CN101993876A - miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途。根据本发明的改造的miRNA169d前体序列amiR169d，其核苷酸序列如SEQ No.2所示。本发明在amiR169d前体序列的颈部结构区域设计了两个特异的酶切位点，可方便的把人工设计的目的序列插入到本发明的载体中，导入植物细胞，可有效引起靶基因沉默。被转化的植物宿主既可以是拟南芥、烟草、大豆等双子叶植物，也可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物。

Description

miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途。

背景技术

RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默是一个非常有用和有效的调控基因表达的工具，在基因功能鉴定、植物抗病毒反应、作物品质改良以及农艺性状的改良等方面得到了广泛的应用。在RNAi方法中，目前通用的方法是把需要沉默的目的基因构建成反向重复序列，转录后就形成卡RNA(hpRNA)，随后被DCL酶加工成22nt的小RNA，特异性的沉默同源的靶基因。由于hpRNA可以产生多个～22nt的siRNA，其中的部分siRNA具有作用于其它的非靶基因的潜在能力，可能会影响其他一些无关基因的表达。

随着对miRNA研究的深入，人们发现可以利用miRNA产生的原理来特异性的沉默目的基因，其基本过程是首先获得野生型的miRNA前体(pre-miRNA)，然后根据目的基因序列选择出特异的大小约21nt的序列，即人工miRNA(amiRNA，artificial microRNA)，最后把pre-miRNA中的野生型的miRNA序列替换为目的序列。利用amiRNA人们可以特异高效的沉默目的基因，如miR159a前体、miR164b前体、miR319a前体等均已用来构建人工小RNA载体，但这些miRNA的前体较大，构建需要进行多次嵌套PCR，构建繁琐。

发明内容

基于此，我们对已有的miRNA及其前体进行了分析，发现miR169d特点是前体序列短(154bp)，二级一种结构中的环比较小，且在颈部可只需要改动5个碱基就可以产生2个特异的酶切位点，因此我们选择了miR169d进行amiRNA载体的构建。

因此，本发明的目的之一是提供一种改造的miR169d前体序列amiR169d。

本发明的再一目的是提供miR169d前体序列及其改造序列的用途。

本发明的再一目的是提供含miR169d前体序列及其改造序列的基因沉默载体。

本发明的再一目的是提供制备上述基因沉默载体的方法。

根据本发明改造的miR169d前体序列amiR169d，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，其中由碱基“n”组成的序列为任意人工设计的miRNA分子序列。所述片段是拟南芥miR169d前体序列(SEQ No.1，其中由碱基“n”组成的序列为miR169分子序列，可替换为人工设计的任意序列)经过改造而获得。

本发明提供了miR169d前体序列及其改造序列用于制备基因沉默载体的用途。

根据本发明的基因沉默载体含有miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列，其中，所述miR169d前体序列、或经改造的miR169d前体序列中的miR169d分子序列被特异性的人工miRNA分子取代，优选地，所述改造的miR169d前体序列具有SEQ No.2所示核苷酸序列。

根据本发明的基因沉默载体可以为载体pAmiR169d，所述载体通过上述具有SEQ No.2所示核苷酸序列的经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体pCAMBIA1303而获得。

根据本发明的制备基因沉默载体的方法包括将miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体的步骤。

本发明的基因沉默载体是一种能够在植物中特异沉默靶基因的人工miRNA载体。本发明的发明人首次成功地利用miR169d前体分子及其改造序列制备基因沉默载体，其在amiR169d前体序列的颈部结构区域设计了两个特异的酶切位点，可方便的把人工设计的目的序列插入到本发明的载体中，导入植物细胞，可有效引起靶基因沉默。被转化的植物宿主既可以是拟南芥、烟草、大豆等双子叶植物，也可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物。

