CN102006886A - 抗-tweak受体抗体的治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗实体瘤的组合物和方法。

Description

抗-TWEAK受体抗体的治疗用途

1.相关申请的交叉引用

本申请在U.S.C.§119(e)35下要求2007年8月3日提交的申请系列号60/953,745和2008年4月9日提交的申请系列号60/61/123,623(其内容通过提及而并入本文)的利益。

2.关于联邦资助研究的声明

不适用。

3.发明背景

TWEAK受体(TweakR)，也已知为Fn14或TNFRSF12A，是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。它表达于衍生自各种实体瘤的癌细胞的表面。在一些正常组织上，包括肾脏(鲍曼氏囊)、肝脏(肝细胞)，和在增殖的内皮细胞和成纤维细胞上可以检测到TweakR的表达(Meighan-Mantha，等人，1999，J.Biol.Chem.1999；274：33166-33176；和Jakubowski，等人，2002，J.Cell Sci.2002；115：267-274)。在体外和在体内，TweakR的表达被生长因子上调以应答于组织损伤、再生和炎症(Feng，等人，2000，Am.J.Pathol.，156：1253-1261；Wiley，等人，2001，Immunity，15：837-846；和Desplat-Jego，等人，2005，J.Neuroimm.，133：116-123)。

已经报道了相应于TweakR的DNA和氨基酸序列(参见例如，美国专利号6,531,447、美国专利号6,824,773、美国专利申请公开号2006/0025574、PCT公开号WO 98/55508、PCT公开号WO 99/61471)。类似地，已报道了制备和使用TweakR拮抗剂和激动剂以调节与免疫紊乱和癌症相关的血管发生的方法(参见例如，美国专利号6,727,225，美国专利号6,824,773、美国专利号7,001,992、美国专利号7,169,387、美国专利号7,208,151、美国专利申请公开号2005/0054047、美国专利申请公开号2005/0208046、美国专利申请公开号2006/0084143、PCT公开号WO 00/42073)。然而，这些报道没有一个发现与TweakR结合并表现抗肿瘤效应的单克隆抗体。如本文所描述的，通过发现与TweakR结合的抗体和表征其生物学活性，这些不足已经得到解决。抗TweakR单克隆抗体的发现导致发展了用于治疗实体瘤的组合物，并且还提供了用于诊断用途的筛选工具。

4.发明概述

本文提供了包含与人TweakR结合的单克隆和人源化抗体或其抗原结合片段的组合物，和将其用于治疗(例如在治疗癌症中)的方法。

抗-TweakR单克隆或人源化抗体可以从编码单克隆或人源化抗-TweakR抗体的多肽的核酸产生，所述多肽与一个或多个选自SEQ IDNOs：3-12的氨基酸序列具有65％、75％、85％、90％、95％、97％或99％或更多的序列同一性。在另外的实施方案中，所述核酸编码包含选自SEQ ID NOs：3-12的氨基酸序列的单克隆或人源化抗-TweakR抗体的多肽。

在另外的实施方案中，抗-TweakR单克隆或人源化抗体可以衍生自与一个或多个选自SEQ ID NOs：3-12的氨基酸序列具有65％、75％、85％、90％、95％、97％或99％或更多的序列同一性的多肽。在有些实施方案中，所述多肽包含一个或多个选自SEQ ID NOs：3-12的氨基酸序列。

在有些实施方案中，所述组合物包含抗-TweakR小鼠单克隆抗体或其抗体片段，其中所述抗体包含成熟的重链可变区(其包含选自SEQID NOs：5、7或9的氨基酸序列)和成熟的轻链可变区(其包含选自SEQ ID NOs：6、8或10的氨基酸序列)。

在有些实施方案中，所述组合物包含抗-TweakR人源化抗体或其抗体片段，其中所述抗体包含成熟的重链可变区(其包含选自SEQ IDNOs：3和11的氨基酸序列)和成熟的轻链可变区(其包含选自SEQ IDNOs：4和12的氨基酸序列)。

在有些实施方案中，所述组合物包含抗-TweakR单克隆或人源化抗体或其抗体片段，其中所述抗体包含重链互补决定区(其包含选自SEQ ID NOs：13-30和120-122的氨基酸序列)和轻链互补决定区(其包含选自SEQ ID NOs：66-83和127-129的氨基酸序列)。此外，所述组合物可以包含重链框架区(其包含选自SEQ ID NOs：31-65和123-126的氨基酸序列)和/或轻链框架区(其包含选自SEQ ID NOs：84-119和130-133的氨基酸序列)。所述抗体可以包含本文所公开的抗-TweakR抗体的重链和/或轻链可变结构域的所有互补决定区，任选地，其中互补决定区附近的一个或多个框架区也存在。在有些实施方案中，重链和轻链可变区的互补决定区都存在。

在有些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与由抗-TweakR人源化抗体PDL192所识别的人TweakR表位结合，其中所述表位在SEQ IDNO：2的56位处包含一个R。能够与在56位处包含一个R的TweakR表位结合的PDL192和其他抗体能够杀死TweakR表达细胞。

虽然抗-TweakR抗体已有描述，但本文所描述的抗-TweakR抗体具有许多有用的特性，包括在表达TweakR的细胞中触发凋亡和/或刺激抗体介导的细胞的细胞毒性(ADCC)。TweakR表达细胞包括来自膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、子宫颈癌、食管癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤和肉瘤的癌细胞。

因此，本文描述的组合物可以用于抑制增殖和/或杀死表达TweakR的细胞。例如，在有些实施方案中，本文描述的组合物可以用于治疗患有下列癌症的个体，包含但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食管癌、子宫癌、胃癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤和肉瘤。

技术人员将会意识到，本文描述的任何实施方案的一个或多个具体特征可以与本文描述的任何另一个实施方案的一个或多个具体特征相组合。

5.附图简述

图1A提供了TweakR的核酸序列(SEQ ID NO：1)和图1B提供了TweakR的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；

图2A提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192的重链可变区(SEQ IDNO：3)和轻链可变区(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列；

图2B提供了鼠抗-TweakR抗体19.2.1的重链可变区(SEQ ID NO：5)和轻链可变区(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列；

图2C提供了鼠抗-TweakR抗体18.3.3的重链可变区(SEQ ID NO：7)和轻链可变区(SEQ ID NO：8)的氨基酸序列；

图2D提供了鼠抗-TweakR抗体136.1的重链可变区(SEQ ID NO：9)和轻链可变区(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列；

图2E提供了人源化抗-TweakR抗体PDL400的重链可变区(SEQ IDNO：11)和轻链可变区(SEQ ID NO：12)的氨基酸序列；

图3A提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：13)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：14)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：15)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：16)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：17)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：18)的重链互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列；

图3B提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：19)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：20)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：21)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：22)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：23)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：24)的重链CDR2的氨基酸序列；

图3C提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：25)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：26)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：27)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：28)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：29)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：30)的重链CDR3的氨基酸序列；

图3D提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：31)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：32)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：33)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：34)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：35)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：36)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：37)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：38)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：39)的重链框架区1(FR1)的氨基酸序列；

图3E提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：40)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：41)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：42)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：43)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：44)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：45)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：46)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：47)和鼠抗-TweakR抗体I TEM-1(SEQ ID NO：48)的重链FR2的氨基酸序列；

图3F提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：49)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：50)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：51)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：52)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：53)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：54)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：55)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：56)和鼠抗-TweakR抗体I TEM-1(SEQ ID NO：57)的重链FR3的氨基酸序列；

图3G提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：58)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：59)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：60)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：61)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：62)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQ ID NO：63)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ IDNO：64)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：65)的重链FR4的氨基酸序列；

图4A提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：66)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：67)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：68)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：69)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：70)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：71)的轻链CDR1的氨基酸序列；

图4B提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：72)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：73)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：74)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：75)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：76)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：77)的轻链CDR2的氨基酸序列；

图4C提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：78)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：79)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：80)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：81)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：82)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：83)的轻链CDR3的氨基酸序列；

图4D提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：84)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：85)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：86)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：87)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：88)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：89)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：90)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：91)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：92)的轻链FR1的氨基酸序列；

图4E提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：93)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：94)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：95)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：96)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：97)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：98)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：99)、鼠抗-TweakR抗体I TEM-3(SEQ ID NO：100)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：101)的轻链FR2的氨基酸序列；

图4F提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：102)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：103)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：104)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：105)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：106)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：107)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQID NO：108)、鼠抗-TweakR抗体ITEM-3(SEQ ID NO：109)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：110)的轻链FR3的氨基酸序列；

图4G提供了人源化抗-TweakR抗体PDL192(SEQ ID NO：111)、人源化抗-TweakR抗体PDL192-2(SEQ ID NO：112)、鼠抗-TweakR抗体19.2.1(SEQ ID NO：113)、鼠抗-TweakR抗体136.1(SEQ ID NO：114)、鼠抗-TweakR抗体18.3.3(SEQ ID NO：115)、人源化抗-TweakR抗体PDL183(SEQ ID NO：116)、人源化抗-TweakR抗体PDL183-2(SEQ ID NO：117)、鼠抗-TweakR抗体I TEM-3(SEQ ID NO：118)和鼠抗-TweakR抗体ITEM-1(SEQ ID NO：119)的轻链FR4的氨基酸序列；

图5提供了抗-TweakR抗体的CDR和FR共有序列；

图6提供了各种实体瘤中TweakR基因表达的示例性基因表达谱。X-轴代表基因芯片上评估的单个样品，Y-轴指示每个样品TweakR表达的平均强度；

图7描述用抗-TweakR抗体29.T10进行的TweakR表达肿瘤细胞的免疫组织学染色；

图8A描述由抗-TweakR抗体ITEM1、ITEM2、ITEM3、ITEM4和同种型对照引起的IL-8释放；

图8B描述由抗-TweakR抗体PDL192引起的IL-8释放；

图8C描述由抗-TweakR抗体18.3.3引起的IL-8释放；

图8D描述由抗-TweakR抗体136.1引起的IL-8释放；

图8E描述由抗-TweakR抗体PDL400引起的IL-8释放；

图9描述使用抗-TweakR抗体19.2.1的典型的抗增殖检测；

图10A-10B提供示例性的实例，其中抗-TweakR抗体PDL192(图10A)和136.1(10B)通过胱天蛋白酶激活诱导凋亡来抑制细胞生长；

图11描述在SN12C肾细胞异种移植模型中PDL192的抗肿瘤活性；

图12描述在A253头颈癌异种移植模型中用19.2.1的剂量范围寻找研究；

图13描述在A253头颈癌模型中以慢性剂量给药方案使用19.2.1的抗肿瘤活性；

图14描述在HT1376尿道膀胱异种移植模型中PDL192的抗肿瘤活性；

图15描述在剂量范围寻找研究中，PDL192在A375黑色素瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性；

图16描述在CSOC卵巢异种移植模型中PDL192的抗肿瘤活性；

图17描述在Panc1异种移植模型中PDL192±吉西他滨的抗肿瘤活性；

图18A-18D描述在HT29异种移植模型中PDL192±伊立替康±西妥昔单抗的抗肿瘤活性；

图19A-19B描述在使用MDA-MB-231变体移植物的乳腺癌模型中PDL192的抗肿瘤和抗转移活性；

图20A-20B描述用人PBMC作为效应细胞，抗TweakR抗体PDL192对TweakR转染细胞(图20A)和SN12C肾癌细胞(图20B)的ADCC活性；

图20C描述使用小鼠脾细胞作为效应细胞，抗TweakR抗体PDL192对TweakR转染细胞的ADCC活性；

图21A-21B描述在SN12C肾异种移植模型(图21A)和A375黑色素瘤异种移植模型(图21B)中鼠IgG1同种型(19.2.1xG1)和鼠IgG2a同种型(19.2.1)的抗肿瘤活性；和

图22A-22B描述抗TweakR抗体与人TweakR、人TweakR(R56P)和小鼠TweakR的结合。

6.发明详述

应当理解，前面的一般性描述和下面的详细描述仅是示例性的和说明性的，并不限制本文所描述的组合物和方法。在该申请中，除非另外特别说明，单数的使用包括复数。同样，除非另外说明，“或”的使用意指“和/或”。类似地，“comprise”、“comprises”、“comprising”、“include”、“includes”和“including”不意图是限制性的。

6.2定义

如本文所用的，下面的术语意图具有下面的意义：

如本文所用的，“抗体”包括提及与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，和包括多克隆和单克隆抗体。所述术语还包括经基因改造的形式例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异缀合物(heteroconjugate)抗体(例如，双特异性抗体)。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如，Fab′、F(ab′).sub.2、Fab、Fv和rIgG)。还参见，Pierce Catalog andHandbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.)。还参见例如，Kuby，J.，Immunology，第3补充版，W.H.Freeman &Co.，New York(1998)。该术语还指重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”还包括二价或双特异分子、二体(diabodies)、三体(triabodies)和四体(tetrabodies)。二价抗体和双特异性分子描述于例如Kostelny等人(1992)J Immunol 148：1547，Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31：1579，Hollinger等人，1993，同上，Gruber等人(1994)J Immunol：5368，Zhu等人(1997)ProteinSci 6：781，Hu等人(1996)Cancer Res.56：3055，Adams等人(1993)Cancer Res.53：4026，和McCartney，等人(1995)Protein Eng.8：301。

本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术所产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指来自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指产生它的方法。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知的和例如在Harlow和Lane，″Antibodies：ALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1988)；Hammerling等人，在：″Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas，″Elsevier，N.Y.(1981)，第563681页及其后中所教导的那些技术(两者都通过提及以其整体而合并入本文)。

与特定抗原发生免疫反应的抗体可以通过重组方法来产生，例如在噬菌体或相似载体中选择重组抗体文库，参见例如Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；Ward等人，Nature 341：544-546(1989)；和Vaughan等人，Nature Biotech.14：309-314(1996)，或通过用抗原或编码所述抗原的DNA免疫动物。使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的和本领域公知的。在非限制性的实例中，用目的抗原或表达如此抗原的细胞来免疫小鼠。一旦检测到免疫应答(例如在小鼠血清中检测到特异于所述抗原的抗体)，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后，通过公知的技术将脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞相融合。通过有限稀释选择并克隆杂交瘤。然后，通过本领域中用于分泌能够结合所述抗原的抗体的细胞的已知的方法来测定杂交瘤克隆。可以通过用阳性杂交瘤克隆向腹膜内接种小鼠来产生腹水液，其通常含有高水平的抗体。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每个重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区也已知为“结构域”)。轻链和重链可变区包含四个被三个高变区(也叫“互补决定区”或“CDR”)所间断的“框架”区。在一个类别(species)内，不同轻链和重链的框架区序列是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合框架区，用来在三维空间上定位和排列CDR。

CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始顺次进行编号，并且还通常通过特定CDR位于其中的链来进行识别。这样，V_HCDR3位于它被发现于其中的抗体重链可变结构域，而V_LCDR1是它被发现于其中的抗体轻链可变结构域的CDR1。

提及“V_H”，是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。提及“V_L”，是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。

短语“单链Fv”或“scFv”是指其中传统的两链抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域已经被连接形成一条链的抗体。通常，将接头肽插入两条链之间以允许适当的折叠和活跃的结合位点的产生。

“嵌合抗体”是这样的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替代或交换以便将抗原结合位点(可变区)连接至不同的或经改变的类别、效应子功能和/或种类的恒定区，或完全不同的分子(其赋予所述嵌合抗体新的特性)，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分被改变、替代或与具有不同或经改变的抗原特异性的可变区进行交换。本文描述的任何抗-TweakR抗体可以是嵌合的。

术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指包含人的框架、至少一个或优选地所有来自非人抗体的互补决定区(CDRs)的免疫球蛋白，并且其中所存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区是基本同一的，即至少约85％、至少90％和至少95％同一。因此，除了可能地CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的相应部分是基本上同一的。通常，人框架区中的框架残基将用来自CDR供体抗体的相应残基进行置换，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架置换通过本领域公知的方法进行识别，例如，通过模拟CDR和框架残基的相互作用以识别对抗原结合而言重要的框架残基，和通过序列比较以识别特定位点处的不寻常框架残基。参见例如，Queen等人，美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370(各自通过提及以其整体而合并)。抗体可以用本领域已知的各种方法进行人源化，例如CDR-移植(EP 239,400；PCT出版物WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Mol.Immunol.，28：489498(1991)；Studnicka等人，Prot.Eng.7：805 814(1994)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969973(1994)和链重排(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，所有文献通过提及以其整体而合并入本文。本文描述的抗-TweakR抗体包括人源化抗体，例如小鼠人源化抗体、完全人抗体和小鼠抗体。

“表位”或“抗原决定簇”是指抗体结合至其上的抗原上的位点。表位可以由邻近氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非邻近氨基酸形成。从邻近氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而从三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。通常，一个表位在独特的空间构象中包括至少3个，和更经常至少5个或8-10个氨基酸。决定表位的空间构象的方法包括例如，x-射线晶体衍射和二维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，第66卷，Glenn E.Morris，编辑(1996)。

确定两个抗体是否实质上结合至相同表位通过本领域已知的方法，例如竞争测定法来完成。在进行对照抗体(例如，本文描述的抗-TweakR抗体之一)和任何测试抗体之间的抗体竞争研究中，可以首先用可检测的标记(例如，生物素、酶、放射性标记或荧光标记)来标记对照抗体，以使得能够进行随后的识别。测量被结合的标记的强度。如果经标记的抗体通过接合至重叠的表位与未经标记的抗体竞争，那么相对于阴性对照的未经标记的抗体结合而言，所述强度将下降。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指这样的物质，其实质上或基本上没有在其天然状态所发现的通常伴随它的成分。纯度和同质性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。存在于制剂中的占优势种类的蛋白质或核酸是基本上纯化的。特别地，将分离的核酸与一些开放阅读框相分离，所述开放阅读框天然地位于基因两翼并编码不是由所述基因编码的蛋白质的蛋白质。在有些实施方案中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。在有些实施方案中，这意味着核酸或蛋白质是至少85％纯的、至少95％纯的和至少99％纯的。在另外的实施方案中，“提纯”或“纯化”意指从待纯化的组分中移除至少一种污染物。在这个意义上，纯化并不要求经纯化的化合物是同质的，例如100％纯的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及应用于天然存在的氨基酸聚合物，包含经修饰的残基的那些天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸起相似作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(例如，与氢结合的α-碳、羧基基团、氨基基团和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物可以具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构但与天然存在的氨基酸起相似作用的结构的化合物。

在本文中，氨基酸可以通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以通过其通常被接受的单字母代码来表示。

“经保守修饰的变体”应用于氨基酸序列和核酸序列。关于特定的核酸序列，经保守修饰的变体是指编码同一的或基本上同一的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本同一或相关的(例如天然邻近的)序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上同一的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定的丙氨酸的位置处，可以将密码子改变为另一个所描述的相应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是经保守修饰的变异中的一种。本文的编码多肽的每个核酸序列也描述核酸的沉默变异。技术人员将会意识到，在某些情况下可以修饰核酸中每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上同一的分子。

至于氨基酸序列，技术人员将会意识到，在所编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个置换、删除或添加是“经保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸用化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域公知的。此类经保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因以外的，并且不排除它们。相互的保守置换通常包括例如1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。

“标记”或“可检测的部分”是通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的或其他物理学的手段可检测的组分。例如，有用的标记包括荧光染料、电子密度试剂、酶(例如，如在ELISA通常使用的)、生物素、地高辛配基或半抗原和蛋白质或可以使可检测(例如通过将放射性标记掺入肽中)或可以用于检测与肽特异性反应的抗体的其他实体。放射性同位素可以是例如3H、14C、32P、35S或125I。在有些实施方案中，将放射性同位素用作毒性部分。

可以将标记在任何位置处掺入抗体。可以采用用于将抗体缀合至标记的本领域已知的任何方法，包括由Hunter等人，Nature，144：945(1962)；David等人，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain等人，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；and Nygren，J.Histochem.andCytochem.，30：407(1982)所描述的那些方法。经放射性标记的肽或经放射性标记的抗体组分的寿命可以通过添加使经放射性标记的肽或抗体稳定并保护其免于降解的物质来延长。可以使用使经放射性标记的肽或抗体稳定的任何物质，包括公开于美国专利号5,961,955的那些物质。

当术语“重组”指涉例如细胞或核酸、蛋白质或载体而使用时，是指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或所述细胞衍生自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式之内没有发现的基因，或表达否则将非正常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。本文的术语“重组核酸”意指通常通过操控核酸，例如使用聚合酶和核酸内切酶，以通常未见于自然界的形式最初在体外形成的核酸。以这种方式取得不同序列的有效连接。因此，以线性形式的分离的核酸，或通过连接通常未接合的DNA分子而在体外形成表达载体，就本发明的目的而言都可以认为是重组的。可以理解，重组核酸一经制备并引入宿主细胞或生物，它将会非重组地(即在使用宿主细胞的体内细胞机器而非体外操纵)复制；然而，此类核酸一经重组产生，尽管随后非重组地复制，但就本发明的目的而言仍被认为是重组的。类似地，“重组蛋白质”是使用重组技术例如通过如上文所描述的重组核酸的表达而制备的蛋白质。

当术语“异源的”指涉核酸的片段使用时，是指示包含通常未见于自然界中相同的相互关系的两个或多个亚序列的核酸。例如，通常重组产生这样的核酸，其具有两个或多个序列，例如来自从经安排以产生新的功能性核酸的非相关基因，例如，来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质经常是指未见于自然界中相同的相互关系的两个或多个亚序列(例如，融合蛋白质)。

“启动子”定义为指导核酸的转录的一系列核酸控制序列。如本文所用的，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子的情况下，是TATA元件。启动子也任选地包括远端的增强子或抑制子元件，其可以位于离转录起始位点几千碱基对这样远。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下活跃的启动子。“可诱导的”启动子是在环境或发育调控下活跃的启动子。术语“有效地连接”是指在表达控制序列(例如，启动子或一系列转录因子结合位点)和第二个核酸序列(其中表达控制序列指导相应于第二个序列的核酸的转录)之间的功能性连接。

“表达载体”是用允许在宿主细胞中特定核酸进行转录的一系列指定的核酸元件重组地或合成地产生的核酸构建体。表达载体可以是质粒的一部分、病毒或核酸片段。通常，表达载体包括有效地连接至启动子的待转录的核酸。

短语“特异地(或选择地)结合”至抗体或“与……特异地(或选择地)发生免疫反应”，当指涉蛋白质或肽时，是指这样的结合反应，其是所述蛋白质在蛋白质或其他生物制品的异质群体中存在的决定性事件。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体以至少两倍背景或更通常多于10至100倍背景结合至特定的蛋白质序列。

6.3发明详述

本文描述的组合物是基于单克隆或人源化抗-TweakR抗体的鉴别，所述抗体能够在表达TweakR的细胞中触发凋亡和/或刺激ADCC。特别地，这些抗体在用于治疗癌症的药学组合物中具有用途。

6.4TweakR抗体

本文描述的抗-TweakR抗体特异地与TweakR蛋白结合。“特异地结合”在本文中意指抗体以至少约1μM、至少约0.1μM或更好的，至少约0.01μM和至少约0.001μM或更好的K_D与蛋白质相结合的抗体。在有些实施方案中，本文描述的抗体能够选择性地与特定的靶标而不与相关序列结合。

“TweakR蛋白”，在本文中意指抗-TweakR抗体可以与这样的蛋白质结合，所述蛋白质包含由SEQ ID NO：1所编码或由可以与SEQID NO：1杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本文描述的抗-TweakR抗体能够调节TweakR或配体基因的活性。通常，所述抗体表现至少一种与TweakR的激动剂和拮抗剂相关的特性。“激动剂”在本文中意指能够提高与TweakR相关的一种或多种生物学活性的抗体。“拮抗剂”在本文中意指能够抑制与TweakR和/或与TweakR-配体相互作用相关的一种或多种生物学活性的抗体。与TweakR相关的生物学特性包括但不限于前凋亡、前增殖和前炎症活性(参见例如，Wiley，等人，2001，Immunity，15：837-846，Wiley和Winkles，2003，Cytokine & Growth Factor Review，14：241-249；和Winkles，等人，2006，Cancer Letters，235(1)：11-7)。因此，本文描述的抗-TweakR抗体可以表现0％至100％之间的激动剂活性。例如，在有些实施方案中，抗-TweakR抗体可以表现至少约0％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％的激动剂活性。在有些实施方案中，本文描述的抗-TweakR抗体可以表现大于100％的激动剂活性。

激动剂/拮抗剂活性可以通过在体外细胞生长测定法中测量细胞因子和/或趋化因子的释放来确定。例如，如在实施例中所示，在典型的测定法中，将细胞在体外与抗-TweakR抗体±TWEAK配体进行孵育。24小时后，使用ELISA测定法或商业的基于荧光珠粒的多重测定法(例如，

Upstate)就细胞因子/或趋化因子的存在评估细胞上清液。

在有些实施方案中，使用IL-8释放测定法来表征本文描述的各种抗-TweakR抗体的激动剂/拮抗剂活性(参见例如，图8A-8E和实施例2)。使用从IL-8测定法产生的数据，可以用公式：％激动剂活性＝(a-c)/(b-c)来计算百分比的激动剂活性；可以用公式：％拮抗剂活性＝(b-d)/(b-a)来计算百分比的拮抗剂活性；其中a＝从用10μg/ml的抗体处理的细胞所释放的IL8的量，b＝从用300ng/ml的TWEAK处理的细胞所释放的IL8的量，c＝从未经处理的细胞所释放的I L8的量，和d＝从用300ng/ml TWEAK和10μg/ml抗体处理的细胞所释放的IL8的量。

图8A-8E描述使用抗-TweakR抗体PDL192(图8B)、18.3.3(图8C)、136.1(图8D)、PDL400(图8E)以及以前发现的抗-TweakR抗体ITEM1、ITEM2、ITEM3和ITEM4(图8A；Nakayama，等人，2003，Biochem Biophy Res Comm，306：819-825)的IL-8释放的示例性实施方案。基于两次或多次实验的结果，ITEM1表现约25％的激动剂活性，ITEM2表现约28％的激动剂活性，ITEM3表现约37％的激动剂活性，ITEM4表现约12％的激动剂活性，PDL192表现约25％的激动剂活性，19.2.1表现约39％的激动剂活性，18.3.3表现约14％的激动剂活性，136.1表现约278％的激动剂活性，和PDL400表现约8％的激动剂活性。

在有些实施方案中，抗-TweakR抗体在表达TweakR的细胞中诱导凋亡。凋亡测定法可以通过末端脱氧核苷酰转移酶介导的地高辛配基-11-dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析(Lazebnik等人，Nature：371，346(1994)来进行。例如，如在图10A-10B中举例说明的，抗-TweakR抗体能够通过诱导凋亡抑制肿瘤细胞的生长。在提供于图10A-10B的示例性实施例中，推测凋亡的诱导通过胱天蛋白酶激活而发生。

在有些实施方案中，抗-TweakR抗体在表达TweakR的细胞中刺激抗体依赖性细胞细胞毒(ADCC)。通常，抗-TweakR抗体在效应细胞(例如自然杀伤细胞或巨噬细胞)存在下结合靶细胞(表达TweakR的细胞)表面的抗原。效应细胞上的Fc受体识别经结合的抗体。Fc受体的交联向效应细胞发出信号通过细胞溶解或凋亡杀死靶细胞。细胞溶解可以通过检测标记或乳酸脱氢酶从被溶解的细胞中释放来检测。细胞毒性可以通过本领域已知的检测试剂盒，例如来自RocheApplied Science的Cytotoxicity Detection Kit(Indianapolis，IN)直接进行检测。

在有些实施方案中，通过测量上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)(其在质膜损伤时快速释放)释放来监测和定量抗体相关的ADCC活性。为了确定细胞介导的细胞毒性的百分比，使用下面的公式计算样品的平均吸光度并减去背景对照：

细胞毒性(％)＝LDH释放_样品-SR_效应细胞-SR_靶细胞x100

MR_靶细胞-SR_靶细胞

SR是指自发释放和MR是指最大释放。也参见美国专利申请公开号2005/0025763所公开的方法；其公开内容以其整体合并入本文。

在有些实施方案中，抗-TweakR抗体诱导至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或80％的靶细胞细胞毒性。本文描述的抗-TweakR抗体可以具有所定义的激动剂和/或拮抗剂活性中的任何一种，和所定义的细胞毒性中的任何一种。

在提供于图20A-20C的示例性实施例中，使用人外周血单核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，抗-TweakR抗体PDL192在SN12C肾细胞以及TweakR转染细胞系中诱导ADCC活性。在不表达TweakR的细胞中未观察到抗-TweakR抗体的ADCC诱导(数据未显示)。

