精子DNA片段化指数(DFI)。控制流速小于300个精子每秒。
统计分析
每个实验组独立重复三次，用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
实施例1
NaOH对小鼠精子头尾分离效果的影响
发明人在0-37℃下，用5-50mM的NaOH溶液处理小鼠附睾尾精子，显微镜下观察，发现精子经5mM NaOH浓度处理30分钟后，其活率已降为0，仅有极少数精子仍在游动。见图1。
结果表明，随着NaOH浓度的提高，头尾分离的效率在逐步提高，但不同处理温度对精子头尾分离效果存在显著影响，0-4℃下，精子头尾分离效果显著低于其他温度条件。
实施例2
NaOH对小鼠精子质膜完整性的影响
发明人用Transgreen/PI复染NaOH处理后的精子，分别于荧光显微镜下观察及用流式细胞仪检测其质膜完整性(图2)，实验数据显示(图3)。
结果表明，5mM NaOH处理精子30分钟，质膜损伤的精子均已达到90％，10mM以上浓度NaOH处理的精子质膜损伤程度接近100％。
实施例3
NaOH对小鼠精子DNA完整性的影响
随着NaOH浓度的增加，精子DNA损伤的程度越大。结果见图4和表1。
表1NaOH浓度和孵育温度对小鼠精子DNA
的影响
*P＜0.05，与阴性对照组相比
结果表明，在37℃温度下，即使10mM NaOH对精子DNA也有显著损伤，低温则能降低NaOH对精子DNA的影响，在0℃条件下，50mM NaOH孵育精子30分钟，精子DNA未发生显著的损伤。
实施例4
NaOH与精子共孵育时间对精子头尾分离及DNA完整性的影响
低温下低浓度NaOH对精子DNA的损伤最小，但该条件对精子头尾分离的效果较低。发明人在0℃条件下，将精子与不同浓度的NaOH共孵育，并将孵育时间分别延长至3h，结果见图5和表2。
表2SCSA分析0℃下不同NaOH处理浓度和时间对小鼠精子DNA受损率
的影响
结果表明，在0℃条件下时，精子与10mM NaOH溶液共孵育2小时，精子头尾分离效率将提高至55％，同时精子DNA未发生显著损伤。
实施例5
0℃条件下10mM NaOH处理上游后的人的精子2h，对照组(0℃，0mM NaOH孵育2小时的人精子)与实验组(0℃，10mM NaOH孵育2小时后的人精子)的数据比较，结果见图6和7，以及以下数据：
(1)断尾率：1.81％(对照组)和26.0％(实验组)
(2)质膜完整性：60.84％(对照组)和27.06％(实验组)
(3)DNA完整性：受损率：0.19％(对照组)和0.28％(实验组)
结果表明，0℃，10mM NaOH对人精子DNA损伤没有影响。同样的条件，小鼠精子膜比人精子膜更敏感，表现在短尾率，人的精子要低一些。
讨论
DNA片段化指数(DNA fragmentation index，DFI)是精子DNA完整性的量化指标，精子染色质结构分析试验(SCSA)是目前最常用的精子DNA完整性检测技术之一。SCSA试验于1980年由Evenson首先提出，现己被广泛用于精子DNA完整性的检测，其检测原理为精子经低pH缓冲液处理后用吖啶橙(AO)染色，然后通过流式细胞仪检测红、绿精子的比例，从而判断样品的DNA完整性。正常精子DNA结合紧密而具有抗酸性，双链稳定，而不成熟精子染色质结构松散，其DNA在酸的作用下变性形成单链。AO与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，而与单链DNA结合呈聚合物形式发出红色荧光，发红色荧光的精子在总精子中所占的比值即DFI，也就是在流式图上位于主群以外的细胞。此方法灵敏度高，检测速度快，发明人对处理好的精子样本(即ICSI前精子)用吖啶橙染色。运用SCSA方法，发明人可以快速准确的检测到精子的DNA受损情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (9)
1.一种精子的处理方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子；
所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，孵育时间1-3小时，所述精子悬液中，氢氧化钠浓度为5-20mM。
3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述精子悬液在0-2℃孵育1.5-2.5小时，所述精子悬液中，氢氧化钠浓度为8-12mM。
4.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，以精子悬液的总体积计，其中精子密度为5-10×106/mL。
5.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述的精子悬液中含有精子培养液。
6.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(1)后还包括步骤：
(2)将精子悬液和无机酸混合。
7.如权利要求1-6任一所述的处理方法，其特征在于，所述的精子选自小鼠精子、大鼠精子、牛精子、羊精子、猪精子、或人精子。
8.一种单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子，其特征在于，通过如下述步骤的方法得到：
(1)将精子悬液在0-4℃孵育0.5-3小时，得到单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子；
所述精子悬液中含有精子和氢氧化钠(NaOH)，以所述精子悬液的总体积计，其中氢氧化钠的浓度为5-30mM。
9.如权利要求8所述的单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)前精子，其特征在于，所述的精子选自小鼠精子、大鼠精子、牛精子、羊精子、猪精子、或人精子。
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|---|---|---|---|---|
| CN103271778A (zh) * | 2013-04-09 | 2013-09-04 | 华东师范大学 | 利用卵细胞胞浆注射精子方法的小鼠微生物净化方法 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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