CN101932337A - 替代途径的血清灭菌蛋白调节及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用抗血清灭菌蛋白抗体选择性激活替代途径(alternative pathway，AP)。特别地，本发明涉及通过将对象与抗血清灭菌蛋白抗体接触来治疗对象中AP补体介导的病症或AP介导的状况的方法。同样，本发明提供血清灭菌蛋白敲除的转基因非人哺乳动物以及它们的用途。

Description

替代途径的血清灭菌蛋白调节及其应用

政府利益

本发明部分得到美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)基金AI-62388、AI-49344、AI-44970的支持。政府可以享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及使用抗血清灭菌蛋白(properdin)抗体选择性激活替代途径(alternative pathway，AP)。特别地，本发明涉及通过将对象与抗血清灭菌蛋白抗体接触来治疗对象中AP补体介导的病症(pathology)或AP介导的状况的方法。同样，本发明提供血清灭菌蛋白敲除转基因非人哺乳动物以及它们的用途。

发明背景

补体系统提供宿主对侵入病原体的第一道防御屏障。补体激活经由3个不同的途径发生：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通过抗原-抗体结合启动。当结合甘露糖的凝集素(mannose-bindinglectins，MBL)与微生物表面糖分子相互作用时引发凝集素途径。这两种途径的激活引起经典途径C3转变酶C4b2a的装配——尽管也可以发生MBL-相关的丝氨酸蛋白酶对C3的直接剪切。替代途径(AP)是AP C3转变酶——C3bBb驱动的自身放大环(self-amplification loop)。AP激活可发生在经典途径或凝集素途径激活之后，或被独立地启动。在后一种情况下，低水平的自发C3“慢速运转”产生最初的C3bBb，其在缺乏适当调节的情况下快速增殖AP。因此，不具有负调节或具有不足负调节的非自身表面上的AP补体激活被认为是缺省过程，而自体细胞通常在多种膜-结合和液相补体抑制蛋白的帮助下来避免这种结果。

与许多抑制蛋白的存在形成对比，血浆蛋白血清灭菌蛋白是唯一已知的补体激活级联的正调节剂。50多年以前被发现时，血清灭菌蛋白最初被认为是AP补体的启动剂，其以类似于经典途径抗体的方式发挥作用。血清灭菌蛋白和AP的存在没有被立即接受并成为争论的主题，其中AP曾经被认为是“血清灭菌蛋白途径”。尽管AP在补体激活中的重要性已经被证实并且现在是教科书知识，但血清灭菌蛋白是AP激活驱动力的概念本质上被抛弃了，取而代之的是目前持有的观点：血清灭菌蛋白通过延长新生C3bBb转变酶的半衰期来促进AP补体激活。最近，证实了表面C3b-结合血清灭菌蛋白可以作为新C3bBb组装的平台。

这指出了血清灭菌蛋白在AP补体激活中更复杂的作用机理并且带来了进一步研究的需要，所述研究针对血清灭菌蛋白功能及其在赋予血清灭菌蛋白-缺乏的个体免疫性方面的应用。

发明概述

在一个实施方式中，本发明提供治疗对象中AP补体介导的病症的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

在另一个实施方式中，本发明提供抑制对象中血清灭菌蛋白依赖性的、微生物抗原引发的、非生物外源表面引发的或改变的自身组织引发的AP补体激活的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

在一个实施方式中，本发明提供转基因非人哺乳动物及其子代，其基因组包含血清灭菌蛋白编码基因的破坏，以便所述哺乳动物缺乏功能性血清灭菌蛋白或具有降低的功能性血清灭菌蛋白的水平。

在另一个实施方式中，本发明提供鉴定化合物体内生物活性的方法，所述方法包括下列步骤：提供不能表达血清灭菌蛋白的转基因非人哺乳动物；向所述非人哺乳动物给予所述化合物；测定所述非人哺乳动物表现的病症；以及鉴定所述化合物的体内生物活性。

在一个实施方式中，本发明提供制备转基因非人哺乳动物的方法，包括：将多核苷酸导入非人哺乳动物的胚胎中，所述多核苷酸包含编码血清灭菌蛋白编码基因的破坏的内含子的编码区；将所述胚胎转移至代孕母体小鼠中；将所述胚胎妊娠；以及选择所述代孕母体小鼠生出的转基因小鼠，其中所述转基因非人哺乳动物的特征在于当与非转基因哺乳动物比较时，其具有降低的AP补体激活。