与在体内肿瘤细胞的死亡相关的生物学途径包括凋亡和经过ADCC的细胞的细胞溶解。使用两种在体外具有不同ADCC活性的抗-TweakR小鼠抗体在体内测量了凋亡和ADCC对于抗-TweakR抗体的抗肿瘤活性的贡献(数据未显示)。小鼠抗-TweakR 19.2.1，一种在体外表现强烈ADCC活性的IgG2a抗体，在SN12C肾异种移植模型(图21A)和A375黑色素瘤异种移植模型(图21B)中具有显著的抗肿瘤活性。小鼠抗-TweakR抗体19.2.1xG1(其在体外表现弱的ADCC)在SN12C肾异种移植模型(图21A)中的抗肿瘤活性可以忽视而在A375黑色素瘤异种移植模型(图21B)中抗肿瘤活性可与19.2.1相比。因此，本文描述的抗-TweakR抗体能够通过诱导与在体内杀死癌细胞相关的一条或多条生物学途径而减缓或抑制肿瘤细胞生长。

用于本文描述的组合物和方法的抗体包括特异地与相同的一个或多个表位结合的抗-TweakR抗体，例如PDL192、18.3.3或136.1。被本文描述的抗体所结合的表位抗原是相同的、重叠的或不同的。例如，通过在其氨基酸序列(SEQ ID NO：2；参见图22A和22B)的位置56处改变单个氨基酸，即R56P，取消了PDL192和19.2.1与人TweakR蛋白的特异结合。当将R56变为P56，抗-TweakR抗体18.3.3、ITEM1和ITEM3抗体仍然能够结合人TweakR序列(参见例如，图22A)。此外，抗-TweakR抗体18.3.3、ITEM1和ITEM3结合小鼠TweakR蛋白，其在其氨基酸序列的位置56处包含脯氨酸。然而，抗-TweakR抗体PDL192和19.2.1不接合小鼠TweakR蛋白(参见例如，图22A-22B)。这些结果暗示PDL192和19.2.1结合不同于被18.3.3、ITEM1和ITEM3所结合的表位的表位。

用于本文描述的组合物和方法的其他抗体包括，但不限于，包含可变区、至少一个框架区或至少一个CDR氨基酸序列的抗-TweakR抗体，所述CDR氨基酸序列与选自SEQ ID NO：3-119的那些序列共享100％的同一性或与那些序列是基本上同一的。可变区、框架区和CDR的程度对本领域普通技术人员而言是公知的(参见例如，Kabat，等人，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，第5补充版，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。

如本文描述的，能够特异地结合TweakR的抗-TweakR抗体可以包含重链和/或轻链CDR和/或框架区的各种组合。在有些实施方案中，抗-TweakR抗体包含重链和/或轻链可变区。在另外的实施方案中，其中描述的抗-TweakR抗体包含重链和/或轻链可变区的一个、两个或所有三个CDR。在另外的实施方案中，其中描述的抗-TweakR抗体包含一个、两个、三个或所有四个框架区。在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体包含重链和轻链可变区这二者的CDR。在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体包含重链和轻链可变区这二者的CDR和框架区。如从前面的描述中显而易见的，用于本文描述的组合物和方法的抗-TweakR抗体可以包含CDR和框架区的任何组合，只要所得的抗体能够特异地结合TweakR和杀死癌细胞。抗-TweakR抗体可以是单克隆的、嵌合的、人源化的或完全的人的。

在有些实施方案中，抗-TweakR抗体可以包含重链和/或轻链可变区的一个或多个CDR，其包含选自SEQ ID NO：120-123和127-129的共有序列，和包含重链和/或轻链可变区的一个或多个框架区(其包含选自SEQ ID NOs：123-126和SEQ ID NO：130-133的共有序列)的各种组合。

例如，抗-TweakR抗体或其抗原结合片段可以选自：由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N；由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M；由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q；由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D；由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L；由包含式EVXaaLXaaESGGGLVQPGGSXaaXaaLSCXaaASGFXaaFXaa(SEQ ID NO 123)的氨基酸序列编码的重链FR1，其中位置3处的Xaa是Q或K，位置5处的Xaa是E、V或G，位置18处的Xaa是L或M，位置19处的Xaa是R或K，位置23处的Xaa是A或V，位置28处的Xaa是T或P，和位置30处的Xaa是S、N或T；由包含式WVRQXaaPXaaKGLEWXaaA(SEQID NO 124)的氨基酸序列编码的重链FR2，其中位置5处的Xaa是A或S，位置7处的Xaa是E或G，位置13处的Xaa是V或L；由包含式XaaFTISRDXaaXaaXaaXaaXaaXaaYLQMNXaaLRAEXaaTXaaXaaYYCXaaXaa(SEQ ID NO 125)的氨基酸序列编码的重链FR3，其中位置1处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是D或N，位置9处的Xaa是S或A，位置10处的Xaa是K或R，位置11处的Xaa是N或S，位置12处的Xaa是S、R或T，位置13处的Xaa是L或V，位置19处的Xaa是S或N，位置24处的Xaa是D或N，位置26处的Xaa是A或G，位置27处的Xaa是I或V，位置31处的Xaa是T、S或A，和位置32处的Xaa是G、P或R；由包含式WGQGTXaaXaaTVSS(SEQ ID NO 126)的氨基酸序列编码的重链FR4，其中位置6处的Xaa是L、S或T和位置7处的Xaa是V或L；由包含式XaaIXaaXaaTQSPXaaSLXaaXaaSXaaGXaaRXaaTIXaaC(SEQ ID NO 130)的氨基酸序列编码的轻链FR1，其中位置1处的Xaa是D或E，位置3处的Xaa是Q或V，位置4处的Xaa是M或L，位置9处的Xaa是G、S或A，位置12处的Xaa是S、A或T，位置13处的Xaa是A、L或V，位置15处的Xaa是P、V或L，位置17处的Xaa是D、E或Q，位置19处的Xaa是V或A，和位置22处的Xaa是T或S；由包含式WYQQXaaPGXaaXaaPKLLIK(SEQ ID NO 131)的氨基酸序列编码的轻链FR2，其中位置5处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是K或Q，和位置9处的Xaa是A、P或S；由包含式GXaaPXaaRFSGSGSGTDFTLXaa IXaaXaaXaaXaaXaaEDXaaAXaaYYC(SEQ IDNO 132)的氨基酸序列编码的轻链FR3，其中位置2处的Xaa是V或I，位置4处的Xaa是S、D或A，位置18处的Xaa是T或N，位置20处的Xaa是S或H，位置21处的Xaa是S、R或P，位置22处的Xaa是L或V，位置23处的Xaa是Q或E，位置24处的Xaa是P或E，位置27处的Xaa是F，T或A和位置29处的Xaa是T或V；和/或由包含式FGXaaGTXaaXaaEIKR(SEQ ID NO 133)的氨基酸序列编码的轻链FR4，其中位置3处的Xaa是G或Q，位置6处的Xaa是K或R，和位置7处的Xaa是V或L。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N；由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；和由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q，由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D，和由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L。

在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体可以包含由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N，由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ IDNO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T、或Y，和位置6处的Xaa是F或M，由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q，由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D，和由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L。除了描述重链和/或轻链CDR的实施方案外，抗-TweakR抗体可以包含重链和/或轻链CDR的其他组合，只要所得的抗体能够特异地结合TweakR和杀死癌细胞。

在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体可以包含由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N，由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T、或Y，和位置6处的Xaa是F或M，由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q，由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D，由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L，由包含式EVXaaLXaaESGGGLVQPGGSXaaXaaLSCXaaASGFXaaFXaa(SEQ ID NO 123)的氨基酸序列编码的重链FR1，其中位置3处的Xaa是Q或K，位置5处的Xaa是E、V或G，位置18处的Xaa是L或M，位置19处的Xaa是R或K，位置23处的Xaa是A或V，位置28处的Xaa是T或P，和位置30处的Xaa是S、N或T，由包含式WVRQXaaPXaaKGLEWXaaA(SEQID NO 124)的氨基酸序列编码的重链FR2，其中位置5处的Xaa是A或S，位置7处的Xaa是E或G，位置13处的Xaa是V或L，由包含式XaaFTISRDXaaXaaXaaXaaXaaXaaYLQMNXaaLRAEXaaTXaaXaaYYCXaaXaa(SEQ ID NO 125)的氨基酸序列编码的重链FR3，其中位置1处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是D或N，位置9处的Xaa是S或A，位置10处的Xaa是K或R，位置11处的Xaa是N或S，位置12处的Xaa是S、R或T，位置13处的Xaa是L或V，位置19处的Xaa是S或N，位置24处的Xaa是D或N，位置26处的Xaa是A或G，位置27处的Xaa是I或V，位置31处的Xaa是T、S或A，和位置32处的Xaa是G、P或R，和由包含式WGQGTXaaXaaTVSS(SEQ ID NO 126)的氨基酸序列编码的重链FR4，其中位置6处的Xaa是L、S或T和位置7处的Xaa是V或L。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N，由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M；由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q，由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D，由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L，由包含式EVXaaLXaaESGGGLVQPGGSXaaXaaLSCXaaASGFXaaFXaa(SEQ ID NO 123)的氨基酸序列编码的重链FR1，其中位置3处的Xaa是Q或K，位置5处的Xaa是E、V或G，位置18处的Xaa是L或M，位置19处的Xaa是R或K，位置23处的Xaa是A或V，位置28处的Xaa是T或P，和位置30处的Xaa是S、N或T，由包含式WVRQXaaPXaaKGLEWXaaA(SEQID NO 124)的氨基酸序列编码的重链FR2，其中位置5处的Xaa是A或S，位置7处的Xaa是E或G，位置13处的Xaa是V或L，由包含式XaaFTISRDXaaXaaXaaXaaXaaXaaYLQMNXaaLRAEXaaTXaaXaaYYCXaaXaa(SEQ ID NO 125)的氨基酸序列编码的重链FR3，其中位置1处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是D或N，位置9处的Xaa是S或A，位置10处的Xaa是K或R，位置11处的Xaa是N或S，位置12处的Xaa是S、R或T，位置13处的Xaa是L或V，位置19处的Xaa是S或N，位置24处的Xaa是D或N，位置26处的Xaa是A或G，位置27处的Xaa是I或V，位置31处的Xaa是T，S或A，和位置32处的Xaa是G、P或R，由包含式WGQGTXaaXaaTVSS(SEQ ID NO 126)的氨基酸序列编码的重链FR4，其中位置6处的Xaa是L、S或T和位置7处的Xaa是V或L，由包含式XaaIXaaXaaTQSPXaaSLXaaXaaSXaaGXaaRXaaTIXaaC(SEQ ID NO 130)的氨基酸序列编码的轻链FR1，其中位置1处的Xaa是D或E，位置3处的Xaa是Q或V，位置4处的Xaa是M或L，位置9处的Xaa是G、S或A，位置12处的Xaa是S、A或T，位置13处的Xaa是A、L或V，位置15处的Xaa是P、V或L，位置17处的Xaa是D、E或Q，位置19处的Xaa是V或A，和位置22处的Xaa是T或S，由包含式WYQQXaaPGXaaXaaPKLLIK(SEQ ID NO 131)的氨基酸序列编码的轻链FR2，其中位置5处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是K或Q，和位置9处的Xaa是A、P或S，由包含式GXaaPXaaRFSGSGSGTDFTLXaaIXaaXaaXaaXaaXaaEDXaaAXaaYYC(SEQ IDNO 132)的氨基酸序列编码的轻链FR 3，其中位置2处的Xaa是V或I，位置4处的Xaa是S、D或A，位置18处的Xaa是T或N，位置20处的Xaa是S或H，位置21处的Xaa是S、R或P，位置22处的Xaa是L或V，位置23处的Xaa是Q或E，位置24处的Xaa是P或E，位置27处的Xaa是F、T或A和位置29处的Xaa是T或V，和由包含式FGXaaGTXaaXaaEIKR(SEQ ID NO 133)的氨基酸序列编码的轻链FR4，其中位置3处的Xaa是G或Q，位置6处的Xaa是K或R，和位置7处的Xaa是V或L。

除了包含上文描述的重链和/或轻链CDR和框架区的共有序列的各种组合外，本文描述的抗-TweakR抗体还可以包含选自SEQ ID NOs：13、19、25、66、72、78、31、40、49、58、84、93、102和111的重链和/或轻链CDR和框架区的各种组合。

根据实施例并且非限制地，抗-TweakR抗体可以包含由包含SYWMS(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列编码的重链CDR1、由包含EIRLKSDNYATHYAESVKG(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列编码的重链CDR2和由包含式YYADAMDY(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列编码的重链CDR3。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO 66)的氨基酸序列编码的轻链CDR1、由包含YASNLES(SEQ ID NO 72)的氨基酸序列编码的轻链CDR2和由包含式QHSWEIPYT(SEQ ID NO 78)的氨基酸序列编码的轻链CDR3。

在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体可以包含来自重链和轻链的所有三个CDR，例如，由包含SYWMS(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列编码的重链CDR1、由包含EIRLKSDNYATHYAESVKG(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列编码的重链CDR2和由包含式YYADAMDY(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列编码的重链CDR3、由包含RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO66)的氨基酸序列编码的轻链CDR1、由包含YASNLES(SEQ ID NO 72)的氨基酸序列编码的轻链CDR2和由包含式QHSWEIPYT(SEQ ID NO 78)的氨基酸序列编码的轻链CDR3。除了描述重链和/或轻链CDR的实施方案外，抗-TweakR抗体可以包含重链和/或轻链CDR的其他组合，只要所得的抗体能够特异地结合TweakR和杀死癌细胞。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO 31)的氨基酸序列编码的重链FR1、由包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO 40)的氨基酸序列编码的重链FR2、由包含RFTISRDDSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTG(SEQID NO 49)的氨基酸序列编码的重链FR3和由包含WGQGTLVTVSS(SEQID NO 58)的氨基酸序列编码的重链FR4。正如本领域技术人员将会意识到的，除了由SEQ ID NOs；31、40、49和58编码的重链框架区外，本文描述的抗-TweakR抗体还可以包含一个或多个重链CDR序列，例如SEQ ID NOs：13、19和25和/或一个或多个轻链CDR，例如SEQ IDNOs：66、72和78。除了描述重链和/或轻链CDR的实施方案外，抗-TweakR抗体还包含重链和/或轻链CDR的其他组合，只要所得的抗体能够特异地结合TweakR和杀死癌细胞。

