CN102008438B - 顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备方法 - Google Patents
顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102008438B CN102008438B CN2010105306551A CN201010530655A CN102008438B CN 102008438 B CN102008438 B CN 102008438B CN 2010105306551 A CN2010105306551 A CN 2010105306551A CN 201010530655 A CN201010530655 A CN 201010530655A CN 102008438 B CN102008438 B CN 102008438B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lung cancer
- cisplatin
- stealth
- drug
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 49
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 49
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 49
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Substances [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 10
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 title abstract description 7
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims abstract description 17
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 64
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 16
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 7
- RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N dicetyl hydrogen phosphate Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCOP(O)(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC RNPXCFINMKSQPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical class [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 3
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 claims description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 2
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229940093541 dicetylphosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 2
- PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M dimethyl(dioctadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC PSLWZOIUBRXAQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 2
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 2
- 239000011345 viscous material Substances 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 229940050176 methyl chloride Drugs 0.000 claims 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 40
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 16
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 16
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 abstract description 5
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000007794 irritation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 abstract description 3
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 239000004557 technical material Substances 0.000 abstract 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 88
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 88
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 10
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 10
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 6
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009513 drug distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 3
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000010970 Connexin Human genes 0.000 description 1
- 108050001175 Connexin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010059024 Gastrointestinal toxicity Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033109 Ototoxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- BSJGASKRWFKGMV-UHFFFAOYSA-L ammonia dichloroplatinum(2+) Chemical compound N.N.Cl[Pt+2]Cl BSJGASKRWFKGMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 229940105442 cisplatin injection Drugs 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009096 combination chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000414 gastrointestinal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- AKPUJVVHYUHGKY-UHFFFAOYSA-N hydron;propan-2-ol;chloride Chemical compound Cl.CC(C)O AKPUJVVHYUHGKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 231100000262 ototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000000637 radiosensitizating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及顺铂主动肺靶向隐形类脂质体给药系统。是由顺铂与自制聚合物-单抗F(ab’)2片段修饰物、自制胆固醇-聚合物结合物、胆固醇等通过自组装方式制备得到的注射液或冻干品，应用于治疗人肺鳞癌实体瘤。该给药系统的包封率为(71.25±1.14)％，载药量为(8.81±0.23)％，细胞试验、动物试验结果表明具有明显的药物缓释作用，并在血中可规避RES的清除，对荷相应肺癌裸鼠癌块生长的抑制率比顺铂溶液提高80.34％，靶向性地发挥治疗相应肺癌的作用显著，尚未发现有明显的毒性，还可降低原药的局部刺激性。
Description
本发明涉及的生物材料已进行生物保藏。
技术领域
本发明涉及顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备，并作为注射液或注射用冻干品，经静脉注射，由人源性抗肺癌单抗片段将顺铂隐形类脂质体给药系统特异性导向于肺癌细胞发挥作用，治疗相应的肺癌。
背景技术
靶向给药系统是指采用新技术、新工艺制备而成的、可使药物浓集于作用部位的给药系统。它能将药物最大限度地输送至靶器官或靶细胞，从而减小对非靶器官、非靶细胞的影响，达到降低全身毒副作用，提高疗效的目的。可分为物理化学靶向制剂、被动靶向制剂、主动靶向制剂以及双重和多重靶向制剂。物理化学靶向系利用磁场导向或温度、pH等因素实现靶向给药。被动靶向给药系统是利用不同组织部位、器官自然生理特性的差异，拦截不同粒径范围的载药微粒。若微粒表面被链状亲水聚合物修饰可在血液环境中高度水合，形成表面水化层，既增加了稳定性，又有随时变化的空间构象，难于被血浆中的调理素识别、摄取，可规避机体网状内皮系统(RES，肝脾组织中分布丰富)的清除，而具有隐形作用，在血液中长循环，从而对血管渗漏性强的炎症区、实体瘤等实现更为有效的被动靶向给药。
主动靶向给药系统一方面可利用细胞特异性配体作为导向物质，将载药微粒导向于细胞的特异性受体而发挥作用。另一方面，主动靶向给药系统也可利用细胞表面抗原与特异性抗体结合力很强，以癌表皮细胞为免疫原，通过抗体制备技术制得的特异性单抗或其经酶切后的Fab或F(ab’)2片段。F(ab’)2片段来源：用肺癌杂交瘤细胞株4A10(分类命名：肺癌杂交瘤细胞株4A10，human lung cancer McAb 4A10，保藏日期：2010年10月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC C201090)细胞接种BALB/C小鼠腹腔获得腹水后，经常规盐析及Protein-G Sepharose 4B亲和层析后，再经胃蛋白酶没切纯化后获得。作为导向物质，将载药微粒特异性地导向于癌细胞发挥作用。去除单抗Fc片段后的Fab或F(ab’)2片段可避免机体产生二次抗体，用其修饰的载药微粒也可规避被机体RES清除，但去除Fc片段有降低单抗免疫反应特性的风险，相对而言通常F(ab’)2片段较Fab更好。结合隐形作用和主动靶向性的给药系统，是抗癌药研究的重要方向。