附图说明

图1为miRNA前体的二级结构图，其中A为改造前的拟南芥miR169d的前体结构；B为改造后的miR169d前体结构；C为人工amiR-gfp的前体结构；

图2为改造的人工miRNA载体pAmiR169d和pAmiR-gfp的构建图；其中35S为花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)蛋白基因启动子；Nos为胭脂碱合成酶(Nos)基因中止子；GUS报告基因；LB和RB为T-DNA左右边界。

图3为pAmiR-gfp对靶基因的沉默效应分析，其中，A为GUS活性分析，B为GUS-GFP转录本的半定量RT-PCR，C为GUS-GFP转录本的实时定量PCR；

图4为AmiR-gfp对GUS-GFP转录本的切割位点分析，其中，A为5’RACE-PCR；B为amiR-gfp的剪切位点。

具体实施方式

实施例1、pCAMBIA-35SE载体的获得

利用HindIII/EcoRI从pBI121(Clontech)上切下来大约3000bp的35S-GUS-Nos片段，酶切片段经Qiagen的琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化后连入pCAMBIA1303(CAMBIA)的HindIII/EcoRI位点，形成中间载体pCAMBIA-35S。该质粒经EcoRI消化后，通过T4DNA聚合酶补平粘端再自连，从而去掉了质粒pCAMBIA-35S中的EcoR I位点，命名为pCAMBIA1303-35SE。

实施例2、人工miRNA载体pAmiR169d

拟南芥miR169d前体序列包含154nt，能够形成一个简单的颈环结构(图1A)，对其序列进行分析后，在不改变其二级结构特征的前提下，进行修饰改造。

人工设计合成了具有重叠互补序列的8条寡核苷酸片段，在中间分别突变2个和3个碱基，在miRNA的两端分别产生了EcoR I和Sal I酶切位点，但不改变ath-miR169d前体序列的二级结构(图1B)。8条寡核苷酸片段的序列如下：

oligo 1(5′-gatccGTATCATAGAGTCTTGCATGGA-3′)

oligo2(5′-AAAATTAAAGaattcATTGAGCCAAGGATGACTTGCCGATGTT-3′)

oligo3 5′-ATCAACAAATCTTAACTGATTTTGGTGTCCGGCAAGTTGACCTT-3′)

oligo4 5′-GGCTCTGTCGACTTCTTTTCTTTTCAATGTCAAACTCTAGATATgagct-3′)

oligo5(5′-cATATCTAGAGTTTGACATTGAA-3′)

oligo6 5′-AAGAAAAGAAgtcgacAGAGCCAAGGTCAACTTGCCGGACACCA-3′)

oligo7(5′-AAATCAGTTAAGGATTTGTTGATAACATCGGCAAGTCATCCTTGGC-3′)

oligo8(5′-TCAATCGAATTCTTTAATTTTTCCATGCAAGACTCTATGATACg-3′)

将8条人工合成的寡核苷酸片段经磷酸化和退火形成双链DNA，直接克隆到pCAMBIA1303-35SE的BamH I和Sac I位点，形成人工miRNA载体pAmiR169d。

实施例3、利用pAmiR169d载体沉默目的基因GUS-GFP

直接合成4条寡核苷酸片段，退火形成一段包含AmiR-gfp序列的双链DNA(如图1C)，末端设计为EcoR I和SalI酶切位点，具体序列如下：

oligo9(5′-aattcGATtTGTATTCCAaCTTGTGGCCGatgtTAT-3′)

oligo 10(5′-CAAcaAATCttAActGATTTTGGTGtccggccacaagatggaatacatGTcgac-3′)

oligo 11(5′-AAAATCagTTaaGATTtgTTGATAacatCGGCCACAAGtTGGAATACAaATCg-3′)

oligo 12(5′-tcgagtcgACatgtattccatcttgtggccggaCACC-3′)