根据另一个实施例，抗-TweakR抗体可以包含由包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO 84)的氨基酸序列编码的轻链FR1、由包含WYQQKPGKAPKLLIK(SEQ ID NO 93)的氨基酸序列编码的轻链FR2、由包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ IDNO 102)的氨基酸序列编码的轻链FR 3和由包含FGGGTKVEIKR(SEQ IDNO 111)的氨基酸序列编码的轻链FR4。正如本领域技术人员将会意识到的，除了由SEQ ID NOs；84、93、102和111编码的轻链框架区外，本文描述的抗-TweakR抗体可以包含一个多个重链CDR序列，例如SEQ ID NOs：13、19和25和/或一个或多个轻链CDR，例如SEQ IDNOs：66、72和78，和/或一个或多个由31、40、49和58编码的重链框架区；因此，抗-TweakR抗体可以包含重链和/或轻链CDR和框架区的其他组合，只要所得的抗体能够特异地结合TweakR和杀死癌细胞。

“基本上同一的”可变区、恒定区、框架区和CDR是指这样的抗体区，其中至少约85-90％，和优选至少95％的氨基酸序列与天然的或未经改变的抗体可变区或恒定区是同一的。术语“同一的”或百分比“同一性”，在两个或多个氨基酸或核苷酸序列的情况下，是指两个或多个序列或亚序列是相同的，或这样的两个或多个序列或亚序列，其具有相同的特定的氨基酸残基或核苷酸百分比(例如，在特定的区域上约60％的同一性，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％，92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性，当在比较窗或指定的区域上就最大对应进行比较或比对时)，如使用具有下文描述的缺省参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手工比对和目视检查(参见例如，在位于www.ncbi.nlm.nih.gov的National Center for Biotechnology Information(NCBI)的BLAST的描述)所测得的。

同一的或基本上同一的序列包括具有删除和/或添加，以及具有置换的序列，以及天然存在的，例如，多态性或等位基因变体，和人造变体例如经保守修饰的变体。用于测量序列同一性的公知的算法可以解释缺口等等。优选地，序列同一性存在于至少约25个氨基酸或核苷酸长的区域，或更优选地在50-100个氨基酸或核苷酸长的区域。

用于本文描述的方法的抗-TweakR抗体的氨基酸序列不限于在天然抗体中发现的序列；使用公知的重组DNA技术，可以重新设计抗体以获得所希望的特征。此类“经遗传改变的抗体”包括其中氨基酸序列已从亲本(即未经改造的)抗体发生变异的那些。可能的变异从仅一个或几个氨基酸的改变到例如可变区或恒定区的完全重新设计。可以通过定点突变在恒定区制造改变以改善或改变治疗性抗体的功能特征，例如免疫原性、药物代谢的动力学特征(例如，血清半衰期)、补体结合、与膜的相互作用和其他效应子功能。可以制造抗体可变区的改变以改善抗原结合特性。

编码本文所描述的抗-TweakR抗体和氨基酸序列的核酸，以及与所述核酸序列杂交和编码抗-TweakR抗体的分子，具有本文描述的功能特性的此类抗体，可以用于本文所公开的方法中。

抗-TweakR抗体可以是任何已发现的同种型。在有些实施方案中，抗-TweakR抗体是四种人IgG同种型(即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中)的一种，或四种小鼠IgG同种型(即，小鼠IgG1、小鼠IgG2a、IgG2b和小鼠IgG3中)的一种。在另外的实施方案中，抗-TweakR抗体是人IgG1同种型。

在另一个实施方案中，所述抗体具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。已将缺乏岩藻糖的抗体与增强的ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒)活性相关联，特别在低剂量的抗体时。Shields，R.L.，等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Shinkawa，T.等人，(2003)，J.Biol.Chem.278：3466。制备无岩藻糖抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞中(ATCC CRL 1662)生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，其编码对于多肽的岩藻糖化而言所必需的酶(α1，6-岩藻糖基转移酶)。

增加ADCC活性的备选方法包括在抗-TweakR抗体的Fc部分进行突变，尤其是增加抗体对FcγR受体的亲和力的突变。使用基于细胞的靶向细胞毒性测定已显示了增加的FcγR结合与经突变的Fc之间的相关性。Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem 276：6591-6604；Presta等人(2002)，Biochem Soc.Trans.30：487-490。增加ADCC活性的其他方法包括特定Fc区突变的产生，如在美国专利申请公开号2005/0025763中所描述的；其公开内容以其整体而合并入本文。

可以用于本文描述的组合物和方法的其他类型的抗体包括，但不限于，结合(优选地，免疫特异地，即竞争掉非特异性结合，如通过本领域公知用于测定特异性抗原-抗体结合的免疫测定法所测定的)抗原的任何免疫球蛋白分子。此类抗体包括，但不限于，多克隆的、单克隆的、双特异性的、多特异性的、人的、人源化的、嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段，二硫键连接的Fv和包含，在某些情况下，经改造以包含或融合至Fc结合结构域的V_L或V_H结构域甚或特异地结合抗原的互补决定区(CDR)的片段。

6.5检测用于诊断应用的TweakR序列

评价了在正常组织(例如，没有发生病症的)和在疾病组织(和在一些情况下，涉及预后的不同严重度的病症的，如下文描述的)中基因的表达水平，以提供表达谱。特定细胞状态或发育点的基因表达谱本质上是所述细胞的状态的“指纹”。当两种状态可能具有相似表达的特定基因时，同时评价许多基因使得能够产生反映所述细胞的状态的基因表达谱。通过比较在不同状态中的细胞的表达谱，获得关于在这些状态的每一个中哪些基因是重要的这样的信息(包括基因的上调或下调)。然后，可以进行或确认诊断，以确定组织样品是否具有正常或疾病组织的基因表达谱。这将提供相关病状的分子诊断。

本文所用的“差异表达”或语法上的等价语是指在细胞和组织之内或之间在时间的和/或细胞的基因表达图谱(pattern)中质的或量的差异。因此，差异表达的基因可以定性地改变其表达，包括在例如正常组织相对疾病组织中的激活或失活。基因可以在相对于其他状态的特定状态打开或关闭，从而使得能够比较两个或多个状态。经定性调控的基因将在某种状态或细胞类型中展现通过标准方法可检测的表达谱。有些基因将在一种状态或细胞类型中表达，但不是在两者中都表达。备选地，表达的差异可以是定量的，例如，表达是增加的或减少的，例如，基因表达被上调，从而导致增加量的转录本，或者被下调，从而导致减少量的转录本。表达差异的程度只需要足够大至通过如下文描述的标准表征技术，例如通过使用Affymetrix

(DNA微芯片阵列)表达阵列来进行定量。参见，Lockhart(1996)Nature Biotechnology 14：1675-1680。其他技术包括，但不限于，定量反转录PCR、northern分析和RNase保护。如上文所描述的，优选地，表达中的变化(例如，上调或下调)为至少约50％，更优选至少约100％，更优选至少约150％，更优选至少约200％，从300至至少1000％是特别优选的。

可以在基因转录本或蛋白质水平上进行评价。基因表达的量可以使用针对基因转录本的RNA或DNA等价物的核酸探针来监测，而基因表达水平的定量或备选地，最终基因产物本身(蛋白质)可以例如用针对TweakR蛋白的抗体和标准免疫测定法(ELISA等)或其他技术，包括质谱分析、2D凝胶电泳分析等来监测。相应于TweakR的蛋白质，例如被发现为在疾病表型中是重要的那些蛋白质，可以在疾病诊断测试中进行评价。在另一个实施方案中，对许多基因同时进行基因表达监测。也可以进行多重蛋白质表达监测。

因此，在有些实施方案中，将TweakR核酸探针附着至生物芯片以检测和定量特定细胞中的TweakR序列。在下文中在实施例中进一步描述所述分析。PCR技术可以用来提供更大的灵敏度。

在另外的实施方案中，检测编码TweakR的核酸，虽然可以检测编码TweakR的DNA或RNA，但特别有兴趣的是其中检测编码TweakR蛋白的mRNA的方法。检测mRNA的探针可以是与mRNA互补或杂交的核苷酸或脱氧核苷酸探针，并且包括但不限于，寡核苷酸、cDNA或RNA。探针还应当包含如本文所定义的可检测的标记。在一个方法中，在固定化待检查的核酸于固体支持物例如尼龙膜并将探针与样品杂交后检查mRNA。在洗涤以除去非特异结合的探针后，检测标记。在另一个方法中，mRNA的检测原位地进行。在该方法中，将经可渗透化处理的细胞或组织与可检测地标记的核酸接触足够的时间以允许探针与靶mRNA杂交。在洗涤以除去非特异结合的探针后，检测标记。例如，通过地高辛配基与抗地高辛配基二抗的结合来检测经地高辛配基标记的互补于编码骨髓瘤蛋白的mRNA的核糖核酸探针(RNA探针)，并用氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸进行显色。

在另外的实施方案中，TweakR蛋白质、抗体、核酸、经修饰的蛋白质和包含TweakR序列的细胞被用于诊断分析。可以在独个基因或相应多肽的水平上进行这些分析。在一个实施方案中，优选地将表达谱与高通量筛选技术联合使用以使得能够监测表达谱基因和/或相应的多肽。

如本文描述和定义的，TweakR被用作癌性病状的疾病标志物，所述癌性病状包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、子宫颈癌、食管癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤和肉瘤。此外，TweakR被用作预后或诊断目的的标志物。检测在推定的患病组织和/或循环的肿瘤细胞中的这些蛋白质使得能够对此类病状进行检测、预测和诊断，从而能够选择治疗策略。在一个实施方案中，使用抗体来检测TweakR。优选的方法通过在凝胶上(通常是变性或还原蛋白质凝胶，但可以是另外形式的凝胶，包括等电点聚焦凝胶，等等)进行电泳从样品中分离蛋白质。在蛋白质分离后，检测TweakR，例如通过用针对TweakR而建立的抗体进行免疫印迹。

在另一个方法中，TweakR抗体用于原位显像技术，例如在组织学中。参见例如，Asai，等人(1993编辑)Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology(第37卷)Academic Press。在该方法中，将细胞与从一种至多种针对TweakR蛋白的抗体相接触。在洗涤以除去非特异性抗体结合后，检测一种或多种抗体的存在。在一个实施方案中，通过与包含可检测标记的二抗孵育来检测抗体。在另一个方法中，TweakR的一抗包含可检测的标记，例如可以作用于底物上的酶标志物。在另一个实施方案中，多种一抗中的每一种包含不同的并可检测的标记。该方法特别地用于与前面提及条件的其他标志物一起同时筛选TweakR。本发明还提供了许多其他的组织学显象技术。

在一个实施方案中，在能够检测和区分不同波长的发射的荧光计中检测所述标记。此外，在该方法中可以使用荧光激活的细胞分选器(FACS)。

在另一个实施方案中，抗体用于从血液、血清、血浆、粪便和其他样品中诊断癌症。通过前面描述的免疫测定技术(包括ELISA、免疫印迹(Western印迹)、免疫沉淀、BIACORE技术等等)，抗体可以被用来检测TweakR。

在另一个实施方案中，进行了经标记的TweakR核酸探针与组织阵列的原位杂交。例如，制备了一系列组织样品，包括疾病组织和/或正常组织的。然后进行原位杂交(参见例如，Ausubel，同上)。当比较个体和标准之间的指纹时，诊断、预后和预测可以基于所见结果。进一步应当理解，指示诊断的基因可以不同于指示预后的基因，并且所述细胞条件下的分子谱可以导致应答和不应条件之间的区别或可以预测结果。

在一个实施方案中，TweakR蛋白质、抗体、核酸、经修饰的蛋白质和包含TweakR序列的细胞用于诊断分析。如上所述，可以产生与疾病状态(临床的、病理的)或就长期预后而言的其他信息相关的基因表达谱。再次，这可以使用优选的基因在蛋白质或基因水平上进行。在各种组合中，单个或多个基因可以是有用的。如上所述，可以将TweakR探针附着至生物芯片以检测和定量化组织或患者中的TweakR序列。如上文描述的那样进行分析以用于诊断。PCR方法可以提供更灵敏和精确的定量。

6.6治疗癌症

本文描述的抗体可以用于预防和治疗异常的细胞增殖。如本文所述的，异常的细胞增殖可以表现为肿瘤或转移。如本文所用的术语“肿瘤”，是指所有肿瘤性细胞生长和增殖，不论是恶性的或良性的，和所有癌变前的和癌性的细胞和组织。术语“转移”在本文中在最宽泛的意义上使用，并且是指肿瘤的散布，例如，癌从身体的一部分到另一部分。从已散布的细胞形成的肿瘤称为继发性肿瘤，并包含与最初的(原发性)肿瘤相同类型的细胞。因此，已转移至肝脏或骨的前列腺癌不是肝癌或骨癌，而是转移的前列腺癌，因为它仍然包含前列腺癌细胞，而无关其位置。

因此，在有些实施方案中，抗TweakR抗体的施用可以引发癌细胞的杀死。所述癌细胞可以存在于实体瘤、淋巴系统或血流中。如本文所用的“癌症”包括所有恶性赘生物，包括但不限于，癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。使用本文所公开的方法可以被靶向的癌症的实例包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食管癌、子宫癌、胃癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤和肉瘤。本文描述的治疗方法通常应用于人患者，但可以应用于其他哺乳动物。

在有些实施方案中，施用抗-TweakR抗体诱导表达TweakR的细胞的凋亡和细胞溶解。在有些实施方案中，细胞溶解的诱导是通过抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)来取得。例如，抗-TweakR抗体可以诱导表达TweakR的细胞的10％至大于80％的细胞毒性。在有些实施方案中，施用抗-TweakR抗体诱导表达TweakR的细胞的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或80％或更多的细胞毒性。

在有些实施方案中，施用抗-TweakR抗体可以通过用一种或多种本文描述的抗体靶向癌细胞表面的TweakR来缩减实体瘤的大小。所述肿瘤可以是原发性肿瘤或继发性肿瘤。根据实施例，施用抗-TweakR抗体可以缩减实体瘤的大小至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或80％或更多。在另一些实施方案中，施用抗-TweakR抗体可以完全抑制或防止实体瘤的生长。

将会意识到，本文描述了不同细胞毒性的范围和肿瘤大小缩减的范围。技术人员将会意识到，抗-TweakR抗体可以具有任何一种所描述的细胞毒性和任何一种所描述的肿瘤大小缩减。

在有些实施方案中，所述方法可以采用缀合至效应子部分的抗-TweakR抗体。所述效应子部分可以是任何数目的分子，包括标记部分例如放射性标记或荧光标记，或优选地可以是治疗性部分。效应子部分(或效应子组分)可以结合(连接或缀合)至抗-TweakR抗体，共价地，通过接头或化学键，或非共价地，通过离子键、范德华力、静电相互作用或氢键。