类脂质体是非离子表面活性剂单独或与其它脂质混合，在溶液中以自组装方式形成、结构类似于生物膜的新型给药系统。其结构组成及体内外性质与脂质体相似，但因不含易氧化变质的磷脂，而更加稳定。并且它对亲水药物、疏水性药物、难溶性药物均可包载，可调整药物的体内分布和释放特性，大大增加药物的生物利用度，降低药物的毒性，提高疗效。因此，近年来类脂质体新型给药系统已经成为药物的包载与传输的研究热点。
顺铂(CDDP)是一种重金属铂的络合物，为双官能团烷化剂，化学名为：顺式-二氯二氨铂(II)，为黄色粉末状结晶，在水中微溶，不溶于乙醇等一般有机溶剂，溶于二甲基甲酰胺。它首次在1845年由M.Peyrone合成，1978年美国FDA批准其用于临床治疗癌症。顺铂的发现带动了金属配合物在医学领域的发展，对于癌症治疗具有革命性的意义。其抗癌作用特点有：(1)为高效广谱的抗肿瘤药，可与作用靶点DNA形成CDDP-DNA复合物而发挥作用，属细胞周期非特异性药物。对肿瘤抑制率为61％～98％，尤其对实体瘤和对一般化疗药不甚敏感的肿瘤疗效较为显著；(2)不仅能杀伤肿瘤细胞，抑制细胞修复，还具有较强的放疗增敏作用；(3)与多种抗肿瘤药物有协同作用，其毒性谱也与它们有不同，且无交叉耐药性，因此易与其它抗肿瘤药配伍，既有利于临床的联合用药，还可逆转联合化疗的毒性。因此，长期以来顺铂在抗癌药中地位显著。
但是，目前临床所用顺铂制剂，如中国药典2010版和欧洲药典2001收载的注射用顺铂，英国药典2000版收载的注射用顺铂和顺铂注射剂，均为对癌组织、癌细胞没有选择性的普通注射剂，药物的生物利用度低，毒副作用大。其存在的问题主要表现为：(1)严重毒副作用：顺铂及其代谢产物主要从肾脏排泄，故肾毒性大。另有胃肠道毒性、耳毒性及神经毒性等也不可忽视；(2)对某些癌细胞活性较低，如乳腺癌、结肠癌等；(3)易产生耐药性；(4)仅微溶于水，性质不稳定，见光分解，其水溶液在室温中放置后会发生水解而失效，并转变为有毒却无抑瘤作用的反铂。
鉴于近年来肺癌发病率、死亡率均高居各类癌症之首，且比例仍在继续升高的问题亟待解决，应力求使给药系统所传递的顺铂在进入体内后可规避RES清除，靶向于癌组织、癌细胞，增加生物利用度，减少全身不良反应，提高疗效。
发明内容
本发明针对现有顺铂制剂用于癌症治疗的不足，提供一种不同于普通制剂的顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统及其制备方法，包括抗肺癌细胞单抗、单抗F(ab’)2片段的制备及其两亲性聚合物修饰物的制备、胆固醇-亲水聚合物结合物的制备、自组装为表面有水化层和单抗片段的包载顺铂的抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统，并通过体内外试验，证实顺铂主动靶向隐形类脂质体的隐形性、靶向性和抗肺癌活性。其特点为：同时具有长循环的特性和高度的细胞靶向性，可规避RES的清除，使药物高度浓集于靶细胞，显著提高药物的生物利用度，从而高效低毒治疗相应肺癌。
本发明的目的通过以下技术措施实现：
1、本发明顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统中，每ml该隐形类脂质体混悬液由以下物质组成：顺铂0.5～10mg，经抗肺癌细胞单克隆抗体的F(ab’)2片段修饰的聚合物的溶液(A)0.05～0.16ml，胆固醇-亲水聚合物(B)0.2～100mg，胆固醇(C)0.2～90mg，表面活性剂(D)脂肪酸山梨坦(Span)、聚山梨酯(Tween)0.5～60mg，带电荷的附加剂(E)----带负电荷的磷酸二鲸蜡酯或带正电的十八胺、二甲基双十八烷基溴化铵0～20mg，缓冲溶液----任一种pH3.6～9.5的硼酸盐、磷酸盐或碳酸盐缓冲溶液适量。
其中，A和B为自制品，其余为市售产品。
2、本发明顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统的制备方法为：处方量的脂溶性膜材B、C、D、E用有机溶剂溶解完全后，与顺铂混合超声，再采用注入法或薄膜法与含有聚合物-抗肺癌细胞单抗F(ab’)2片段修饰物(水溶性膜材)溶液A的缓冲溶液混合，在20-40℃下混合搅拌并超声，脂溶性部分因疏水作用自动聚集，亲水性部分自动向外舒张而自组装成为类脂质体，有机溶剂挥发后得到表面载有单抗片段的顺铂主动肺靶向隐形类脂质体混悬液。
3、本发明顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统，是注射剂或注射用冻干品。以甘露醇为冻干保护剂，顺铂类脂质体冻干品，以及用同样处方更换主药制得的维甲酸类脂质体冻干品，均可于4℃避光长期保存。
本发明所采用自制抗肺癌细胞单克隆抗体的F(ab’)2片段修饰的聚合物、自制胆固醇与亲水聚合物的结合物及其它辅料，以自组装方式制备所得顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体给药系统的混悬液，可直接静脉注射使用，也可制成冻干粉针使用。其平均粒径为1.1μm，Zeta电位为-65.0mv，包封率为(71.25±1.14)％，载药量为(8.81±0.23)％，释放规律符合Weibulldistribution模型，拟合方程为：lnln100/(100-Q)＝0.3785lnt-1.4299(r2＝0.9596)，t1/2＝17h，264小时累积释放量(Q264h)＝94.21％。细胞试验结果说明，表面用蛋白修饰的隐形类脂质体与类脂质体相比较，规避巨噬细胞的吞噬的作用可提高65.84％～22.55％，具有显著性差异；对癌细胞的抑制与原药活性一致，没有显现原药以外的毒性。在正常大鼠体内的试验结果表明，该给药系统进入血液后释放缓慢，且没有突释效应，AUC0-t＝11.368，药物的生物利用度高；在各主要器官的分布由大到小为：心、肾、脾、肺、肝。然而在接种了肺癌细胞后的裸鼠体内抗癌药效试验结果表明，药物在非靶器官心、肝、肾中下降34.19％～82.85％，脾中变化不明显；对靶标：肿瘤组织增加25.40％，肺组织增加209.57％，药物的靶向分布作用显著，从而有利于癌症治疗。并且，与原药相比，它的抑瘤率提高80.34％。组织切片结果显示了它不仅能显著抑制癌细胞的生长，还具有控制转移的作用。总之，经动物体外、体内试验证实，该给药系统具有明显的缓释作用，并可靶向性地发挥抗癌作用，抑制肿瘤生长及转移作用显著，尚未发现有明显的毒性，还可降低原药的局部刺激性，展示了该给药系统血液中的隐形性、对癌细胞的主动靶向性和抗肺癌的活性，能充分发挥高效低毒治疗相应肺癌的作用。
