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CN101970001A - Cripto结合分子 - Google Patents

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CN101970001A
CN101970001A CN2008801014818A CN200880101481A CN101970001A CN 101970001 A CN101970001 A CN 101970001A CN 2008801014818 A CN2008801014818 A CN 2008801014818A CN 200880101481 A CN200880101481 A CN 200880101481A CN 101970001 A CN101970001 A CN 101970001A
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antibody
binding molecule
cripto
present
molecule
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CN2008801014818A
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米歇尔·萨尼科拉纳德尔
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Biogen MA Inc
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Biogen Idec MA Inc
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Abstract

本发明涉及抗CRIPTO抗体的人源化形式及其部分，以及其单独或联合其它药剂治疗病症诸如癌症的应用。

Description

CRIPTO结合分子
相关申请
本申请要求2007年6月1日提交的名为“Cripto Binding Molecules(Cripto结合分子)”的USSN 60/932,879的优先权。本申请与2006年1月5日提交的名为“Cripto Binding Molecules(Cripto结合分子)”的国际专利申请PCT/US2006/000502相关。本申请还与2005年1月5日提交的名为“Purification andPreferential Synthesis of Binding Molecules(纯化和优先合成结合分子)”的USSN 60/641691相关。本申请还与2003年6月27日提交的名为“Purificationand Preferential Synthesis of Polypeptides(纯化和优先合成多肽)”的USSN60/483877和2003年10月3日提交的名为“Purification and PreferentialSynthesis of Antigen Binding Polypeptides(纯化和优先合成抗原结合多肽)”的USSN 60/508,810相关。本申请还与2004年6月28日提交的名为“Purification and Preferential Synthesis of Binding Molecules (纯化和优先合成结合分子)”的USSN 10/880,320相关。本申请还与2004年9月20日提交的名为“Cripto-Specific Antibodies(Cripto特异性抗体)”的USSN 10/945,853、2003年10月23日提交的名为“Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof(Cripto封闭抗体及其应用)”的USSN 10/693,538、2002年3月22日提交的名为“Antibodies Directed to the Ligand Binding Domain of Cripto(针对Cripto的配体结合域的抗体)”的美国专利申请60/367,002；2001年6月26日提交的名为“Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof(Cripto封闭抗体及其应用)”的申请60/301,091；2001年5月17日提交的名为“Antibodies Directed to theLigand Binding Domain of Cripto(针对Cripto的配体结合域的抗体)”的申请60/293,020；以及2001年4月26日提交的名为“Antibodies Directed to theLigand Binding Domain of cripto(针对Cripto的配体结合域的抗体)”的申请60/286,782相关。这些专利申请每一个的内容均通过该引用整体并入本文。
发明背景
抗体及其各种工程化形式是目前用于治疗患有多种病症的患者的有效治疗剂。这些抗体中的一些识别位于肿瘤细胞表面上的抗原。Cripto是一种许多肿瘤细胞过表达的188个氨基酸的细胞表面蛋白。在人胚胎癌文库的cDNA筛选中分离到了Cripto(Ciccodicola等人，1989，EMBO J.8：1987-91)。Cripto最初被划分为EGF家族的成员(Ciccodicola等人，同上)；但是，后来的分析表明Cripto不与任何已知EGF受体结合，它的EGF样的结构域实际上与EGF家族是趋异的(Bianco等人，1999，J.Biol.Chem.274：8624-29)。
Cripto蛋白的过表达与许多组织(包括但不限于脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃)的肿瘤相关。Panico等人，1996，Int.J.Cancer 65：51-56；Byrne等人，1998，J.Pathology 185：108-11；De Angelis等人，1999，Int.J.Oncology 14：437-40。
对结合Cripto的鼠抗体已有描述。然而，尽管鼠抗体确实可用作人类治疗剂，但因为它们并非来源于人类，所以它们可能是免疫原性的。施用这样的抗体可能导致中和抗体反应(人类抗鼠抗体(HAMA)反应)，这在需要反复施用抗体的情况下(例如治疗慢性或复发性疾病状况)尤其有问题。同时，因为它们含有的是小鼠恒定区，可能不会显示人效应子功能。
试图减弱免疫原性危险时，通常会制备“人源化”抗体。在一个实验方案中，将来源于小鼠的抗体的CDR转移到人框架区上，产生“CDR移植”抗体。通常，框架区中可能影响抗原结合的氨基酸残基会被回复突变(backmuate)成相应的小鼠残基。
但是，虽然人源化抗体因其可能在人体中具有低免疫原性而是想要的，但它们的产生是无法预计的。例如，抗体的序列修饰可能导致极大甚至完全丧失其抗原结合亲和性，或者失去结合特异性。此外，不论序列修饰，″人源化抗体″可能还是会在人体中表现出免疫原性。这类抗体将提供靶向Cripto阳性肿瘤细胞以递送抗肿瘤剂诸如毒素、放射性标记及类似物的途径。开发这种偶联的抗体分子和施用它们的给药方案将大有益处。
发明概述
本发明至少部分基于发现偶联于美登木素生物碱(maytansoid)的人源化抗Cripto抗体B3F6.1(B3F6.1-DM4)当以单次剂量或每两周的给药方案施用时，在动物模型中有效地抑制体内肿瘤细胞生长。这些模型中每两周给药表示，B3F6.1-DM4在人类的有效剂量包括每3周施用一次的给药方案。本发明进一步基于发现单次剂量的B3F6.1-DM4在体内动物模型中有效抑制已建立的肿瘤生长。本发明将进一步基于发现施用B3F6.1-DM4联同另外的药剂如抗代谢物，如5’-氟尿嘧啶，在体内动物模型中造成协同抑制体内肿瘤细胞生长。
因此，一方面，本发明提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子，其中所述结合分子每三周施用一次，从而抑制受治疗者肿瘤生长。
在一个实施方案，该结合分子是抗Cripto抗体。在一个实施方案，该结合分子是人源化抗Cripto抗体。在一个实施方案，该抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱如DM4。在一个实施方案，该美登木素生物碱经由异双官能交联剂如SPDB偶联于所述抗体。在一个实施方案，平均3.5个DM4分子连接于抗Cripto抗体。
在一个实施方案，所述受治疗者患有选自下组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。在优选实施方案，所述受治疗者患有结肠癌。
在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量选自下组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
另一方面，本发明提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子和化疗剂如抗代谢物，从而抑制受治疗者肿瘤生长。
在一个实施方案，该结合分子与化疗剂如抗代谢物协同作用。
在一个实施方案，该化疗剂是抗代谢物。在一个实施方案，该抗代谢物是嘧啶类似物。在一个实施方案，该嘧啶类似物是5’-氟尿嘧啶。
在一个实施方案，该结合分子是抗Cripto抗体。在一个实施方案，该结合分子是人源化抗Cripto抗体。在一个实施方案，该抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱如DM4。在一个实施方案，该美登木素生物碱经由异双官能交联剂如SPDB偶联于抗体。在一个实施方案，平均3.5个DM4分子连接于抗Cripto抗体。
在一个实施方案，所述结合分子与所述化疗剂如抗代谢物以单次剂量施用。在一个实施方案，所述结合分子与所述化疗剂如抗代谢物每两周施用一次。在一个实施方案，所述结合分子与所述化疗剂如抗代谢物每三周施用一次。
在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量选自下组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。在优选实施方案，所述结合分子的有效剂量是15mg/kg。
在一个实施方案，所述结合分子与所述化疗剂如抗代谢物腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、表面局部(topical)或静脉内地施用。
在一个实施方案，所述受治疗者患有选自下组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、直肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。在优选实施方案，所述受治疗者患有结肠癌。
另一方面，本发明提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，所述方法包括以下步骤：(i)选择具有已建立的肿瘤的患者；并(ii)向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子；从而抑制受治疗者肿瘤生长。在一个实施方案，该结合分子是抗Cripto抗体。在一个实施方案，该结合分子是人源化抗Cripto抗体。在一个实施方案，该抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱如DM4。在一个实施方案，该美登木素生物碱经由异双官能交联剂如SPDB偶联于抗体。在一个实施方案，平均3.5个DM4分子连接于抗Cripto抗体。
在一个实施方案，所述结合分子以单次剂量施用。在一个实施方案，所述结合分子每两周施用一次。在一个实施方案，所述结合分子每三周施用一次。
在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量选自下组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量是至少约15mg/kg。在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量是至少约25mg/kg。在一个实施方案，所述结合分子(如，偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体如，B3F6.1-DM4)的有效剂量是至少约40mg/kg)。
在一个实施方案，所述结合分子腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、表面局部或静脉内地施用。
在一个实施方案，所述受治疗者患有选自下组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。在优选实施方案，所述受治疗者患有结肠癌。
另一方面，本发明提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用单次有效剂量的结合Cripto的结合分子，从而抑制受治疗者肿瘤生长。
在一个实施方案，该结合分子是抗Cripto抗体。在一个实施方案，该结合分子是人源化抗Cripto抗体。在一个实施方案，该抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。在优选实施方案，该美登木素生物碱是DM4。在优选实施方案，平均3.5个DM4分子连接于一分子的抗体。在一个实施方案，该美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于抗体。在一个实施方案，该异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(4-(2-pyridyldithio)butanoic acid N-hydroxysuccinimide ester，SPDB)。
在一个实施方案，有效单次剂量选自下组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
在一个实施方案，所述受治疗者患有选自下组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、直肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
另一方面，本发明提供一种液态含水药物制剂，其包含：(a)治疗有效量的结合Cripto的结合分子，(b)10mM琥珀酸钠，pH是5.0，(c)120mM L-甘氨酸，(d)120mM甘油，和(e)0.01％Polysorbate 80。
在一个实施方案，该结合分子是人源化抗Cripto抗体。在一个实施方案，该人源化抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。在一个实施方案，该美登木素生物碱是DM4。在优选实施方案，平均3.5个DM4分子连接于一分子的抗体。在一个实施方案，该美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于抗体。在一个实施方案，该异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。在优选实施方案，结合分子(如，偶联于DM4的人源化抗Cripto抗体)的浓度是5mg/ml。
附图简述
图1显示在带有已建立的CT-3异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，以各种方案IV施用的单次剂量(25和40mg/kg/inj)或两次剂量(25和40mg/kg/inj)B3F6.1-DM4对肿瘤重量变化的效应。
图2显示在带有已建立的CT-3异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，各以IV施用的单次剂量(15mg/kg/inj)B3F6.1-DM4、单次剂量(30mg/kg/inj)5-氟尿嘧啶、和单次剂量(15mg/kg/inj)B3F6.1-DM4联同单次剂量(30mg/kg/inj)5-氟尿嘧啶的组合对肿瘤重量变化的效应。
图3显示在带有大的CT-3异种移植肿瘤，如具有550-775mg的平均肿瘤重量的肿瘤的无胸腺裸小鼠中，IV施用的单次剂量(15和25mg/kg/inj)B3F6.1-DM4对肿瘤重量变化的效应。
图4显示在带有已建立的人类睾丸异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，IV施用的单次剂量(5、10和15mg/kg/inj)B3F6.1-SMCC-DM1或单次剂量(5、10和15mg/kg/inj)B3F6.1-SPDB-DM4对肿瘤重量变化的效应。
发明详述
本发明至少部分基于发现偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体B3F6.1(B3F6.1-DM4)当以单次剂量或每两周的给药方案施用时，在动物模型中有效地抑制体内肿瘤细胞生长。鼠模型中每两周给药等效于在灵长类每三周一次的剂量，表示B3F6.1-DM4在人类的有效剂量包括每3周施用一次的给药方案。本发明进一步基于发现单次剂量的B3F6.1-DM4在体内鼠模型中有效抑制已建立的肿瘤生长。本发明将进一步基于发现施用B3F6.1-DM4联同另外的药剂如化疗剂诸如抗代谢物，如5’-氟尿嘧啶，在体内鼠模型中造成协同抑制体内肿瘤细胞生长。
因此，本发明提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，该方法包括向患者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子，例如偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体(如，B3F6.1-DM4)，其中所述结合分子每三周施用一次。本发明进一步提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子，如偶联于美登木素生物碱的人源化抗Cripto抗体(如，B3F6.1-DM4)和另外的化疗剂，如抗代谢物，如嘧啶类似物，如5’-氟尿嘧啶，从而抑制受治疗者肿瘤生长。本发明还提供一种抑制受治疗者肿瘤生长的方法，所述方法包括以下步骤：选择具有已建立的肿瘤的患者；并向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子；从而抑制受治疗者肿瘤生长。
在进一步描述本发明之前，为了方便起见，一些术语描述如下：
I.定义
本发明的结合分子是包含至少一个结合结构域的多肽分子，所述结合结构域包含特异结合人类Cripto分子的结合位点。人类Cripto的示例性序列如SEQ ID NO：6(CR-1)和SEQ ID NO：7(CR-3)所示。CR-1对应编码在未分化的人畸胎癌细胞中表达的人类Cripto蛋白质的结构基因，CR-3对应编码区中含有7个碱基取代的mRNA完整拷贝，这些碱基取代代表了沉默和置换取代。CR-1定位到染色体3，CR-3定位到Xq21-q22。Dono等人.1991.Am J Hum Genet.1991 49：555。
优选地，本发明的结合分子包含至少一个来源于鼠B3F6抗体的CDR(如1、2、3、4、5或优选地6个CDR)。鼠B3F6抗体结合到Cripto内跨越氨基酸残基46-62的结构域中的表位。制备鼠B3F6抗体(又称为B3F6.17)的杂交瘤以PTA-3319的保藏号保存在ATCC。所述抗体通过用在CHO细胞中表达的Cripto融合蛋白免疫小鼠而获得。用于免疫的融合蛋白包含融合至人类IgG1Fc区的Cripto的氨基酸残基1到169[SEQ ID NO：6的氨基酸1-169](构建体称为CR(del C)-Fc)。制备B3F6抗体的方法在例如WO 02/058170中有更详细的描述。尤其是，示例性人源化B3F6抗体可见于WO 06/74397。产生一种人源化版本的B3F6抗体的CHO细胞以PTA-7284的保藏号保存在ATCC。
如本文使用，“已建立的肿瘤”是实体瘤，其大小足以使得营养即氧气不再能从受治疗者的脉管系统通过渗透渗入肿瘤中心，因此肿瘤需要其自身的脉管供应以接受营养。
在一个实施方案，本方法用于治疗血管瘤。血管瘤包括具有已建立的脉管系统的标志的肿瘤。这种肿瘤由其大小和/或存在血管或血管发生的标志物而被鉴定。
在本发明一个实施方案，联合治疗用于治疗已建立的肿瘤，如大小足以使得营养不再能从受治疗者的脉管系统通过渗透渗入肿瘤中心，因此肿瘤需要其自身的脉管供应以接受营养的肿瘤，即脉管瘤。在一个实施方案，联合治疗用于治疗直径为至少约1mmX1mm的肿瘤。在本发明另一实施方案，联合治疗用于治疗至少约2mmX2mm的肿瘤。在本发明另一实施方案，联合治疗用于治疗至少约5mmX5mm的肿瘤。在本发明其它实施方案，肿瘤具有至少约1cm3的体积。在一个实施方案，本发明的联合治疗用于治疗足够大以致于可以触诊或本领域熟知的成像技术如MRI、超声或CAT扫描发现的肿瘤。
如本文使用，术语“来源于”指定蛋白质是指多肽的来源。在一实施方案中，来源于特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或与其相关的序列。在一实施方案中，来源于特定起始多肽的氨基酸序列是不连续的。例如，在一实施方案中，1、2、3、4、5或6个CDR来源于起始抗体。在一实施方案中，来源于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列的氨基酸序列与所述起始序列或者其部分的氨基酸序列基本相同，其中所述部分由至少3-5个氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸，或至少30-50个氨基酸组成；或者本领域技术人员可以识别出其来源是所述起始序列。在一实施方案中，来源于起始抗体的一或多个CDR序列被改变，从而产生变体CDR序列，其中所述变体CDR序列保持了Cripto结合活性。
本领域技术人员还会理解，可以对本发明的结合分子进行修饰，使其与衍生其的B3F6分子的氨基酸序列不同。例如，可以进行核苷酸或氨基酸取代，这些取代导致在“非关键”氨基酸残基上发生保守取代或改变(例如在CDR和/或框架残基)。本发明的结合分子保持了结合Cripto的能力。
编码多肽非天然变体的分离核酸分子可以通过在免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一或多个核苷酸取代、添加或缺失而产生，使得所编码的蛋白中被引入一或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术来引入突变，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变。优选的，在一或多个非关键氨基酸残基上进行保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基所代替的取代。本领域对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有界定，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非关键氨基酸残基可以用来自相同侧链家族中的另一个氨基酸残基来代替。在另一实施方案中，一串氨基酸可以用结构上类似、在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的氨基酸串来代替。
可选地，在另一实施方案中，可以沿全部或部分免疫球蛋白编码序列随机引入突变。
在一实施方案中，所述结合分子包含一个结合位点。在另一实施方案中，所述结合分子包含至少两个结合位点。在一实施方案中，结合分子包含两个结合位点。在一实施方案中，结合分子包含三个结合位点。在另一实施方案中，结合分子包含四个结合位点。
在一实施方案中，本发明的结合分子是单体。在另一实施方案中，本发明的结合分子是多聚体。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是二聚体。在一实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包含两个相同的单体亚基。在另一实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，包含两个不同的单体亚基。所述二聚体的亚基可以包含一或多个多肽链。例如，在一实施方案中，所述二聚体包含至少两个多肽链。在一实施方案中，所述二聚体包含两个多肽链。在另一实施方案中，所述二聚体包含四个多肽链(例如，在抗体分子的情况中)。
本发明优选的结合分子包含来源于人类氨基酸序列的框架和/或恒定区氨基酸序列。例如，在一实施方案中，本发明结合分子是嵌合抗体。在另一实施方案中，本发明结合分子是人源化抗体。但是，结合多肽可以包含来源于其它哺乳动物物种的框架和/或恒定区序列。例如，灵长类框架区(例如非人类灵长类)、重链部分和/或铰链部分都可以包括在所述结合分子中。在一实施方案中，结合多肽的框架区可以存在一或多个鼠氨基酸，例如人类或非人类灵长类框架氨基酸序列可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中存在相应的鼠氨基酸残基。本发明优选的结合分子比起始的B3F6鼠抗体免疫原性低。
如本文使用，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。含有重链部分的多肽包含以下至少之一：CH1结构域、铰链(例如上游、中游和/或下游铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或者它们的变体或片段。在一实施方案中，本发明多肽包括含有CH1结构域、至少部分铰链区，和CH2结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明多肽包括含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明多肽包括含有CH1结构域、至少部分铰链区，和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本发明多肽包括含有CH3结构域的多肽链。在一实施方案中，本发明的多肽缺少至少部分CH2结构域(例如，全部或部分CH2结构域)。在另一实施方案中，本发明的多肽包含完整的Ig重链。如上所述，本领域技术人员会理解，可以对这些结构域(例如，重链部分)进行修饰从而使其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在一实施方案中，本发明结合分子的至少两个多肽链包含至少一个来源于抗体或免疫球蛋白分子的重链部分。在一实施方案中，本发明多肽的至少两个重链部分位于不同多肽链上，并例如借助至少一个二硫键相互作用(A型)或借助非共价健相互作用(B型)而形成二聚体多肽，该二聚体的每个单体包含至少一个重链部分。
在一实施方案中，二聚体的一个多肽链的重链部分与该二聚体第二个多肽链的重链部分相同。在一实施方案中，本发明二聚体的单体(或半体)彼此相同。在另一实施方案中，它们是不同的。例如，每个单体可能包含不同的靶结合位点。
在一实施方案中，本发明的结合分子是通过共价相互作用(例如二硫键)连在一起的，并是二聚的。在一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选两个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选三个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选四个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选五个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选六个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选七个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选八个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选九个二硫键连在一起的。在另一实施方案中，本发明的二聚体是通过一或多个，优选十个二硫键连在一起的。在进一步的实施方案中，本发明的二聚体不是通过二硫键连在一起的，而是例如借助非共价相互作用连在一起的。
多肽的重链部分可以来源于不同免疫球蛋白分子。例如多肽的重链部分可以包含来源于IgG1分子的CH1结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分来源于IgG1分子、部分来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含嵌合铰链，其部分来源于IgG1分子，部分来源于IgG4分子。
如本文使用，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选的，所述轻链部分包含VL或CL结构域的至少一个。
在一实施方案中，本发明的多肽包含不是来源于Ig分子的氨基酸序列或者一或多个部分。示例性的修饰在下文有更详细的描述。例如，在一实施方案中，本发明的多肽可以包含柔性的接头序列。在另一实施方案中，多肽可以被修饰从而添加一或多个功能部分(例如，PEG、药物、前药，和/或可检测标记)。
“嵌合”蛋白包含连接至自然界中不与其天然连接的第二氨基酸序列的第一氨基酸序列。所述氨基酸序列可能在正常情况下存在于在融合多肽中在一起的分开的蛋白中，或者它们通常存在于相同蛋白中，但在融合多肽中处于新的排列方式。嵌合蛋白可以例如通过化学合成，或者通过产生并翻译其中肽区按所需位置关系编码的多核苷酸而产生。示例性的嵌合多肽包括本发明的融合蛋白和嵌合铰链连接肽。
在一实施方案中，本发明的结合多肽是融合蛋白。在一实施方案中，本发明的融合蛋白是包含结合结构域(该结构域含有至少一个结合位点)和二聚化结构域(该结构域含有至少一个重链部分)的嵌合分子。所述重链部分可以来自任何免疫球蛋白，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。在一实施方案中，融合蛋白还包含合成的连接肽。
在本发明的另一实施方案中，结合分子是“抗体-融合蛋白嵌合体”。这些分子包含结合了抗体的至少一个结合结构域和至少一个融合蛋白的分子。优选地，两个多肽之间的界面是免疫球蛋白分子的CH3结构域。
术语“异源”在用于多核苷酸或多肽时，意味着该多核苷酸或多肽来源于基因型不同于与之进行比较的其他实体的实体。例如，异源多核苷酸或抗原可以来源于不同物种、不同细胞型，或不同个体的相同细胞型。
术语“配体结合结构域”或“配体结合部分”于本文用来指任何天然受体(例如，细胞表面受体)或该受体的任何区域或衍生物，这些区域或衍生物保持了相应天然受体的至少性质上的配体结合能力，优选保持了相应天然受体的生物活性。
术语“受体结合结构域”或“受体结合部分”于本文用来指天然配体或该配体的区域或衍生物，这些区域或衍生物保持了相应天然配体的至少性质上的受体结合能力，优选保持了相应天然配体的生物活性。
在一实施方案中，本发明的结合分子是“抗体”或“免疫球蛋白”分子，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子(或其抗原结合片段)，或者遗传工程化抗体分子，它们结合抗原的方式与抗体分子类似。如本文使用，术语“免疫球蛋白”包括这样的多肽，无论是否具备任何相关的特异免疫反应性，它都有两条重链和两条轻链的组合。“抗体”是指那些对目标抗原(例如，肿瘤相关抗原)有明显的已知特异免疫反应活性的组装体。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间有或没有链间共价键。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构已有了较好的理解。