治疗性部分可以是调节TweakR活性的小分子。在另一个方面，治疗性部分影响与TweakR相关的或极为接近的分子或细胞的活性。例如，治疗性部分可以是细胞毒性试剂。本文所用的术语“细胞毒性试剂”是指抑制或防止细胞的功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如，I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰和Re¹⁸⁶)、化学治疗剂和毒素例如细胞、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段。合适的毒素或其相应片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻风树毒素、巴豆毒素、酚毒素、依诺霉素、auristatins(例如，auristatin E或auristatin F)，等等。将治疗性部分靶向表达于癌细胞表面的TweakR不但用于增加治疗性部分在患病区的局部浓度，而且还用于减少可能与治疗性部分相关的有害副作用。

在另外一些实施方案中，抗-TweakR抗体可以与用于治疗具体癌症的常规治疗剂相组合地使用。照料具体癌症的常规标准是本领域技术人员已知的，因此，本领域技术人员将能够选择一种或多种治疗剂以与本文描述的抗-TweakR抗体进行组合。根据实施例，当前正在使用治疗剂吉西他滨，与或不与埃罗替尼(erlotinib)

一起来治疗胰腺癌。因此，可以与吉西他滨和/或埃罗替尼相组合地使用抗-TweakR抗体以治疗胰腺癌。

目前用于治疗癌症并因此可以与本文描述的抗-TweakR抗体相组合地使用的其他治疗剂的实例包括但不限于靶向试剂、常规化学治疗剂和激素治疗剂。

在有些实施方案中，本文描述的抗-TweakR抗体可以与靶向试剂相组合地使用。靶向试剂包括但不限于抗血管发生试剂(例如，贝伐珠单抗、舒尼替尼、索拉非尼、坦罗莫司、2-甲氧雌二醇或2ME2、finasunate、PTK787和凡德他尼)，EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、吉非替尼、拉帕替尼和曲妥珠单抗(trastuzumab))，免疫调节剂(例如利妥昔单抗、阿仑珠单抗和阿地白介素)，蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、PR-171和NPI-052)，整联蛋白抑制剂(例如那他珠单抗、伏洛昔单抗、etaracizumab和西仑吉肽)，前凋亡试剂(例如马帕木单抗、来沙木单抗、AMG951、ABT-737、奥利美生和普利肽新)和具有其他作用机制的试剂(例如伊马替尼、达沙替尼、来那度胺、沙立度胺、阿地白介素和干扰素-α)。

在有些实施方案中，本文描述的抗-TweakR抗体可以与常规化学治疗剂相组合地使用。常规化学治疗剂包括但不限于烷化剂(例如奥沙利铂、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺、乌拉莫司汀、苯丁酸氮芥、氮芥、塞替派、白消安、替莫唑胺和达卡巴嗪，抗代谢物(吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷-C(Ara-C)、卡培他滨、5FU(5-氟尿嘧啶)、硫唑嘌呤、巯嘌呤(6-MP)、6-硫鸟嘌呤、氨基蝶呤、培美曲塞和甲基蝶呤)，植物生物碱和萜类化合物(例如多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、蛋白质结合紫杉醇(protein-bound paclitaxel)、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、VP-16、替尼泊苷、伊立替康、和托泊替康)，和抗肿瘤抗生素(例如更生霉素、多柔比星、脂质体多柔比星(liposomaldoxorubicin)、柔红霉素、道诺霉素、表柔比星、米托蒽醌、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素C、洋红霉素、埃斯培拉霉素(esperamicins))。

在有些实施方案中，本文描述的抗-TweakR抗体可以与激素治疗剂(例如阿那曲唑、来曲唑、戈舍瑞林和他莫昔芬)相组合地使用。

因此，本文描述的抗-TweakR抗体可以以单一疗法或与其他治疗剂相组合地使用。在有些实施方案中，本文描述的抗-TweakR抗体作为单一疗法试剂或作为用于治疗已变得对于抗-EGFR抗体抵抗的癌症患者的组合治疗方案的一部分试剂是有用的。据推测对于抗-EGFR抗体抵抗与导致EGFR-介导的信号的组成性激活的突变相关(参见例如，Jhawer，等人，2008，Cancer Res.，68(6)：1953-1961)。几个最近的研究已显示K-Ras突变状态和西妥昔他单抗应答之间的关联，其中K-Ras的肿瘤野生型显示对于该试剂的提高的应答(Lievre，等人，2008，J.Clin.Oncology，26(3)：374-379)。发现具有激活性PIK3CA突变或PTEN表达的丢失的结直肠癌细胞系对西妥昔单抗比对PIK3CA野生型/PTEN表达细胞系更为抵抗(Jhawer，等人，2008，Cancer Res.，68(6)：1953-1961)。激活RAS/RAF信号途径的突变已显示在直肠癌患者中是预测和预后的指示物。(Benvenuti，等人，2007，CancerRes.，67(6)：2643-2648)。

许多用于测试抗-TweakR抗体疗效的异种移植模型携带BRAF、KRAS、PTEN和PIK3CA突变，所述模型包括NW231(乳腺癌)、HT29(结直肠腺癌)、A375(黑色素瘤)、Calu6(间变性肺癌)、A549(肺癌)、786-0(肾透明细胞癌)和HCT116(结直肠腺癌)。在这些模型中的一些，例如NW231、HT29和A375中，抗-TweakR抗体PDL192对减缓和/或抑制肿瘤的生长是有效的(参见表2)，从而暗示抗-TweakR抗体可以用于治疗对EGFR抑制剂(例如抗-EGFR抗体)不应答或变得抵抗的癌症患者。

在HT29异种移植模型中，PDL192显示在HT29中提高西妥昔单抗/伊立替康组合的抗肿瘤活性(参见例如，图18D)。这些结果提供了将抗-TweakR抗体与靶向不同途径的试剂相组合的原理，所述靶向不同途径的试剂作为用于治疗对EGFR抑制剂(例如抗-EGFR抗体)不应答或变得抵抗的患者的治疗方案的一部分。

因此，在有些实施方案中，抗-TweakR抗体施用于对用抗-表皮生长因子受体(EGFR)抗体(例如西妥昔单抗和帕尼单抗)的治疗不应答或变得抵抗的癌症患者。抗-TweakR抗体可以单独或与其他治疗剂，包括但不限于常规化学治疗剂和激素治疗剂相组合地施用。

在有些实施方案中，如在Benvenuti，等人2007，Cancer Res.，67(6)：2643-2648中描述的那样，就BRAF、KRAS、PTEN和PIK3CA突变筛选对于抗-EGFR抗体抵抗或不应答的癌症患者。鉴别在一个或多个这些基因中具有突变的患者，并用抗-TweakR抗体单独或与包括但不限于靶向试剂、常规化学治疗剂和激素治疗剂的其他治疗剂相组合地进行治疗。

可以与施用抗-TweakR抗体同时地、在施用抗-TweakR抗体之前或之后施用一种或多种上述治疗剂。所述试剂可以分开地或组合成“鸡尾酒”并作为单一组合物一起施用。所述组合物可以通过本领域已知的任何方法来施用。

可以与抗-TweakR抗体相组合使用的其他有用的治疗，包括放射疗法。

可以将抗-TweakR抗体配制成以治疗有效量施用于受试者的药学组合物。如本文所用的，“治疗有效量”是指足够治疗、减轻、缓解或至少阻止癌症和/或其症状，和/或并发症的药学制剂或组合物的量。确定抗-TweakR抗体治疗有效量的临床方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以使用常规实验凭经验来确定。例如，在癌症治疗的情况下，“治疗有效量”是能够引起一种或多种下列效应的量：(1)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全的生长阻滞；(2)减少肿瘤细胞的数目；(3)缩减肿瘤大小；(4)抑制(即减少、减缓或完全阻止)癌细胞浸润入周围器官；(5)抑制(即减少、减缓或完全阻止)癌细胞转移；(6)增强抗癌免疫应答，其可以但不是必须导致肿瘤的消退和排斥；和/或(7)在某种程度上减轻与所述病症相关的一种或多种症状。

这些制剂中的抗体浓度从约0.1至100mg/ml广泛地变化，但经常在1至20mg/ml的范围中。为了治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于疾病的严重度和病程、患者的临床病史和反应、抗体的毒性和主治医生的谨慎。可以将抗体一次性或在一系列治疗中适当地施用给患者。合适的剂量和治疗方案可以使用本领域技术人员已知的常规技术，通过监测治疗的进展来建立。

通常，本文描述的组合物由静脉内以推注或通过在一段时间中连续输注施用给患者；或通过肌肉内、皮下、腹膜内或脑脊髓内途径。制备可直接施用的组合物的方法是本领域技术人员已知的或是显而易见的，并且详细描述于例如Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980)，其通过提及而合并入本文。

如本文所公开的，为药学用途而配制的组合物包含一种或多种本文描述的抗-TweakR抗体。任选地，所述组合物进一步包含载体。本文描述的药物组合物通常包含抗-TweakR抗体和药学载体，和通常，它们包含溶解于可接受的载体，优选地含水载体中的抗-TweakR抗体的溶液，或其“鸡尾酒”。可以使用各种含水载体，例如注射用水(WFI)，或用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等进行了缓冲的水，通常至pH 5.0至8.0，最经常6.0至7.0，和/或含有例如氯化钠、氯化钾等盐以使得成为等渗的。所述载体可以包含诸如人血清白蛋白、聚山梨酯80、糖或氨基酸以保护活性蛋白质。

对于上文建议的在诊断和研究应用中的使用，本文还提供了试剂盒。在诊断和研究应用中，此类试剂盒可以包含下列中的至少一种：分析试剂、缓冲液、TweakR特异性核酸或抗体、杂交探针和/或引物、反义多核苷酸、核酶、显性负性TweakR多肽或多核苷酸和/或TweakR相关序列的小分子抑制剂。

此外，所述试剂盒可以包括包含用于实施本发明的方法的指导(例如，实验方案)的指导性材料。指导性材料通常包含书写的或印刷的材料，但它们并不限于此类。本发明考虑了能够存储此类指导并将它们传达给最终用户的媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如磁盘、磁带、卡式磁带、芯片)，光学媒介(例如，CD ROM)，等等。此类媒介可以包括提供此类指导性材料的互联网点的地址。

因此，本文所公开的抗-TweakR抗体和抗原结合片段，和包含这些抗体和抗原结合片段的组合物和试剂盒可以用于治疗，和尤其是治疗用于本文描述的任何疾病。

7.实施例

实施例1：原发性肿瘤中的TweakR表达

使用基因表达谱以检测各种原发性实体瘤，包括肺癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌和头颈癌中的TweakR mRNA的表达。从各种癌和347份正常成人组织中分离mRNA并且与Eos Hu03，一种定制的包含约59,000套探针(代表46,000种基因、EST聚簇和预测的外显子)的Affymetrix基因芯片进行杂交。

在下列中检测到显著的TweakR表达：31/44例肺腺癌、27/56例肺鳞状细胞癌、37/47例胰腺肿瘤、14/23例头颈来源的肿瘤、48/66例卵巢癌、190/253例原发性和转移性结直肠癌、11/11例食管癌、16/35例黑色素瘤、15/20例肾癌、29/39例胃癌、25/43例子宫癌、7/14例子宫颈癌、8/26例肉瘤、23/93例膀胱癌和16/27例成胶质细胞瘤(数据未显示)。在乳腺癌中，来自45例患者的24/47例原发性肿瘤样品显示显著的TweakR表达，和脊柱的7/10例转移性肿瘤表达TweakR(数据未显示)。

在图6中，将胰腺癌、肺癌(腺癌和鳞状细胞癌)和肾癌中TweakR的cDNA阵列表达水平与正常机体组织的范围进行比较。将样品沿着X-轴展示，每个样品的高度反映TweakR的平均强度或表达水平。认为具有高于100处的水平虚线的表达水平的样品为TweakR表达阳性。

还使用用抗-TweakR抗体进行的免疫组织化学染色以检查来自肺腺癌、肺鳞状细胞癌和胰腺癌的TweakR表达。将冷冻保存的肿瘤样品与抗-TweakR抗体29.T10(5μg/ml)孵育。加入经辣根过氧化物酶-缀合的二抗，随后用二氨基联苯(DAB)进行显色。

免疫组织化学染色与基因芯片结果一致。使用TweakR抗体(29.T10、374.2和349.2)对肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺导管癌、结直肠腺癌、卵巢癌、胃腺癌、膀胱癌和头颈来源癌的癌的TweakR蛋白质进行检测。图7是使用抗体29.T10对实体瘤进行的TweakR蛋白质染色的典型实例。

实施例2：抗-TweakR抗体的产生和表征

抗-TweakR抗体的产生

单克隆抗体

用过表达人TweakR的小鼠3T12细胞腹膜内免疫Balb/c小鼠来产生单克隆抗体。收获脾脏，并将脾细胞与多发性骨髓瘤细胞系NSO融合。用氨基蝶呤来选择杂交瘤。将表达目的抗-TweakR抗体的杂交瘤进行数次亚克隆以分离单个克隆。

对19.2.1进行人源化以产生PDL192

基本上根据Queen，C.等人(Proc。Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989))的步骤进行19.2.1的人源化。首先，识别与19.2.1VH和VL氨基酸序列分别具有高同源性的人VH和VL区段。其次，将CDR序列连同对维持CDR结构而言重要的框架氨基酸移植入经选择的人框架序列。将所得的人源化单克隆抗体(PDL192)在小鼠骨髓瘤细胞系NS O中进行表达。

19.2.1可变区cDNA的克隆和测序

使用TRIzol试剂(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)从约5x10⁷个产生19.2.1的杂交瘤细胞中提取总RNA。使用SMARTRACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)根据供应商的说明方案来合成双链cDNA。使用SMART RACE cDNAAmplification Kit中提供的与小鼠γ和κ链C区分别退火的3′引物和通用的5′引物，通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增重链和轻链可变区的cDNAs。将VH和VL cDNAs亚克隆入pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)以用于序列确定。根据制造商的指导，通过具有荧光双脱氧链终止子(Applied Biosystems，Foster City，CA)的PCR循环测序反应来进行DNA测序测序。就每条重链和轻链可变区的多个质粒克隆进行测序。

PDL192V区的设计

如Queen，C.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989))所描述的那样进行抗体V区的人源化。首先，借助于计算机程序ABMOD和ENCAD构建19.2.1可变区的分子模型(Levitt，M.，J.Mol.Biol.168：595-620(1983))。其次，基于针对人抗体cDNA序列的同源性搜索，选择合适的人VH、VL和J区段以提供PDL192可变区的框架。