附图说明
图1BSA隐形类脂质体的镜下形态(×400)；
图2顺铂的累积释放曲线/％(n＝3)；
图3普通类脂质体与连接BSA的隐形类脂质体在不同时间条件下的被吞噬率；
图4普通类脂质体与连接BSA的隐形类脂质体在不同浓度条件下的被吞噬率；
图5健康大鼠血液中的药物浓度-时间曲线。
培养物名称：肺癌杂交瘤细胞株4A10
保藏日期：2010年10月13日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC
保藏编号：CCTCC C201090
具体实施方式
本发明的制备过程，不仅可以将含有聚合物-抗体F(ab’)2片段结合物溶液的缓冲溶液，与含处方量的顺铂和脂溶性膜材的有机相混合，通过自组装过程制得表面连接有抗肺癌单抗片段的隐形类脂质体，还可通过处方调整，采用同样的制备过程，制备得到表面带不同电荷的顺铂类脂质体、表面带不同蛋白质的顺铂隐形类脂质体，以及顺铂类脂质体和顺铂隐形类脂质体。
在主要处方成分及用量基本不变前提下，调整个别处方成分与比例，得到表面不带电荷的普通类脂质体与带正电荷的类脂质体、负电荷的类脂质体；通过分别加入Chol-PEG4000、Chol-PEG6000、Chol-PVA、Chol-Plu、Plu等两亲性物质，得到不同的顺铂隐形类脂质体；以Plu-BSA、Plu-OVA或Plu-单抗片段修饰物调整隐形类脂质体的处方，在20～40℃条件温和地制得表面进行蛋白质修饰或单抗片段修饰的顺铂隐形类脂质体。将制得的各种类脂质体混悬液保存于4℃，用于有关性质研究。
对BSA、OVA连接到类脂质体表面的性质特点的研究，不仅为连接单抗片段的工作提供经验，也提供了观察性质相近、分子量不同的系列蛋白质对隐形类脂质体表面的影响的条件。
另外，本发明还可通过调整模型药物---主药，制备得到维甲酸隐形类脂质体。
经过对部分考察项目进行比较发现：顺铂主动肺靶向隐形类脂质体给药系统，对模型药物没有特定要求，可以采用同样处方，包载不同性质的药物。当其包载水溶性药物时药物处于类脂质体的双分子层中间；而当其包载疏水性药物时，药物位于类脂质体的疏水内腔中。
因此该领域技术熟练者，对该处方作非实质性调整，还可应用于包载其它各类药物。
实施例：
1聚合物-抗癌细胞单克隆抗体F(ab’)
2
片段修饰物(A)的制备：
抗肺癌单克隆抗体及其Fab片段的制备、分离纯化和鉴定方法：按常规方法进行。以人肺鳞癌(云南矽肺癌，YTMLC-90)细胞株，按常规单抗制备与纯化后进行酶切而得。以试验组(YTMLC-90)、小细胞肺癌(NCL-H446)、肺腺癌(A2)和对照组(人支气管上皮细胞HBE)，分别做免疫组化和Western-blot试验证实，具有肺癌靶向性。为避免修饰类脂质体表面后，作为异体蛋白的单抗有Fc片段，易被血浆中的特异蛋白发现、被内皮网状系统清除，也为避免单抗异体蛋白激活机体免疫反应产生二次抗体，在获得抗肺癌单抗后，用胃蛋白酶切除其Fc片段并与F(ab’)2片段分离，纯化后所得F(ab’)2片段经电泳鉴定分子量。ELISA夹心法测定单抗及其F(ab’)2片段活性，结果二者活性基本一致。于4℃保存。
聚合物-单抗F(ab’)2片段修饰物(A)的合成方法为：将末端含有羟基的聚合物PluronicF68(简称Plu)，与丁二酸酐溶于无水吡啶，40～90℃反应2～8h后，将减压蒸除吡啶所得粘稠物溶于水后，水层经无水乙醚洗涤、氯仿萃取，干燥后的氯仿层经过滤、浓缩后，用无水乙醚沉淀产物，乙酸乙酯重结晶。产物经12～72h透析后旋转蒸馏至干，得白色蜡状固体，以DMF溶解后，搅拌下将该溶液滴入N-羟基丁二酸亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液中，搅拌至生成聚合物活化酯R(可与蛋白质的ε-氨基反应)，离心后将上清液缓慢滴入0.01～2g·L-1的单抗F(ab’)2片段溶液(与R的摩尔比＝1∶10～1000)中，室温搅拌反应1～10h，混合于0.005～0.2mol·L-1NaHCO3溶液中，即得相应的单抗片段修饰的两亲性聚合物的溶液A。4℃保存。另以同样方法，以牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA制备了Plu-BSA、Plu-OVA，供制备对照品用。
2亲水聚合物-胆固醇(B)的合成：
根据末端含有羟基的亲水性或两亲性大分子聚合物，如：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、PluronicF68(Plu)等亲水性或两亲性大分子物质，可采用合成路线：PEG-OH+(CH3CO)2O+CH3SOCH3→PEGOCH2CHO得到聚合物缩醛(称聚合物-醛)，即以二甲亚砜(DMSO)为溶剂，在室温下与乙酸酐反应，得到相应的缩醛衍生物聚合物-醛。再与胆固醇在无水乙醇和稀盐酸中回流反应，逐步经水、稀氢氧化钠溶液精制处理，抽滤后干燥，即得相应亲水性聚合物-Chol的结合物B。
3.表面载有单抗片段的顺铂主动肺靶向隐形类脂质体的制备
将前述处方量的脂溶性膜材B、C、D、E用有机溶剂溶解完全后，与处方量顺铂混合超声，再采用注入法或薄膜法与含有聚合物-抗肺癌细胞单抗F(ab’)2片段修饰物(水溶性膜材)溶液A的缓冲溶液混合，在20-40℃搅拌并超声，有机溶剂挥发后得到表面载有单抗片段的顺铂主动肺靶向隐形类脂质体混悬液。
4、给药系统的形态观察
倒置显微镜下观察，见附图1，结果微粒均匀度好，基本为圆形。
5、给药系统的平均粒径及表面Zeta电位测定
鉴于癌细胞带负电性，为使主动靶向隐形类脂质体的肿瘤靶向药效试验所检验的主动靶向作用更为可靠，本发明制备的类脂质体均带有不同的负电性，将对类脂质体表面连接单抗后，排除正电荷对癌细胞的趋向作用，实现抗体-抗原特异性结合的主动靶向作用，进行检验。结果见表1。