如下文将详细讨论的，通用术语“免疫球蛋白”包括可以从生物化学加以区分的5类不同抗体。所有5类抗体均在本发明的范围内，以下讨论一般是针对免疫球蛋白分子中的IgG类。就IgG而言，免疫球蛋白包含两个相同的分子量约23,000道尔顿的多肽轻链，和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链。这四条链通过二硫键连接成“Y”形构型，其中轻链位于重链外侧，从“Y”的开口处开始，一直延续通过可变区。
轻链和重链均被划分成结构和功能同源的一些区域。术语“恒定”和“可变”是就功能而言的。就此而言，应理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物特性，诸如分泌、通过胎盘、Fc受体结合、补体结合等。传统上，恒定区结构域的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基端而增加。N末端是可变区，C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如本文使用，术语“可变区CDR氨基酸残基”包括利用基于序列或结构的方法鉴定的CDR或互补决定区中的氨基酸。如本文使用，术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和轻链多肽的可变区中存在的非连续性抗原结合部位。这些特定区域已由Kabat等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest(免疫学上重要蛋白的序列).(1991)，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述过，其中定义包括了在相互之间进行比较时，氨基酸残基的重叠或子集。本文列出了涵盖以上引用的每个文献所定义的CDR的氨基酸残基进行比较。优选地，术语“CDR”是Kabat在序列比较的基础上所定义的CDR。
1残基编号按照Kabat等人的系统命名法，同上
2残基编号按照Chothia等人的命名法，同上
3残基编号按照MacCallum等人的命名法，同上
如本文使用，术语“可变区框架(FR)氨基酸残基”是指Ig链的框架区中的那些氨基酸。用于本文的术语“框架区”或“FR区”包括是可变区的部分，但不是CDR(例如，按照Kabat对CDR的定义)的部分的氨基酸残基。因此，可变区框架长度为约100-120氨基酸，但只包括CDR之外的那些氨基酸。作为重链可变区和Kabat等人定义的CDR的具体例子，框架区1对应涵盖氨基酸1-30的可变区结构域；框架区2对应涵盖氨基酸36-49的可变区结构域；框架区3对应涵盖氨基酸66-94的可变区结构域；框架区4对应从氨基酸103到可变区末端的可变区结构域。轻链框架区类似地被每个轻链可变区CDR分隔开。类似的，采用Chothia等人或者McCallum等人对CDR的定义，框架区边界被上面描述的各自CDR末端分隔开。在优选实施方案中，CDR是按照Kabat的定义。
在天然存在的抗体中，每个单体抗体中存在的六个CDR是短的非连续氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，这些序列处于特异性的位置从而构成抗原结合位点。重链和轻链可变区其它部分显示较小的氨基酸序列的分子间差异，被命名为框架区。框架区主要采取β-折叠构型，CDR形成连接β-折叠结构的一些环，在一些情况中构成β-折叠结构的一部分。因此，这些框架区形成了一个支架，通过链间、非共价相互作用使六个CDR处于正确的方位。被定位的CDR所形成的抗原结合位点界定出与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这一互补表面会促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地鉴定出CDR的位置。
如前文所述，各个免疫球蛋白类的恒定区亚基结构和三维构型是人们熟知的。如本文使用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基端的)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且处于免疫球蛋白重链分子中铰链区的氨基端。
如本文使用，术语“CH2结构域”包括重链分子的一部分，按照常规的编号方案，该部分例如从抗体的约残基244延伸到残基360(残基244到360，Kabat编号系统；残基231-340，EU编号系统，Kabat EA等人.Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列).Bethesda，USDepartment of Health and Human services，NIH.1991)。CH2结构域的独特之处在于它不与另一结构域紧密配对。而是两个N-连接的分支碳水化合物链置于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还充分报道，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C末端，包含约108个残基。
如本文使用，术语“铰链区”包括重链分子中连接CH1结构域和CH2结构域的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合结构域独立移动。铰链区可以细分成三个不同的结构域：上游、中游和下游铰链区(Roux等人.J.Immunol.1998161：4083)。
轻链分为κ或λ(κ、λ)。每个重链种类可以结合κ或λ轻链。一般来说，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程化宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉末端的N端延伸到每个链的底部的C末端。本领域技术人员知道重链分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如，γ1-γ4)。重链的特性决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被很好表征，并且已知它们赋予功能特化。参照本文的公开内容，技术人员可以容易地看出这些种类和同种型的每一种的修饰版本，因此这些修饰版本也属于本发明的范围。
如上文所述，可变区使得抗体选择性地识别并特异性结合抗原的表位。这就是说，抗体的VL结构域和VH结构域结合起来形成定义三维的抗原结合位点的可变区。这一四级抗体结构形成了位于Y构型每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点是由位于每个VH和VL链上的三个互补决定区(CDR)界定的。
术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分或组成部分，其包含的氨基酸残基比完整或整个抗体或抗体链少。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，该片段结合抗原或与完整抗体(即它所来源的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。如本文使用，术语抗体分子的“抗原结合片段”包括抗体的抗原结合片段，例如，抗体轻链(VL)、抗体重链(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab’)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段和单结构域抗体片段(DAb)。片段可以例如通过完整或完全的抗体或抗体链的化学或酶处理或者通过重组手段来获得。
如本文使用，术语“结合位点”包含负责选择性地与目标靶分子(例如，抗原、配体、受体、底物或抑制剂)结合的多肽区域。结合结构域包含至少一个结合位点。示例性的结合结构域包括抗体可变区、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结合结构域或者酶促结构域。
如本文使用，术语“价”是指多肽中可能的靶结合位点数目。每个靶结合位点特异结合一个靶分子或者靶分子上的特定位点。当多肽包含一个以上靶结合位点时，每个靶结合位点可以特异结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或者同一抗原上的不同表位)。这里讨论的结合分子有至少一个特异性针对人类Cripto分子的结合位点。
术语“特异性”是指与指定目标特异结合(例如与之免疫反应)的能力。多肽可以是单特异性的，含有一或多个特异结合靶的结合位点；或者多肽可以是多特异性的，含有两个或更多个特异结合相同或不同靶的结合位点。
在一实施方案中，本发明的结合分子对一个以上的靶有特异性。例如，在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子结合Cripto和肿瘤细胞上表达的第二个分子。本领域已知包含与肿瘤细胞上表达的抗原结合的抗原结合位点的示例性抗体，这类抗体的一或多个CDR可以包括在本发明的结合分子中。这类抗体的例子包括：2B8、Lym 1、Lym 2、LL2、Her2、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8和5E10。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含连接肽。本发明的连接肽是合成的。如本文使用，术语“合成的”涉及到多肽时包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如，是天然存在多肽的修饰形式(例如，包含诸如添加、取代或缺失的突变)或者包含与其在自然界中不是天然连接的第二氨基酸序列(是或不是天然存在的)以线性氨基酸序列连接的第一氨基酸序列(是或不是天然存在的)的非天然存在的多肽。
本发明的连接肽连接本发明结合分子的两个结构域(例如，结合结构域和二聚化结构域)。例如，连接肽将重链部分连到含有结合位点的结合结构域上。在一实施方案中，连接肽以多肽链的线性氨基酸序列连接两个重链恒定区，诸如CH1和CH2结构域；CH1和CH3结构域；铰链区和CH1结构域；铰链区和CH3结构域；VH和铰链区，或者CH3结构域和非免疫球蛋白多肽)。优选的，这类连接肽给结合分子提供了柔性，并促进借助二硫键的二聚化。在一实施方案中，本发明的连接肽用来代替一或多个重链结构域(例如，结构域缺失的构建体中至少恒定区结构域的一部分(例如，至少CH2结构域的一部分)和/或至少铰链区的一部分(例如，至少下游铰链区结构域的一部分))。例如，在一实施方案中，VH结构域与CH3结构域通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3结构域的N末端，连接肽的N末端连到VH结构域的C末端)。在另一实施方案中，VL结构域与CH3结构域通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3结构域的N末端，连接肽的N末端连到VL结构域的C末端)。在另一实施方案中，CH1结构域与CH3结构域通过连接肽融合在一起(连接肽的C末端连到CH3结构域的N末端，连接肽的N末端连到CH1结构域的C末端)。
在一实施方案中，合成连接肽包含恒定区结构域的一部分。例如，在一实施方案中，代替CH2结构域的连接肽可能包含CH2结构域的一部分。
在一实施方案中，连接肽包含gly-ser接头，或由该接头组成。如本文使用，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser接头包含氨基酸序列GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：8)。在一实施方案中，本发明的连接肽包含至少部分上游铰链区(例如，来源于IgG1、IgG3或IgG4分子)、至少部分中游铰链区(例如，来源于IgG1、IgG3或IgG4分子)以及一系列gly/ser氨基酸残基(例如，gly/ser接头，诸如GGGSSGGGSG(SEQ IDNO：8))。在一实施方案中，与天然存在的IgG1或IgG3铰链区相比，所述连接肽包含一或多个氨基酸取代。在另一实施方案中，连接肽包含诸如WO 02/060955中描述的氨基酸序列。连接肽在下文有更详细的描述。
如本文使用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价健。氨基酸半胱氨酸包含一个巯基，可以与第二巯基形成二硫键或桥。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，两个重链通过在对应于使用Kabat编号系统的239和242位点(EU编号系统的位点226或229)的位置的两个二硫键连接。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含抗体结合位点。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是全长抗体分子。在另一实施方案中，本发明的结合分子是抗体分子的片段。在另一实施方案中，本发明的结合分子是修饰或合成的抗体分子。
本发明的结合分子可以利用本领域已知的技术来制备。在一实施方案中，本发明多肽是“重组产生”的抗体分子，即是利用重组DNA技术产生的。制备抗体分子的示例性技术在下文有更详细的讨论。
在一实施方案中，本发明的多肽是修饰的抗体。如本文使用，术语“修饰的抗体”包括合成形式的抗体，即抗体被改变成非天然存在的形式，例如包含至少两个重链部分，但不是两个完整的重链的抗体(诸如，结构域缺失抗体或微抗体)；被改变成结合两个或更多个不同抗原或单个抗原上的不同表位的多特异性抗体形式(例如，双特异性、三特异性等)；重链分子与scFv分子相连的抗体等。ScFv分子是本领域已知的，在美国专利5,892,019中有描述。此外，术语“修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如，结合三个或更多个拷贝的相同抗原的三价、四价等抗体)。在另一实施方案中，本发明的结合分子是融合蛋白，其包含至少一个缺少CH2结构域的重链部分，并包含一种多肽的结合结构域，其中所述多肽含有受体配体对之一成员的结合部分。
在一实施方案中，术语“修饰的抗体”根据本发明包括免疫球蛋白、抗体或它们的免疫反应片段或重组体，其中一或多个恒定区结构域的至少一部分被缺失或以其它方式改变，从而提供所期望的生化特性，诸如与具有大体相同的免疫原性的完整的未改变抗体相比，非共价地二聚化的能力、定位到肿瘤位点的能力增强，或者血清半衰期降低。在一个实施方案中，本发明的多肽是结构域缺失的抗体，其包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但是缺少一或多个重链结构域的至少一部分。更优选地，经修饰的抗体的恒定区的一个整个结构域被缺失，甚至更优选的是，全部或部分CH2结构域被缺失。
在优选实施方案中，本发明的多肽不会在人体中引起有害的免疫应答。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区，与野生型恒定区相比，该恒定区被修饰。即，本文公开的发明多肽可能包含对三个重链恒定区结构域(CH1、CH2或CH3)中的一或多个和/或对轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一或多个结构域中一或多个氨基酸的添加、缺失或取代。
如本文使用，术语“恶性肿瘤(malignancy)”是指非良性的肿瘤或癌症。如本文使用，术语“癌症”包括以不受调节或失去控制的细胞生长为特点的恶性肿瘤。癌症的例子包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞没有转移到受治疗者体内原始肿瘤部位之外的位点的恶性肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，通过转移，即肿瘤细胞迁移到原始肿瘤部位之外的第二位点形成的)。
如本文使用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如，通过重组技术、体外肽合成、肽的酶促或化学偶联，或者这些技术的一些组合)对核酸或多肽分子进行操作。优选地，本发明的结合分子被工程化用于例如表达本发明连接肽。
如本文使用，术语“连接”、“融合的”或者“融合”可以交换使用。这些术语是指通过包括化学偶联或重组手段的任何手段将两个以上的元件或组分联系到一起。“符合读框的融合”是指将两个或以上的可读框(ORF)连在一起形成一个连续的更长的ORF，连接方式保持原始ORF的正确阅读框。因此，得到的重组融合蛋白是含有两个或多个区段的单个蛋白，其中的区段对应由原始ORF编码的多肽(这些区段在自然界中通常不天然地如此连接)。虽然全部融合区段的阅读框被制成了连续的，这些区段可以被例如符合读框的接头序列物理上或空间上分隔开。
在多肽上下文中，“线性序列”或“序列”是指多肽中氨基酸的顺序处于从氨基到羧基端的方向，其中序列中相邻的残基在该多肽的一级结构中是连续的。
如本文使用，短语“因施用结合分子而受益的受治疗者”包括这样一些受治疗者(诸如哺乳动物受治疗者)，它们受益于施用结合分子，这些结合分子是用来例如检测该结合分子能识别的抗原(如用于诊断方案)，和/或受益于用该结合分子进行处理从而减少或去除这些分子能够识别的靶。例如，在一实施方案中，受治疗者可能受益于减少或去除循环系统或血清中的可溶性或颗粒性分子(例如毒素或病原体)，或者受益于减少或去除表达靶的细胞群(例如肿瘤细胞)。如本文更详细的描述，所述结合分子可以以非偶联的形式使用，或者偶联到例如药物、前药或表位上来使用。
II.人源化
在一实施方案中，本发明结合分子包含或来源于至少一个人源化的B3F6抗体可变区，例如轻链或重链可变区。
术语“人源化抗体”是指这样的抗体，其包含至少一条含有基本来自人类抗体链(称为“受者抗体”)的可变区框架残基的链，和至少一条基本来自非人类抗体(称为“供者抗体”)的互补决定区(“CDR”)的链，本例中为抗Cripto抗体，如B3F6。优选地，如果存在恒定区，则恒定区也是基本或完全来自人类免疫球蛋白。
鼠B3F6抗体描述于WO 2006074397。鼠B3F6抗体的轻链可变区和重链可变区的序列分别提供在SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。鼠B3F6的CDR如下表1所示：
表1：B3F6CDR序列(Kabat定义)
  CDR L1   RSSQSIVHSNGNTYLE   SEQ ID NO：9
  CDR L2   KVSNRFS   SEQ ID NO：10
  CDR L3   FQGSHVPLT   SEQ ID NO：11
  CDR H1   SYWIH   SEQ ID NO：12
  CDR H2   ENDPSNGRTNYNEKFKN  SEQ ID NO：13
  CDR H3   GPNYFYSMDY   SEQ ID NO：14
鼠B3F6抗体的可变轻链是小鼠亚组κ2的成员，在113aa重叠中有92.9％同一性(小鼠亚组κ2的共有序列显示在SEq ID NO：41)。可变重链是小鼠亚组2B的成员，在128aa重叠中有80.5％同一性(小鼠亚组2B的共有序列显示在SEQ ID NO：42)。可变轻链对应于人类亚组κ2，在114aa重叠中有76.3％同一性(人类亚组κ2的共有序列显示在SEQ ID NO：43)。可变重链对应于人类亚组1，在129aa重叠中有65.1％同一性(人类亚组1的共有序列显示在SEQ IDNO：44)。
在一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含B3F6抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少两个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少三个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少四个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少五个来自B3F6抗体分子的CDR。在另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含至少六个来自B3F6抗体分子的CDR。在一实施方案中，所述至少一个CDR(或结合分子中存在的一个以上B3F6CDR中的至少一个CDR)被修饰，因此其序列与天然存在的B3F6分子的CDR不同，但保留了结合B3F6的能力。
人源化抗体可以利用重组DNA技术来制备，参见例如Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：10029-10033；Jones等人，Nature，(1986)，321：522-25；Riechmann等人，Nature，(1988)，332：323-27；Verhoeyen等人，Science，(1988)，239：1534-36；Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)，86：3833-37；美国专利第5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370号。
例如，当已经选择了用于人源化的优选的非人类供者抗体时，合适的人类受者抗体可以得自，例如被表达的人类抗体基因序列数据库，来自种系Ig序列或者几种人类抗体共有序列。如果人类可变结构域框架处于和CDR所来源的非人类可变框架相同或类似的构型，则将该非人类CDR替代到人类可变区结构域框架中非常可能的结果是会保持它们的正确空间方向。实现这一点是通过从人类受者抗体中获取人可变结构域，所述受者抗体的框架序列与CDR所来源的非人类可变框架结构域有很高的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同人类抗体序列。优选的，人类受者抗体保留了供者抗体的规范残基和界面残基。此外，优选人类受者抗体在CDR环的长度上具有相当的类似性。参见Kettleborough等人，ProteinEngineering 4：773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6：971(1993)和Carter等人，WO 92/22653。
鉴定了供者抗体和合适的人类受者抗体的CDR后，下一步是确定这些成分中的哪些残基(如果有)应当被取代以便优化所得人源化抗体的特性。通常，要用抗原结合所需要的非人类供者免疫球蛋白轻链或重链中氨基酸的一些或全部(例如，一或多个CDR)来取代人类受者抗体轻链或重链中的相应氨基酸。人类受者抗体保留了不为抗原结合所需要的一些或全部氨基酸。一般来说，将人类氨基酸残基替代为鼠的应当尽量少，因为引入鼠残基会增加抗体引发人的人抗小鼠抗体(HAMA)反应的危险。可以采用本领域认可的方法来测定免疫反应以便监测特定患者或进行临床试验时的HAMA反应。被施用人源化抗体的患者可以在施用该治疗的开始和整个过程中进行免疫原性评价。例如，利用本领域技术人员已知的方法(包括表面等离子共振技术(BIACORE)和/或固相ELISA分析)检测患者血清样品中针对人源化治疗剂的抗体来测量HAMA反应。
如果需要，可以将人类框架区的一或多个残基改变成鼠抗体中相应位点的残基，从而保留人源化抗体对抗原的结合亲和性。这种改变有时被称为“回复突变”。根据对CDR构象和/或结合抗原的可能影响，挑选一些人类可变区框架氨基酸残基来进行回复突变。用人类可变框架区代替鼠CDR区会造成构象限制，这除非通过对一些氨基酸残基进行取代来纠正，否则会导致结合亲和性的丧失。
在一实施方案中，挑选用于回复突变的氨基酸残基可以利用本领域认可的技术，部分地通过计算机建模来决定。通常，从免疫球蛋白链或其结构域的已知结构出发产生出分子模型。比较待建模链与已知三维结构(例如，X-射线结构)的链或结构域的氨基酸序列相似性，选择表现出最高序列相似性的链或结构域为出发点来构建分子模型。对已知的起始结构进行修饰，以允许待建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中的氨基酸的不同。然后将修饰过的结构组装成复合免疫球蛋白。最后，通过能量最小化并通过确认所有原子相互之间保持适当的距离以及键长和角度处于化学上可接受的范围来完善模型。
在另一实施方案中，可以利用基于已有知识的方法或数据库分析来进行人源化。例如，这类人源化策略可以基于根据Rosok等(Rosok MJ，等人，1996.J.Biol.Chem.271：22611-22618)描述的方法目测和分析V区序列。鉴定出规范决定簇、表面残基和可能的接触残基。可能的接触残基被记录并根据以下进行大概分类：Chothia等人(Chothia C和Lesk AM.1987.J.Mol.Biol.196：901-917)定义的CDR环的结构定义、Kabat等人(Kabat EA，Wu TT，Reid-Miller M，Parry HM，和Gottesman KS.1987.Sequences of Protein ofImmunological Interest(免疫学上重要蛋白的序列)，U.S.department of Healthand Human Services，NIH，Bethesda，MD)定义的序列高变性，以及MacCallum等人(MacCallum RM，Martin ACR和Thorton JM.1996.J.Mol.Biol.262：732-745)定义的可能的抗原接触残基。将遵循Kabat编号和定义的鼠CDR环全部移植到受者人类框架上。鉴定出Padlan(Padlan EA.1991.Mol Immunol.28：489-498)所定义的堆积残基，并尝试按照Singer等人(Singer II等人.1993.J.Immunol.150：2844-2857)描述的策略来保留这些堆积残基。框架序列中的每个残基被指定为Harris和Bajorath(Harris L和Bajorath J.1995.ProteinScience 4：306-310)描述的抗体人源化的低度、中度或高度“危险位点”。
一般来说，低危险位点保持为人类的残基。关于许多各不相同的中度和高度危险氨基酸位点，可以参考公开的或私有的人源化抗体序列资料。在参考以前的人源化抗体序列时，记录下含有人类或鼠(回复突变)氨基酸残基是否会产生功能性的结合活性。在考虑进行取代的情况中，可以参考氨基酸取代图谱(D.Bordo和P.Argos.1991.J.Mol.Biol.217：721-729)以便确认这些残基是功能上可以互换的。
也可以部分地通过研究特定位置上的氨基酸的特性，或者根据经验观察特定氨基酸的取代或诱变的影响来挑选进行取代的氨基酸残基。例如，当非人类可变区框架残基和选定的人类可变区框架残基有一个氨基酸不同，供者抗体中的氨基酸是规范残基、界面堆积残基，或者靠近结合位点的不常见或罕见残基时，通常应当将人类框架氨基酸取代为来自非人类供者抗体的等效的框架氨基酸。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人类氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基是界面堆积残基。“界面堆积残基”包括按照例如Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-66(1985)定义的位于VL和VH之间的界面的残基。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人类氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基是规范残基。“规范残基”是已知对CDR构象重要的规范类型或结构类型中的保守的框架残基(Tramontano等人，J.Mol.Biol.215：175(1990)，其全文以参考的方式引入本文)。规范残基包括轻链中的2、25、27B、28、29、30、33、48、51、52、64、71、90、94和95，以及重链中的残基24、26、27、29、34、54、55、71和94。其它残基(例如，CDR结构决定残基)可以根据Martin和Thorton(1996)J.Mol.Biol.263：800的方法来鉴定。
在一实施方案中，本发明的结合分子还包含至少一个人类氨基酸残基回复突变为相应的小鼠氨基酸残基，其中该氨基酸残基处于能够和CDR相互作用的位置。特别是，在许多抗体中，轻链中位点2、48、64和71的氨基酸以及重链中位点26-30、71和94的氨基酸(按照Kabat的编号)是已知能与CDR相互作用的。轻链位点35和重链位点93和103的氨基酸也有可能与CDR相互作用。
在例如美国专利5,585,089中提出了挑选进行取代的框架残基的示例性技术。那项专利中描述了几类可以被改变的人类框架氨基酸。在一实施方案中，第2类氨基酸被回复突变为相应的鼠残基。具体来说，第2类氨基酸是人类受者免疫球蛋白框架中的不常见氨基酸(即，“罕见”，该术语在文中表示在代表性数据库中，人类重链(轻链)V区序列中低于约20％，通常低于约10％会在该位点出现这个氨基酸)，如果该位点的供者氨基酸对于人类序列来说是典型的(即，“常见”，该术语在文中表示所述氨基酸出现在代表性数据库中约25％以上，通常是约50％以上的序列中)，则可以选择非人类供者氨基酸(例如，鼠氨基酸)，而不是人类受者氨基酸。这个标准帮助确保人类框架中的非典型氨基酸不会破坏抗体的结构。并且，通过用供者抗体中碰巧对人类抗体而言是典型的氨基酸来代替不常见氨基酸，可以使人源化抗体的免疫原性下降。
所有人类轻链和重链可变区序列均被分别划分成相互之间同源性特别高、在一些关键位点有相同氨基酸的序列“亚群”(Kabat等人，同上)。在确定人类受者序列中的氨基酸对于人类序列来说是“罕见”还是“常见”的时候，经常优选只将相同亚群中的人类序列考虑为受者序列。
在一实施方案中，第3类氨基酸被回复突变为相应的鼠残基。属于第3类的残基在人源化免疫球蛋白链的一级序列中与3个CDR中的一或多个相邻，可以选择供者氨基酸而非受体氨基酸。这些氨基酸特别可能与CDR中的氨基酸相互作用，并且如果选自受者，则它们会使供者CDR变形并降低亲和性。而且，相邻氨基酸可能与抗原直接相互作用(Amit等人，Science，233，747-753(1986))，挑选供者中的这些氨基酸可能有益于保持原始抗体中提供亲和性的所有的抗原接触。
在一实施方案中，第4类氨基酸被回复突变成相应的鼠残基。第4类氨基酸是这样一些氨基酸，通常在原始供者抗体的三维模型中，显示CDR之外的一些氨基酸与CDR很近，有很大的可能性通过氢键、范德华力、疏水相互作用等与CDR中的氨基酸相互作用。在这些氨基酸位点，可选择供者免疫球蛋白氨基酸，而非受者免疫球蛋白氨基酸。遵循这个标准的氨基酸一般具有与CDR中的一些原子距离在约3埃单位以内的侧链原子，并且必须含有能与这些CDR原子通过诸如上面列举的已知化学力发生相互作用的原子。
在可形成氢键的原子的例子中，3埃是在它们的原子核之间测量，但是对于不形成键的原子，3埃是在它们的范德华表面之间测量的。因此，在后一种情况中，被认为能发生相互作用的原子的原子核必须处于约6埃以内(3+范德华半径之和)。许多情况中，原子核相距4或5至
Figure GPA00001010822100241
确定氨基酸能否与CDR相互作用时，优选不将重链CDR 2的最后8个氨基酸认为是CDR的一部分，因为从结构来看，这8个氨基酸表现得更象是框架的一部分。
框架中能与CDR氨基酸发生相互作用的氨基酸属于第4类，可以通过另一种方式进行区别。每个框架氨基酸的溶剂可及性表面积以两种方法计算：(1)完整抗体，和(2)由去除了CDR的抗体组成的假设分子。这些数字之间约10平方埃或以上的显著差异表明框架氨基酸与溶剂的接触至少部分被CDR阻断，因此该氨基酸与CDR有相互作用。氨基酸的溶剂可及性表面积可以在抗体的三维模型的基础上，利用本领域已知的算法来计算(例如，Connolly，J.Appl.Cryst.16，548(1983)，Lee和Richards，J.Mol.Biol.55，379(1971))。框架氨基酸还可能偶尔通过影响另一个框架氨基酸的构象，使之与CDR发生接触，从而间接地与CDR相互作用。