在其中计算机模型暗示与CDR明显接触的框架位置处，将来自19.2.1V区的氨基酸置换为原始的人框架氨基酸。这在重链的残基73、74、93和94处进行。对于轻链，在残基49处进行置换。注意此处所用的编号系统是Kabat的编号系统(Sequence s of Proteins ofImmunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。

PDL192VH和VL基因的构建

将编码每条PDL192VH和VL DNA的区段设计为包括信号肽、剪切供体信号和合适的限制性酶位点(用于随后的克隆入哺乳动物表达载体)的小外显子。通过扩展从33至43碱基的长范围的重叠的合成寡核苷酸和PCR扩增来构建19.2.1VH和VL小外显子(Stemmer等人，Gene 164：49-53(1995))。经PCR扩增的片段用Qiaquick PCRpurification kit(Qiagen)进行纯化，用合适的限制性酶消化，克隆入包含人IgG1和κ链恒定结构域的表达载体，并在小鼠NSO细胞中表达。

来自ITEM4的PDL400的人源化与对于PDL192的人源化描述的方法相似，除了基于计算机模型来选择不同的框架置换。

结合亲和力

使用人TweakR的细胞外结构域的可溶性形式以Biacore测定法来评估各种小鼠和人源化的抗-TweakR抗体的相对结合亲和性。简言之，首先将山羊抗-小鼠Fc抗体或山羊抗人Fc固定化在生物传感器表面，接着捕捉测试表面的抗体。随后，注射人TweakR的细胞外结构域的可溶性形式以测量与抗体的结合和从抗体的解离。各种小鼠抗体，包括19.2.1、136.1和18.3.3，和各种人源化抗体，包括PDL192和PDL400的相对结合亲和力显示于表1。

表1

抗-TweakR抗体	结合亲和力(KD)
		PDL192	5.5nM
19.2.1	7.12nM
		136.1	0.68nM
18.3.3	0.23nM
		PDL400	0.58nM

如表1中所显示的，PDL192的亲和力与鼠亲本抗体19.2.1的亲和力相似。因此，人源化方法没有显著地改变抗体结合亲和力。

激动剂/拮抗剂活性

TWEAK，TweakR的配体，激活多重信号途径，从而导致细胞上的多向性效应，包括增加细胞因子和趋化因子的表达，刺激血管发生和诱导癌细胞的凋亡。使用为测量抗-TweakR抗体对细胞生长、血管发生的刺激和细胞因子和趋化因子的表达而设计的几种体外测定法，就其产生归因于TWEAK的生物学活性的能力来评估抗-TweakR抗体。

在细胞生长测定法中，在100ng/ml TWEAK或10μg/ml同种型对照抗体或抗-TweakR抗体19.2.1存在下，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、冠状动脉平滑肌细胞、肺成纤维细胞或肝细胞孵育3天。使用alamar蓝来评估细胞生活力。与同种型处理的细胞相比，HUVEC生长被TWEAK或19.2.1所刺激(数据未显示)。在这些细胞上，TWEAK提高了生长2.4倍，而19.2.1刺激了1.6倍的生长的增加。无论TWEAK还是19.2.1对冠状动脉平滑肌细胞、主动脉平滑肌细胞、肺成纤维细胞或肝细胞都没有任何效应。

就其在体外促进内皮管的形成的能力来评估抗-TweakR抗体。在200ng/ml TWEAK、10μg/ml同种型抗体或10μg/ml 19.2.1存在下，将HUVEC细胞在纤维蛋白基质中进行孵育。6天后，定量所产生的管的长度。TWEAK和19.2.1都刺激了内皮管形成，其中TWEAK显示总管长度的约3.5倍增加，和19.2.1刺激2.5-倍增加(数据未显示)。

在许多癌细胞系和也在正常原代人细胞，包括内皮细胞、肝细胞、肺成纤维细胞和冠状动脉平滑肌细胞上测试抗-TweakR抗体刺激细胞因子和趋化因子表达的能力。将细胞在体外与100ng/ml TWEAK或与10μg/ml抗-TweakR抗体孵育24小时。24小时后，就多达15种不同的细胞因子和趋化因子的存在来评估上清液，使用商业的基于荧光珠粒的多重(

Upstate)测定法。

作为对TwEAK的应答，每种细胞类型释放独特的一群细胞因子/趋化因子。有些抗-TweakR抗体，例如19.2.1和PDL192，诱导与TWEAK相同亚群的细胞因子/趋化因子(例如IL-8、IL-6、GM-CSF、MCP-1、RANTES和IP-10)，但以低的浓度。TWEAK、19.2.1和PDL192不刺激IFNγ、TNFα、TNFβ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12或IL-13从所检查的细胞类型的释放(数据未显示)。

基于上述结果，使用通过抗-TweakR抗体的IL-8从A375黑色素细胞的释放作为选择的测定法以表征各种抗体以及前面鉴定的抗-TweakR抗体(包括ITEM1、ITEM2、ITEM3和ITEM4)的激动剂/拮抗剂的活性(Nakayama，等人，2003，Biochem Biophysical ResComm.，306：819-825)。图8描绘了通过ITEM1、ITEM2、ITEM3和ITEM4(均以10g/ml使用)以及各种同种型对照的IL-8释放。如在图8中举例说明的，所有I TEM抗体都具有激动剂活性，因为当与A375孵育时，它们诱导某些IL-8表达。此外，所有ITEM抗体都具有一些拮抗剂活性，因为当A375细胞与TWEAK配体(300ng/ml)加抗体孵育时，所释放的IL-8的量少于用TWEAK单独处理所观察到的。显示了具有纯的拮抗剂活性的试剂，TweakR细胞外结构域(TweakR-Fc)的一种可溶形式和一种中和性抗-TWEAK抗体，以便进行比较。

抗-TweakR抗体PDL192、18.3.3、136.1和PDL 400的代表性IL-8释放测定法显示于图8B、8C、8D和8E。如图8B-8E所显示的，激动剂/拮抗剂活性在本文描述的抗体中是不同的。例如，PDL192(图8B)和19.2.1(数据未显示)实际上不具有拮抗剂活性，即它们不阻断由TWEAK诱导的IL-8释放。PDL 400(图8E)和18.3.3(图8C)具有激动剂和拮抗剂活性。抗-TweakR抗体136.1(图8D)具有非常高的激动剂活性，其妨碍在该测定法中进行其拮抗剂活性的评估。

体外抗肿瘤活性

采用两种测定法来评估抗-TweakR抗体的体外抗增殖效应，锚固依赖性测定法(增殖测定法)和锚固非依赖性测定法(克隆形成测定法)。使用19.2.1在A375黑色素瘤细胞上进行的典型的抗增殖测定法显示于图9。总之，PDL192和19.2.1降低了15/40个TweakR表达细胞系的增殖和降低了9/33个TweakR表达癌细胞系的克隆形成潜力(数据未显示)。

通过胱天蛋白酶诱导凋亡来降低或抑制癌细胞生长的能力测试了抗-TweakR抗体PDL192、19.2.1和136.1。将经IFNγ处理的HT29的结肠癌细胞与三种抗体滴度进行孵育。在抗体处理的1-2天内，就胱天蛋白酶3/7的激活对细胞进行评估。如图10A-10B所显示的，PDL192和136.1能够通过在HT29中的胱天蛋白酶激活而诱导凋亡。19.2.1具有相似的效应(数据未显示)。在其他的癌细胞系中，凋亡看来不是抗-TweakR抗体抑制增殖的机制；在这些细胞系中，推测抗体通过在较长期7-10天生长测定法中引起增殖减少的代替机制来介导活性(数据未显示)。

实施例3：抗-TweakR抗体的体内肿瘤活性

在产生自许多癌细胞系的异种移植模型中进行用抗-TweakR抗体的体内治疗。如表2所显示的，抗-TweakR抗体在降低和/或抑制许多不同的癌的生长中是有效的。

表2.异种移植模型中抗肿瘤活性的总结

¹通过将对照动物的平均肿瘤体积与经处理的动物进行比较来计算抑制百分比，使用在处死对照动物组的当天(当大部分肿瘤在可允许的限度时)进行的测量。

²nt：未检测。

³NS：在抗-TweakR抗体和同种型对照处理组之间没有显著差异。

用SN12C肾癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物服用PDL192、PDL400或19.2.1，或同种型对照抗体10mg/kg每周3次共3周。还使用剂量范围寻找研究以确定在SN12C模型中用PDL192的有效剂量水平的范围。在该模型中，用10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的PDL192或10mg/kg的对照抗体给动物服药3周，每周3次。

在SN12C肾癌异种移植模型中PDL192造成肿瘤消退。用PDL400和19.2.1观察到相似的结果(数据未显示)。在图11所显示的剂量范围寻找研究中，用低至1mg/kg剂量的PDL192观察到肿瘤消退。在较低的0.3mg/kg，未获得退行，但观察到PDL192的显著的抗肿瘤活性。

用A253唾液腺癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用19.2.1、PDL192、18.3.3，和PDL400，或同种型对照抗体10mg/kg每周3次共3周。还使用19.2.1的剂量范围寻找研究以确定在A253头颈癌中显示生物学活性的循环抗体的最小浓度(最小有效血清浓度)。用A253唾液腺癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠，当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的19.2.1，或10mg/kg的同种型对照抗体3周，每周3次。

如图12中所显示的，在10mg/kg剂量水平，用19.2.1在A253头颈癌模型中观察到显著的抗肿瘤活性。用PDL192、18.3.3和PDL400获得相似的结果(数据未显示)。在描述于图12的剂量范围寻找研究中，在5mg/kg，取得用19.2.1在A253头颈癌模型中的最大抗肿瘤活性，和在0.5mg/kg观察到最小活性。在独立的研究中，在这些相同的剂量水平上评估19.2.1的血清浓度。观察到最大抗肿瘤活性时的5mg/kg剂量水平与20-120μg/ml的循环抗体的浓度相关联。在0.5mg/kg剂量水平上观察到的最小生物学活性，与1-7μg/ml的抗体浓度相关联(数据未显示)。该剂量范围表征了抗-TweakR抗体的潜在的治疗窗。

用A253唾液腺癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用5mg/kg的19.2.1，或10mg/kg的同种型对照抗体每周3次共3周(9剂)或每周3次共7周(22剂)(仅19.2.1)。

在头颈癌A253异种移植模型中，19.2.1显著地抑制了肿瘤生长。在以5mg/kg接受3周9剂或以5mg/kg接受7周22剂的小鼠中评估19.2.1的效力(图13)。对于两个剂量组，在给药期间和完成给药后约3周，都显著地抑制了肿瘤生长(图13)。该结果暗示抗肿瘤活性维持到循环抗体的浓度下落至有效性所需的最小水平以下。

用HT1376尿道膀胱癌细胞接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用PDL192、19.2.1和PDL400，或同种型对照抗体10mg/kg每周3次共7剂。

在HT1376尿道膀胱异种移植模型中，适度地抑制了肿瘤生长。图14描述在用PDL192进行治疗后肿瘤生长的减少。使用19.2.1和PDL400获得相似的结果(数据未显示)。

用A375黑色素瘤细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用PDL192、19.2.1和18.3.3或同种型对照抗体10mg/kg每周3次共3周。还使用剂量范围寻找研究以确定在A375模型中用PDL192的有效剂量水平的范围。在该研究中，给动物施用10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg 0.3mg/kg或0.1mg/kg的PDL192，或10mg/kg的同种型对照抗体，每周3次(3qw)共3周。

在3qw的A375黑色素瘤异种移植模型中，用10mg/kg的PDL192，显著地抑制肿瘤生长(图15)。用19.2.1和18.3.3获得了相似的结果(数据未显示)。图15描述在剂量范围寻找研究中用PDL192治疗后肿瘤生长的减少，其中在所有剂量水平，甚至在低至0.1mg/kg时，观察到显著的抗肿瘤活性。

在A375异种移植模型中进行了独立的剂量范围寻找研究以将PDL192的最小和最佳生物学活性与循环抗体浓度相关联。用A 375黑色素瘤细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物每三天(q3d)腹膜内施用5mg/kg、1mg/kg、0.6mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg的PDL192，或5mg/kg的同种型对照抗体，总共8剂。在贯穿研究的不同时间，给动物放血以测量血清中的PDL192浓度。

在q3d的A375剂量寻找研究中，PDL192在1mg/kg和5mg/kg剂量水平显示最佳的抗肿瘤活性(数据未显示)，其时PDL192的血清谷浓度是2.4和62μg/ml和血清峰浓度是5.9和86μg/ml。在0.1、0.3和0.6mg/kg剂量水平观察到最小至中等的抗肿瘤活性(数据未显示)，其时PDL192的血清谷浓度分别是0.97ng/ml、4.1ng/ml和27ng/ml，和血清峰浓度分别是0.087、1.4，和3μg/ml。该剂量范围表征了抗-TweakR抗体的潜在的治疗窗。

用CSOC卵巢癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用PDL192，或同种型对照抗体10mg/kg每周3次共3周。

在CSOC卵巢癌异种移植模型中，PDL192强烈地抑制肿瘤生长。图16描述在用PDL192进行治疗后肿瘤生长的减少。

用Panc1胰腺癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用10mg/kg的PDL192，或10mg/kg的同种型对照抗体，或10mg/kg的PDL192和60mg/kg的吉西他滨，或10mg/kg的同种型对照抗体和60mg/kg的吉西他滨。动物接受3周每周3次的抗体剂量和/或5剂每周2次的吉西他滨。

在Panc1异种移植模型中，PDL192显著地抑制肿瘤生长。PDL192和吉西他滨的组合导致100％的肿瘤消退。图17描述用PDL192±吉西他滨进行治疗后肿瘤生长的减少。

用HT29结直肠癌细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用10mg/kg或0.5mg/kg的PDL192、10mg/kg的同种型对照抗体、10mg/的西妥昔单抗、25mg/kg的伊立替康和10mg/kg的同种型对照抗体、25mg/kg的伊立替康和10mg/kg的西妥昔单抗、25mg/kg的伊立替康和0.5mg/kg的PDL192、0.5mg/kg的PDL192和10mg/kg的西妥昔单抗，或0.5mg/kg PDL192和10mg/kg的西妥昔单抗和25mg/kg的伊立替康。动物接受3周每周3次的抗体剂量和/或3周每周2次的伊立替康。

在HT29异种移植模型中，10mg/kg剂量水平的PDL192强烈地抑制肿瘤生长。图18A描述10mg/kg的PDL192的肿瘤抑制。在0.5mg/kg的较低剂量，PDL192单独不抑制肿瘤生长，但是显著地增加了伊立替康的抗肿瘤活性。图18B描述用PDL192±伊立替康进行治疗后肿瘤生长的减少。