表1不同修饰的类脂质体的平均粒径及表面Zeta电位
其中，FBSA：BSA修饰的隐形类脂质体；FOVA：OVA修饰的隐形类脂质体；FF(ab’)2：F(ab’)2修饰的隐形类脂质体；F1-BSA：处方中加DCP(可增加负电性)的BSA隐形类脂质体；F2-BSA：处方中加GC(可增加正电性，即部分抵消原有负电性)的BSA隐形类脂质体。
从表1中可以看出：
(1)蛋白质种类对隐形类脂质体的粒径有影响，FBSA的粒径大于FOVA，两者电位无显著差异；(BSA Mr＝67KD、OVA Mr＝43KD)；
(2)当隐形类脂质体表面连接抗体片段时，其粒径和电位变化并没有遵循上述(1)的规律，FF(ab’)2的粒径超过1μm，表面电位显著降低，可能与F(ab’)2片段自身的结构和性质有关；
(3)不同带电脂质对隐形类脂质体的粒径、电位有不同程度的影响：当加入DCP或GC时，制得的F1-BSA、F2-BSA粒径比FBSA小，电位变化与带电脂质本身性质一致，但变化程度不太明显，或由隐形类脂质体表面的蛋白表现出的电负性，遮盖了部分由带电脂质引起的变化。且GC对隐形类脂质体的粒径和电位影响较DCP大。
6、给药系统的包封率测定
将处方量类脂质体混悬液全部转入预先处理好的透析袋中，室温下悬于透析介质(pH6.4的0.9％生理盐水)中，120rpm搅拌，每隔0.5h更换透析液，1.5h后停止(此时空白泡囊加处方比例的顺铂透析率为93％以上)，测定透析液中顺铂量之和即为游离药物的量；将透析袋内类脂质体全部转入容量瓶中，用0.1mol·L-1盐酸-异丙醇处理后，测定袋内药物量。计算得到表面不同修饰的各类隐形类脂质体的包封率，结果见表2。
表2不同修饰的隐形类脂质体的包封率
由表2可知，表面不同修饰的各隐形类脂质体的包封率有以下情况：
(1)表面连有蛋白的隐形类脂质体包封率受蛋白质分子量影响，FBSA的包封率高于FOVA(P＜0.05)；
(2)加入带电脂质后包封率下降：当加入DCP或GC所制得的F1-BSA、F2-BSA与FBSA相比，包封率F2-BSA＜F1-BsA＜FBsA。带电脂质GC对包封率的影响比DCP大。
7、给药系统的投药量对包封率和载药量的影响
为体内研究时用较小的给药体积达到较高的药物治疗浓度，将投药量提高33.3％后，包封率及载药量结果，见表3。
表3顺铂用量对包封率及载药量的影响
由表3可知，当增大投药量时，对表面载有蛋白类脂质体FBSA的包封率影响不明显，包封率却显著提高。故采用10mg的投药量，制备主动靶向隐形类脂质体。
8、给药系统体外试验研究结果
1)表面蛋白种类对隐形类脂质体体外释放规律影响考察
在预试的基础上，以氯化钠溶液作透析介质，以等量游离药物溶液和表面未修饰的隐形类脂质体作对照，考察表面连有BSA、OVA和F(ab’)2片段的隐形类脂质体的释放特性。于37℃100ml氯化钠溶液中，透析顺铂溶液和隐形类脂质体F、FBSA、FOVA、FF(ab’)2，120rpm搅拌，于0.5～264h中设置不同时间点取透析外液1ml，同时补加1ml释放介质维持漏槽条件继续透析至终点。样品经测定计算药物累积释放百分率(Q％)，以药物累积释放百分率对取样时间百分率做Q％-t图，得到累计释放曲线，结果见附图2。
由图2可知，游离药物释放较快，2.5h已基本释放完全，而隐形类脂质体F、FBSA、FOVA、FF(ab’)2释放明显缓慢，无论表面有无蛋白类物质遮盖的隐形类脂质体的释放曲线都符合Weibull distribution模型，拟合方程依次为：
虽然4种隐形类脂质体的体外释放规律一致，但半衰期t1/2存在差别，说明蛋白种类对隐形类脂质体的体外释放有一定影响，BSA(Mr＝67KD)约为OVA(Mr＝43KD)的1.6倍。OVA的空间结构体积稍小，对隐形类脂质体的水化层遮盖的影响较小，从而使隐形类脂质体FOVA缓释效果比FBSA较好。当隐形类脂质体表面接了单抗片段之后，比其它三种隐形类脂质体的缓释效果进一步提高，可能与其去掉Fc片段后，空间结构体积大大降低有关。t1/2和264h的累积释放量，F为10h和91.92％，FF(ab’)2为17h和94.21％。说明顺铂隐形类脂质体体外累积释放具有明显的缓释作用，而顺铂主动肺靶向隐形类脂质体的缓释作用更好，半衰期也显著增加。
2)给药系统的体外单核巨噬细胞吞噬试验
为考察隐形类脂质体表面连接蛋白质后的隐形效果，对表面无亲水链的普通类脂质体L与隐形类脂质体FBSA的隐形作用进行了比较，分别将2种类脂质体混悬液稀释100倍和1000倍后，与巨噬细胞细胞孵育1～24h不同时间后测定，以吞噬率对孵育时间或类脂质体液稀释倍数作图，结果见附图3、图4。
由图4可知在类脂质体混悬液稀释1000-100倍范围内，表面带有蛋白的隐形类脂质体FBSA比普通类脂质体L，具有较强的规避吞噬系统识别的能力(P＜0.01)。2种类脂质体均在前3h内吞噬率增加较快，之后变化幅度不明显，说明巨噬细胞的吞噬能力达到饱和，这也是吞噬试验时间点设计的依据。此外，类脂质体的细胞吞噬率与其稀释倍数有一定关系，当类脂质体稀释100倍和1000倍时，表面连有蛋白的隐形类脂质体规避吞噬的作用分别提高65.84％(P＜0.01)、22.55％(P＜0.01)，具有显著性差异。由此可知，本发明采用的表面连接蛋白的隐形类脂质体制备方法是可行的，通过亲水聚合物末端连接在隐形类脂质体表面的蛋白质后，规避巨噬细胞吞噬的作用显著。也可推断，若隐形类脂质体表面连接空间位阻更小的单抗片段应仍然具有隐形效果。
3)给药系统对巨噬细胞的生长抑制试验
以顺铂含量9.375μg/ml的样品，用含5％新生牛血清的RPMI-1640培养液按1∶50～1∶1600不同倍数稀释，每孔加入100μl，再在每孔加入巨噬细胞悬液，进行生长抑制试验，结果BSA修饰的隐形类脂质体的对细胞的生长抑制率为63.72％，同样条件下顺铂原药为63.88％，二者之间几乎完全一致。说明顺铂原药经过制剂制备工艺过程，所得的蛋白修饰的隐形类脂质体，保持原药的细胞毒性。
4)通过其他方面的毒性考察，各种表面修饰的顺铂类脂质体混悬液的pH为中性，完全满足注射剂要求。体外溶血试验结果发现，各种类脂质体均无溶血现象。