已知在许多抗体中，框架中多个位点的氨基酸能够与CDR相互作用(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196，901(1987)、Chothia等人，Nature 342，877(1989)以及Tramontano等人，J.Mol.Biol.215，175(1990)，这些文章全部以参考的方式引入本文)，特别是，轻链的位点2、48、64和71以及重链的26-30、71和94(按照Kabat的编号系统，同上)，因此这些氨基酸一般属于第4类。在一实施方案中，本发明的人源化免疫球蛋白除此之外还包括属于第4类的供者氨基酸(当它们不同时)。轻链位点35以及重链位点93和103的氨基酸也可能与CDR有相互作用。因此，在一实施方案中，人源化免疫球蛋白中可能包括一或多个供者氨基酸，而非受者氨基酸(当它们不同时)。另一方面，一些可能属于第4类的位点，诸如轻链的前5个氨基酸，有时可能从受者免疫球蛋白中挑选而并不损失人源化免疫球蛋白的亲和性。
除了以上这些描述人源化免疫球蛋白中的氨基酸何时可取自供者的类别，人源化免疫球蛋白中的一些氨基酸如果落入第5类，则它们既不能从供者也不能从受者中获取。如果供者免疫球蛋白中给定位点的氨基酸对于人类序列来说是上文中定义的“罕见的”，受者免疫球蛋白中该位点的氨基酸对于人类序列也是“罕见的”，则人源化免疫球蛋白中该位点的氨基酸可以选择为人类序列中的某“典型”氨基酸。优选的选择是最常出现在与受者序列属于同一亚群的已知人类序列该位点的氨基酸。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含三个B3F6轻链CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)和人类轻链框架区。在一实施方案中，最适合的表达的人类轻链框架是人类gi-21669417(BAC01733)(SEQ ID NO：45)。在一实施方案中，本发明的结合分子还包含在至少一个选自2和100的位点的人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子还包含在至少一个选自2和100的位点的人氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的一个回复突变。在另一实施方案中，结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点2和100的回复突变。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点2的回复突变和至少另外一个回复突变。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含位于人源化B3F6轻链的位点100的回复突变和至少另外一个回复突变。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含三个B3F6重链CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和人类重链框架区。在一实施方案中，最适合的表达的人类重链框架是gi-14289106(AAK57792)(SEQ ID NO：46)。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的至少一个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的一个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的一个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的两个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的两个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的三个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的三个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的四个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的四个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的五个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的五个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的六个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的六个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的七个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的七个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的八个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的八个回复突变。在一实施方案中，本发明的结合分子在选自1、48、67、71、73、81、82b、93和112组成的组的九个位点上，包含人类氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的九个回复突变。
在一实施方案中，本发明涉及B3F6抗体的人源化可变区，以及包含该人源化可变区的多肽。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：52中氨基酸1-112所示的CDR移植的轻链可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：55中氨基酸1-121所示的CDR移植的轻链可变区序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：47所示的轻链版本1可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：48所示的重链版本1可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQID NO：49所示的重链版本2可变区序列。
在另一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：50所示的轻链版本2可变区序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：51所示的重链版本3可变区序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：52所示的CDR移植的轻链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：53所示的版本1轻链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：54所示的版本2轻链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：55所示的CDR移植的重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：56所示的版本1重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：57所示的版本2重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：58所示的版本3重链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：59所示的CDR移植的结构域缺失重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：60所示的版本1结构域缺失重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：61所示的版本2结构域缺失重链。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：62所示的版本3结构域缺失重链。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含如SEQ ID NO：63所示的CDR移植的轻链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：64所示的版本1轻链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：65所示的版本2轻链序列，其包括任选的信号序列。
在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：66所示的CDR移植的重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：67所示的版本1重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQ ID NO：68所示的版本2重链序列，其包括任选的信号序列。在一实施方案中，本发明的结合分子包含SEQID NO：69所示的版本3重链序列，其包括任选的信号序列。
在一实施方案中，将包含鼠B3F6 CDR和人类框架区的轻链与包含鼠B3F6 CDR和人类框架区的重链结合在一起。在一实施方案中，将包含鼠B3F6 CDR和人类框架区的轻链与含有人类框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的至少一个回复突变的人源化B3F6重链版本组合在一起。在另一实施方案中，将含有至少一个人类框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变的人源化B3F6轻链版本，与含有至少一个人类框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变的人源化B3F6重链版本组合在一起。在另一实施方案中，将包含小鼠B3F6 CDR和人类框架区以及至少一个从人类框架氨基酸残基到相应小鼠氨基酸残基的回复突变的轻链与人源化B3F6重链版本组合在一起。示例性的组合方式在WO 2006 074397的实施例中有更详细的描述。例如，在一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L1轻链与WO 2006 074397实施例中的H1重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第1个版本。在另一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L1轻链与WO 2006 074397实施例中的H2重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第2版本。这一版本的人源化B3F6由保藏在ATCC，保藏号是PTA-7284的CHO细胞系产生。在另一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L1轻链与WO 2006 074397实施例中的H3重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第3版本。在另一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L2轻链与WO 2006 074397实施例中的H1重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第4个版本。在另一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L2轻链与WO 2006 074397实施例中的H2重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第5个版本。在另一实施方案中，WO 2006 074397实施例中的人源化L2轻链与WO 2006 074397实施例中的H3重链组合在一起形成人源化B3F6抗体的第6个版本。对本领域普通技术人员来说，显然这些组合方式都在本发明的范围内。
在一实施方案中，本发明的结合分子是由根据布达佩斯条约，保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110，保藏号为PTA-7284的细胞系产生的人源化抗体。
II.结合分子的形式
A.抗体或其部分
在一实施方案中，本发明的结合分子是抗体分子。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子是结合Cripto的人源化抗体或其部分。在另一实施方案中，本发明的结合分子是多价的，包含人源化抗体的结合Cripto的抗原结合片段，以及抗体的第二个抗原结合片段。
在一实施方案中，可制备其它抗Cripto抗体。此外，可制备用于并入多价抗Cripto抗体的结合位点。例如，优选通过在哺乳动物中多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关抗原或含有该抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂来培育抗体。这类免疫接种通常会引发包括由活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体在内的免疫应答。虽然可以从动物血清中收集所得抗体来提供多克隆制品，但通常希望从脾、淋巴结或外周血中分离单个淋巴细胞以便提供单克隆抗体(MAb)的均一制品。优选地，所述淋巴细胞得自脾。
在这个众所周知的方法(Kohler等人，Nature，256：495(1975))中，将来自被注射了抗原的哺乳动物的相对短寿或者会死亡的淋巴细胞与永生的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，从而制备出杂交细胞或“杂交瘤”，其既可以无限增殖又能产生遗传编码的B细胞抗体。经过挑选、稀释并再培养含有形成单个抗体的特定基因的每个单独株，将所得杂交体分离成单遗传株。它们产生的抗体均一地抗目的抗原，就其纯的遗传家系而言，被称为“单克隆的”。
将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，优选培养基含有一或多种能够抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。本领域技术人员知道，用于形成、挑选和培养杂交瘤的试剂、细胞系和培养基可以从多种来源购买，标准方案已建立完善。通常，要检测杂交瘤细胞生长培养基中针对目的抗原的单克隆抗体的产生。优选的，通过免疫沉淀或者体外测定(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA))来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。鉴定到产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可以经有限稀释程序进行亚克隆并用标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体的原理和实践)，第59-103页(Academic Press，1986))。还要理解，可通过常规纯化方法，诸如蛋白A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离出来。
在另一实施方案中，可以利用常规步骤(例如，利用能够特异结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离出编码所需单克隆抗体的DNA并测序。分离并亚克隆的杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。分离后，DNA可以引入表达载体，然后将后者转染到本来不会产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体地说，可以按照Newman等人1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号(全文以参考的方式引入本文)中描述的，用分离的DNA(可以是如本文描述的合成DNA)来克隆恒定和可变区序列以便制备抗体。实质上，这需要从所选细胞中提取RNA、转化成cDNA以及用Ig特异引物PCR扩增。适用于该目的的引物在美国专利第5,658,570号中也有描述。如下文更详细描述的，表达所需抗体的转化细胞可以较大量地培养以便提供免疫球蛋白的临床和商业供应。
本领域技术人员还会理解，编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以来源于抗体噬菌体文库，例如利用pd噬菌体或Fd噬菌粒技术。示例性的方法在例如EP 368 684 B1；美国专利第5,969,108号、Hoogenboom，H.R.和Chames.2000.Immunol.Today 21：371；Nagy等人.2002.Nat.Med.8：801；Huie等人.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682；Lui等人.2002.J.Mol.Biol.315：1063中描述，这些文献均以参考的方式引入本文。有些出版物(例如，Marks等人.Bio/Technology 10：779-783(1992))描述了通过链改组来产生高亲和性人类抗体、以及用组合感染和体内重组作为构建大噬菌体文库的策略。在另一实施方案中，可以利用核糖体展示代替噬菌体作为展示平台(参见例如，Hanes等人.2000.Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson等人.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：3750；或Irving等人.2001 J.Immunol.Methods 248：31)。在另一实施方案中，可以筛选细胞表面文库来获得抗体(Boder等人.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701；Daugherty等人.2000J.Immunol.Methods243：211)。这些方案提供了用于分离以及随后克隆单克隆抗体的传统杂交瘤技术的替代方法。
在本发明的另一实施方案中，本发明结合分子的结合位点可以由人类抗体或基本上人类抗体提供。人类抗体或基本上人类抗体可以在不能产生内源免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中制备(参见例如，美国专利第6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369号，均以参考方式引入本文)。例如，有人描述，嵌合和种系突变小鼠中抗体的重链连接区的纯合缺失导致内源抗体产生被完全抑制。将人类免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中，使得它在抗原攻击时产生人类抗体。另一种优选的利用SCID小鼠产生人类抗体的手段在美国专利第5,811,524号中有描述，该专利以参考方式引入本文。应理解，与这些人类抗体相关的遗传物质也能如文中所述进行分离和操纵。
还有一种高效率产生重组抗体的手段在Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)中公开。具体来说，这一技术使得产生了含有猴可变区和人类恒定区序列的灵长类源化抗体。该文献以引用的方式全文引入本文。此外，这一技术在共同转让的美国专利第5,655,570、5,693,780和5,756,096号中也有描述，这些专利均以参考的方式引入本文。
在另一实施方案中，可以通过显微操作挑选淋巴细胞，并分离可变区基因。例如，可以从免疫的哺乳动物中分离外周血单核细胞，体外培养约7天。在培养物中筛选符合筛选标准的特异IgG。可分离阳性孔中的细胞。单个产生Ig的B细胞可以经FACS或者通过在补体介导的溶血斑测定中鉴定它们而被分离。产生Ig的B细胞可以显微操作到试管中，利用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可将VH和VL基因克隆到抗体表达载体中，并转染到细胞(例如，真核或原核细胞)内进行表达。
此外，用于产生本发明结合分子的遗传序列可以得自许多不同来源。例如，象上面大量讨论过的，许多人类抗体基因是公众可以获取的保存形式。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公开了，可以利用本领域认可的技术由这些序列化学合成合适的抗体基因。与本发明这一方面相符的寡核苷酸合成技术是技术人员熟知的，可以利用任何多种可购买获得的自动合成仪来实现。另外，本文中给出的编码不同种类重链和轻链的DNA序列可以通过商业的DNA合成供应商获得。然后可以将利用任何以上方法得到的遗传物质进行改变或合成，从而得到本发明的多肽。
可选地，可以用技术人员熟知的技术挑选和培养抗体产生细胞系。这类技术在许多实验室手册和主要出版物中都有描述。就此而言，适用于本发明的技术在Current Protocols in Immunology(免疫学最新实验方案)，Coligan等人编辑，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley andSons，New York(1991)中描述，该书以参考文献的方式全文引入本文，包括补充内容。
应当进一步意识到本发明的范围进一步覆盖了抗原结合性DNA序列的等位基因、变体和突变。
众所周知，RNA可以从起始杂交瘤细胞或其它转化细胞中通过标准技术分离，所述技术诸如异硫氰酸胍提取和沉淀，随后进行离心或层析。如果需要，可以通过标准技术(诸如在寡dT纤维素上进行层析)从总RNA中分离mRNA。合适的技术是本领域所熟悉的。
在一实施方案中，编码抗体轻链和重链的cDNA可以同时或分别用逆转录酶和DNA聚合酶，根据公知方法制备。可以在已公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的基础上，用共有恒定区引物或更特异的引物引发PCR。如上面讨论过的，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况中，可以用共有引物或更大的同源探针，诸如小鼠恒定区探针来筛选文库。
可以采用领域已知的技术从细胞中分离DNA(通常是质粒DNA)，并按照在例如前面涉及重组DNA技术的参考文献中详细描述的标准公知技术进行限制酶切图谱和测序。当然，根据本发明，在分离或随后的分析过程中的任何点，DNA可以是合成的。用于本发明结合分子的示例性抗体或其片段包括识别文中给出的靶的抗体。
在一些实施方案中，可用领域公知技术制备抗体的抗原结合片段。
B.修饰的抗体
在一实施方案中，本发明的结合分子包含被修饰的抗体，或由经修饰的抗体组成，即来源于抗体的分子，但不是野生型抗体，例如微抗体(微抗体可以用领域中已描述过的方法来制备(参见，例如美国专利第5,837,821号或WO 94/09817A1)等)。
1.结构域缺失的抗体
在一实施方案中，本发明结合分子包含其中一或多个结构域被部分或完全缺失的合成恒定区(“结构域缺失抗体”)。在特别优选的实施方案中，适用修饰抗体包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域被去除(ΔCH2构建体)。对于其它优选实施方案，可以用短的连接肽来取代被缺失的结构域以为可变区提供柔性和移动自由。本领域技术人员理解，由于CH2结构域对抗体代谢速率的调节作用，这样的构建体是特别优选的。
在另一实施方案中，本发明的经修饰的抗体是CH2结构域缺失抗体。结构域缺失构建体可以利用编码IgG1人类恒定结构域的载体(例如，来自IDECPharmaceuticals，San Diego)来获得(参见，例如WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。这个示例性的载体被工程化以缺失CH2结构域并提供一种表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。然后编码C2B8抗体、5E8抗体、B3F6抗体的鼠可变区，或人源化CC49抗体的可变区的基因被插入到该合成载体并克隆。当在转化细胞中表达时，这些载体分别提供了C2B8.ΔCH2、5E8.ΔCH2、B3F6.ΔCH2或huCC49.ΔCH2。这些构建体表现出许多特性，使得它们成为了特别有吸引力的单体亚基候选物。
使用铰链区连接肽G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：5)构建的一种CH2结构域缺失的嵌合B3F6(chB3F6ΔCH2)抗体描述于WO2006074397。“chB3F6”是嵌合的抗CRIPTO单克隆抗体，由分别融合于人类重链和轻链恒定结构域的鼠重链和轻链可变结构域组成。由分别融合于人类重链和轻链恒定结构域的鼠重链和轻链可变结构域组成、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]铰链连接肽的重链CH2结构域缺失的嵌合抗CRIPTO单克隆抗体(chB3F6)的DNA序列显示在SEQ ID NO：1。轻链CH2结构域缺失的chB3F6的DNA序列显示在SEQ ID NO：2。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[GlySer]铰链连接肽的重链CH2结构域缺失的chB3F6的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：3。轻链CH2结构域缺失的chB3F6的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：4。用于制备结构域缺失的抗体(包含铰链连接肽(HCP))的恒定区序列显示在SEQ ID NO：70，用于制备全长抗体的全长IgG1恒定区序列显示在SEQ ID NO：71。已制备了人源化结构域缺失的B3F6抗体，更详细地描述于WO 2006074397的实施例。
应指出的是这些示例性的构建体被工程化了，使得CH3结构域直接融合到本发明相应多肽的铰链区。在其它构建体中，可能希望在铰链区和合成CH2和/或CH3结构域之间提供一个间隔肽。例如，可以表达这样的适用构建体，其中CH2结构域被缺失，剩下的CH3结构域(合成或非合成的)借助5-20个氨基酸的间隔连接至铰链区。例如，可以加上这样的间隔肽来保证恒定结构域的调节元件保持自由，具有可及性，或者铰链区保持灵活。例如，可以使用这样一种结构域缺失的B3F6构建体，该构建体有取代了CH2结构域的短氨基酸间隔GGSSGGGGSG(SEQ.ID No.8)和下游铰链区(B3F6.ΔCH2[gly/ser])。其它示例性的连接肽如表2所示。这些连接肽可以用于本发明的任何多肽。优选地，所述连接肽用于缺少CH2重链结构域的多肽。优选地，适合本发明的任何接头是相对非免疫原性的，不会抑制本发明多肽的非共价键结合。
在一实施方案中，只要允许在单体亚基之间形成共价或非共价连接，则本发明多肽包含带有数个甚至单个氨基酸缺失或取代的免疫球蛋白重链。例如，在CH2结构域的选定区域的单氨基酸突变可足以明显减少Fc结合，从而提高对肿瘤的定位。类似的，可能希望仅缺失一或多个恒定区结构域中控制待调节的效应子功能(例如，补体结合)的那部分。恒定区的这种部分缺失可改善抗体的选定特性(血清半衰期)，而与目标恒定区结构域相关的其它所需功能保持完整。而且，如上文提到的，公开的抗体的恒定区可以是合成的，通过一或多个氨基酸的突变或取代，增强了所得构建体的特性。从这一点来说，有可能将保守结合位点(例如，Fc结合)所赋予的活性破坏掉，而基本上维持被修饰抗体的构型和免疫原性特点。但是，其它优选实施方案可能包含在恒定区中添加一或多个氨基酸以便增强所需特性(诸如效应子功能)或者提供更强的细胞毒素或碳水化合物附着。在这些实施方案中，可能希望插入或重复来源于选定恒定区结构域的特异序列。
本领域已知恒定区介导多种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体结合会活化补体体系。补体的活化在调理作用和细胞病原体的裂解中非常重要。补体的活化还刺激炎症反应，并可参与自身免疫超敏感性。此外，随着抗体Fc区域的Fc受体位点结合到细胞上的Fc受体(FcR)，抗体借助Fc区域结合到细胞上。有许多针对不同种类的抗体的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体结合细胞表面上的Fc受体引发大量重要和多样的生物反应，包括胞吞和破坏被抗体包被的颗粒、清除免疫复合体、杀伤细胞对包被抗体的靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、释放炎性介质、通过胎盘以及控制免疫球蛋白的产生。
在一实施方案中，效应子功能可以通过下述被消除或降低：利用被认为不能清除靶细胞的IgG4抗体的恒定区；或者生成Fc变体，其中Fc区域里对于效应子功能很关键的残基利用本领域已知技术(例如，美国专利第5,585,097号)被突变。例如，恒定区结构域的缺失或灭活(通过点突变或其它手段)可减少Fc受体结合循环的经修饰的抗体，从而提高对肿瘤的定位。其它情况中，可能与本发明一致的恒定区修饰会减缓补体结合，因此降低偶联的细胞毒素的血清半衰期和非特异缔合。然而，可以用恒定区的其它修饰来改变二硫键或寡糖部分，从而使其定位因为抗原特异性或抗体柔性增加而增强。更一般来说，本领域技术人员会认识到如本文的描述进行修饰的抗体可产生许多微妙的效果，这些效果可以或可以不很容易地得到领会。但是，这些修饰所产生的生理特性、生物利用度及其它生化效果(诸如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)不需要经过过多实验，可以容易地利用已知免疫技术测量和定量。
在一实施方案中，可以用本领域已知技术由整个前体或母体抗体制得修饰形式的抗体。示例性技术在下文有更详细描述。
包含重链部分的多肽可以包含或不包含不是来源于免疫球蛋白分子的其它氨基酸序列或部分。以下更详细地描述了这类修饰。例如，在一实施方案中，本发明多肽可能包含柔性接头序列。在另一实施方案中，多肽可以被修饰以添加功能部分，诸如药物或PEG。
2.双特异性结合分子
在一实施方案中，本发明的结合分子是双特异性的。例如，在一实施方案中，所述结合分子结合Cripto和另一个分子。在一实施方案中，本发明的双特异性结合分子可包含另外的结合位点，该结合位点结合一或多个肿瘤分子或与肿瘤细胞生长相关的分子。在一实施方案中，对于赘生性病症，所公开的多肽的抗原结合位点(即，可变区或免疫反应片段或其重组体)结合到位于恶性肿瘤部位的选定肿瘤相关分子。考虑到已报道的与赘生肿瘤细胞生长相关的分子的数量和相关抗体的数量，本领域技术人员应意识到，要求保护的结合分子的结合位点可以因此来源于大量完整抗体的任何之一。更一般来说，用于本发明的结合位点可以得自或来源于与选定情况相关的靶分子或标记物反应的任何抗体(包括文献中已有报道的)。此外，用于产生本文公开的多肽的母体或前体抗体，或者其片段可以是鼠的、人类的、嵌合的、人源化的、非人类灵长类的或灵长类源化的。在其它优选实施方案中，本发明的多肽可以包含具有本文描述的被改变恒定区的单链抗体构建体(诸如美国专利第5,892,019号中公开的那些，该专利以参考的方式引入本文)。因此，这些类型的抗体的任何一种都可以用来获得能引入本发明双特异性分子的结合位点。