HT29结直肠癌细胞是B-raf的突变型。与HT29模型中10mg/kgPDL192的有力的抗肿瘤活性明显不同，10mg/kg的西妥昔单抗不显示肿瘤生长的抑制。然而，将10mg/kg的西妥昔单抗与0.5mg/kg的低剂量PDL192相组合导致统计学上显著的肿瘤生长抑制。图18C描述HT29异种移植模型中西妥昔单独抗肿瘤活性的缺乏和西妥昔单抗/PDL192组合的肿瘤生长抑制。

在HT29异种移植模型中，西妥昔单抗和伊立替康的组合治疗导致显著的肿瘤生长抑制。在0.5mg/kg的低剂量，PDL192单独不抑制肿瘤生长，但它增加西妥昔单抗/伊立替康组合的抗肿瘤活性。图18D描述西妥昔单抗/伊立替康±PDL192治疗后肿瘤生长的减少。

用MDA-MB-231乳腺癌细胞系的变体在乳腺脂肪垫中原位接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用PDL192或19.2.1，或10mg/kg的同种型对照抗体3周，每周3次。在该模型中还使用剂量范围寻找研究以确定用PDL192的有效剂量水平。在该研究中，给动物施用10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg的PDL192，或10mg/kg的同种型对照抗体3周，每周3次。

在MDA-MB-231变体模型中，PDL192显著地抑制了原发性肿瘤生长。图19A描述用PDL192治疗后原发性肿瘤大小的减少。用19.2.1获得了相似的结果(数据未显示)。MDA-MB-231变体模型在荷瘤小鼠的肺中显示转移性生长。肺转移的定量揭示PDL192显著地减少被治疗小鼠中肺转移的建立和生长。图19B描述肺转移的抑制。转移性生长比原发性肿瘤对PDL192治疗更为敏感。

实施例4：体外ADCC活性

抗-TweakR抗体的体内抗肿瘤活性可能部分地归因于所述抗体通过抗体分子的Fc部分刺激抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)的能力。为了确定ADCC是否参与抗-TweakR抗体(包括PDL192、19.2.1、PDL400、136.1和18.3.3)的抗肿瘤活性，将所述抗体与下列进行体外孵育：1)TweakR转染细胞，在健康的人外周血单核细胞(PBMCs)存在下，2)癌细胞系，在PBMCs存在下，3)TweakR转染细胞，在小鼠脾细胞存在下，或4)癌细胞系，在小鼠脾细胞存在下。

将TweakR转染细胞系用⁵¹Cr进行标记并在PDL192、19.2.1、PDL400和18.3.3滴度，或同种型对照抗体滴度存在下以50∶1比例的效应子细胞：靶细胞与人PBMCs进行孵育。所有四种抗体都观察到在与人PBMCs一起的TweakR转染细胞上的ADCC活性。图20A描述使用PDL192的典型实验。用其他三种抗体获得了相似的结果(结果未显示)。

用⁵¹Cr标记SN12C肾癌细胞并在PDL192和PDL400滴度，或同种型对照抗体滴度存在下以50∶1比例的效应子效应：靶细胞与人PBMCs孵育。这两种抗体都观察到针对与人PBMCs一起的SN12C细胞的ADCC活性。图20B描述使用PDL192的典型实验。用PDL400获得了相似的结果(结果未显示)。

用⁵¹Cr标记TweakR转染细胞系并在PDL192、19.2.1、PDL400、136.1和18.3.3滴度，或同种型对照抗体滴度存在下以50∶1比例的效应子效应：靶细胞与小鼠脾细胞孵育。所有五种抗体都观察到针对与小鼠脾细胞一起的TweakR转染细胞的ADCC活性。图20C描述使用PDL192的典型实验。用其他四种抗体获得了相似的结果(结果未显示)。

实施例5：通过多重机制作用的体内抗肿瘤活性

将19.2.1的Fc部分从鼠IgG2a变成了鼠IgG1，产生19.2.1xG1。在体外测试中，19.2.1和19.2.1xG1显示对TweakR表达细胞的相似的结合，并且这两种抗体都以剂量依赖的方式杀死HT29结肠癌细胞。然而，19.2.1有力地诱导TweakR转染细胞上的ADCC，而19.2.1xG1显示弱的ADCC活性。

用SN12C肾癌细胞或A375黑色素瘤细胞皮下接种严重联合免疫缺陷的(SCID)小鼠。当肿瘤达到约100mm³时，给动物腹膜内施用19.2.1、19.2.1xG1，或小鼠I gG1同种型对照抗体10mg/kg每周3次共3周。

在SN12C肾癌异种移植模型中，19.2.1治疗导致完全的肿瘤消退。相反，19.2.1xG1显示最小的抗肿瘤活性(图20A)。在A 375黑色素瘤异种移植模型中，19.2.1的这两种同种型显示同等有力的抗肿瘤活性(图21B)。

本申请所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献通过提及以其整体而合并入本文以用于所有目的，在相同的程度上，正如每个单个的出版物、专利、专利申请和其他文献单独被指示通过提及而合并以用于所有目的。

在举例说明和描述各种具体的实施方案时，将会意识到可以进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。

序列表

<110>PDL BioPharma，Inc.

 

<120>抗-TWEAK受体抗体的治疗用途

 

<130>214 US UT01

 

<160>133

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>1043

<212>DNA

<213>智人

 

<400>1

tcgacccacg cgtccgccca cgcgtccgcc cacgcgtccg ggcgcaggac gtgcactatg     60

gctcggggct cgctgcgccg gttgctgcgg ctcctcgtgc tggggctctg gctggcgttg    120

ctgcgctccg tggccgggga gcaagcgcca ggcaccgccc cctgctcccg cggcagctcc    180

tggagcgcgg acctggacaa gtgcatggac tgcgcgtctt gcagggcgcg accgcacagc    240

gacttctgcc tgggctgcgc tgcagcacct cctgccccct tccggctgct ttggcccatc    300

cttgggggcg ctctgagcct gaccttcgtg ctggggctgc tttctggctt tttggtctgg    360

agacgatgcc gcaggagaga gaagttcacc acccccatag aggagaccgg cggagagggc    420

tgcccagctg tggcgctgat ccagtgacaa tgtgccccct gccagccggg gctcgcccac    480

tcatcattca ttcatccatt ctagagccag tctctgcctc ccagacgcgg cgggagccaa    540

gctcctccac cacaaggggg gtggggggcg gtgaatcacc tctgaggcct gggcccaggg    600

ttcaggggaa ccttccaagg tgtctggttg ccctgcctct ggctccagaa cagaaaggga    660

gcctcacgct ggctcacaca aaacagctga cactgactaa ggaactgcag catttgcaca    720

ggggaggggg gtgccctcct tcctagaggc cctgggggcc aggctgactt ggggggcaga    780

cttgacacta ggccccactc actcagatgt cctgaaattc caccacgggg gtcaccctgg    840

ggggttaggg acctattttt aacactaggg ggctggccca ctaggagggc tggccctaag    900

atacagaccc ccccaactcc ccaaagcggg gaggagatat ttattttggg gagagtttgg    960

aggggaggga gaatttatta ataaaagaat ctttaacttt aaaaaaaaaa aaaaaaaagg   1020

gcggccgctc tagaggatcc ctc                                           1043

 

<210>2

<211>129

<212>PRT

<213>智人

 

<400>2

 

Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly

1               5                   10                  15

Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly

            20                  25                  30

Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys

        35                  40                  45

Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys

    50                  55                  60

Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro

65                  70                  75                  80

Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser

                85                  90                  95

Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr

            100                 105                 110

Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile

        115                 120                 125

Gln

 

<210>3

<211>119

<212>PRT

<213>智人

 

<400>3

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>智人

 

<400>4

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65                  70                  75                  80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

                85                  90                  95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 1l0

 

<210>5

<211>119

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>5

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>6

<211>111

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>6

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

                85                  90                  95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

 

<210>7

<211>119

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>7

 

Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr Lys Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ser

65                  70                  75                  80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                  110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>8

<211>112

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>8

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Thr Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

                85                  90                  95

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105                 110

 

<210>9

<211>119

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>9

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu

        35                  40                  45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asn Thr Gly Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Thr Gly Gly Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

        115

 

<210>10

<211>112

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>10

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

            20                  25                  30

Ser Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro

        35                  40                  45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

    50                  55                  60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65                  70                  75                  80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

                85                  90                  95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105                 110

 

<210>11

<211>120

<212>PRT

<213>智人

 

<400>11

 

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe

            20                  25                  30

Ile Ile Ala Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Arg Thr Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

 

<210>12

<211>112

<212>PRT

<213>智人

 

<400>12

 

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Asn

                85                  90                  95

Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

 

<210>13

<211>5

<212>PRT

<213>智人

 

<400>13

 

Ser Tyr Trp Met Ser

1               5

 

<210>14

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>14

 

Ser Tyr Trp Met Ser

1               5

 

<210>15

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>15

 

Asn Tyr Trp Met Ser

1               5

 

<210>16

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>16

 

Lys Tyr Trp Met Asn

1               5

 

<210>17

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>17

 

Arg Tyr Trp Met Ser

1               5

 

<210>18

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>18

 

Asn Tyr Trp Met Asn

1               5

<210>19

<211>19

<212>PRT

<213>智人

 

<400>19

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Gly

 

<210>20

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>20

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Gly

 

<210>21

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>21

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Gly

 

<210>22

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>22

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Ala Lys Gly

 

<210>23

<211>20

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>23

 

Glu Ile Arg Val Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Thr His Tyr Ala Glu

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Gly

            20

<210>24

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>24

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Lys Gly

 

<210>25

<211>8

<212>PRT

<213>智人

 

<400>25

 

Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr

1               5

 

<210>26

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>26

 

Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr

1               5

 

<210>27

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>27

 

Gly Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr

1               5

 

<210>28

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>28

 

Thr Tyr Ala Asp Thr Met Asp Tyr

1               5

 

<210>29

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>29

 

Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr

1               5

 

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>30

 

Ala Tyr Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr

1               5

 

<210>31

<211>30

<212>PRT

<213>智人

 

<400>31

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>32

<211>30

<212>PRT

<213>智人

 

<400>32

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>33

<211>30

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>33

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>34

<211>30

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>34

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

            20                  25                  30

 

<210>35

<211>30

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>35

 

Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5               10              15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr

            20                  25                  30

 

<210>36

<211>30

<212>PRT

<213>智人

 

<400>36

 

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr

            20                  25                  30

 

<210>37

<211>30

<212>PRT

<213>智人

 

<400>37

 

Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>38

<211>30

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>38

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Leu Thr Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>39

<211>30

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>39

 

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser

            20                  25                  30

 

<210>40

<211>14

<212>PRT

<213>智人

 

<400>40

 

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

<210>41

<211>14

<212>PRT

<213>智人

 

<400>41

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

 

<210>42

<211>14

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>42

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

 

<210>43

<211>14

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>43

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala

1               5                   10

 

<210>44

<211>14

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>44

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

 

<210>45

<211>14

<212>PRT

<213>智人

 

<400>45

 

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

 

<210>46

<211>14

<212>PRT

<213>智人

 

<400>46

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1               5                   10

 

<210>47

<211>14

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>47

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

<210>48

<211>14

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>48

 

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1               5                   10

 

<210>49

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>49

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gly

            20                  25                  30

 

<210>50

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>50

 

Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Arg Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

            20                  25                  30

 

<210>51

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>51

 

Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly

            20                  25                  30

 

<210>52

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>52

 

Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asn Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly

            20                  25                  30

 

<210>53

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>53

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ser Val Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser Pro

            20                  25                  30

 

<210>54

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>54

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Pro

            20                  25                  30

 

<210>55

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>55

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ser Ser Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr AIa Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

            20                  25                  30

 

<210>56

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>56

 

Lys Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg Leu Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ile Gly

            20                  25                  30

 

<210>57

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>57

 

Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg

            20                  25                  30

 

<210>58

<211>11

<212>PRT

<213>智人

<400>58

 

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>59

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>59

 

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>60

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>60

 

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>61

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>61

 

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>62

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>62

 

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>63

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>63

 

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>64

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>64

 

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>65

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>65

 

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>66

<211>15

<212>PRT

<213>智人

 

<400>66

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His

1               5                   10                  15

 

<210>67

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>67

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His

1               5                   10                  15

 

<210>68

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>68

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met Gln

1               5                   10                  15

 

<210>69

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>69

 

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Ser Tyr Met Gln

1               5                   10                  15

 

<210>70

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>70

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His

1               5                   10                  15

 

<210>71

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>71

 

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Ser Tyr Met His

1               5                   10                  15

 

<210>72

<211>7

<212>PRT

<213>智人

 

<400>72

 

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1               5

 

<210>73

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>73

 

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1               5

 

<210>74

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>74

 

Tyr Ala Thr Asn Leu Asp Ser

1               5

 

<210>75

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>75

 

Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser

1               5

 

<210>76

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>76

 

Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser

1               5

 

<210>77

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>77

 

Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1               5

 

<210>78

<211>9

<212>PRT

<213>智人

 

<400>78

 

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>79

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>79

 

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>80

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>80

 

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>81

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>81

 

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>82

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>82

 

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Trp Thr

1               5

 

<210>83

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>83

 

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>84

<211>23

<212>PRT

<213>智人

 

<400>84

 

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

            20

 

<210>85

<211>23

<212>PRT

<213>智人

 

<400>85

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>86

<211>23

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>86

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>87

<211>23

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>87

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>88

<211>23

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>88

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>89

<211>23

<212>PRT

<213>智人

 

<400>89

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

            20

 

<210>90

<211>23

<212>PRT

<213>智人

 

<400>90

 

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>91

<211>23

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>91

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>92

<211>23

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>92

 

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

            20

 

<210>93

<211>15

<212>PRT

<213>智人

 

<400>93

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>94

<211>15

<212>PRT

<213>智人

 

<400>94

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1               5                   10                  15

 

<210>95

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>95

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>96

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>96

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>97

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>97

 

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>98

<211>15

<212>PRT

<213>智人

 

<400>98

 

Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>99

<211>15

<212>PRT

<213>智人

 

<400>99

 

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1               5                   10                  15

 

<210>100

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>100

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>101

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>101

 

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ile Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>102

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>102

 

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>103

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>103

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>104

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>104

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>105

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>105

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>106

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>106

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>107

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>107

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>108

<211>32

<212>PRT

<213>智人

 

<400>108

 

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Gln Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>109

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>109

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1           5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

        20                  25                  30

 

<210>110

<211>32

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>110

 

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>111

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>111

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>112

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>112

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>113

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>113

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>114

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>114

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>115

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>115

 

Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>116

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>116

 

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>117

<211>11

<212>PRT

<213>智人

 