9.给药系统动物试验研究结果：
经过将荷瘤裸鼠(以YTMLC-90建立模型)分为原料药溶液对照组、含药隐形类脂质体F组、含药主动靶向隐形类脂质体FF(ab’)2组，尾静脉注射给药，单位体重给药量一致，将给药后完成治疗周期的小鼠拉断颈锥处死，完整取出主要脏器及肿瘤组织，称重、HPLC测定各组织的药物浓度，并制作切片观察，得到以下有关荷瘤裸鼠的结果。
经过将正常大鼠分组(①原料药注射液组；②含药类脂质体F组；③主动靶向隐形类脂质体FF(ab’)2组)，同上自尾静脉分别注射顺铂原药溶液或含药类脂质体混悬液，于给药后1～144h处死各组相应大鼠，取出血及完整心、肝、脾、肺、肾各脏器，HPLC测定顺铂在血中及体内各组织的浓度，得到以下有关正常大鼠的结果。
针对顺铂主动靶向隐形类脂质体对肺癌的抗癌活性，与隐形类脂质体和原药注射液进行比较研究，以揭示顺铂主动靶向隐形类脂质体的隐形性、靶向性和抗癌活性。
1)药代动力学与体内分布研究：
考察含药隐形类脂质体F，表面连接单抗片段的含药类脂质体FF(ab’)及顺铂原料药溶液经大鼠尾静脉注射后，在大鼠心、肝、肺、肾及血液中的分布，并采用DAS2.0软件对血液药物浓度，经时变化过程，进行统计学分析。
以大鼠血液中测定的顺铂含量对时间作图，绘制大鼠血液中的药时曲线，结果见说明书附图5。
从图5可看出，原料药注射液①从一开始就呈急剧下降，24h已降至0.023μg/ml。主动靶向隐形类脂质体③在血中药物浓度呈现先降、后升、再下降趋势，变化过程分两个时相，类似于二室模型。顺铂浓度于初始相下降迅速，推测药物随类脂质体在体内的快速分布，随后第二相缓慢下降，或为类脂质体释放顺铂的速度。该药动学过程在理论上可以部分解释其在抗癌疗效优于原药，因原药进入体内后迅速分布代谢，而类脂质体中药物为持续释放，利于维持癌症部位有效药物浓度。但要量化其药物利用效率，还需从作用部位的药物量来衡量，因此荷瘤裸鼠体内组织分布试验更具有研究意义。隐形类脂质体②的曲线较为异常，在144h血药浓度突然增大，由于没有对后面时间点继续测定，因此无法判断其趋势以及房室模型。
此外，(1)正常大鼠的药代动力学与体内分布研究：
考察了药物经尾静脉注射后，在大鼠心、肝、脾、肺、肾及血液中的分布。
将测得的顺铂主动靶向隐形类脂质体在血中及各组织中药物浓度数据经DAS2.0软件处理后再进行体内组织分布的比较。由于原药组代谢太快时间点不够，无法用软件进行数据拟合，因此只有含药主动靶向隐形类脂质体的体内分布参数，见表4。
表4顺铂主动靶向隐形类脂质体在正常大鼠体内的药代动力学参数
对于缓释制剂，体内组织药时曲线下面积AUC表示的生物利用度和平均滞留时间MRT更具有研究意义。由表4可知，主动靶向隐形类脂质体在正常大鼠体内的MRT(0-t)为75h，大大延长了顺铂在血浆中的滞留时间，具有长循环效果。体内半衰期为71h，AUC0-t＝11.368，生物利用度高。
药物在各主要脏器的最大浓度依次为：心、肾、脾、肺、肝，符合在无靶标的情况下，肺部无明显分布优势的预期。
2)荷瘤鼠体内药物分布、代谢与药效学及毒性初步观察
(A)给药系统在荷瘤鼠体内的药物分布情况
在接种了肺癌细胞后的荷瘤裸鼠(大体解剖发现有癌转移)体内各组织中，顺铂主动靶向隐形类脂质体相对于顺铂溶液，药物的相对分布结果为：非靶标组织中，除脾组织中几乎无变化外，心组织中下降82.85％，肝组织中下降55.96％，肾组织中下降34.19％；而对靶标，肺组织中增加209.57％，肿瘤组织中增加25.40％，充分显示了本专利给药系统对药物分布的靶向调节作用。预示肺癌的治疗效果将会得到提高，并降低其毒性。
(B)药物的代谢情况
以∑组织中药物量的总和可知，评价药物的代谢情况。主动靶向隐形类脂质体为0.706μg，隐形类脂质体为0.49μg；而原料药溶液为0.272μg。说明原料药代谢迅速，使得最后测得的药物浓度最低，而主动靶向隐形类脂质体被清除的最慢，在癌组织中存在时间长，因而可以持续释放发挥治疗作用。
3)对荷瘤裸鼠抑瘤率考察及毒性初步考察
称量记录各组荷瘤裸鼠给药前体重W1和处死前体重W2，观察各组动物给药部位，并比较体重的前后变化及瘤重占体重百分率，以及以原药溶液组的瘤重/体重评价含药主动靶向隐形类脂质体的抗癌作用效果，结果见表5。
表5顺铂主动靶向隐形类脂质体对荷瘤裸鼠癌块的抑瘤作用及对体重的影响
由表5可知，主动靶向隐形类脂质体组的肿瘤生长抑制率比原药组提高80.34％，抑瘤效果显著提高。
另外，因药物的毒性对动物生长有影响，原药溶液组动物给药后体重减轻46.41％；含药主动靶向隐形类脂质体组的体重仅下降15.20％，下降幅度仅为原药溶液组的32.75％。并且，其瘤重占体重百分率为原药组的55.45％，说明本专利给药系统改善药物毒性效果显著。
经与正常裸鼠器官对照，对大体检查发现异常的肝、肺及瘤块，以HE染色切片后检查，显示了主动靶向隐形类脂质体FF(ab’)2具有较为明显的抑制肿瘤生长及转移的作用。此外，比较动物给药部位(尾巴)针口愈合情况，发现只有顺铂原药组的鼠尾巴都有红肿(裸鼠尤为明显)。说明所构建的给药系统不仅本身毒性低，还降低了原药的局部刺激性。
充分显示了顺铂主动肺靶向隐形类脂质体突出的高效低毒特点。
Claims (5)
1.一种顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体，其特征在于：抗癌药顺铂是由抗肺癌单抗F(ab’)2片段及亲水性链状聚合物修饰表面的类脂质体给药系统包载；
其由以下方法制得：处方量的脂溶性膜材，用适量有机溶剂溶解完全后，与处方量顺铂混合超声，再采用注入法或薄膜法与含有聚合物-抗肺癌细胞单抗F(ab’)2片段修饰物溶液的缓冲溶液混合，在20-40℃下混合搅拌并超声，脂溶性部分因疏水作用自动聚集，同时亲水性部分自动向外舒张而自组装成为类脂质体，有机溶剂挥发后得到表面载有单抗片段的顺铂主动肺靶向隐形类脂质体混悬液；
其中每毫升该隐形类脂质体混悬液由以下物质组成：
顺铂药物0.5～10mg，
经抗肺癌细胞单克隆抗体的F(ab’)2片段修饰的聚合物的溶液0.05～0.16ml，
胆固醇-亲水聚合物0.2～100mg，
胆固醇0.2～90mg，
表面活性剂0.5～60mg，