如本文使用，“肿瘤相关分子”指通常与肿瘤细胞相关的任何抗原或靶分子，即其表达程度与正常细胞相同或更高。更广泛的说，肿瘤相关分子包括任何这样的分子，这些分子即使在非恶性肿瘤细胞上也有表达，它们使得免疫反应性抗体能定位到赘生性细胞上。这些分子可相对具有肿瘤特异性，其表达限于恶性肿瘤细胞表面。可选地，在恶性和非恶性肿瘤细胞上都能发现这类分子。例如，CD20是一种在恶性和非恶性B细胞表面上都有发现的泛B抗原，它已被证实是治疗非霍奇金淋巴瘤的免疫治疗抗体的极其有效的靶。
在这方面，泛T细胞抗原，诸如CD2、CD3、CD5、CD6和CD7也包含本发明意义中的肿瘤相关分子。其它示例性肿瘤相关分子包括但不限于LewisY、MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6&E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。许多情况中，这些抗原每一个的免疫反应性抗体在文献中已有报道。本领域技术人员会理解，与本发明一致的，这些抗体每一个都可以作为本发明多肽的前体。
以前报道过的能与肿瘤相关分子反应的抗体可以按照本文的描述进行改变，从而给本发明多肽提供一或多个结合位点。可以用来给所述多肽提供结合位点的示例性抗体(或者结合位点可以来源的抗体)包括但不限于，2B8和C2B8(和
Figure GPA00001010822100362
IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego)、Lym 1和Lym 2(Techniclone)、LL2(Immunomedics Corp.，New Jersey)、HER2(
Figure GPA00001010822100371
Genentech Inc.，South San Francisco)、B1(
Figure GPA00001010822100372
Coulter Pharm.，San Francisco)、
Figure GPA00001010822100373
(Millennium Pharmaceuticals，Cambridge)、MB1、BH3、B4、B72.3(Cytogen Corp.)、CC49(National Cancer Institute)和SE10(University of Iowa)。在优选实施方案中，本发明多肽会与以上列举的抗体结合相同的肿瘤相关抗原。在特别优选的实施方案中，所述多肽来源于2B8、C2B8、CC49和C5E10，或者和它们结合的抗原相同，更优选的是，所述多肽包含结构域缺失的抗体(即，ΔCH2抗体)。
在第一优选实施方案中，本发明的双特异性分子与结合相同的肿瘤相关抗原。(又称为利妥昔单抗、IDEC-C2B8和C2B8)是FDA批准的第一个用于治疗人类B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(参见美国专利第5,843,439；5,776,456和5,736,137号，这些专利均以参考的方式引入本文)。Y2B8(90Y标记的2B8；
Figure GPA00001010822100376
替伊莫单抗)是C2B8的鼠亲本。
Figure GPA00001010822100377
是一种嵌合的抗CD20的单克隆抗体，该抗体具有生长抑制性，并且有报道说它能在体外使一些淋巴瘤细胞系对化疗剂的细胞凋亡敏感。所述抗体能够有效地结合人类补体，具有强FcR结合，并且能借助补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制体外有效地杀伤人类淋巴细胞(Reff等人，Blood 83：435-445(1994))。本领域技术人员明白，按照本公开文本能够结合Cripto和CD20+的双特异性结合分子，可以偶联或非偶联形式使用以有效地治疗出现CD20+恶性肿瘤的患者。更一般地说，我们要重申本文公开的多肽可以以“裸露”或未偶联状态或者偶联细胞毒性剂来有效地治疗多种病患的任何之一。
在本发明其它优选实施方案中，本发明双特异性多肽可以包含来自CC49抗体(或来源于CC49抗体)的结合位点。正如前面提到的，CC49能够结合人肿瘤相关抗原TAG-72，该抗原与一些来自人类的肿瘤细胞，特别是LS174T肿瘤细胞系的表面结合。LS 174T[美国典型培养物保藏中心(文中称为ATCC)No.CL 188]是LS180(ATCC No.CL187)结肠腺癌细胞系的变体。
我们还知道，已开发了对TAG-72有结合特异性的许多鼠单克隆抗体。这些单克隆抗体中的一个称为B72.3，是由杂交瘤B72.3(ATCC No.HB-8108)产生的鼠IgG1。B72.3是用人类乳腺癌提取物作为免疫原开发出的第一代单克隆抗体(参见Colcher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78：3199-3203(1981)；以及美国专利第4,522,918和4,612,282号，这些出版物均以参考的方式引入本文)。其它针对TAG-72的单克隆抗体被命名为“CC”(表示结肠癌)。正如Schlom等人(美国专利第5,512,443号，以参考的方式引入本文)描述的，CC单克隆抗体是用TAG-72从B72.3中纯化制备的第二代鼠单克隆抗体家族。由于对TAG-72的结合亲和性相对较好，以下CC抗体已被保存在ATCC，经申请后有限制的访问：CC49(ATCC No.HB 9459)；CC 83(ATCC No.HB 9453)；CC46(ATCCNo.HB 9458)；CC92(ATTCC No.HB 9454)；CC30(ATCC No.HB 9457)；CC11(ATCC No.9455)；和CC15(ATCC No.HB 9460)。U.S.P.N.5,512,443进一步教导了，可以利用本领域已知的重组DNA技术将公开的抗体改变成它们的嵌合形式，例如通过用人类恒定区结构域(Fc)取代小鼠恒定区。除了公开了鼠和嵌合抗TAG-72抗体，Schlom等人还制备了PCT/US99/25552中公开的人源化CC49抗体、和美国专利第5,892,019号中公开的单链构建体的变体，这两份专利均以参考的方式引入本文。本领域技术人员明白，以上提到的抗体、构建体或重组体，以及它们的变体的每一个可以是合成的，并用于制备本发明双特异性分子。
除了上面讨论过的抗TAG-72抗体，多个研究组还报道过结构域缺失的CC49和B72.3抗体的构建和部分表征情况(例如，Calvo等人.CancerBiotherapy，8(1)：95-109(1993)，Slavin-Chiorini等人.Int.J.Cancer 53：97-103(1993)和Slavin-Chiorini等人.Cancer.Res.55：5957-5967(1995)。这些构建体也可以包括在本发明的双特异性分子中。
在一实施方案中，本发明的双特异性分子与CD23结合(美国专利第6,011,138号)。在一个优选实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与5E8抗体结合相同表位的结合位点。在另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个来自抗CD23抗体(例如5E8抗体)的CDR。
在另一实施方案中，本发明的双特异性分子包含来源于C5E10抗体的一个结合位点(或者是与C5E10抗体结合相同肿瘤相关性抗原的结合位点)。正如同时待审的专利申请09/104,717中提出的，CSE10是识别似乎特异于前列腺肿瘤细胞系(例如，DU 145、PC3或ND1)的约115kDa的糖蛋白决定子的抗体。因此，结合本发明来看，可以产生特异结合C5E10抗体所识别的相同肿瘤相关抗原的双特异性多肽(例如，CH2结构域缺失的抗体)，并以偶联或未偶联形式用于治疗赘生性病症。在特别优选的实施方案中，所述结合分子来源于或者包含C5E10抗体的抗原结合结构域的全部或部分，C5E10抗体如ATCC保藏号为PTA-865的杂交瘤细胞系所分泌的。然后可以将得到的结合分子象下文描述的那样偶联于放射性核素，并按照本文的方法施用于患有前列腺癌的患者。
在另一实施方案中，可以在本发明结合分子中包含配体，例如用来赋予对特定受体的结合能力，或者在结合分子中加上受体，用于例如从循环中去除配体。所述双特异性结合分子可以包含的示例性配体及其受体包括：
a.细胞因子或细胞因子受体
细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能活化具有多效性作用。各种细胞因子或其受体结合部分均可以用于本发明融合蛋白中。示例性细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)，集落刺激因子(CSF)(例如，粒细胞CSF(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)，和单核细胞巨噬细胞CSF(M-CSF))，肿瘤坏死因子(TNF)α和β，及干扰素如干扰素-α、β或γ(美国专利第4,925,793和4,929,554号)。
细胞因子受体典型地由配体特异的α链和共同的β链组成。示例性细胞因子受体包括GM-CSF、IL-3(美国专利第5,639,605号)、IL-4(美国专利第5,599,905号)、IL-5(美国专利第5,453,491号)、IFNγ(EP0240975)的受体，和TNF受体家族(如，TNFα(如，TNFR-1(EP 417,563)、TNFR-2(EP 417,014)淋巴毒素β受体)。
b.粘附蛋白或其受体
粘附分子是允许细胞彼此相互作用的膜结合蛋白。各种粘附蛋白，包括白细胞归巢受体和细胞粘附分子，或其受体结合部分，均可以掺入本发明结合分子中。白细胞归巢受体在炎症期间表达在白细胞表面上，包括介导与细胞外基质成分结合的β-1整联蛋白(如VLA-1、2、3、4、5和6)、和与血管内皮上的细胞粘附分子(CAM)结合的β2-整联蛋白(例如，LFA-1、LPAM-1、CR3和CR4)。示例性CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-1。其它CAM包括选择蛋白家族的那些，包括E-选择蛋白、L-选择蛋白和P-选择蛋白。
c.趋化因子或其受体
趋化因子-刺激白细胞向感染位点迁移的趋化蛋白-也可以掺入本发明结合分子中。示例性趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、嗜中性粒细胞趋化因子和RANTES(受活化调节的、正常由T细胞表达和分泌的)。
d.生长因子或生长因子受体
生长因子或其受体(或其受体结合部分或配体结合部分)或与它们结合的分子可以掺入本发明结合分子中。示例性生长因子包括血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)和其同种型(美国专利第5,194,596号)；表皮生长因子(EGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心房钠尿因子(ANF)；肝生长因子(HGF；美国专利第5,227,155和6,099,541号)、神经营养因子例如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子例如NGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)(美国专利第4,889,919、4,545,075、5,910,574和5,877,016号)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β(WO 90/14359)，骨诱导因子包括骨形成蛋白(BMP)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II；美国专利第6,403,764和6,506,874号)；促红细胞生成素(EPO)；干细胞因子(SCF)，血小板生成素(c-Mpl配体)，和Wnt多肽(美国专利第6,159,462号)。
可以使用的示例性生长因子受体包括EGF受体(EGFR)；VEGF受体(如，Flt1或Flk1/KDR)、PDGF受体(WO 90/14425)；HGF受体(美国专利第5,648,273和5,686,292号)，IGF受体(如IGFR1和IGFR2)，和神经营养受体包括结合NGF、BNDF和NT-3的低亲和受体(LNGFR)，也称作p75NTR或p75，以及作为受体酪氨酸激酶trk家族成员的高亲和受体(如trkA、trkB(EP455,460)、trkC(EP 522,530))。在另一实施方案中，靶向IGFR1和VEGF两者。在另一实施方案中，靶向VLA4和VEGF。
还可靶向其它细胞表面受体和/或其配体(如，TNF家族受体或其配体(如本文更详细描述的)。
e.激素
用作本发明结合分子中靶向剂的示例性生长激素或与其结合的分子包括肾素、人生长激素(HGH；美国专利第5,834,598号)、N-甲硫氨酰基人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素(PTH)；甲状腺刺激激素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利第5,157,021和6,576,605号)；滤泡刺激激素(FSH)、降钙素、黄体生成素(LH)、瘦蛋白、胰高血糖素；铃蟾肽(bombesin)；促生长素；Mullerian抑制物；松弛素和松弛素原；促性腺激素相关肽；催乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白；或mullerian抑制物。
f.凝血因子
在本发明结合分子中用作靶向剂的示例性血液凝结因子包括凝血因子(例如因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII、von Willebrand因子)；组织因子(美国专利第5,346,991、5,349,991、5,726,147和6,596,84号)；凝血酶和凝血酶原；纤维蛋白和纤维蛋白原；纤溶酶和纤溶酶原；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人类尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。
C.融合蛋白
本发明还涉及包含一或多个免疫球蛋白结构域的结合分子。在一实施方案中，本发明的融合蛋白包含结合结构域(其包含至少一个结合位点)和二聚化结构域(其包含至少一个重链部分)。例如，在一实施方案中，本发明的结合分子可包含至少一个人源化B3F6结合位点和二聚化结构域。在一实施方案中，所述融合蛋白是双特异性的(有一个对第一靶的结合位点，和对第二靶的第二结合位点)。在一实施方案中，所述融合蛋白是多价的(有针对相同靶分子的两个结合位点)。
在一实施方案中，所述融合蛋白包含B3F6结合位点、至少一个重链结构域和合成连接肽。
文献中报道的示例性融合蛋白包括以下物质的融合：T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon等人，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等人，Nature 344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等人，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.第115卷，摘要No.1448(1991))。
在一实施方案中，当制备本发明融合蛋白时，编码结合结构域(例如，人源化B3F6结合结构域)的核酸C-末端与编码免疫球蛋白恒定结构域序列N-末端的核酸融合。N-末端融合也是可能的。在一实施方案中，融合蛋白包含CH2和CH3结构域。还可以在恒定区Fc部分的C末端，或者重链CH1紧邻N末端的位置或者轻链中的相应区域进行融合。
在一实施方案中，配体或受体结构域的序列与免疫球蛋白分子Fc区的N末端融合。还可能将整个重链恒定区与配体或受体结构域的序列融合。在一实施方案中，用于融合的是刚好从铰链区中化学上界定了IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，假设重链恒定区的第一个残基在位点114)或者其它免疫球蛋白中类似位点的上游开始的一段序列。进行融合的确切位点并不重要；特定位点是熟知的并可以被选择以优化所述分子的生物活性、分泌或结合特点。制备融合蛋白的方法是本领域已知的。
对于双特异性融合蛋白，所述融合蛋白被组装成多聚体，特别是异二聚体或异四聚体。通常，这些组装好的免疫球蛋白具有已知单元结构。IgG、IgD和IgE均以基本的四链结构单元的形式存在。在更高分子量免疫球蛋白中是四链单元的重复；IgM一般是由二硫键连接在一起的四链基本单元的五聚体。IgA球蛋白，以及有时IgG球蛋白，可能还会以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况中，四个单元中的每一个可能是相同或不同的。
例如WO0069913A1和WO0040615A2中教导了融合蛋白。融合蛋白可以利用本领域熟知的方法来制备(参见，例如美国专利第5,116,964和5,225,538号)。通常，配体或受体结构域通过C-末端融合到重链(或重链部分)恒定区的N-末端，代替可变区。优选在融合前将配体结合受体中任何跨膜区或者脂质或磷脂锚识别序列灭活或缺失。将编码配体或受体结构域的DNA用限制性内切酶在编码所需ORF片段的DNA的5’和3’端或者附近进行切割。然后将得到的DNA片段容易地插入编码重链恒定区的DNA。可以根据经验挑选进行融合的确切位点以便优化可溶性融合蛋白的分泌或结合特性。然后编码融合蛋白的DNA被转染到宿主细胞内进行表达。
III.合成的连接肽
在一实施方案中，本发明二聚体的至少一条多肽链包含合成连接肽。在一实施方案中，本发明二聚体的至少两条链包含连接肽。在优选实施方案中，本发明二聚体的两条链包含连接肽。
在一实施方案中，可以用连接肽将两个重链部分符合读框地连接到单个多肽链中。例如，在一实施方案中，本发明的连接肽可以用于将CH3结构域(或合成CH3结构域)与铰链区(或合成铰链区)融合。在另一实施方案中，本发明的连接肽可用于将CH3结构域(或合成CH3结构域)融合到CH1结构域(或合成CH1结构域)上。还有一实施方案中，连接肽可以作为铰链区(或合成铰链区)和CH2结构域(或合成CH2结构域)之间的间隔肽。
在另一实施方案中，CH3结构域可以被融合到胞外蛋白结构域上(例如，VL结构域(或合成结构域)、VH结构域(或合成结构域)、CH1结构域(或合成结构域)、铰链区(或合成铰链)，或者融合到受体的配体结合部分或配体的受体结合部分上)。例如，在一实施方案中，VH或VL结构域借助连接肽(连接肽的C-末端连着CH3结构域的N-末端，连接肽的N-末端连着VH或VL结构域的C-末端)被融合到CH3结构域上。在另一实施方案中，CH1结构域借助连接肽(连接肽的C-末端连着CH3结构域的N-末端，连接肽的N-末端连着CH1结构域的C-末端)融合到CH3结构域上。在另一实施方案中，本发明的连接肽可以用于将CH3结构域(或合成CH3结构域)融合到铰链区(或合成铰链区)或其部分上。还有一实施方案中，连接肽可以作为铰链区(或合成铰链区)和CH2结构域(或合成CH2结构域)之间的间隔肽。
在一实施方案中，连接肽可以包含gly/ser间隔子或由它组成。例如，可以使用含有短氨基酸间隔序列GGSSGGGGSG(SEQ ID No.8)的结构域缺失构建体(CH2[gly/ser])，间隔序列取代了CH2结构域和下游铰链区。在另一实施方案中，连接肽包含氨基酸序列IGKTISKKAK(SEQ ID NO：15)。
在另一实施方案中，连接肽可以包含免疫球蛋白铰链区的至少一部分。铰链结构域可以细分成三个不同的区：上游、中游和下游铰链区(Roux等人.J.Immunol.1998161：4083)。包含对IgG1和IgG3铰链的这些区域的多肽序列显示在表3。例如，可以构建将来源于不同抗体同种型的铰链元件联合起来嵌合铰链结构域。在一实施方案中，连接肽可包含IgG1链区的至少一部分。在另一实施方案中，连接肽可以包含IgG3铰链区的至少一部分。在另一实施方案中，连接肽可以包含IgG1铰链区的至少一部分和IgG3铰链区的至少一部分。在一实施方案中，连接肽可以包含IgG1上游和中游铰链以及单个IgG3中游铰链重复基序。
表3：IgG1、IgG3和IgG4铰链区
示例性连接肽教导于例如WO 06/74397。
在一实施方案中，本发明的连接肽包含非天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域，例如所述铰链区结构域天然情况下不会见于包含该铰链区结构域的多肽，和/或该铰链区结构域被改变而使它的氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域不同。在一实施方案中，可以对铰链区结构域进行突变以便制得本发明的连接肽。在一实施方案中，本发明连接肽包含的铰链结构域不含有天然存在数量的半胱氨酸，即该连接肽包含的半胱氨酸数目比天然存在的铰链分子要少或多。在一个优选实施方案中，在多肽中引入所述连接肽得到组合物，其中50％、60％、70％、80％或90％以上的二聚体分子以两个重链部分借助至少一个链间二硫键连在一起的形式存在。
在本发明的一实施方案中，连接肽包含铰链区结构域，该结构域在与Kabat编号系统中氨基酸位点243(位点230，EU编号系统)对应的氨基酸位点含有脯氨酸残基。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号系统中氨基酸位点244(位点246，EU编号系统)对应的氨基酸位点含有丙氨酸残基。在另一实施方案中，本发明连接肽在与位点245(Kabat编号系统；位点247，EU编号系统))对应的氨基酸位点包含脯氨酸残基。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号系统的位点239(位点226，EU编号系统)对应的氨基酸位点包含半胱氨酸残基。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号系统的位点239(位点226，EU编号系统)对应的氨基酸位点包含丝氨酸残基。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号系统的位点242(位点229，EU编号系统)对应的氨基酸位点包含半胱氨酸残基。在一实施方案中，连接肽在与Kabat编号系统的位点242(位点229，EU编号系统)对应的氨基酸位点包含丝氨酸残基。
在一实施方案中，可以挑选连接肽以便优先合成多肽的特定同种型，例如其中两个重链部分借助二硫键连接或者不借助二硫键连接。例如，如WO 2006074397实施例中的描述，G1/G3/Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：26)、G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：5)、Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：33)和Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQID NO：32)，连接肽导致仅产生A型CH2结构域缺失抗体，没有可检测的B型。相反，CH2结构域缺失的Cys242Ser：Pro243(SEQ ID NO：31)，和CH2结构域缺失的Cys242Ser：Pro243Ala244Pro245(SEQ ID NO：32)，均优先产生B同种型。因此这些合成铰链区连接肽可以用于帮助合成A型或B型同种型。根据CH3结构域所有四种人类同种型之间的高同源性，这对抗体的任何同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)都是正确的。(包括相同和保守氨基酸残基，IgG1 CH3结构域与IgG2 CH3结构域95.13％同源，与IgG3 CH3 97.20％同源，与IgG4 CH3 96.26％同源)。除非另有说明，提及本发明连接肽和各种结合分子时的括号内的内容代表等同的术语。
在一实施方案中，本发明连接肽包含的铰链区结构域跟随着柔性gly/ser接头。示例性的连接肽示于表2和SEQ ID NO：5、25-34。人们会理解，产生这些示例性连接肽的变体形式可以通过向编码该连接肽的核苷酸序列中引入一或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而在连接肽中引入一或多个氨基酸取代、添加或缺失。例如，可以通过标准技术来引入突变，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，在一或多个非关键氨基酸残基进行保守性氨基酸取代，使得连接肽优先促进合成A型或B型的能力没有改变。因此，优选将免疫球蛋白多肽中的非关键氨基酸残基用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一实施方案中，可以将一串氨基酸用结构类似、而侧链家族成员的顺序和/或组成不同的氨基酸串取代。
表2：铰链区连接肽序列
本发明的连接肽可以是不同长度的。在一实施方案中，本发明连接肽长约15到约50个氨基酸。在另一实施方案中，本发明连接肽长约20到约45个氨基酸。在另一实施方案中，本发明连接肽长约25到约40个氨基酸。在另一实施方案中，本发明连接肽长约30到约35个氨基酸。在另一实施方案中，本发明连接肽长约24到约27个氨基酸。在另一实施方案中，本发明连接肽长约40到约42个氨基酸。
可以利用本领域已知技术将连接肽引入多肽序列。例如，在一实施方案中，可以采用重叠延伸剪接(SOE)方法(Horton，R.M.1993 Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)，第15卷：PCR Protocols：CurrentMethods and applications(PCR方案：最新方法和应用)B.A.White编辑)。通过DNA序列分析可以证实修饰。质粒DNA可以用于转化宿主细胞以便稳定地产生所得多肽。
在一实施方案中，将一个所述连接肽引入多肽产生的组合物包含具有至少两个结合位点和至少两个多肽链的结合分子，其中至少两个多肽链包含一个合成连接肽，而且其中50％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，60％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，70％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，80％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。在另一实施方案中，90％以上的分子表现为两个重链部分借助至少一个链间二硫键连接在一起的形式。
IV.结合分子的表达
如上所述对分离的遗传物质进行操作以便提供本发明多肽之后，通常将基因插入表达载体来引入宿主细胞，该宿主细胞可以用于产生所需量的多肽，进而提供要求保护的结合分子。
根据说明书和权利要求书目的，术语“载体”或“表达载体”用在本文中表示根据本发明用作将所需基因导入细胞并进行表达的媒介物的载体。正如本领域技术人员已知的，这类载体可以容易地从质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒中选择。通常，适用于本发明的载体包含选择标记、协助克隆所需基因的合适的酶切位点以及进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
根据本发明目的，有大量表达载体系统可以采用。例如，一类载体利用来源于动物病毒的DNA元件，其中所述动物病毒诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它载体涉及到利用带有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，可以通过导入一或多个能够用来挑选被转染宿主细胞的标记物来挑出DNA整合到染色体中的细胞。所述标记物可以给营养缺陷型宿主提供原养型能力、杀生物剂抗性(例如，抗生素)或对重金属(诸如铜)的抗性。选择标记基因可以直接连在待表达DNA序列上，或者通过共转化导入相同的细胞。mRNA的最佳合成可能还需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因和按照上面的讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选人类的)一起插入表达载体。优选的，用IDEC，Inc.的专有表达载体，也称为NEOSPLA(美国专利第6,159,730号)来实施。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主启动子、SV40复制原点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。在WO 2006074397的实施例中会看到，在引入可变和恒定区基因，转染CHO细胞，然后在含有G418的培养基中进行挑选和氨甲喋呤扩增后，发现该载体导致抗体的很高水平表达。美国专利第5,736,137和5,658,570号中也有关于载体系统的教导，这两篇专利均以参考的方式全文引入本文。该系统提供了高表达水平，例如＞30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统在例如美国专利第6,413,777号中公开。
在其它优选实施方案中，本发明的多肽可以用多顺反子构建体来表达，诸如2001年11月16日提交的共同待决美国临时申请第60/331,451号中公开的那些，该申请全文引入本文。在这些新的表达系统中，多个目的基因产物，诸如抗体的重链和轻链可以由单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地利用了内部核糖体进入位点(IRES)来提供在真核宿主细胞内较高水平的本发明多肽。适用的IRES序列在美国专利第6,193,980号中公开，该专利同样引入本文。本领域技术人员能够意识到，可以利用这类表达系统来高效地产生本申请公开的各种多肽。
更一般地，制备编码多肽(例如，经修饰的抗体)的单体亚基的载体或DNA序列之后，可以将表达载体导入合适的宿主细胞。即可以转化宿主细胞。质粒可以通过本领域技术人员所熟知的多种技术导入宿主细胞。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包被DNA进行的细胞融合、显微注射以及用完整病毒进行感染。参见，Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors(哺乳动物表达载体)″第24.2章，第470-472页Vectors(载体)，Rodriguez和Denhardt编辑.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。最优选的，质粒借助电穿孔导入宿主。将转化细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，检测重链和/或轻链蛋白合成。示例性的检测技术包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光激活的细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学及类似技术。
本文所用的术语“转化”将以广义使用，指将DNA导入受者宿主细胞而改变表型并从而造成受者细胞的变化。
依此类推，“宿主细胞”是指转化了利用重组DNA技术构建的编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的过程时，术语″细胞″和″细胞培养物″可以交换使用来指示抗体的来源，除非另外清楚地说明。换句话说，从“细胞”中回收多肽可能意味着从离心沉淀的完整细胞，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