<400>117

 

Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>118

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>118

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>119

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<400>119

 

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

 

<210>120

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>120

 

Xaa Tyr Trp Met Xaa

1               5

 

<210>121

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>121

 

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Xaa Lys Gly

 

<210>122

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(6)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>122

 

Xaa Xaa Ala Asp Xaa Xaa Asp Tyr

1               5

 

<210>123

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(19)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>123

 

Glu Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Xaa Xaa Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Xaa Phe Xaa

            20                  25                  30

 

<210>124

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>124

 

Trp Val Arg Gln Xaa Pro Xaa Lys Gly Leu Glu Trp Xaa Ala

1               5                   10

 

<210>125

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(13)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(27)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(31)..(32)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>125

 

Xaa Phe Thr Ile Ser Arg Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln

1               5                   10                  15

Met Asn Xaa Leu Arg Ala Glu Xaa Thr Xaa Xaa Tyr Tyr Cys Xaa Xaa

            20                  25                  30

 

<210>126

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(7)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>126

 

Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser

1               5                   10

 

<210>127

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>127

 

Xaa Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Xaa Tyr Ser Tyr Met Xaa

1               5                   10                  15

<210>128

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>128

 

Tyr Ala Xaa Xaa Leu Xaa Ser

1               5

 

<210>129

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>129

 

Gln His Ser Trp Glu Xaa Pro Tyr Thr

1               5

 

<210>130

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(4)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(13)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>130

 

Xaa Ile Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Xaa Xaa Ser Xaa Gly

1               5                   10                  15

Xaa Arg Xaa Thr Ile Xaa Cys

            20

 

<210>131

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(9)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>131

 

Trp Tyr Gln Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Lys

1               5                   10                  15

 

<210>132

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(24)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>132

 

Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Leu Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys

            20                  25                  30

 

<210>133

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(7)

<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

 

<400>133

 

Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg

1               5                   10

Claims (38)

1.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其特异地与SEQ IDNO：2位置56处的R结合并在表达SEQ ID NO：2的实体瘤中表现抗肿瘤活性。

2.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体是单克隆抗体。

3.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体是人源化抗体。

4.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：25共享至少85％同一性的氨基酸序列的VH区。

5.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或抗原结合片段，其包含含有与SEQ NO：66、SEQ NO：72和SEQ ID NO：78共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_L区。

6.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或抗原结合片段，其包含含有相应于SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：25的氨基酸序列的V_H区，和含有相应于SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：78的氨基酸序列的V_L区。

7.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：3的V_H区和含有SEQ ID NO：4的V_L区。

8.根据权利要求7的分离的抗体，其中所述重链恒定区是IgG1。

9.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQID NO：5共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_H区和含有与SEQ ID NO：6共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_L区。

10.根据权利要求1的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：5的V_H区和含有SEQ ID NO：6的V_L区。

11.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQID NO：7共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_H区和含有与SEQ ID NO：8共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_L区。

12.根据权利要求11的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：7的V_H区和含有SEQ ID NO：8的V_L区。

13.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQID NO：9共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_H区和含有与SEQ ID NO：10共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_L区。

14.根据权利要求13的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9的V_H区和含有SEQ ID NO：10的V_L区。

15.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQID NO：11共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_H区和含有与SEQ IDNO：12共享至少85％同一性的氨基酸序列的V_L区。

16.根据权利要求15的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：11的V_H区和含有SEQ ID NO：12的V_L区。

17.分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其选自：

a)由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N；

b)由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；

c)由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M；

d)由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q；

e)由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D；

f)由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L；

g)由包含式EVXaaLXaaESGGGLVQPGGSXaaXaaLSCXaaASGFXaaFXaa(SEQ ID NO 123)的氨基酸序列编码的重链FR1，其中位置3处的Xaa是Q或K，位置5处的Xaa是E、V或G，位置18处的Xaa是L或M，位置19处的Xaa是R或K，位置23处的Xaa是A或V，位置28处的Xaa是T或P，和位置30处的Xaa是S、N或T；

h)由包含式WVRQXaaPXaaKGLEWXaaA(SEQ ID NO 124)的氨基酸序列编码的重链FR2，其中位置5处的Xaa是A或S，位置7处的Xaa是E或G，位置13处的Xaa是V或L；

i)由包含式XaaFTISRDXaaXaaXaaXaaXaaXaaYLQMNXaaLRAEXaaTXaaXaaYYCXaaXaa(SEQ ID NO 125)的氨基酸序列编码的重链FR3，其中位置1处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是D或N，位置9处的Xaa是S或A，位置10处的Xaa是K或R，位置11处的Xaa是N或S，位置12处的Xaa是S、R或T，位置13处的Xaa是L或V，位置19处的Xaa是S或N，位置24处的Xaa是D或N，位置26处的Xaa是A或G，位置27处的Xaa是I或V，位置31处的Xaa是T、S或A，和位置32处的Xaa是G、P或R；

j)由包含式WGQGTXaaXaaTVSS(SEQ ID NO 126)的氨基酸序列编码的重链FR4，其中位置6处的Xaa是L、S或T和位置7处的Xaa是V或L；

k)由包含式XaaIXaaXaaTQSPXaaSLXaaXaaSXaaGXaaRXaaTIXaaC(SEQ ID NO 130)的氨基酸序列编码的轻链FR1，其中位置1处的Xaa是D或E，位置3处的Xaa是Q或V，位置4处的Xaa是M或L，位置9处的Xaa是G、S或A，位置12处的Xaa是S、A或T，位置13处的Xaa是A、L或V，位置15处的Xaa是P、V或L，位置17处的Xaa是D、E或Q，位置19处的Xaa是V或A，和位置22处的Xaa是T或S；

l)由包含式WYQQXaaPGXaaXaaPKLLIK(SEQ ID NO 131)的氨基酸序列编码的轻链FR2，其中位置5处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是K或Q，和位置9处的Xaa是A、P或S；

m)由包含式GXaaPXaaRFSGSGSGTDFTLXaaIXaaXaaXaaXaaXaaEDXaaAXaaYYC(SEQ ID NO 132)的氨基酸序列编码的轻链FR3，其中位置2处的Xaa是V或I，位置4处的Xaa是S、D或A，位置18处的Xaa是T或N，位置20处的Xaa是S或H，位置21处的Xaa是S、R或P，位置22处的Xaa是L或V，位置23处的Xaa是Q或E，位置24处的Xaa是P或E，位置27处的Xaa是F、T或A和位置29处的Xaa是T或V；

n)由包含式FGXaaGTXaaXaaEIKR(SEQ ID NO 133)的氨基酸序列编码的轻链FR4，其中位置3处的Xaa是G或Q，位置6处的Xaa是K或R，和位置7处的Xaa是V或L；和，

o)诸多序列，其中每个序列独立地选自序列a)-n)；

其中所述抗体与人TweakR结合。

18.根据权利要求17的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含：

由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N；

由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；和

由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M。

19.根据权利要求17的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含：

由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q；

由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D；和

由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L。

20.根据权利要求17的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含：

由包含式XaaYWMXaa(SEQ ID NO 120)的氨基酸序列编码的重链CDR1，其中位置1处的Xaa是S、N或K和位置5处的Xaa是S或N；

由包含式EIRLKSDNYATHYAESXaaKG(SEQ ID NO 121)的氨基酸序列编码的重链CDR2，其中位置17处的Xaa是A或V；

由包含式XaaXaaADXaaXaaDY(SEQ ID NO 122)的氨基酸序列编码的重链CDR3，其中位置1处的Xaa是G、T或Y，位置2处的Xaa是F或Y，位置5处的Xaa是A、T或Y，和位置6处的Xaa是F或M；

由包含式XaaASQSVSTSXaaYSYMXaa(SEQ ID NO 127)的氨基酸序列编码的轻链CDR1，其中位置1处的Xaa是R或K，位置10处的Xaa是S或T和位置15处的Xaa是H或Q；

由包含式YAXaaXaaLXaaS(SEQ ID NO 128)的氨基酸序列编码的轻链CDR2，其中位置3处的Xaa是S或T，位置4处的Xaa是N或K，位置6处的Xaa是E或D；和

由包含式QHSWEXaaPYT(SEQ ID NO 129)的氨基酸序列编码的轻链CDR3，其中位置6处的Xaa是I或L。

21.根据权利要求17的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含：

由包含式EVXaaLXaaESGGGLVQPGGSXaaXaaLSCXaaASGFXaaFXaa(SEQ ID NO 123)的氨基酸序列编码的重链FR1，其中位置3处的Xaa是Q或K，位置5处的Xaa是E、V或G，位置18处的Xaa是L或M，位置19处的Xaa是R或K，位置23处的Xaa是A或V，位置28处的Xaa是T或P，和位置30处的Xaa是S、N或T；

由包含式WVRQXaaPXaaKGLEWXaaA(SEQ ID NO 124)的氨基酸序列编码的重链FR2，其中位置5处的Xaa是A或S，位置7处的Xaa是E或G，位置13处的Xaa是V或L；

由包含式XaaFTISRDXaaXaaXaaXaaXaaXaaYLQMNXaaLRAEXaaTXaaXaaYYCXa aXaa(SEQ ID NO 125)的氨基酸序列编码的重链FR3，其中位置1处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是D或N，位置9处的Xaa是S或A，位置10处的Xaa是K或R，位置11处的Xaa是N或S，位置12处的Xaa是S、R或T，位置13处的Xaa是L或V，位置19处的Xaa是S或N，位置24处的Xaa是D或N，位置26处的Xaa是A或G，位置27处的Xaa是I或V，位置31处的Xaa是T、S或A，和位置32处的Xaa是G、P或R；

由包含式WGQGTXaaXaaTVSS(SEQ ID NO 126)的氨基酸序列编码的重链FR4，其中位置6处的Xaa是L、S或T和位置7处的Xaa是V或L。

22.根据权利要求17的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其包含：

由包含式XaaIXaaXaaTQSPXaaSLXaaXaaSXaaGXaaRXaaTIXaaC(SEQID NO 130)的氨基酸序列编码的轻链FR1，其中位置1处的Xaa是D或E，位置3处的Xaa是Q或V，位置4处的Xaa是M或L，位置9处的Xaa是G、S或A，位置12处的Xaa是S、A或T，位置13处的Xaa是A、L或V，位置15处的Xaa是P、V或L，位置17处的Xaa是D、E或Q，位置19处的Xaa是V或A，和位置22处的Xaa是T或S；

由包含式WYQQXaaPGXaaXaaPKLLIK(SEQ ID NO 131)的氨基酸序列编码的轻链FR2，其中位置5处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是K或Q，和位置9处的Xaa是A、P或S；

由包含式GXaaPXaaRFSGSGSGTDFTLXaaIXaaXaaXaaXaaXaaEDXaaAXaaYYC(SEQ ID NO 132)的氨基酸序列编码的轻链FR3，其中位置2处的Xaa是V或I，位置4处的Xaa是S、D或A，位置18处的Xaa是T或N，位置20处的Xaa是S或H，位置21处的Xaa是S、R或P，位置22处的Xaa是L或V，位置23处的Xaa是Q或E，位置24处的Xaa是P或E，位置27处的Xaa是F、T或A和位置29处的Xaa是T或V；和

由包含式FGXaaGTXaaXaaEIKR(SEQ ID NO 133)的氨基酸序列编码的轻链FR4，其中位置3处的Xaa是G或Q，位置6处的Xaa是K或R，和位置7处的Xaa是V或L。

23.根据权利要求21的分离的抗-TweakR抗体或其抗原结合片段，其进一步包含：

由包含式XaaIXaaXaaTQSPXaaSLXaaXaaSXaaGXaaRXaaTIXaaC(SEQID NO 130)的氨基酸序列编码的轻链FR1，其中位置1处的Xaa是D或E，位置3处的Xaa是Q或V，位置4处的Xaa是M或L，位置9处的Xaa是G、S或A，位置12处的Xaa是S、A或T，位置13处的Xaa是A、L或V，位置15处的Xaa是P、V或L，位置17处的Xaa是D、E或Q，位置19处的Xaa是V或A，和位置22处的Xaa是T或S；

由包含式WYQQXaaPGXaaXaaPKLLIK(SEQ ID NO 131)的氨基酸序列编码的轻链FR2，其中位置5处的Xaa是R或K，位置8处的Xaa是K或Q，和位置9处的Xaa是A、P或S；

由包含式GXaaPXaaRFSGSGSGTDFTLXaaIXaaXaaXaaXaaXaaEDXaaAXaaYYC(SEQ ID NO 132)的氨基酸序列编码的轻链FR3，其中位置2处的Xaa是V或I，位置4处的Xaa是S、D或A，位置18处的Xaa是T或N，位置20处的Xaa是S或H，位置21处的Xaa是S、R或P，位置22处的Xaa是L或V，位置23处的Xaa是Q或E，位置24处的Xaa是P或E，位置27处的Xaa是F、T或A和位置29处的Xaa是T或V；和

由包含式FGXaaGTXaaXaaEIKR(SEQ ID NO 133)的氨基酸序列编码的轻链FR4，其中位置3处的Xaa是G或Q，位置6处的Xaa是K或R，和位置7处的Xaa是V或L。

24.根据权利要求1的包含抗体或抗原结合片段的缀合化合物，其被连接至效应子部分和/或可检测的标记。

25.根据权利要求24的缀合化合物，其中所述抗体或抗原结合片段缀合至可检测的标记。

26.根据权利要求25的缀合化合物，其中所述可检测的标记是放射性化合物、荧光化合物和酶、底物或表位标签。

27.根据权利要求24的缀合化合物，其中所述效应子部分是细胞毒性试剂。

28.根据权利要求27的缀合化合物，其中所述细胞毒性试剂是毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素。

29.根据权利要求1的包含抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的药学组合物。

30.根据权利要求29的组合物，其中所述抗体是人源化抗体。

31.治疗受试者体内的实体瘤的方法，其包含给具有实体瘤的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1的抗体或抗原结合片段。

32.根据权利要求31的方法，其进一步包含选自靶向试剂、常规化学治疗剂和激素治疗剂的治疗剂。

33.根据权利要求31的方法，其中所述实体瘤选自膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食管癌、子宫癌、胃癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤和肉瘤。

34.根据权利要求33的方法，其中所述实体瘤是结直肠癌。

35.根据权利要求33的方法，其中所述实体瘤是胰腺癌。

36.根据权利要求33的方法，其中所述实体瘤是乳腺癌。

37.根据权利要求33的方法，其中所述受试者具有选自BRAF、KRAS、PTEN和PIK3CA的突变的肿瘤。

38.根据权利要求33的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

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