将该退火产物直接插入经EcoR I和Sal I酶切的质粒pAmiR169d中，形成载体pAmiR-gfp，构建流程见图2。

实施例4、pAmiR-gfp沉默效果分析

将构建好的载体pAmiR-gfp和对照载体pCAMBIA1303转化农杆菌GV3101。利用农杆菌渗透法转化烟草N.benthamiana叶片，转化方法如下：取在24℃，16h光周期条件下生长到6-8片叶子的烟草植株，用0.5ml含有pAmiR-gfp的农杆菌浸润烟草叶片。同样，用0.5ml含有pCAMBIA1303的农杆菌浸润NC89叶片作为对照。继续24℃，16h光周期条件下培养48h。取样，液氮研磨，提取总蛋白，总蛋白含量按标准Bradford的方法测定。

由于GUS-GFP基因转录融合，GFP靶向序列可以同时沉默GFP和GUS基因，所以通过检测GUS活性可以反映沉默效率。GUS活性以MU纳摩尔数与总蛋白含量及时间的比值nmolMU·mg-1蛋白min-1表示。分析仪器为Hoefer DyNA Quant 200型荧光分光光度计，在激发波长为350nm、发射波长455nm下测定荧光值。烟草叶片中的GUS活性测定结果如图3A所示，结果表明经pAmiR-gfp浸润的烟草叶片的GUS活性显著低于对照，GUS活性降低了大约50％，说明所构建的人工miRNA载体pAmiR-GFP能够有效的沉默其靶基因。

实施例5、转化烟草叶片的GUS-GFP转录产物的PCR测定

提取烟草叶片RNA，按Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System kit进行总RNA的提取，然后取2μg总RNA用Invitrogen公司的SuperScript First-StrandSynthesis System进行反转录，以反转录产物为模板，扩增GUS-GFP的转录本。上游引物forward  5′-CGATGCGGTCACTCATTAC-3′；下游引物reverse5′-TTCACACGTGGTGGTGGTGGT-3′。反应条件为：94℃2分钟，94℃20秒，53℃40秒，72℃1.5分钟，35个循环；71℃10分钟，PCR产物为2600bp。以烟草的ACTIN1作为内参，根据GeneBank公布的actin1(AccessionNumber：AB158612)的序列设计引物NAcfw，5′-atgagcaagagttggagactg-3′(forward)and NAcrv，5′-CAATGGAAGGACCAGATTCAT-3′(reverse)进行PCR，反应条件为：94℃2分钟，94℃20秒，53℃40秒，72℃1分钟，25个循环；71℃10分钟，PCR产物为441bp。结果表明，经pAmiR-gfp浸润的烟草叶片中GUS-GFP的mRNA水平比对照显著降低(图3B)。

为了对GUS-GFP转录产物进行精确分析，本发明采用实时定量PCR的方法对其进行测定。引物：forward GFP FW 5′-CGACGGGAACTACAAGACAC-3′和reverseGFP RV5′-TTCACACGTGGTGGTGGTGGT-3′。PCR反应条件为：95℃1min，95℃15sec，55℃20s，72℃45s(45个循环)，72℃10min，PCR产物为440bp。以上述的烟草Actin1作为内参基因。实时PCR结果表明经pAmiR-gfp浸润的烟草叶片中GUS-GFP的mRNA水平比对照低30倍(图3C)。