用于蛋白表达的宿主细胞系最优选是来源于哺乳动物的；本领域技术人员有能力优先确定最适用于在其中表达期望基因产物的具体宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人类宫颈癌细胞)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾细胞)。尤其优选CHO细胞。宿主细胞系通常可以得自商业服务机构、美国组织培养物保藏中心或公开文献。
体外制备保证了能够扩大规模产生大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或者固定化或包埋细胞培养(例如，在中空纤维、微囊、琼脂糖微珠或陶瓷柱上进行)。如果必要和/或希望，可以在例如优先地生物合成了合成铰链区多肽之后，或者在进行文中描述的HIC层析步骤之前，通过常规的层析方法将多肽溶液进行纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
编码本发明多肽的基因也可以在非哺乳动物细胞内进行表达，诸如细菌或酵母或植物细胞。就此而言，应该意识到各种单细胞非哺乳动物微生物诸如细菌也可以被转化；即那些能够在培养基中或发酵生长的。易于被转化的细菌包括：肠杆菌科的成员，诸如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌科，诸如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。还应该进一步意识到，在细菌中进行表达时，多肽通常成为内涵体的一部分。多肽必须被分离、纯化，然后组装成功能性分子。当需要四价形式的抗体时，随后将亚基自组装成四价抗体(WO02/096948A2)。
除了原核生物，还可使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，而多种其它株系通常也可获得。对于在酵母中表达，通常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，Nature，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene，7：141(1979)；Tschemper等人，Gene，10：157(1980))。该质粒已包含TRP1基因，其为缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记(Jones，Genetics，85：12(1977))。trp1损伤作为酵母宿主细胞基因组特征的存在则提供有效环境来通过在不存在色氨酸时生长而检测转化。
V.结合分子的标记或偶联
本发明结合分子可以以非偶联形式来使用，或者偶联多种效应子即功能部分中的至少一种，从而例如便于检测靶或者给患者成像或治疗。本发明多肽可以在纯化之前或之后，或进行纯化时被标记或偶联。具体地，本发明多肽可偶联于细胞毒素(诸如放射性同位素、细胞毒性药物或毒素)、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子既能结合赘生性细胞，又结合效应细胞，诸如T细胞)、PEG或用于成像的可检测部分。在另一个实施方案，本发明多肽可以偶联到能降低肿瘤血管形成的分子。在其它实施方案，公开的组合物可包含偶联了药物或前药的本发明多肽。本发明的再其它实施方案包括偶联了特异性生物毒素(诸如蓖麻毒蛋白、白树毒蛋白、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或其细胞毒性片段的本发明多肽的用途。选择使用偶联或未偶联多肽取决于癌症的类型和发展阶段、所用的辅助治疗(例如化疗或外部放疗)以及患者的状态。应当意识到，本领域技术人员根据本文的教导可以容易地做出这类选择。
应当意识到，在以前的研究中，标记了同位素的抗肿瘤抗体已被成功地用于在动物模型中以及在一些情形下在人类中破坏实体瘤的细胞以及淋巴瘤/白血病细胞。示例性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通过产生电离辐射，引起核DNA多处链断裂，导致细胞死亡而作用。用于产生治疗偶联物的同位素典型地产生具有短路径长度的高能α或β粒子。这些放射性核素杀伤其邻近的细胞，例如该偶联物所附着的或已经进入的赘生性细胞。它们对非定位细胞很少或无作用。放射性核素基本上是无免疫原性的。
在与本发明相关的放射标记偶联物的使用方面，本发明多肽可以直接标记(诸如通过电离)或利用螯合剂来间接标记。本文所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均意味着螯合剂共价地连接结合分子，而至少一种放射性核素与该螯合剂相关联。这些螯合剂通常是指双官能螯合剂，因为它们既能结合多肽，又能结合放射性同位素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(″MX-DTPA″)和环己基二乙烯三胺五乙酸(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均意味着放射性核素直接共价地连到多肽上(通常借助氨基酸残基)。更具体的说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，标记定点到多肽上的特定位点，诸如仅存在于偶联物Fc部分的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和实验方案是适用于本发明的。例如，锝-99m标记的多肽可以通过配体交换过程来制备，即通过用锡离子溶液还原锝酸盐(Pertechnate)(TcO4-)，将被还原的锝螯合到Sephadex柱上，将多肽上样到该柱上；或者通过批量标记技术，例如将锝酸盐、还原剂(诸如SnCl2、缓冲液(诸如邻苯二甲酸钠钾溶液)，以及抗体一起培养。在任何情况中，用于直接标记抗体的优选放射性核素是本领域公知的，特别优选用于直接标记的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的131I。根据本发明的多肽可以用例如放射性碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(诸如次氯酸钠、氯胺T或类似物)，或者酶促氧化剂(乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)来进行衍生。但是，为了本发明的目的，特别优选的是间接标记方法。关于螯合剂和螯合偶联物的专利是本领域已知的。例如，Gansow的美国专利第4,831,175号涉及多重取代的二乙烯三胺五乙酸螯合物，和含有该螯合物的蛋白偶联体，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471号还涉及到多重取代的DTPA螯合物。这些专利均全文引入本文。其它适用的金属螯合剂的例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧代-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸或类似物。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的，在下文有大量的例子。其它一些适用的螯合剂，包括有待发现的，可能很容易地被技术人员识别，显然在本发明的范围内。
优选共同待审申请序列号08/475,813、08/475,815和08/478,967中用于协助螯合的相容螯合剂，包括特异性双官能螯合剂来提供对三价金属的高亲合性，显示升高的肿瘤对非肿瘤比率，骨吸收下降以及更高的放射性核素在体内目标部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤位点)的保留。但是，其它具备或不具备所有这些特点的双官能螯合剂也是本领域已知的，并且有益于肿瘤治疗。还应当意识到，与本文的教导一致的，为了诊断和治疗目的，多肽可以偶联不同的放射性标记。为了这个目的，前面提到的共同待审申请(以参考的方式全文引入本文)公开了放射性标记的治疗偶联物，其用于在施用治疗抗体前进行肿瘤诊断“成像”。“In2B8”偶联物包含对人类CD20抗原具有特异性的鼠单克隆抗体2B8，其借助双官能螯合剂连接于111In，其中所述螯合剂是包含1∶1混合的1-异硫氰酸苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰酸苄基-DTPA的MX-DTPA(二乙烯三胺五乙酸)。111In是特别优选的诊断放射性核素，因为在约1到约10mCi可以安全地施用而没有可检测到的毒性；成像数据通常可以预测后续的90Y标记的抗体分布。多数成像研究使用5mCi111In标记的抗体，因为这个剂量既安全又比更低剂量的成像效率高，最佳成像出现在施用抗体后的3到6天。参见，例如Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.Med.26：67(1985)。
如上文所述，有许多放射性核素可以用于本发明，本领域技术人员可以容易地确定各种情况下，哪种放射性核素是最合适的。例如，131I是公知用于靶向免疫治疗的放射性核素。然而，131I的临床应用可能受到几个因素的限制：物理半衰期为8天；碘化抗体在血液和肿瘤部位的脱卤作用；以及发射特性(例如，γ成分高)，这对肿瘤局部剂量蓄积可能是次优的。随着更佳螯合剂的出现，在蛋白上连接金属螯合基团的能力提高了利用其它放射性核素诸如111In和90Y的机会。90Y提供了几个用于放射免疫治疗应用的优势：90Y的半衰期是64小时，足够抗体在肿瘤部位的积累；并且与例如131I不同，90Y是单纯的高能β射线源，在衰变过程中不产生γ辐射；范围在100到1,000细胞直径的组织内。另外，最低贯穿辐射量使得可以门诊施用90Y-标记的抗体。此外，细胞杀伤不要求标记抗体内在化，电离辐射的局部发射对没有靶分子的临近肿瘤细胞是致死的。
本领域技术人员会意识到，这些非放射活性的偶联物也可以根据选择的待偶联的试剂利用多种技术来组装。例如，通过例如将多肽与生物素的活化酯(诸如生物素N-羟基琥珀酰胺酯)进行反应来制备与生物素的偶联物。类似的，带有荧光标记的偶联物可以在存在偶联剂(例如前面列举的)的情况下制备，或者通过与异硫氰酸酯，优选异硫氰酸荧光素进行反应来制备。本发明多肽与细胞抑制剂/细胞毒性物质以及金属螯合剂的偶联物可以通过类似的方式制备。
许多效应子部分缺少可以连接抗体的适当的官能团。在一个实施方案，效应子部分例如药物或前药通过连接部分连到抗体上。在一个实施方案，所述连接部分含有能够在特定位点激活细胞毒性的化学键。合适的化学键是本领域公知的，包括二硫键、酸敏性键、光敏性键、肽酶敏感性键、在巯基和马来酰亚胺基团之间形成的硫醚键，以及酯酶敏感性健。最优选地，所述连接部分包含二硫键或硫醚键。与本发明一致的，所述连接部分优选包含活性化学基团。特别优选的活性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。在优选的实施方案，所述活性化学基团可以借助硫氢基之间的二硫键共价结合到效应子上。在一个实施方案，效应子分子被修饰以便含有硫氢基。本领域技术人员明白，硫氢基含有与氢原子结合的硫原子，在本领域通常又称为巯基，可以用″--SH″或″RSH″表示。
在一个实施方案，可以用连接部分将效应子部分与结合分子连接起来。本发明的连接部分可以是可切割的或不可切割的。在一个实施方案，可切割连接部分是氧化还原可切割连接部分，以使该连接部分在较低氧还电势的环境中是可切割的，这种环境诸如细胞质和其它游离巯基的分子浓度较高的区域。因为氧还电势的改变而可被切割的连接部分的例子包括那些含有二硫键的连接部分。切割刺激可以通过本发明结合蛋白被吸收到胞内提供，在这里细胞质的较低氧还电势促使连接部分被切割。在另一个实施方案，pH降低引发美登木素生物碱释放到靶细胞内。在许多生理或病理过程中涉及到pH的下降，诸如内体转运、肿瘤生长、发炎和心肌局部缺血。pH由生理值7.4下降到内体中的5-6，或者溶酶体中的4-5。可以用来靶向癌细胞的溶酶体或内体的酸敏感性连接部分的例子包括，见于诸如乙缩醛、缩酮、原酸酯、腙、三苯甲基、顺式乌头基或硫代氨甲酰的带有酸敏感性键的那些(参见例如，Willner等人，(1993)，Bioconj.Chem.，4：521-7；美国专利第4,569,789、4,631,190、5,306,809和5,665,358号)。其它示例性酸敏感性连接部分包括二肽序列Phe-Lys和Val-Lys(King等人，(2002)，J.Med.Chem.，45：4336-43)。切割刺激可以在摄取到胞内并运输到低pH的内体区室(例如溶酶体)时提供。其它示例性酸切割连接部分是含有两个或多个供两个或多个美登木素生物碱附着的酸可切割键的部分(King等人，(1999)，Bioconj.Chem.，10：279-88；WO 98/19705)。
可切割的连接部分可以是对生物供应的与特定靶细胞相关的切割试剂(例如，溶酶体或肿瘤相关酶)敏感。可以通过酶促切割的连接部分的例子包括但不限于，肽和酯。示例性可酶切连接部分包括对肿瘤相关蛋白酶，诸如组织蛋白酶B或血纤蛋白溶酶敏感的连接部分(Dubowchik等人，(1999)，Pharm.Ther.，83：67-123；Dubowchik等人，(1998)，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：3341-52；de Groot等人，(2000)，J.Med.Chem.，43：3093-102；de Groot等人，(1999)m 42：5277-83)。组织蛋白酶B可切割的位点包括二肽序列缬氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(Doronina等人，(2003)，Nat.Biotech.，21(7)：778-84)；Dubowchik等人，(2002)，Bioconjug.Chem.，13：855-69)。其它示例性酶切位点包括由4到16个氨基酸的寡肽序列形成的那些(例如，Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)，该位点可以被trouse蛋白酶，诸如甲拌磷寡肽酶(TOP)识别，该酶优先由嗜中性粒细胞、巨噬细胞和其它粒细胞释放。
在进一步实施方案，连接部分的形成是通过将本发明结合分子与下式连接分子反应：
X-Y-Z
其中：
X是附着部分；
Y是间隔子部分；且
Z是效应子附着部分。
术语“结合分子附着部分”包括使得接头能共价附着到本发明结合分子的部分。
所述附着部分可以包含，例如1-60个碳、氧、氮、硫原子的共价链，任选以氢原子和其它使得结合分子能行使其预期功能的取代基取代。附着部分可以包含肽、酯、烷基、烯基、炔基、芳基、醚、硫醚等官能团。优选地，附着部分的选择保证它能与包含至少一个抗原结合位点的多肽上的活性官能团发生反应，形成本发明的结合分子。附着部分的例子包括，例如氨基、羧基和硫氢附着部分。
氨基附着部分包括与多肽上的氨基反应，从而形成本发明结合分子的部分。氨基附着部分是本领域已知的。氨基附着部分的例子包括，活化脲(例如，其可与结合分子上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接部分)、醛(例如，其能与结合分子上的氨基发生反应)，以及活化的异硫氰酸酯(其能与结合分子上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接部分)。氨基附着部分的例子包括但不限于，N-琥珀酰亚胺基、N-磺基琥珀酰亚胺基、N-对酞内酰胺(phthahmidyl)、N-磺基对酞内酰胺、2-硝基苯、4-硝基苯、2，4-二硝基苯、3-磺酰基-4-硝基苯或3-羧基-4-硝基苯部分。
羧基附着部分包括能与多肽上的羧基基团发生反应，从而形成本发明结合分子的部分。羧基附着部分是本领域已知的。羧基附着部分的例子包括但不限于，活化的酯中间体和活化的羰基中间体，它们能与结合分子上的COOH基团发生反应，形成包含酯、硫酯或酰胺基团的连接部分。
硫氢(thiol)附着部分包括能与多肽上的硫氢基发生反应，从而形成本发明结合分子的部分。硫氢附着部分是本领域已知的。硫氢附着部分的例子包括但不限于活化的酰基(其能与结合分子上的巯基发生反应形成包含硫酯的连接部分)、活化的烷基(其能与结合分子上的巯基发生反应形成包含硫酯部分的连接部分)、Michael受体，诸如马来酰亚胺基团或丙烯基团(其能与结合分子上的巯基发生反应形成Michael型加成产物)、经由氧化还原反应与巯基发生反应的基团、活化的二硫化物基团(其能与结合分子上的巯基基团发生反应形成，例如包含二硫化物部分的连接部分)。其它硫氢附着部分包括丙烯酰胺、α-碘乙酰胺以及环丙烷-1，1-二羰基化合物。此外，硫氢附着部分可能含有这样的部分，其能将结合分子上的硫氢修饰形成另外的活性基团，连接部分可结合其上形成本发明的结合分子。
间隔子部分Y是含有一或多个氨基酸残基的共价键或共价原子链。它还可能包含0-60个碳、氧、硫或氮原子，任选被氢或其它使得结合分子能行使其预期功能的取代基所取代。在一个实施方案，Y包含烷基、烯基、炔基、酯、醚、羰基或酰胺部分。
在另一个实施方案，结合分子上的硫氢基被转化为活性基团，诸如活性羰基基团，诸如酮或醛。然后所述附着部分与酮或醛反应形成本发明期望的化合物。羰基活性附着部分的例子包括但不限于，肼、酰肼、O-取代的羟胺、α-β-不饱和酮，以及H2C＝CH-CO-NH-NH2。附着部分和修饰可用于形成本发明结合分子的硫氢分子的方法的其它实例描述在Pratt，M.L.等人JAm Chem Soc.2003May 21；125(20)：6149-59；和Saxon，E.Science.2000Mar17；287(5460)：2007-10。
连接部分可以是能与效应子部分或其衍生物发生反应，形成本发明结合分子的分子。例如，效应子部分可以借助二硫键连接到分子的其它部分。在这种情况中，连接部分的选择使其能与合适的效应子部分衍生物发生反应，从而使得该效应子部分附着到本发明结合分子上。如上所述，可以选择在合适的环境中，接头能被切割的连接部分和/或整个接头。
特别优选的接头分子包括，例如3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(参见，例如Carlsson等人，Biochem.J.，173，723-737(1978))、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见，例如美国专利第4,563,304号)、4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(参见，例如CAS登记号341498-08-6)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)(参见，例如Yoshitake等人，Eur.J.Biochem.，101，395-399(1979))和4-甲基-4-[2-(5-硝基-吡啶基)-二硫代]戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SMNP)(参见，例如美国专利第4,563,304号)。最优选的用于发明组合物的接头分子是SPP、SMCC和SPDB。在一个优选实施方案中，用SPDB将效应子部分连接到本发明结合分子上。
在本发明一个实施方案中，用接头分子SPP、SMCC或SPDB来连接抗Cripto结合分子于美登木素生物碱。在一个实施方案中，用SPDB交联剂来连接DM4于抗Cripto结合分子。在另一个实施方案中，用SPDB来连接DM1于抗Cripto结合分子。在另一个实施方案中，用SMCC来连接DM4于抗Cripto结合分子。在另一个实施方案中，用SMCC来连接DM1于抗Cripto结合分子。在另一个实施方案中，用SPP来连接DM4于抗Cripto结合分子。在另一个实施方案中，用SPP来连接DM1于抗Cripto结合分子。在优选实施方案中，该抗Cripto结合分子是人源化的抗Cripto抗体。
优选用于本发明的细胞毒性效应子部分是细胞毒性药物，特别是用于癌症疗法的那些。如本文使用，“细胞毒素或细胞毒性剂”意味着对细胞生长和增殖有害的任何试剂，其可能表现为使细胞或恶性肿瘤减少、抑制或破坏。示例性的细胞毒素包括但不限于，放射性核素、生物毒素、酶促活性毒素、细胞抑制剂或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体和生物应答调节剂(诸如细胞因子)。任何阻滞或减慢免疫反应性细胞或恶性肿瘤细胞生长的细胞毒素均在本发明范围内。
示例性细胞毒素通常包括，细胞抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、和类似的细胞毒素。适用于本发明的示例性细胞抑制剂包括烷化物质，诸如双氯乙基亚胺(mechiorethamine)、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物，诸如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。
用于偶联的特别优选的部分是美登木素生物碱。美登木素生物碱最初分离自东非一种属于美登木属Maytenus的灌木，但后来发现它也是土壤细菌如珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的代谢物(参见如，美国专利第3,896,111号)。本领域已知的美登木素生物碱包括美登素(maytansine)、美登木醇(maytansinol)、美登木醇的C-3酯以及其它美登木醇类似物和衍生物(参见如，美国专利第5,208,020和6,441,163号)。美登木醇的C-3酯可以是天然存在的或合成衍生的。并且，天然存在和合成的C-3美登木醇酯可以归类为简单羧酸的C-3酯，或与N-甲基-L-丙氨酸衍生物形成的C-3酯，后者比前者细胞毒性更强。合成的美登木素生物碱类似物是本领域已知的，在例如Kupchan等人，J.Med.Chem.，21，31-37(1978)中描述。制备美登醇及其类似物和衍生物的方法描述在例如美国专利第4,151,042号。
适合作为抗体偶联物的美登木素生物碱可以用本领域已知的方法从天然来源分离，合成制备，或者半合成制备。此外，可以通过任何合适的方式对美登木素生物碱进行修饰，只要最后的偶联分子保留了足够的细胞毒性。
特别优选的包含连接部分、含有活性化学基团的美登木素生物碱是美登木醇的C-3酯和它们的类似物，其中连接部分含有二硫键，附着部分包含N-琥珀酰亚胺或N-磺基琥珀酰亚胺酯。美登木素生物碱上的许多位点可以作为例如通过效应子附着部分化学连接连接部分的位置。例如，带有羟基的C-3位点、修饰有羟甲基的C-14位点、修饰有羟基的C-15位点以及带有羟基基团的C-20位点都有用。连接部分最优选与美登木醇的C-3位点连在一起。最优选地，与本发明组合物和方法一起使用的美登木素生物碱是N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(-3-巯基-1-氧代丙基)-美登木素(DM1)或N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登木素(DM4)。已知这些不同的连接部分释放在人体具有不同半衰期的偶联的抗体。特别是，SPP-DM1接头偶联物在人体具有大约24-48小时的半衰期，SPDB-DM4接头偶联物在人体具有大约5天的半衰期，SMCC-DM1接头偶联物在人体具有大约6天的半衰期。特别是，SPP和SPDB接头产生可重新进入相邻肿瘤细胞的代谢物，产生所谓的“旁观”效应，可促进杀伤肿瘤细胞。相反，SMCC-DM1接头系统不产生可重新进入相邻肿瘤细胞的代谢物。因此，包含SMCC-DM1接头系统的抗体偶联物如B3F6-SMCC-DM1可用于治疗不需要“旁观”杀伤活性的肿瘤。包含SPDB-DM4接头系统的抗体偶联物如B3F6-SPDB-DM4可用于在需要和不需要“旁观”杀伤活性的两类肿瘤抑制肿瘤生长。
带有其它化学键的连接部分，和其它美登木素生物碱一样也可以用于本发明的情况。可以引入所述连接部分的其它化学键的特定例子包括以上描述的，诸如酸敏性键、硫醚键、光敏感性键、肽酶敏感性键和酯酶敏感性键。制备带有连接部分和/或效应子附着部分的美登木素生物碱的方法描述在例如美国专利第5,208,020、5,416,064和6,333,410号。
美登木素生物碱的连接部分(和/或效应子附着部分)通常，并且优选是更大的接头分子的一部分，所述接头分子是用来将抗体与美登木素生物碱连在一起的。任何合适的接头分子都可以用于本发明，只要该连接部分保留了美登木素生物碱和抗体各自的细胞毒性和靶向特点。连接部分通过化学键(如上所述)将美登木素生物碱连到抗体上，因此美登木素生物碱和抗体是彼此化学偶联(例如，共价结合)的。希望连接部分通过二硫键或硫醚键将美登木素生物碱化学偶联到抗体上。最优选的，抗体借助二硫键化学偶联到美登木素生物碱。
本发明优选的偶联的结合分子是与美登木素生物碱例如DM4或DM1偶联的抗Cripto抗体。本发明优选的抗Cripto抗体-美登木素生物碱偶联物具有连接于一分子抗体的平均约0.5到10分子的美登木素生物碱，如DM4。优选地，有连接于一分子抗体的平均约1到8分子的美登木素生物碱，如DM4，或有连接于一分子抗体的平均约2到6分子的美登木素生物碱，如DM4。优选地，有连接于一分子抗体的平均约3到5分子的美登木素生物碱，如DM4，更优选地，有连接于一分子抗体的平均约3到4分子的美登木素生物碱，如DM4。在优选实施方案，有连接于一分子抗体的平均约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0分子的美登木素生物碱，如DM4。在特别优选的实施方案，本发明的抗Cripto抗体-美登木素生物碱偶联物具有连接于一分子抗体的平均约3.5分子的美登木素生物碱，如DM4。在一实施方案，本发明的抗Cripto抗体-美登木素生物碱偶联物的至少50％具有2、3或4分子的美登木素生物碱，如DM4。
其它优选的细胞毒试剂种类包括，例如蒽环霉素(anthracycline)族药物、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶族药物、diynenes以及鬼臼毒素。这些种类中特别有用的成员包括，例如阿霉素、洋红霉素(carminomycin)、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星(doxorubicin)、氨基喋呤(aminopterin)、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤(methopterin)、普卡霉素(mithramycin)、链黑菌素(streptonigrin)、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、喃氟啶(ftorafur)、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞嘧啶(cytosinearabinoside)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷，美法仑(melphalan)，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，异长春碱(leurosidine)，长春地辛(vindesine)，环氧长春碱(leurosine)等等。适用于本文教导的其他细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷(taxane)，松胞菌素B(cytochalasin B)，短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根碱(emetine)，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(Puromycin)以及它们的类似物或同系物。激素和激素拮抗剂，诸如皮质类固醇激素，例如泼尼松(Prednisone)；孕激素，例如羟基孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone)；雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，例如睾酮，以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特(aminogluthetimide)也适用于本文的教导。正如前面提到的，本领域技术人员可以对所需化合物进行修饰，从而使得该化合物的反应更方便制备本发明偶联物。
特别优选的细胞毒素的一个实例包含抗肿瘤抗生素中烯二炔(enediyne)家族的成员或衍生物，包括加里刹霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素或达内霉素。这些毒素非常强力，通过切割核DNA导致细胞死亡而起作用。与能被体内切割产生许多无活性但是有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，象加里刹霉素、埃斯培拉霉素和其它烯二炔类毒素是基本没有免疫原性的小分子。这些非肽毒素是通过以前用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接到二聚体或四聚体上的。这类连接技术包括经由存在于构建体Fc部分上的N-连接的糖残基发生的位点特异性连接。这种定点连接方法的益处是减少了连接对构建体的结合特性的可能影响。
应当意识到，除了其它细胞毒素，多肽也可以与生物毒素结合，所述生物毒素诸如蓖麻毒蛋白(ricin)亚基A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒毒素(botulinum)、蓝藻毒素、石房蛤毒素(saxitoxin)、志贺毒素(shigatoxin)、破伤风、河豚毒素(tetrodotoxin)、单端孢霉毒素(trichothecene)、致震颤真菌毒素(verrucofogen)或毒性酶。优选地，利用允许直接表达抗体-毒素构建体的遗传工程技术来制备这些构建体。其它能与本发明多肽相结合的生物应答调节剂包含细胞因子，诸如淋巴因子和干扰素。就本说明书公开内容而言，本领域技术人员应当能容易地利用常规技术制成这类构建体。
另一类可以与所公开多肽联合使用的相容细胞毒素是放射增敏药物，其可能被有效地定向到肿瘤或免疫反应性细胞。这类药物增加了对电离辐射的敏感性，从而提高放疗的效力。被肿瘤细胞内在化的抗体偶联物会将放射增敏剂递送到细胞核附近，那里的放射增敏作用最强。未结合的连接有放射增敏剂的本发明多肽会很快从血液中清除，使其余的放射增敏剂局限于目标肿瘤中，而在正常组织中只有最低的摄取。从血液中迅速清除后，以三种方式之一进行辅助放疗：1)特异针对肿瘤的体外照射，2)直接植入肿瘤的放射性，或3)用相同的靶向抗体进行系统放射免疫疗法。这个方法的一个很有吸引力的变化是将治疗放射性同位素附着到放射增敏的免疫偶联物上，从而给患者提供了施用单种药物的方便。
在一个实施方案，可偶联增强多肽稳定性或效力的部分。例如，在一个实施方案，PEG可偶联于本发明多肽以增加其体内半衰期。Leong，S.R.，等人2001.Cytokine 16：106；2002；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531；或Weir等人2002.Biochem.Soc.Transactions 30：512。
如前面提到的，相容细胞毒素可以包含前药。本文所用的术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，与母体药物相比，它们对肿瘤细胞的细胞毒性低，能被酶促活化或转化成活性更高的母体形式。适用于本发明的前药包括但不限于，含磷酸酯的前药、含硫代磷酸酯的前药、含硫酸酯的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药，含有任选地取代的苯氧基乙酰胺的前药或含有任选地取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们能被转化为细胞毒性更高的游离型药物。在一个实施方案，细胞毒性剂，诸如美登木素生物碱被以前药的形式施用，在二硫键被水解后释放。可以衍生成前药形式用于本发明的细胞毒性药物的进一步例子包括上面描述过的那些化疗剂。