带电荷的附加剂0～20mg，
缓冲溶液，适量；
所述的经抗肺癌细胞单克隆抗体F(ab’)2片段修饰的聚合物的溶液是将末端含有羟基的聚合物PluronicF68，与丁二酸酐溶于无水吡啶，40～90℃反应2～8h后，将减压蒸除吡啶所得粘稠物溶于水后，水层经无水乙醚洗涤、氯仿萃取，干燥后的氯仿层经过滤、浓缩后，用无水乙醚沉淀产物，乙酸乙酯重结晶；产物经12～72h透析后旋转蒸馏至干，得白色蜡状固体，以DMF溶解后，搅拌下滴入N-羟基丁二酸亚胺和二环己基碳二亚胺的DMF溶液中，搅拌至生成聚合物活化酯R，离心后将上清液缓慢滴入0.01～2g·L-1的单抗F(ab’)2片段溶液中，室温搅拌反应1～10h，混合于0.005～0.2mol·L-1NaHCO3溶液中，即得相应的单抗片段修饰的两亲性聚合物的溶液；
所述的胆固醇-亲水聚合物是由末端含有羟基的聚乙二醇、聚乙烯醇、PluronicF68中的一种通过合成反应生成缩醛衍生物聚合物-醛，再与胆固醇反应，即得到胆固醇-亲水聚合物；
所述的带电荷的附加剂为自带负电荷的磷酸二鲸蜡酯，或选自带正电的十八胺、二甲基双十八烷基溴化铵中的一种或两种；
所述的表面活性剂选自脂肪酸山梨坦、聚山梨酯中一种或两种；
所述的F(ab’)2片段来源：用肺癌杂交瘤细胞株4A10，分类命名：肺癌杂交瘤细胞株4A10，human lung cancer McAb 4A10，保藏日期：2010年10月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC C201090。
2.根据权利要求1所述的顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体，其特征在于：是注射剂或是以甘露醇为冻干剂所制得的注射用冻干品。
3.根据权利要求1所述的顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体，其特征在于：所述的缓冲溶液选自pH3.6～9.5硼酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液中一种或多种。
4.一种根据权利要求1所述的顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体的制备方法，其特征在于：处方量的脂溶性膜材，用适量有机溶剂溶解完全后，与处方量顺铂混合超声，再采用注入法或薄膜法与含有聚合物-抗肺癌细胞单抗F(ab’)2片段修饰物溶液的缓冲溶液混合，在20-40℃下混合搅拌并超声，脂溶性部分因疏水作用自动聚集，同时亲水性部分自动向外舒张而自组装成为类脂质体，有机溶剂挥发后得到表面载有单抗片段的顺铂主动肺靶向隐形类脂质体混悬液。
5.根据权利要求4所述的顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105306551A CN102008438B (zh) | 2010-11-04 | 2010-11-04 | 顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105306551A CN102008438B (zh) | 2010-11-04 | 2010-11-04 | 顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102008438A CN102008438A (zh) | 2011-04-13 |
| CN102008438B true CN102008438B (zh) | 2012-05-30 |
Family
ID=43838915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105306551A Expired - Fee Related CN102008438B (zh) | 2010-11-04 | 2010-11-04 | 顺铂抗肺癌主动靶向隐形类脂质体及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102008438B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105560213B (zh) * | 2014-10-16 | 2018-10-19 | 倪健 | 抗血管抑素受体单克隆抗体结合纳米胶束及其制备与应用 |
| CN116687861A (zh) * | 2023-06-07 | 2023-09-05 | 上海其胜生物制剂有限公司 | 一种具有细胞调节功能的大尺寸脂质体及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101484139A (zh) * | 2006-05-15 | 2009-07-15 | 乔治敦大学 | 用于治疗剂或诊断剂的全身施用的抗体或抗体片段靶向的免疫脂质体的制备及其应用 |
| CN101264057A (zh) * | 2008-04-29 | 2008-09-17 | 上海微纳科技有限公司 | pH敏感长循环脂质体组合物及其制备方法 |
-
2010
- 2010-11-04 CN CN2010105306551A patent/CN102008438B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102008438A (zh) | 2011-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Song et al. | Erythrocyte-biomimetic nanosystems to improve antitumor effects of paclitaxel on epithelial cancers | |
| Lakkadwala et al. | Biodistribution of TAT or QLPVM coupled to receptor targeted liposomes for delivery of anticancer therapeutics to brain in vitro and in vivo | |