实施例6、人工miRNA对靶基因的剪切位点分析

5′RACE即cDNA末端的快速扩增，可以鉴定RNA的5’末端序列，为了验证amiR-gfp对靶基因GUS-GFP的精确剪切位点，对GUS-GFP的mRNA进行了5′RACE分析。按GIBCO BRL Life Technologies公司的5’RACE System2.0版本的说明书进行5′RACE的操作。首先取2μg总RNA用GFP特异的引物(GFP RV：5′TTCACACGTGGTGGTGGTGGT-3′)进行反转录，纯化获得的cDNA，以除去过量的dNTPs和GFP RV引物，再用TdT处理(末端脱氧核苷酸转移酶)在3′末端添加多聚C尾。然后以加尾的cDNA为模板，用锚定引物T7-G(5’TAATACGACTCACTATAGGGGGGGGGG)和GFP RV进行PCR扩增，反应条件为：94℃2min，94℃20sec，65℃20sec，72℃45sec(30个循环)，72℃10min。利用T7引物(5’TAATACGACTCACTATAGGG)和GFP  RV2(5’GTGGTGGTGGTGGCTAGCTTT)进行巢式PCR，反应条件为：94℃2min，94℃20sec，55℃20sec，72℃45sec(30个循环)，72℃10min，然后用1％琼脂糖进行电泳，扩增结果如图4A所示，在经载体pAmiR-gfp渗透的样品中有一个320bp的条带，但是经空载体pCAMBIA1303渗透的样品中则没有扩增产物。利用Qiagen的纯化试剂盒纯化该320bp的DNA片段，与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取5个克隆进行序列分析。序列分析结果表明，5个克隆都有相同的5’末端核苷酸序列，该剪切位点与预期的剪切位点完全一致，表明本发明中的改造的pAmiR-169d载体在植物细胞中能够正确的加工，产生特异的人工miRNA，引起目的基因的沉默。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>miR169d前体序列改造及其在基因沉默中的用途

<160>14

<210>1

<211>154

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)

<400>1

gtatcataga gtcttgcatg gaaaaattaa agaatgagat nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    60

natgttatca acaaatctta actgattttg gtgtcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngttt    120

ccttcttttc ttttcaatgt caaactctag atat                                154

<210>2

<211>154

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)

<400>2

gtatcataga gtcttgcatg gaaaaattaa agaattcgat nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    60

natgttatca acaaatctta actgattttg gtgtcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngtcg    120

acttcttttc ttttcaatgt caaactctag atat                                154

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gatccgtatc atagagtctt gcatgga                                        27

<210>4

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aaaattaaag aattcattga gccaaggatg acttgccgat gtt                    43

<210>5

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atcaacaaat cttaactgat tttggtgtcc ggcaagttga cctt                   44

<210>6

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggctctgtcg acttcttttc ttttcaatgt caaactctag atatgagct              49

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

catatctaga gtttgacatt gaa                                          23

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aagaaaagaa gtcgacagag ccaaggtcaa cttgccggac acca                   44

<210>9

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aaatcagtta aggatttgtt gataacatcg gcaagtcatc cttggc                46

<210>10

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tcaatcgaat tctttaattt ttccatgcaa gactctatga tacg                  44

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aattcgattt gtattccaac ttgtggccga tgttat                           36

<210>12

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caacaaatct taactgattt tggtgtccgg ccacaagatg gaatacatgt cgac       54

<210>13

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aaaatcagtt aagatttgtt gataacatcg gccacaagtt ggaatacaaa tcg    53

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tcgagtcgac atgtattcca tcttgtggcc ggacacc                      37

Claims (7)

1.改造的miR169d前体序列amiR169d，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，其中，由碱基“n”组成的序列为任意的人工设计序列。

2.miR169d前体序列及其改造序列用于制备基因沉默载体的用途。

3.一种基因沉默载体，其特征在于，所述载体含有miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列，其中，所述miR169d前体序列、或经改造的miR169d前体序列中的miR169d分子序列被特异性的人工设计序列取代。

4.根据权利要求3所述的基因沉默载体，其特征在于，所述改造的miR169d前体序列为权利要求1所述序列。

5.一种基因沉默载体pAmiR169d，其特征在于，所述载体通过将权利要求1所述改造的miR169d前体序列克隆至表达载体pCAMBIA1303而获得。

6.一种制备基因沉默载体的方法，其特征在于，包括将miR169d前体序列，或经改造的miR169d前体序列克隆至表达载体的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述改造的miR169d前体序列为权利要求1所述序列。

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