VI.结合分子的施用
制备并将本发明多肽施用受治疗者的方法是本领域技术人员所熟知或容易确定的。本发明多肽的施用途径可以是口服、肠胃外、经吸入或表面局部。本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。通常优选静脉内、动脉内、皮下和肌内形式的肠胃外施用方式。虽然所有这些施用方式都明显被认为是本发明范围内的，但一种施用形式是用于注射，特别是静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。一般来说，适用于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，Polysorbate)，任选稳定剂(例如人类白蛋白)等。但是，在与本文教导相容的其它方法中，可以将多肽直接递送到有害细胞群体的部位，从而提高患病组织与治疗剂的接触。
用于肠胃外给药的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)以及可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外载体包括磷酸钠溶液、Ringer′s右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的Ringer′s溶液，或者不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于Ringer′s右旋糖的等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更具体地说，适用于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(当是水溶性时)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在这些情况中，所述组合物必须是无菌的，流动程度应达到容易进行注射器操作。其应当在制造和储存条件下是稳定的，优选抗微生物(诸如细菌和真菌)污染作用地保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)，和其合适混合物。可以利用包被诸如卵磷脂、在分散体的情况中维持所需颗粒大小，以及使用表面活性剂来保持合适的流动性。防止微生物的作用可以用各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包含能延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以将注射组合物的吸收延长。
在任何情况中，可将所需量活性化合物(例如，多肽自身或联合其它活性试剂)、与所需的如本文所列的一或多种成分的组合，一起引入合适溶剂中，随后过滤除菌制得无菌注射液。通常将活性化合物引入含有基本分散体介质和以上列举的其它所需成分的无菌载体，制得分散体。对于制备无菌注射液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤溶液产生出活性成分和任何其它所需成分的粉末。用于注射的制剂根据本领域已知的方法在无菌条件下加工、装入容器(诸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶)，封口。进一步，可以将制剂包装，以药盒的形式出售，象共同待审的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中描述的那些，这两份申请以参考的方式引入本文。这类制造产品优选带有标签或包装插页，表明相关组合物用于治疗患有或易患自身免疫或肿瘤病症的受治疗者。
对于上述病症的治疗，本发明组合物的有效剂量随着许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理学状况、患者是人类还是动物、施用的其它药物、和治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人类哺乳动物包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
对于用抗体进行被动免疫，剂量范围可以是大约0.0001至100mg/kg、更通常是0.01至50mg/kg，甚至更通常是0.1至40mg/kg(如，0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围内的任何剂量，优选地至少1mg/kg。上述范围中的中间剂量也意为在本发明范围内。
剂量也可变化，例如从0.0037至3700mg/m2，更通常从0.37至1850mg/m2，甚至更通常从3.7mg/m2至1480mg/m2。剂量还可变化，例如从1至1000mg/m2，更通常从6mg/m2至500mg/m2，更通常从10mg/m2至200mg/m2，更通常从20至80mg/m2，甚至更通常从50-75mg/m2，最通常从60-70mg/m2。剂量还可从24至90mg/m2变化。上述范围中的中间剂量也意为在本发明范围内。
可以每日、隔日、每周、或根据任何其它通过经验分析确定的方案，向受治疗者施用此剂量。一个示例性疗法需要长期，例如至少6个月的多剂量施用。其它示例性治疗方案需要每两周施用一次(两周地)、每三周施用一次、每四周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用1次。在本发明一个实施方案，示例性治疗方案需要每三周施用一次(如，与美登木素生物碱偶联的人源化抗Cripto抗体，如B3F6.1-DM4)。在特别优选的实施方案，每三周施用一次(如，与美登木素生物碱偶联的人源化抗Cripto抗体，如B3F6.1-DM4)的示例性治疗方案特别有用于治疗结肠癌。在另一个实施方案，示例性治疗方案需要单次剂量施用(如，与美登木素生物碱偶联的人源化抗Cripto抗体，如B3F6.1-DM4)。在优选的实施方案，单次剂量(如，与美登木素生物碱偶联的人源化抗Cripto抗体，如B3F6.1-DM4)的示例性治疗方案特别有用于治疗已建立的或晚期肿瘤。在特别优选的实施方案，单次剂量(如，与美登木素生物碱偶联的人源化抗Cripto抗体，如B3F6.1-DM4)的示例性治疗方案特别有用于治疗已建立的或晚期结肠肿瘤。
示例性的剂量安排包括如以5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg或40mg/kg单次剂量施用。示例性的剂量安排进一步包括以如25-40mg/kg每两周的剂量。剂量安排包括以如5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg或40mg/kg每两周的剂量。在一个实施方案，示例性的剂量安排包括以如25-40mg/kg的剂量，每3周施用一次。在一个实施方案，示例性的剂量安排包括以如5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg或40mg/kg的剂量，每3周施用一次。上述范围中的中间剂量也意为在本发明范围内。在一些方法，具有不同结合特异性的两或多种单克隆抗体同时施用，这种情况施用的每种抗体的剂量可能落入所示范围。
本领域技术人员应理解，本文描述的示例性剂量也可表示为受治疗者的每体表面积(BSA)施用的结合分子的量(如以毫克)，如mg/m2。受治疗者的体表面积可根据本领域已知方法计算。例如，体表面积可使用如下Mosteller公式计算：
BSA(m2)＝([身高(cm)x体重(kg)]/3600)1/2
计算BSA的其它方法也是本领域已知的，包括DuBois和DuBois公式、Haycock公式、Gehan和George公式、和Boyd公式。任何指定物种中以mg/kg表示的剂量可转换为以mg/m2表示的等价剂量，通过将剂量乘以适于该物种的“体表面积体重比”(km)。代表性物种的km因子包括以下：小鼠的3.0kg/m2；大鼠的5.9kg/m2，猴的12kg/m2，犬的20kg/m2，人类儿童的25kg/m2，和成年人类的37kg/m2(参见例如，Freireich，EJ等人.Cancer Chemother.Rep.196650(4)：219-244)。因此，例如，在成年人类，100mg/kg的剂量相当于100mg/kgx37kg/m2＝3700mg/m2。
在一个实施方案，本发明的结合分子可以多次施用。单次剂量之间的间隔可以是例如，每天、每周、每两周、每三周、每月或每年。间隔也可以是不规律的，通过测量患者血液中多肽或靶分子的水平来决定。在一些方法中，调节剂量使血浆结合分子或毒素浓度达到例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml。可选地，结合分子可以以缓释剂型施用，这种情况需要较低的施用频率。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而不同。通常，人源化抗体表现出最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人抗体。在一实施方案中，本发明人源化抗体(如，偶联的人源化抗体如B3F6.1-DM4)的半衰期是约100小时，或大约4.2天。在一实施方案中，可以未偶联的形式一次或多次施用本发明结合分子。在另一实施方案中，本发明多肽可以偶联形式多次施用。还有一实施方案中，本发明结合分子可以未偶联形式施用一次或多次，然后施用偶联形式的，或者反过来。
施用剂量和频率可以根据治疗是用于早期还是晚期恶性肿瘤而变化。在一种应用中，含有本发明抗体或其混合物的组合物以较低剂量施用。在此应用中，准确的剂量又取决于患者的健康状况和一般免疫状况，但是通常为0.1至25mg/剂，尤其是0.5至2.5mg/剂。可以以相对长的间隔长期施用相对低的剂量。一些患者可以在其有生之年持续接受治疗。
在其它治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例如，约1至400mg/kg结合分子如抗体/剂，对于放射免疫偶联物更通常使用5至25mg/kg的剂量，对于细胞毒素-药物偶联的分子使用更高剂量如5-50mg/kg)，直到减缓或终止疾病进程，优选地直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。之后，可以较低的剂量方案向患者施用。
在一个实施方案，本发明的结合分子(如，偶联于美登木素生物碱诸如DM4的人源化抗Cripto抗体)可施用于具有已建立的肿瘤，如相当大尺寸的肿瘤的患者。在一个实施方案，本发明的结合分子(如，偶联于美登木素生物碱诸如DM4的人源化抗Cripto抗体)可施用于具有晚期肿瘤，如复发肿瘤或抗性肿瘤，如对其它疗法不响应的肿瘤的患者。在这种治疗应用，可施用单次剂量(如，从约1-100mg/kg、5-50mg/kg，更优选地从约10-40mg/kg，甚至更优选地从15-30mg/kg，包括上述的中间剂量，包括如，15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg和30mg/kg)。
在一个实施方案，单次剂量的本发明结合分子产生抗肿瘤响应，其维持至少一周、两周、三周、四周、五周、六周、3个月、6个月或更久。在一个实施方案，多剂量的本发明结合分子，如每两周一次的剂量或每三周一次的剂量产生抗肿瘤响应，其维持至少一周、两周、三周、四周、五周、六周、3个月、6个月或更久。
在一实施方案中，可以用编码本发明结合分子的核酸分子(例如在载体中)来治疗受治疗者。编码多肽的核酸剂量在约10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μg DNA/患者的范围内。对于感染性病毒载体，剂量在每剂10-100或更多病毒粒子。
治疗剂可以通过肠胃外、表面局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内的方式施用用于预防性和/或治疗性治疗。抗体的施用优选以肌内注射或静脉内输注进行。在一些方法中，一些治疗抗体直接注射到颅内。一些方法中，抗体以缓释组合物或装置的形式给予，诸如MedipadTM装置。
A.联合其它药剂施用
任选地可将本发明药剂与其它对需要治疗(例如，预防性或治疗性)的病症或病状有效的药剂一起联合给药。优选的其它药剂是本领域公认的常规性施用于特定病症的药剂。
90Y标记的本发明多肽的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)范围在约5到约75mCi，更优选在约10到约40mCi。131I标记的抗体的单次治疗骨髓非清除性有效剂量在约5到约70mCi，更优选约5到约40mCi。131I标记的抗体的单次治疗清除有效剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30到约600mCi，更优选在约50到少于约500mCi。就嵌合抗体而言，由于其比鼠抗体更长的循环半衰期，碘-131标记的嵌合抗体的单次治疗非骨髓清除有效剂量在约5到约40mCi，更优选少于约30mCi。对于例如111In标记，成像标准通常少于5mCi。
虽然对于131I和90Y已取得了大量的临床经验，其它放射标记也是本领域已知的，曾被用于类似的目的。还有另外一些放射性同位素被用于成像。例如，其它与本发明范围相容的放射性同位素包括但不限于，123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At和213Bi。在这方面，α、β和γ放射源均与本发明相容。此外，参考本公开文本，应当承认本领域技术人员可以容易地确定哪些放射性核素与选定的治疗进程相匹配，而不需进行过多实验。用于这一目的，其它曾被用于临床诊断的放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga以及111In。抗体也曾被标记上各种放射性核素，可能用于定向免疫治疗(Peirersz等人.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素包括188Re和186Re，以及略微少见的199Au和67Cu。美国专利第5,460,755号提供了涉及到这些放射性同位素的另外数据，该专利以参考方式引入本文。
无论以偶联或未偶联形式使用本发明的结合分子，都应当意识到，本发明的主要优点是可以将这些多肽用于骨髓抑制患者，特别是正在进行，或已进行了辅助治疗，诸如放疗或化疗的那些患者。在其它优选实施方案中，多肽(也是偶联或未偶联形式)可以与化疗剂联合用于治疗方案中。本领域技术人员明白，这类治疗方案可能包含将本文公开的抗体与一或多种化疗剂顺序、同时、并行或同延施用。本发明这个方面特别优选的实施方案包括施用偶联了毒素的结合分子，例如偶联了美登木素生物碱，诸如D4美登木素生物碱。
虽然结合分子可以象上面描述的进行给药，应当强调的是在其它实施方案中，可以将偶联和未偶联多肽施用于本来健康的患者作为一线治疗剂。在这类实施方案中，可以将多肽施用于具有正常或平均红骨髓储备的患者，和/或施用于未曾并且没有正在进行辅助疗法(诸如体外照射或化疗)的患者。
但是，象上面讨论过的，本发明的选择实施方案包括将所述多肽施用于骨髓抑制患者，或者与一或多种辅助疗法，诸如放疗或化疗联合使用(即联合治疗方案)。如本文使用，联合或组合施用多肽和辅助疗法意味着顺序、同时、共延、并行、相伴或同期施用或应用所述疗法和本文公开的多肽。本领域技术人员会理解，施用或应用联合治疗方案的各种成分时应当定时以便提高治疗的整体效果。例如，应当以标准的已知治疗程序施用化疗剂，然后在几周内施用本发明放射免疫偶联物。相反，可以静脉内施用连接了细胞毒素的多肽，然后进行肿瘤局部的体外放射。在其他实施方案中，可以将多肽与一或多种选定的化疗剂在一次就诊时施用。技术人员(例如，有经验的肿瘤专科医生)根据选定的辅助疗法和本说明书的教导，能很容易地确定有效的联合治疗方案，而不需过多实验。
在此方面，可以理解，多肽(偶联或未偶联形式)和化疗剂的联合可以以任何顺序并在向患者提供治疗益处的任何时间段内施用。即，化疗剂和多肽可以以任何顺序或同时施用。在选定的实施方案中，本发明多肽向之前已经进行过化疗的患者施用。在其它实施方案中，多肽和化疗基本上同时或并行地施用。例如，可以给予正在经历化疗疗程的患者结合分子。在优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的1年内施用结合分子。在其它优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用多肽。在其它优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的4、3、2、或1周内施用多肽。在其它优选实施方案中，在选定的化疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用多肽。还可以理解，两种药剂或治疗可以在大约数小时或数分钟内(即，基本上同时地)施用。
此外，遵循本发明，骨髓抑制患者意味着任何血液计数下降的患者。本领域技术人员应当意识到，有多种血液计数参数被常规用作骨髓抑制的临床表征，可以很容易地测量患者体内的骨髓抑制程度。本领域认同的骨髓抑制量度的例子是中性粒细胞绝对计数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分骨髓抑制可能是多种生化病症或疾病的结果，或者更有可能的，是先前化疗或放疗造成的后果。这方面，本领域技术人员会明白，曾经接受常规化疗的患者一般会表现出红骨髓储备下降。正如上面讨论过的，这样的受治疗者通常不能用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)来治疗，因为会出现不能接受的副作用(诸如贫血或免疫抑制)，导致更高的死亡率或发病率。
在一个实施方案，本发明的结合分子(偶联或非偶联的)联合另外的药剂如化疗剂，如抗代谢物施用。在一个实施方案，结合分子联合另外的药剂(如，另外地或协同地)比其单独地在抑制肿瘤细胞生长上作用或表现更好。该实施方案中，联合另外的药剂如化疗剂施用结合分子比单独施用结合分子或另外的药剂如化疗剂更有效地抑制肿瘤细胞生长。优选地，联合疗法抑制肿瘤生长的例如50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。取决于采用的另外的药剂，本领域技术人员将易于确定适于这些方案的标准剂量和安排。在一个实施方案，另外的药剂是抗代谢物，如嘧啶类似物，如5’-氟尿嘧啶。在一个实施方案，另外的药剂是嘧啶类似物，如5’氟尿嘧啶。在一个实施方案，另外的药剂是嘧啶类似物，如5’-氟尿嘧啶，结合分子(如B3F6.1)偶联于毒素，诸如美登木素生物碱，如DM4。在一个实施方案，以30mg/kg的剂量施用5’-氟尿嘧啶。在一个实施方案，以最大耐受剂量施用5’-氟尿嘧啶。在一个实施方案，以30mg/kg的剂量施用5’-氟尿嘧啶，以15mg/kg的剂量施用结合分子，如偶联于美登木素生物碱(如DM4)的人源化抗Cripto抗体。联合施用本发明的结合分子(如，偶联于毒素诸如美登木素生物碱，如DM4的本发明的结合分子)与抗代谢物，诸如嘧啶类似物，如5’-氟尿嘧啶特别有用于治疗结肠癌。在优选实施方案，偶联于美登木素生物碱(如，DM4)的人源化抗Cripto抗体联合5’氟尿嘧啶施用以治疗结肠癌。
更具体的说，本发明所述偶联或未偶联多肽可以用来有效地治疗ANC低于约2000/mm3，或血小板计数低于约150,000/mm3的患者。更优选地，本发明的多肽可以用于治疗ANC低于约1500/mm3、低于约1000/mm3，或者更优选低于约500/mm3的患者。类似的，本发明的多肽可以用来治疗血小板计数低于约75,000/mm3、低于约50,000/mm3或者甚至低于约10,000/mm3的患者。更一般的来说，本领域技术人员可以容易地采用国家制定的指南和程序确定患者是否骨髓抑制。
如上文指出的，许多骨髓抑制患者已经经过了疗程，包括化疗、植入放疗或体外放射。在后一种情况中，体外放射源是用于对恶性肿瘤进行局部辐射的。对于植入放疗法，放射性试剂通过手术放置到恶性肿瘤内部，从而选择性地辐射疾病部位。任何情况中，本文公开的多肽都可以用于治疗表现出骨髓抑制的患者的病症，而不管是什么原因引起的骨髓抑制。
在这方面，应当进一步意识到，本发明的多肽可以与任何能消除、减少、抑制或控制赘生性细胞的体内生长的化疗剂组合起来使用(例如，提供联合治疗方案)。正如讨论过的，这类试剂经常导致红骨髓储备的下降。它的下降可能是全部或部分由于本发明化合物的骨髓毒性消除引发的，这有利地使得能够积极地治疗这些患者的瘤形成。在其它优选实施方案中，本文公开的放射标记免疫偶联物可以有效地与能提高赘生性细胞对放射性核素的易感性的放射增敏剂一起使用。例如，可以在放射标记的结合分子已基本从血流中清除，但在肿瘤部位仍维持在治疗有效水平时，施用放射增敏化合物。
考虑到本发明的这些方面，与本发明相容的示例性化疗剂包括烷化剂、长春花生物碱(例如，长春花新碱、长春花碱)、甲基苄肼、氨甲蝶呤、强的松。四药物联合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春花新碱(Oncovin)、甲基苄肼和强的松)非常有效地治疗各种类型的淋巴瘤，并包括本发明的优选实施方案。在MOPP的耐药性患者中，可以使用ABVD(例如，阿霉素、博来霉素、长春花新碱和达卡巴嗪)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花新碱、甲基苄肼和强的松)、CABS(洛莫司汀、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素和链脲霉素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博来霉素和长春花新碱)或BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春花新碱、甲基苄肼和强的松)联合。对于标准给药和安排，可参见Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas(恶性淋巴瘤)，在HARRISON′S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE(内科原理)1774-1788(Kurt J.Isselbacher等人编辑，第13版.1994)和V.T.DeVita等人，(1997)和其中引用的参考文献。这些疗法可以不经变化或根据具体患者的需要经过变化后与本文所述一种或多种本发明多肽联合使用。
可用于本发明范畴中的其它方案包括使用抗代谢物。本文所用的术语“抗代谢物”包括但不限于，叶酸类似物、嘌呤类似物和嘧啶类似物。叶酸类似物的非限制性例子包括，如，氨甲喋呤、培美曲塞和雷替曲塞。嘌呤类似物的非限制性例子包括，如，硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨。嘧啶类似物的非限制性例子包括，如，5’-氟尿嘧啶、氟尿苷和胞嘧啶阿拉伯糖苷。本发明优选的抗代谢物是嘧啶类似物。本发明特别优选的抗代谢物是5’-氟尿嘧啶。本领域技术人员将易于确定用于这些方案的每种的标准剂量和安排。
可用于本发明范畴的其它治疗方案包括使用单独烷化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥、或联合如CVP(环磷酰胺、长春花新碱和强的松)、CHOP(CVP和阿霉素)、C-MOPP(环磷酰胺、长春花新碱、强的松和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲蝶呤、博来霉素和甲酰四氢叶酸(leucovorin))、ProMACE-MOPP(强的松、氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加标准MoPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春花新碱、氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)以及MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春花新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员能够容易地确定用于这些方案之中每一个的标准剂量和安排。CHOP也已经与博来霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷和依托泊苷联合。其它相容的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)、2′-脱氧助间型霉素(Deoxycoformycin)和氟达拉滨。
对于不能实现疾病缓解或复发的中期和晚期NHL患者，使用拯救疗法(salvage therapy)。拯救疗法使用药物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、顺铂、依托泊苷和异环磷酰胺(单独地或联合地给予)。在复发的或侵袭性的某些肿瘤病症中，常常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲基强的松龙(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)，每个均有熟知的给药速率和安排。
可以与本发明多肽联合使用的化疗剂的量可以随着受治疗者而变化，或者可以根据本领域熟知的施用。见例如，Bruce A Chabner等人，Antineoplastic Agents(抗肿瘤剂)，在Goodman & Gilman′s THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(治疗的药理学基础)1233-1287((Joel G.Hardman等人编辑，第9版.1996)。在另一个实施方案，可以其最大耐受剂量施用与本发明多肽联合使用的化疗剂。
在一实施方案中，本发明的结合分子可以作为一种预防性疗法施用已经、正在或者将要进行手术的受治疗者，所述手术是例如去除原发肿瘤、转移或癌前生长或组织。
在另一实施方案中，本发明的结合分子可以与生物制剂一起施用。可以用于治疗癌症的生物制剂是本领域已知的，本发明结合分子可以例如结合这些已知的生物制剂施用。
例如，FDA已批准将以下生物制剂用于治疗乳腺癌：
Figure GPA00001010822100711
(曲妥珠单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA；一种人源化单克隆抗体，在HER2阳性乳腺癌中有抗肿瘤活性)；
Figure GPA00001010822100712
(氟维司群，AstraZenecaPharmaceuticals，LP，Wilmington，DE；一种用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；
Figure GPA00001010822100721
(阿那曲唑，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；一种阻断芳香酶的非类固醇类芳香酶抑制剂，芳香酶是产生雌激素所需要的酶)；
Figure GPA00001010822100722
(依西美坦，Pfizer Inc.，New York，NY；一种用于治疗乳腺癌的不可逆的类固醇类芳香酶)；
Figure GPA00001010822100723
(来曲唑，Novartis Pharmaceuticals，EastHanover，NJ；一种FDA批准用于治疗乳腺癌的非类固醇类芳香酶抑制剂)；以及
Figure GPA00001010822100724
(他莫昔芬，AstraZeneca Pharmaceuticals，LP；一种FDA批准用于治疗乳腺癌的非类固醇类抗雌激素)。其它能与本发明结合分子组合使用的生物制剂包括：AvastinTM(贝伐单抗，Genentech Inc.；FDA批准的第一个设计用于抑制血管新生的疗法)；和
Figure GPA00001010822100725
(替伊莫单抗，Biogen Idec，Cambridge，MA；一种目前批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射标记的单克隆抗体)。
此外，FDA还批准了以下生物制剂用于治疗结肠直肠癌：AvastinTM；ErbituxTM(爱必妥，ImClone Systems Inc.，New York，NY，和Bristol-MyersSquibb，New York，NY；是一种针对抗表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；
Figure GPA00001010822100726
(甲磺酸伊马替尼；蛋白激酶抑制剂)；和
Figure GPA00001010822100727
(盐酸左旋咪唑，Janssen Pharmaceutica Products，LP，Titusville，NJ；FDA在1990年批准的一种免疫调节剂，与5-氟尿嘧啶联合用于Dukes’C期结肠癌患者手术切除后的辅助治疗)。
目前批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的疗法包括：
Figure GPA00001010822100728
(托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗，GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC；一种多步骤治疗，涉及到连接有放射性分子(碘I-131)的小鼠单克隆抗体(托西莫单抗))；
Figure GPA00001010822100729
A(干扰素α-2b，Schering Corporation，Kenilworth，NJ；一种批准与含有蒽环霉素的联合化疗((例如，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松[CHOP]))一起用于治疗滤泡性非霍奇金淋巴瘤的干扰素)；
Figure GPA000010108221007210
(利妥昔单抗，Genentech Inc.，South San Francisco，CA，和Biogen Idec，Cambridge，MA；一种批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体；
Figure GPA000010108221007211
(地尼白介素，Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA；由白喉毒素的一个片段与白细胞介素-2遗传融合构成的融合蛋白)；以及
Figure GPA000010108221007212
(替伊莫单抗，Biogen Idec；FDA批准用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的放射标记单克隆抗体)。
对于治疗白血病，能与本发明的结合分子联合使用的示例性生物制剂包括-1H(阿仑单抗，Berlex Laboratories，Richmond，CA；一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病的单克隆抗体)。此外，Genasense(奥利莫森，Genta Corporation，Berkley Heights，NJ；一种开发中的用于治疗白血病的BCL-2反义治疗剂(例如单独使用或者与一或多种化疗药物，诸如氟达拉宾和环磷酰胺联合使用)可能与要求保护的结合分子一起给药。
对于治疗肺癌，示例性的生物制剂包括TarcevaTM(盐酸厄洛替尼，OSIPharmaceuticals Inc.，Melville，NY；一种设计用来靶向到人类表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