| Ray et al. | PEG-b-poly (carbonate)-derived nanocarrier platform with pH-responsive properties for pancreatic cancer combination therapy | |
| Yao et al. | Cancer-cell-biomimetic nanoparticles systemically eliminate hypoxia tumors by synergistic chemotherapy and checkpoint blockade immunotherapy | |
| Wang et al. | Paclitaxel derivative-based liposomal nanoplatform for potentiated chemo-immunotherapy | |
| Wei et al. | Multifunctional polymeric micelle-based chemo-immunotherapy with immune checkpoint blockade for efficient treatment of orthotopic and metastatic breast cancer | |
| Li et al. | A folate modified pH sensitive targeted polymeric micelle alleviated systemic toxicity of doxorubicin (DOX) in multi-drug resistant tumor bearing mice | |
| EP3496757A1 (en) | Polyglutamated antifolates and uses thereof | |
| TW200520786A (en) | Liposome preparations containing oxaliplatin | |
| WO2018031980A1 (en) | Polyglutamated antifolates and uses thereof | |
| WO2018031967A1 (en) | Polyglutamated antifolates and uses thereof | |
| Gaber et al. | Co-administration of tretinoin enhances the anti-cancer efficacy of etoposide via tumor-targeted green nano-micelles | |
| Ma et al. | Multi-functionalized dendrimers for targeted co-delivery of sorafenib and paclitaxel in liver cancers | |
| CN104622817B (zh) | 一种蛋白‑聚合物复合纳米载体及其制备方法 | |
| CN107551277A (zh) | 用于包载抗肿瘤药物的pH敏感靶向磷脂聚组氨酸纳米粒 | |
| KR20180120220A (ko) | 난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도 | |
| Rezaei et al. | Erythrocyte− cancer hybrid membrane-coated reduction-sensitive nanoparticles for enhancing chemotherapy efficacy in breast cancer | |
| Qu et al. | Targeted delivery of doxorubicin via CD147-mediated ROS/pH dual-sensitive nanomicelles for the efficient therapy of hepatocellular carcinoma | |
| CN102688200B (zh) | 植物类抗癌靶向纳米制剂及其制备方法 | |
| Li et al. | A micelle-based stage-by-stage impelled system for efficient doxorubicin delivery | |
| Gu et al. | NGR-modified pH-sensitive liposomes for controlled release and tumor target delivery of docetaxel | |
| CN103800915B (zh) | 一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法 | |
| CN110229323A (zh) | 还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其在制备治疗肝癌药物中的应用 | |
| EP2563337A1 (en) | Carrier and targeting system comprising a siosomal composition for intracellular delivery and targeting of active substance | |
| Wang et al. | A conveniently synthesized Pt (IV) conjugated alginate nanoparticle with ligand self-shielded property for targeting treatment of hepatic carcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120530 |