对于治疗多发性骨髓瘤，示例性的生物制剂包括
Figure GPA00001010822100731
Velcade(保特佐米，Millennium Pharmaceuticals，Cambridge MA；一种蛋白酶体抑制剂)。其它生物制剂包括(沙利度胺，Clegene Corporation，Warren，NJ；一种免疫调节剂，似乎具有多种作用，包括能抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及血管新生)。
其它示例性的生物制剂包括由ImClone Systems，Inc.，New York，NY开发的MOAB IMC-C225。
此外，要求保护的结合分子可以与疫苗或其它药剂(例如，细胞因子)一起施用以便调节抗癌免疫应答。例如，
Figure GPA00001010822100733
(Corixa Corporation，Seattle，WA)是一种同种异体肿瘤疫苗，曾有报道它在治疗T3N0M0切除的黑素瘤中取得很有前途的结果。
Figure GPA00001010822100734
(Progenics Pharmaceutical，Inc.，Tarrytown，NY)是作为辅助的第III期药剂施用于黑素瘤复发高危险性患者的神经节苷酯抗原。抗胃泌素治疗疫苗(Anti-gastrin therapeutic
Figure GPA00001010822100735
(Aphton Corporation，Miami，FL)中和激素G17和glyextened，正在结肠直肠癌、胰腺癌和胃癌患者的第III期临床实验。(TitanPharmaceuticals，Inc.，South San Francisco，CA)是一种用于结肠直肠癌研究的抗独特型抗体的疫苗。最后，
Figure GPA00001010822100737
(Biomira Inc.，Edmonton，Alberta，Canada)是一种合成的碳水化合物治疗疫苗，正在研究它作为转移性乳腺癌患者的第III期药剂(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，2000)。
在另一实施方案中，本发明的结合分子可以和抗血管新生剂一起施用，例如内皮抑制素(一种内源的、来源于肿瘤的内皮特异性抑制剂，它能终止微血管内皮细胞的产生)、抗VEGF抗体、沙利度胺，或基质金属蛋白酶抑制剂抑制血管基底膜的合成和降解)。
如前文所述，可以将本发明的多肽、其免疫活性片段或重组体以药学有效量施用用于体内治疗哺乳动物的病症。在这方面，应当意识到所公开抗体将被配制以促进施用并提高活性药剂的稳定性。优选地，符合本发明的药物组合物包含药学可接受的无毒、无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。例如，根据本发明的药物组合物可包含琥珀酸作为pH缓冲剂，L-甘氨酸、甘油和Polysorbate 80的任一或所有作为稳定剂，WFI作为溶剂和氢氧化钠来调节pH。在优选实施方案，本发明的药物组合物包含10mM柠檬酸钠、120mM L-甘氨酸、120mM甘油、0.01％Polysorbate 80，pH5.0。优选地，抗Cripto结合分子如人源化抗Cripto抗体-美登木素生物碱偶联物，如B3F6.1-DM4，以约1mg/ml至10mg/ml，优选地以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/ml的浓度存在于药物制剂中。在优选实施方案，抗Cripto结合分子如人源化抗Cripto抗体-美登木素生物碱偶联物，如B3F6.1-DM4，以5mg/ml的浓度存在于药物制剂中。在一个实施方案，该制剂包含的抗Cripto抗体具有每分子的抗体平均3.5个DM4分子。本发明的药物制剂将在2℃至8℃的温度如5℃稳定至少12个月，优选地至少24个月和最优选地至少36个月。本发明的药物制剂将在诸如25℃的加速温度稳定至少3个月，优选地至少6个月，更优选地至少12个月。
为了本申请的目的，偶联或未偶联治疗剂的药学有效量的多肽、其免疫活性片段或重组体应该理解为这样的用量，其足够实现与靶的有效结合，并取得益处，例如减轻疾病或疾患的症状或者检测物质或细胞。在肿瘤细胞的情况中，优选所述多肽能与赘生性或免疫反应性细胞上的选定免疫反应性抗原发生相互作用，并能引起这些细胞的死亡增加。当然，可以将本发明的药物组合物单次剂量或多次剂量施用，从而提供药学有效量的多肽。
在本公开的范围内，可以将本发明多肽按照前面提到的治疗方法以足够产生治疗或预防效果的量施用于人类或其它动物。可以将本发明多肽以常规剂型给予这样的人类或其它动物，所述剂型通过将多肽与常规药学可接受的载体或稀释剂按照已知技术结合在一起制备。本领域技术人员会意识到，药学可接受的载体或稀释剂的形式和特点受到与之结合使用的活性成分的量、施用途径和其它公知变量的限制。本领域技术人员还会意识到，包含一或多种本发明多肽的混合物可能被证明特别有效。
VII.使用方法
本发明的分子可以主要用于治疗目的。本发明的优选实施方案提供了用于诊断和/或治疗病症的化合物、组合物、药盒和方法，所述病症例如需要这类治疗的哺乳动物受治疗者的赘生性病症。优选的，所述受治疗者是人类。
本发明的多肽可以用于多种不同用途。例如，在一实施方案中，所述结合分子可以用于例如使用ELISA检测法体外探测Cripto的测定。示例性的检测方法是本领域已知的，参见例如美国专利申请20040077025。
在另一实施方案中，本发明结合分子可以用于利用成像技术探测带有Cripto的细胞的存在。对于这类应用，可能最好如下文进一步描述的那样，将结合分子偶联于可检测部分，例如放射标记。
在另一实施方案中，所述结合分子可以用于减少或清除带有被本发明的结合分子识别的靶(例如Cripto表位)的细胞。在另一实施方案中，所述结合分子能有效地降低循环中可溶性靶分子的浓度或将其清除。
在一实施方案中，本发明的结合分子能够减小肿瘤的大小、抑制肿瘤生长和/或延长带有肿瘤的受治疗者的存活时间。相应的，本发明还涉及通过将有效、无毒量的多肽施用于人类或其它动物来治疗人类或其它动物体内肿瘤的方法。本领域技术人员通过常规实验应当能够确定什么是多肽治疗恶性肿瘤的有效、无毒量。例如，多肽的治疗活性量根据一些因素而不同，这些因素包括诸如受治疗者的疾病阶段(例如，第1期相对第4期)、年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑制状况或疾病)和体重，以及抗体在受治疗者体内引发所期望的反应的能力。可以调节剂量方案来提供最佳治疗反应。例如，可以每天给予几个分开的剂量，或者根据治疗情况的紧急性而相应地减少剂量。但是，通常有效剂量预期在约0.05到120毫克/千克体重/天，更优选约0.1到100毫克/千克体重/天，更优选约0.5到50毫克/千克体重/天。
为了澄清，“哺乳动物”是指任何划分为哺乳动物的动物，包括人类、家养的和养殖的动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。优选地，所述哺乳动物是人类。“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止性措施。需要治疗的包括已患有疾病或病症的，也包括要预防所述疾病或病症的。因此，哺乳动物可能已被诊断为患有该疾病或病症，或者易患该疾病或对该疾病易感。
一般来说，本公开的发明可以用于治疗性治疗任何含有标记的赘生物，所述标记使得结合分子能够寻靶到癌细胞上。在一个优选实施方案中，本发明的结合分子被用于治疗实体瘤。可以治疗的示例性的癌症包括但不限于，前列腺癌、胃癌，诸如结肠癌和结肠直肠癌、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌。在另一实施方案中，本发明的抗体可以用于治疗卡波西肉瘤、CNS瘤形成(毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤)、黑素瘤、胃肠道和肾肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、平滑肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢的乳头状囊腺癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm′s tumor)或小细胞肺癌。应当意识到，鉴于本发明公开，无需过度实验即可以针对与前述各种瘤形成有关的肿瘤相关分子，衍生出适当的多肽。
适于使用本发明治疗的示例性血液癌症包括霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病(Burkitt′s type leukemia))、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和单核细胞性白血病。可以理解，本发明的化合物和方法尤其可以有效地治疗各种B细胞淋巴瘤，包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、扩散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)型NHL、中期/滤泡性NHL、中期扩散性NHL、晚期成免疫细胞NHL、晚期成淋巴细胞NHL、晚期小无裂细胞NHL、巨大肿块(bulky disease)NHL和Waldenstrom氏巨球蛋白血症。本领域技术人员应当明了，这些淋巴瘤由于正在变化的分类系统而常常具有不同的名称，而且，患有分类于不同名称下的淋巴瘤的患者也可以得益于本发明的联合治疗方案。除了上述瘤形成病症，可以理解本发明还可以有利地用于治疗带有相容的肿瘤相关抗原的其它恶性肿瘤。
在发明的一实施方案中，提供了能够特异结合Cripto的分子，并且所述分子能够抑制患者的肿瘤细胞生长，特别是那些由活化素B信号传导的消失或下降来介导的肿瘤生长。在一些实施方案中，肿瘤细胞是大脑肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、睾丸肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、非小细胞肺肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤、子宫肿瘤、子宫内膜肿瘤、宫颈肿瘤、胰腺肿瘤和胃肿瘤的细胞。在其它实施方案中，本发明的结合分子特异结合Cripto，并抑制过表达Cripto的肿瘤细胞的生长。在一实施方案中，所述肿瘤细胞是过表达Cripto的细胞系，诸如来源于脑癌、乳腺癌、睾丸癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌和胃癌的细胞系。
本发明通过以下实施例进一步得到阐述，这些实施例不应被看作是限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利申请均以参考的方式引入本文。
实施例
实施例1：偶联于毒素的人源化B3F6抗体当以单次或两次每两周一次的剂量施用时，在体内模型中有效抑制人类结肠肿瘤细胞的生长。
本实施例中使用以下材料和方法：
小鼠
两百一十八只(218)雌性SCID米色(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在六到七周龄时开始研究。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少两天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
原代人类结肠肿瘤的CT-3肿瘤片段最初从Sera Care，Inc(Oceanside，CA)获得(由Peter Chu，Biogen Idec，San Diego赠送)。在Biogen Idec，Inc.建立起连续移植的体内异种移植系，深低温保藏异种移植第三代的片段。在进行本研究的移植之前，将这些深低温保藏的片段(Biogen Idec cryo reg#0226)解冻，在雌性SCID米色小鼠中连续SC体内传代3-5代。在移植到小鼠中的肿瘤组织样品上进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌培养都表明没有染菌。
第1天，给小鼠在左胁皮下(SC)植入BioMedics动物ID芯片(ModelIMI-1000；Seaford，DE)。第0天，从十二只供者动物中收集肿瘤，去除坏死组织，切碎，将3mm3的CT-3肿瘤片段SC植入每个小鼠的右胁区域。从第5天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤最少100mg时(第15天)，排除非进行性生长的肿瘤，根据肿瘤大小将小鼠随机分到治疗和对照组中(见表1)。
表1：对照和测试治疗组
  试剂   剂量/注射   美登素等效剂量(μg/kg)   途径   安排   小鼠数目
  媒介物对照   10ml/kg   0   IVa   单次剂量   16
  B3F6.1-DM4   25mg/kg   353   IV   第14天   8
  B3F6.1-DM4   40mg/kg   564   IV   第14天   8
  B3F6.1-DM4   25mg/kg   353   IV   q14dx2   8
  B3F6.1-DM4   40mg/kg   564   IV   q14dx2   8
a静脉内
实验材料和主动化疗剂
美登素DM4偶联物(2000-112，5.9mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。临床级的Adrucil(5-氟尿嘧啶，NDC 0703-3015-11)从Sicor Pharmaceuticals获得(批号06A625，2007年7月过期)。
研究组和治疗方案
表1描述了各研究组和治疗方案。媒介物对照((10mM柠檬酸盐缓冲液，pH5.5，135mM氯化钠))在第15天作为单次剂量静脉(IV)施用。B3F6.1-DM4在第15天以25mg/kg或40mg/kg作为单次剂量IV施用。B3F6.1-DM4以25mg/kg或40mg/kg交替地IV q14dx2施用(两次剂量)。所有治疗在第15天开始。
抗癌活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第5天记录体重和肿瘤大小的测量值，持续每周记录两次至研究结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设单位密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
统计分析
在每项研究结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个治疗组和媒介物对照组之间是否有任何统计学上显著的差异。
移植后的成瘤率为95％，挑选很窄肿瘤重量范围内的小鼠开始治疗。媒介物对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。
图1显示在带有已建立的CT-3异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，根据不同方案IV施用的单次剂量(25和40mg/kg/inj)或两次剂量(25和40mg/kg/inj)B3F6.1-DM4对肿瘤重量变化的效应。IV施用的25mg/kg/inj或40mg/kg/inj单次剂量B3F6.1-DM4显著抑制肿瘤生长达5周(第49天)。以25mg/kg/inj、q14dx2IV施用和以40mg/kg/inj q14dx2IV施用的B3F6.1-DM4治疗的其他治疗组显示在整个研究期间(8周)显著抑制肿瘤生长，直到研究终止(第70天)。这些结果证明，单次剂量的60-70mg/m2在该体内鼠模型中导致肿瘤消退达5周。这些结果进一步证明，施用两次每两周一次剂量的B3F6.1-DM4，即q14dx2，在该体内鼠模型中维持肿瘤抑制。小鼠中q14dx2剂量相当于在灵长类每三周施用一次的剂量。因此这些结果表示，B3F6.1-DMF在人类的有效剂量包括每3周施用一次的给药方案。
实施例2：人源化B3F6抗体当联合化疗剂施用时，在体内模型中有效协同抑制人类结肠肿瘤细胞生长。
小鼠
两百一十八只(218)雌性SCID米色(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在六到七周龄时开始实验。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少两天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
原代人类结肠肿瘤的CT-3肿瘤片段最初从Sera Care，Inc(Oceanside，CA)获得(由Peter Chu，Biogen Idec，San Diego赠送)。在Biogen Idec，Inc.建立起连续移植的体内异种移植系，深低温保藏异种移植第三代的片段。在进行本研究的移植之前，将这些深低温保藏的片段(Biogen Idec cryo reg#0226)解冻，在雌性SCID米色小鼠中连续SC体内传代3-5代。在移植到小鼠中的肿瘤组织样品上进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌培养都表明没有染菌。
第1天，给小鼠在左胁SC植入BioMedics动物ID芯片(Model IMI-1000；Seaford，DE)。第0天，从八只供者动物收集肿瘤，去除坏死组织，切碎，将3mm3的CT-3肿瘤片段SC植入每个小鼠的右胁区域。从第5天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤最少100mg时(第15天)，排除非进行性生长的肿瘤，根据肿瘤大小将小鼠随机分到治疗和对照组中(见表2)。
表2：对照和试验治疗组
  试剂   剂量/注射   美登素等效剂量(μg/kg)   途径   安排   小鼠数目
  媒介物对照   10ml/kg/inj   0   IVa   第15天   16
B3F6.1-DM4 15mg/kg 212 IV 第15天 8
  5-氟尿嘧啶   30mg/kg   0   IV   第15天   8
  B3F6.1-DM45-氟尿嘧啶   15mg/kg30mg/kg   2120   IVIV   第15天第15天   8
a静脉内
实验材料和阳性化疗剂
美登素DM4偶联物(2000-112，5.9mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。临床级的Adrucil(5-氟尿嘧啶，NDC 0703-3015-11)从Sicor Pharmaceuticals获得(批号06A625，2007年7月过期)。
研究组和治疗方案
表2描述了各研究组和治疗方案。媒介物对照(柠檬酸盐缓冲液)在第15天以10ml/kg作为单次剂量IV施用。B3F6.1-DM4在第15天以15mg/kg/inj作为单次剂量IV施用。5-氟尿嘧啶在第15天以30mg/kg作为单次剂量IV施用。此外，B3F6.1-DM4在第15天以15mg/kg/inj作为单次剂量IV联合在第15天以30mg/kg也作为单次剂量IV施用的5-氟尿嘧啶施用。
抗癌活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第6天记录体重和肿瘤大小的测量值，持续每周记录两次至研究结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设单位密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
统计分析
在每项研究结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个治疗组和媒介物对照组之间是否有任何统计学上显著的差异。
移植后的成瘤率为95％，挑选很窄肿瘤重量范围内的小鼠开始治疗。媒介物对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。
图2显示在带有已建立的CT-3异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，各以IV施用的单次剂量(15mg/kg/inj)B3F6.1-DM4或单次剂量(30mg/kg/inj)5-氟尿嘧啶对肿瘤重量变化的效应。IV施用的单次剂量15mg/kg/inj的B3F6.1-DM4或30mg/kg/inj的5-氟尿嘧啶在研究期间显著抑制肿瘤生长，直到研究终止(第34天)。在研究期间，与仅B3F6.1-DM4或5-氟尿嘧啶相比，15mg/kg/inj的B3F6.1-DM4联合30mg/kg/inj的5-氟尿嘧啶治疗的组显示显著的协同抑制肿瘤生长(抑制80％)，直到研究终止(第34天)。这些结果证明，单次剂量15mg/kg(45mg/m2)的B3F6.1-DM4联合单次剂量的另外化疗剂如5-氟尿嘧啶(30mg/kg)，在该体内鼠模型中导致协同抑制肿瘤生长达3周。这些结果表示，包含抗Cripto抗体如B3F6.1-DM4联合另外治疗剂如5-氟尿嘧啶的联合疗法是对人类癌症如结肠癌的有效疗法。
实施例3：人源化B3F6抗体在体内模型中有效抑制大的人类结肠癌肿瘤生长。
本实施例中使用以下材料和方法：
小鼠
两百一十只(210)雌性SCID米色(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)小鼠(Harlan Sprague Dawley，Madison，WI)在六到七周龄时开始实验。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少两天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
原代人类结肠肿瘤的CT-3肿瘤片段最初从Sera Care，Inc(Oceanside，CA)获得(由Peter Chu，Biogen Idec，San Diego赠送)。在Biogen Idec，Inc.建立起连续移植的体内异种移植系，深低温保藏异种移植第三代的片段。在进行本研究的移植之前，将这些深低温保藏的片段(Biogen Idec cryo reg#0239)解冻，在雌性SCID米色小鼠中连续SC体内传代2代。在移植到小鼠中的肿瘤组织样品上进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌培养都表明没有染菌。
第1天，给小鼠在左胁SC植入BioMedics动物ID芯片(Model IMI-1000；Seaford，DE)。第0天，从十四只供者动物收集肿瘤，去除坏死组织，切碎，将3mm3的CT-3肿瘤片段SC植入每个小鼠的右胁区域。从第6天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤最少有80mg时(第18天)，排除非进行性生长的肿瘤，根据肿瘤大小将小鼠随机分到治疗和对照组中(见表3)。
表3：对照和试验治疗组
  试剂   剂量/注射   美登素等效剂量(μg/kg)   途径   安排   小鼠数目
  媒介物对照：柠檬酸缓冲液+0.9％盐水   10ml/kg，10ml/kg   0   IVaIPb   单次剂量，第18天q2dx6(M，W，F)   13
  B3F6.1-DM4   15mg/kg   225   IV   第30天   8
  B3F6.1-DM4   25mg/kg   375   IV   第30天   8
a静脉内
b腹膜内
实验材料和阳性化疗剂
美登素DM4偶联物(2000-112，5.9mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。临床级的Adrucil(5-氟尿嘧啶，NDC 0703-3015-11)从Sicor Pharmaceuticals获得(批号06A625，2007年7月过期)。
研究组和治疗方案
表3描述了各研究组和治疗方案。媒介物对照(10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5，135mM氯化钠)在第18天以10ml/kg作为单次剂量IV施用，此外，0.9％盐水在第18天开始以10ml/kg q2dx6(M、W和F)的剂量腹膜内施用。B3F6.1-DM4在第30天以15mg/kg或25mg/kg作为单次剂量IV施用。
抗癌活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第6天记录体重和肿瘤大小的测量值，持续每周记录两次至研究结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设单位密度为1，将体积转化为重量(即，mm3＝1mg)。该组在第39天终止。
统计分析
在每项研究结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个治疗组和媒介物对照组之间是否有任何统计学上显著的差异。
移植后的成瘤率为95％，挑选在第18天处于很窄肿瘤重量范围内的小鼠开始治疗。媒介物对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。
图3显示在带有大的CT-3异种移植肿瘤，如具有550-775mg的平均肿瘤重量的肿瘤的无胸腺裸小鼠中，IV施用单次剂量(15和25mg/kg/inj)B3F6.1-DM4对肿瘤重量变化的效应。IV施用15mg/kg/inj或25mg/kg/inj的B3F6.1-DM4显著抑制肿瘤生长，直到研究终止(第39天)。这些结果证明，单次剂量B3F6.1-DM4在该体内小鼠模型中有效抑制大的肿瘤如人类结肠癌肿瘤生长。这些结果表示，施用抗Cripto抗体如B3F6.1-DM4，即使是单次剂量，也有效治疗人类大的已建立的肿瘤。
实施例4：经由不同接头连接于毒素的人源化B3F6抗体有效抑制人类睾九癌细胞的生长
本实施例中使用以下材料和方法：
小鼠
雌性SCID米色(C.B.-17/IcrHsd-Prkcd Lyst Skid Beige)小鼠(HarlanSprague Dawley，Madison，WI)在六到七周龄时开始研究。动物在被移植肿瘤前在实验室中适应至少两天。小鼠关在通风的笼子里，允许随意摄取食物和水。
肿瘤模型
人类睾丸癌肿瘤得自深低温保藏的实体瘤片段，后者来自在BiogenIdec.建立起来的连续传代体内供者系。在进行移植之前，将肿瘤片段从深低温保藏取出，在雌性无胸腺裸小鼠中连续SC体内传代3代。在移植到小鼠中的肿瘤组织样品上进行细菌培养。移植后24小时和48小时的细菌培养都表明没有染菌。
第1天，给小鼠在左胁SC植入BioMedics动物ID芯片(Model IMI-1000；Seaford，DE)。第0天，从供者动物收集肿瘤，去除坏死组织，切碎，将3mm3的CT-3肿瘤片段SC植入每个小鼠的右胁区域。从第5天开始，至少每周两次记录肿瘤大小和体重测量值。当测量到肿瘤最少有100mg时，排除非进行性生长的肿瘤，根据肿瘤大小将小鼠随机分到治疗和对照组中(见表4)。
表4：对照和试验治疗组
  试剂   剂量/注射   美登素等效剂量(μg/kg)   途径   安排
  媒介物对照   10ml./kg   0   IVa   第14天
  顺铂   2mg/kg   0   IPb   q2d6
  B3F6.1-SMCC-DM1   5mg/kg   IV   第14天
  B3F6.1-SMMC-DM1   10mg/kg   IV   第14天
  B3F6.1-SMMC-DM1   15mg/kg   IV   第14天
  B3F6.1-SPDB-DM4   5mg/kg   IV   第14天
  B3F6.1-SPDB-DM4   10mg/kg   IV   第14天
  B3F6.1-SPDB-DM4   15mg/kg   IV   第14天
a静脉内
b腹膜内
实验材料和阳性化疗剂
美登素DM4偶联物(2000-112，5.9mg/ml)在ImmunoGen，Inc(Cambridge，MA)利用ImmunoGen的肿瘤激活前药(TAP)技术制备。临床级的Adrucil(5-氟尿嘧啶，NDC 0703-3015-11)从Sicor Pharmaceuticals获得(批号06A625，2007年7月过期)。
研究组和治疗方案
表4描述了各研究组和治疗方案。媒介物对照(10mM柠檬酸盐缓冲液，pH5.5，135mM氯化钠)在第14天作为单次剂量IV施用。B3F6.1-SMCC-DM1在第14天以5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg作为单次剂量IV施用。B3F6.1-SPDB-DM4在第14天以5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg作为单次剂量IV施用。顺铂在第14天开始以2mg/kg q2dx6IP施用。
抗癌活性的评价
用数码卡尺确定肿瘤的测量值。在第0天记录体重和肿瘤大小的测量值，持续每周记录两次至研究结束。用计算扁椭圆形体积的公式由两维肿瘤测量值来估计肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积(mm3)＝(长度x宽度2)÷2。假设单位密度为1，将体积转化为重量(即，1mm3＝1mg)。
统计分析
在每项研究结束时，对平均肿瘤重量进行Student’s t检验来确定每个治疗组和媒介物对照组之间是否有任何统计学上显著的差异。
移植后的成瘤率为95％，挑选处于很窄大小范围内的小鼠开始治疗。媒介物对照组的肿瘤生长情况很好地落在我们通常在这个模型中看到的范围内。
图4显示在带有已建立的人类睾丸异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠中，IV施用的单次剂量(5、10和15mg/kg/inj)B3F6.1-SMCC-DM1或单次剂量(5、10和15mg/kg/inj)B3F6.1-SPDB-DM4对肿瘤重量变化的效应。在第14天以5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg IV施用的单次剂量B3F6.1-SMCC-DM1在研究期间显著抑制肿瘤生长(大约50％肿瘤抑制)，直到研究终止(第34天)。在第14天以5、10和15mg/kg/inj IV施用的B3F6.1-SPDB-DM4治疗的其他组显示在研究期间引人注目地显著抑制肿瘤生长(大约80-90％肿瘤抑制)，直到研究终止(第34天)。这些结果证明，在该体内小鼠模型中，5-15mg/kg单次剂量B3F6.1-SMCC-DM1导致抑制肿瘤生长达3周。这些结果进一步证明，在该体内小鼠模型中，5-15mg/kg的单次剂量B3F6.1-SPDB-DM4导致引人注目地抑制肿瘤生长达3周。小鼠中q14dx2剂量相当于灵长类中每三周施用一次。
本实施例中，连接于B3F6抗体的不同的接头-美登素偶联物从具有不同半衰期的偶联B3F6抗体释放。特别是，SPP-DM1接头偶联物在人体具有大约24-48小时的半衰期，SPDB-DM4接头偶联物在人体具有大约5天的半衰期，SMCC-DM1接头偶联物在人体具有大约6天的半衰期。SPP和SPDB接头产生可重新进入相邻肿瘤细胞的代谢物，产生所谓的“旁观”效应，可促进杀伤肿瘤细胞。相反，SMCC-DM1接头系统不产生可重新进入相邻肿瘤细胞的代谢产物。本实施例呈现的结果表示，包含SMCC-DM1接头系统的B3F6-SMCC-DM1分子在不需要“旁观杀伤”活性的肿瘤如睾丸癌中有活性。本实施例呈现的结果还表示，包含SPDB-DM4接头系统的B3F6-SPDB-DM4分子比包含SPP-DM1或SMCC-DM1接头系统的B3F6偶联物更有效抑制肿瘤生长。
等同替代
本领域技术人员将意识到或仅利用常规实验能确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等同替代。这些等同替代也被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.)
 
<120>CRIPTO结合分子
 
<130>BGN-A713PC
 
<140>PCT/US2008/007022
<141>2008-06-02
 
<150>60/932,879
<151>2007-06-01
 
<160>71
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
<210>1
<211>1095
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>1
caggtccaac tgcagcaggt tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tacactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gccttgagtg gattggagag aatgatccta gcaacggtcg tactaactac 180
aatgagaagt tcaagaacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aaggggccct 300
aattacttct attctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct 360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 720
cccccatgcc cacggtgccc agcacctgga ggtggctcga gtggaggcgg ttccggaggg 780
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 840
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1080
tccctgtctc cgggt                                                  1095
 
<210>2
<211>657
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>2
gattttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatcaagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctcatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttcct 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt    657
 
<210>3
<211>365
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Val Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            260                 265                 270
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        275                 280                 285
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    290                 295                 300
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
305                 310                 315                 320
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                325                 330                 335
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            340                 345                 350
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        355                 360                 365
 
<210>4
<211>219
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>4
Asp Phe Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
 
<210>5
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu
 1               5                  10                  15
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
            20                  25                  30
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        35                  40
 
<210>6
<211>188
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>6
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
 1               5                  10                  15
Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
            20                  25                  30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp
        35                  40                  45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65                  70                  75                  80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
            100                 105                 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
        115                 120                 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145                 150                 155                 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
                165                 170                 175
Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
            180                 185
 
<210>7
<211>188
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>7
Met Asp Cys Arg Lys Met Val Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
 1               5                  10                  15
Met Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
            20                  25                  30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Asp Leu Ala Phe Arg Asp
        35                  40                  45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Gln Arg Val Leu Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65                  70                  75                  80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Glu Ser Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
            100                 105                 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
        115                 120                 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
    130                 135                 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu yal Met Asp Glu His Leu Val Ala
145                 150                 155                 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
                165                 170                 175
Leu Ala Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
            180                 185
 
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>8
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
 1               5                  10
 
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>9
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
 1               5                  10                  15
 
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
<400>10
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
 1               5
 
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>11
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
 1               5
 
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>12
Ser Tyr Trp Ile His
 1               5
 
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>13
Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Asn
 
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>14
Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
 1               5                  10
 
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
<400>15
Ile Gly Lys Thr Ile Ser Lys Lys Ala Lys
 1               5                  10
 
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>16
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
 1               5                  10                  15
 
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>17
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
 1               5                  10
 
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>18
Cys Pro Pro Cys Pro
 1               5
 
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>19
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
 1               5
 
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>20
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
 1               5                  10
<210>21
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>21
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
 1               5                  10                  15
Pro Arg Cys Pro
            20
 
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
 1               5
 
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>23
Cys Pro Ser Cys Pro
 1               5
 
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>24
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
 1               5
 
<210>25
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>25
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20
 
<210>26
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>26
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu
 1               5                  10                  15
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
        35                  40
 
<210>27
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20
 
<210>28
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>28
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>29
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>29
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>30
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
<400>30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>31
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>31
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>32
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>32
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>33
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>33
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
            20                  25
 
<210>34
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>34
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Glu Pro Lys Ser
 1               5                  10                  15
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
            20                  25
 
<210>35
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>35
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
 1               5                  10                  15
 
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>36
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
 1               5                  10
 
<210>37
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>37
Glu Ser Lys Tyr Gly
 1               5
 
<210>38
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>38
Pro Pro Cys Pro Ser
 1               5
 
<210>39
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>39
Asp Phe Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
            100                 105                 110
<210>40
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Val Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ser Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>41
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>41
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
 1               5                  10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
 
<210>42
<211>129
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<220>
<221>VARIANT
<222>108，109，112
<223>Xaa＝任一氨基酸
 
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Ly s Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ser SerThr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Xaa Xaa Val Tyr Xaa
            100                 105                 110
Tyr Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
 
<210>43
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<220>
<221>VARIANT
<222>33，100，103
<223>Xaa＝任一氨基酸
 
<400>43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Xaa Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Gln Xaa Pro Arg Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
            100                 105                 110
Ile Lys
 
<210>44
<211>131
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<220>
<221>VARIANT
<222>117
<223>Xaa＝任一氨基酸
 
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr
            100                 105                 110
Arg Gly Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
    130
 
<210>45
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>45
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>46
<211>122
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln
    50                  55                  60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Leu Asp Thr Ala Ile Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Cys Ser Asn
        115                 120
 
<210>47
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>47
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>48
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                   15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>49
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>50
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>50
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
 
<210>51
<211>123
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>51
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
 
<210>52
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>52
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
 
<210>53
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>53
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
 
<210>54
<211>223
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>54
Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
 1               5                  10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
    130                 135                 140
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Ala Ser Pro
145                 150                 155                 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
        195                 200                 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
 
<210>55
<211>460
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
yal Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu
    210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                245                 250                 255
A sp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
            260                 265                 270
Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
        275                 280                 285
Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
    290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
                325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
        355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
    370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
                405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
 
<210>56
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                 285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
 
<210>57
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                 285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
 
<210>58
<211>462
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
            260                 265                 270
Val Val Ala Ser Pro Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
        275                 280                 285
Trp Tyr Val Ala Ser Pro Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg
            420                 425                 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
        435                 440                 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
 
<210>59
<211>373
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser
        195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu
    210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly
                245                 250                 255
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            260                 265                 270
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
        275                 280                 285
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    290                 295                 300
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
305                 310                 315                 320
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                325                 330                 335
Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
            340                 345                 350
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Pro Gly
    370
 
<210>60
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            340                 345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370                 375
 
<210>61
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                   60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            340                 345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370                 375
 
<210>62
<211>375
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>62
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
        115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
                165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
            180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
        195                 200                 205
Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Ala Ser Pro Lys Lys
    210                 215                 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
                245                 250                 255
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu
            260                 265                 270
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
        275                 280                 285
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
    290                 295                 300
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                325                 330                 335
Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
            340                 345                 350
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
        355                 360                 365
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    370                 375
 
<210>63
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>63
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
    130
<210>64
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>64
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
    130
 
<210>65
<211>133
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>65
Met Lys Leu Pro Val Ala Arg Gly Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile
 1               5                  10                  15
Pro Ala Ser Ser Ser Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
        35                  40                  45
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Ile Lys
    130
 
<210>66
<211>144
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>66
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg
            100                 105                 110
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn Tyr Phe
        115                 120                 125
Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
 
<210>67
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>67
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
 
<210>68
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>68
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
 
<210>69
<211>146
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>69
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Leu Ala Val Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Arg Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Ala Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Asn Asp Pro Ser Asn
65                  70                  75                  80
Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr
                85                  90                  95
Val Ala Ser Pro Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser
            100                 105                 110
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Asn
        115                 120                 125
Tyr Phe Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
    130                 135                 140
Ser Ser
145
 
<210>70
<211>251
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Ala Ser Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
                85                  90                  95
Ala Ser Pro Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
            100                 105                 110
Cys Pro Pro Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
        115                 120                 125
Pro Arg Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
145                 150                 155                 160
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                165                 170                 175
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            180                 185                 190
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        195                 200                 205
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Ser Pro Lys Ser Arg Trp Gln Gln
    210                 215                 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                245                 250
 
<210>71
<211>913
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的构建体
 
<400>71
Ala Leu Ala Ser Glu Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro
 1               5                  10                  15
Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Pro Arg Leu Glu Ala Leu
            20                  25                  30
Ala Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr
        35                  40                  45
His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Leu
    50                  55                  60
Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Pro His Glu Pro Arg Gly
                85                  90                  95
Leu Pro Arg Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Thr
            100                 105                 110
Arg Pro Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Thr His Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Val Ala Leu His Ile Ser Thr
    130                 135                 140
His Arg Pro His Glu Pro Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Leu Glu Gly
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Tyr Arg
                165                 170                 175
Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Val Ala
            180                 185                 190
Leu Thr His Arg Val Ala Leu Pro Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser
        195                 200                 205
Glu Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Thr His Arg
    210                 215                 220
Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ser Asn His Ile Ser Leu Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn
                245                 250                 255
Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Leu
            260                 265                 270
Tyr Ser Val Ala Leu Gly Leu Pro Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Cys
        275                 280                 285
Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg His Ile Ser Thr His
    290                 295                 300
Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Pro Arg Cys Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
Pro Arg Gly Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro Arg
                325                 330                 335
Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro His Glu Leu Glu Pro His Glu Pro Arg
            340                 345                 350
Pro Arg Leu Tyr Ser Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His Arg
        355                 360                 365
Leu Glu Met Glu Thr Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His
    370                 375                 380
Arg Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Cys Tyr Ser Val Ala
385                 390                 395                 400
Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ser Glu Arg
                405                 410                 415
His Ile Ser Gly Leu Ala Ser Pro Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Leu
            420                 425                 430
Tyr Ser Pro His Glu Ala Ser Asn Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Val Ala
        435                 440                 445
Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Val Ala Leu His
    450                 455                 460
Ile Ser Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg
                485                 490                 495
Ala Ser Asn Ser Glu Arg Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Val
            500                 505                 510
Ala Leu Val Ala Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Glu Thr His Arg
        515                 520                 525
Val Ala Leu Leu Glu His Ile Ser Gly Leu Asn Ala Ser Pro Thr Arg
    530                 535                 540
Pro Leu Glu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Thr Tyr
545                 550                 555                 560
Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ser Glu Arg
                565                 570                 575
Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala
            580                 585                 590
Pro Arg Ile Leu Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Thr His Arg Ile Leu Glu
        595                 600                 605
Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly
    610                 615                 620
Leu Asn Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Pro Arg Gly Leu Asn Val Ala
625                 630                 635                 640
Leu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Pro Arg Pro Arg Ser Glu Arg
                645                 650                 655
Ala Arg Gly Ala Ser Pro Gly Leu Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser
            660                 665                 670
Ala Ser Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Leu Glu Thr His
        675                 680                 685
Arg Cys Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Pro
    690                 695                 700
His Glu Thr Tyr Arg Pro Arg Ser Glu Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu
705                 710                 715                 720
Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Ser Glu Arg
                725                 730                 735
Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu Ala Ser Asn
            740                 745                 750
Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr His Arg Pro
        755                 760                 765
Arg Pro Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser
    770                 775                 780
Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu Thr
785                 790                 795                 800
Tyr Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu
                805                 810                 815
Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Gly
            820                 825                 830
Leu Asn Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala Leu Pro His
        835                 840                 845
Glu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Val Ala Leu Met Glu Thr
    850                 855                 860
His Ile Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn
865                 870                 875                 880
His Ile Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ser
                885                 890                 895
Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Leu Glu Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu
            900                 905                 910
Tyr

Claims (66)

1.一种抑制受治疗者的肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子，其中所述结合分子每三周施用一次，从而抑制受治疗者的肿瘤生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合分子是抗Cripto抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述结合分子是人源化抗Cripto抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述人源化抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
6.根据权利要求5所述的方法，其中平均一个所述抗体分子连接有3.5个DM4分子。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于所述抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者患有选自由以下组成的组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者患有结肠癌。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量选自由以下组成的组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
12.一种抑制受治疗者的肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子和另外的化疗剂，从而抑制受治疗者的肿瘤生长。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子与所述化疗剂协同作用。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述化疗剂是抗代谢物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗代谢物是嘧啶类似物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述嘧啶类似物是5’-氟尿嘧啶。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子是抗Cripto抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述结合分子是人源化抗Cripto抗体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述人源化抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
21.根据权利要求19所述的方法，其中平均一个所述抗体分子连接有3.5个DM4分子。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于所述抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。
24.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子与所述化疗剂以单次剂量施用。
25.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子与所述化疗剂每两周施用一次。
26.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子与所述化疗剂每三周施用一次。
27.根据权利要求9所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量选自由以下组成的组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量是15mg/kg。
29.根据权利要求12所述的方法，其中所述结合分子与所述化疗剂腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、表面局部或静脉内地施用。
30.根据权利要求12所述的方法，其中所述受治疗者患有选自由以下组成的组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
31.根据权利要求12所述的方法，其中所述受治疗者患有结肠癌。
32.一种抑制受治疗者的肿瘤生长的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)选择具有已建立的肿瘤的患者；并
(ii)向该受治疗者施用有效剂量的结合Cripto的结合分子；
从而抑制该受治疗者的肿瘤生长。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子是抗Cripto抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述结合分子是人源化抗Cripto抗体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
37.根据权利要求36所述的方法，其中平均一个所述抗体分子连接有3.5个DM4分子。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于所述抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。
40.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子以单次剂量施用。
41.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子每两周施用一次。
42.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子每三周施用一次。
43.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量选自由以下组成的组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
44.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量是约15mg/kg。
45.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子的有效剂量是约25mg/kg。
46.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合分子腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、表面局部或静脉内地施用。
47.根据权利要求32所述的方法，其中所述受治疗者患有选自由以下组成的组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
48.根据权利要求32所述的方法，其中所述受治疗者患有结肠癌。
49.一种抑制受治疗者的肿瘤生长的方法，该方法包括向受治疗者施用单个有效剂量的结合Cripto的结合分子，从而抑制受治疗者的肿瘤生长。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述结合分子是抗Cripto抗体。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述结合分子是人源化抗Cripto抗体。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
54.根据权利要求53所述的方法，其中平均一个所述抗体分子连接有3.5个DM4分子。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于所述抗体。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。
57.根据权利要求49所述的方法，其中所述有效单次剂量选自由以下组成的组：约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约25mg/kg和约40mg/kg。
58.根据权利要求49所述的方法，其中所述受治疗者患有选自由以下组成的组的器官的癌症：脑、乳腺、睾丸、结肠、肺、卵巢、膀胱、子宫、宫颈、胰腺和胃。
59.一种液态含水药物制剂，其包含：
(a)治疗有效量的结合Cripto的结合分子，
(b)10mM琥珀酸钠，pH是5.0，
(c)120mM L-甘氨酸，
(d)120mM甘油，和
(e)0.01％Polysorbate 80。
60.根据权利要求59所述的药物制剂，其中所述结合分子是人源化抗Cripto抗体。
61.根据权利要求60所述的药物制剂，其中所述人源化抗Cripto抗体偶联于美登木素生物碱。
62.根据权利要求61所述的药物制剂，其中所述美登木素生物碱是DM4。
63.根据权利要求62所述的药物制剂，其中平均一个所述抗体分子连接有3.5个DM4分子。
64.根据权利要求61所述的药物制剂，其中所述美登木素生物碱经由异双官能交联剂偶联于所述抗体。
65.根据权利要求64所述的药物制剂，其中所述异双官能交联剂是4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)。
66.根据权利要求63所述的药物制剂，其中所述结合分子的浓度是5mg/ml。
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