附图简述

结合附图阅读以下的详细描述将更好地理解本发明，在附图中，类似的指代符号用于指示类似的要素，以及其中：

图1显示血清灭菌蛋白^-/-小鼠的产生。A.小鼠血清灭菌蛋白基因座位的示意图。垂直柱表示外显子(E)的位置。水平长方框表示用于ES细胞筛选的cDNA探针的位置。B.靶载体。大箭头表示LoxP位点以及小箭头表示FRT位点。Neo：新霉素，DT：白喉毒素。C.实际重组的血清灭菌蛋白基因座位。D.野生型和重组等位基因的期望的限制性片段长度以及Hinc II和ScaI消化后ES细胞的代表性DNA印迹筛选结果。E.野生型(WT)和血清灭菌蛋白敲除(P^-/-)小鼠组织中血清灭菌蛋白mRNA的RNA印迹分析。F.血浆中血清灭菌蛋白的免疫扩散分析。将抗人血清灭菌蛋白抗体置于中央孔中并将小鼠血浆(10μl)和人(5μl)血浆或纯化的人血清灭菌蛋白(0.5μg)置于周围孔中。在中央孔和周围孔之间的沉淀线表示测试样品中血清灭菌蛋白的存在；

图2显示通过NEO缺失来拯救血清灭菌蛋白基因敲除。A.显示FLPe-介导的NEO缺失后期望的重组血清灭菌蛋白基因座位示意图。B.源自血清灭菌蛋白^-/-×FLPe-转基因小鼠杂交的7只小鼠的PCR基因型分型。使用LoxP或FLPe-特异性引物，两只小鼠(#1和#5)鉴定为具有重组血清灭菌蛋白基因以及4只小鼠(#1至#4)是FLPe转基因的。如所期望的，FLPe-阴性、LoxP-阳性小鼠(#5)含有NEO而FLPe-阳性、LoxP-阳性小鼠(#1)不含有NEO。C.血浆血清灭菌蛋白的免疫扩散分析，其显示在小鼠#5(血清灭菌蛋白-/-)中不存在血清灭菌蛋白，而在小鼠#1(敲除拯救的)中检测到血清灭菌蛋白。将抗人血清灭菌蛋白抗体置于中央孔中并将小鼠#1、#2、#5、#6(参见图B)的血浆样品置于周围孔中；

图3显示LPS-诱导的AP补体激活的ELISA测定。A.在包被LPS的板上进行LPS的ELISA检测。B.在野生型(WT)或血清灭菌蛋白敲除(P^-/-)小鼠血清中通过结合板的伤寒沙门氏菌(S.typhosa)LPS进行AP补体激活。为了重建血清灭菌蛋白-/-小鼠血清中的AP活性，将C3-/-血清或纯化的人血清灭菌蛋白(hP)与血清灭菌蛋白-/-小鼠血清预混合。可选地，在暴露于血清灭菌蛋白-/-血清前，将包被LPS的板与人血清灭菌蛋白温育并且洗涤(hP包被)。用结合板的明尼苏达沙门氏菌(S.minnesota)(S)(C)或大肠杆菌(E.coli)(D)的LPS进行类似的测定。E.和F.与板-结合的LPS相互作用的人血清灭菌蛋白的ELISA测定。首先用不同浓度的LPS包被板，然后与固定浓度的纯化人血清灭菌蛋白(62.5ng/孔)温育(E)。在图F中，首先用固定浓度的LPS(5μg/ml)包被板，然后与递增浓度的纯化人血清灭菌蛋白温育。在洗涤后，通过抗血清灭菌蛋白抗体来检测结合板的血清灭菌蛋白的量；

图4显示Crry^-/-红细胞诱导的和酵母聚糖诱导的AP补体激活。A.野生型(WT)或血清灭菌蛋白^-/-小鼠中生物素标记的Crry^-/-小鼠红细胞(1×10⁹)的存活率。通过FACS测定转输后5分钟在受体小鼠中Crry^-/-红细胞的百分比并作为100％。B.在与Mg⁺⁺-EGTA中的WT、血清灭菌蛋白-/-或B因子敲除(fB^-/-)小鼠血清温育后在酵母聚糖上C3沉积的代表性FACS分析。C.在酵母聚糖上C3沉积的定量。用两个血清稀释度(1∶10，1∶20)和两个酵母聚糖浓度(0.025mg/ml，0.125mg/ml)来进行试验。N＝每组3只小鼠并且每只小鼠血清进行两次测定。MFI：荧光强度均值。P值指Student t检验；

图5显示CVF诱导的AP补体激活和抗-OVA/OVA-诱导的经典途径补体激活。A和B.野生型(A)或血清灭菌蛋白^-/-(B)小鼠血清中C3激活的蛋白印迹分析。在用Mg⁺⁺-EGTA中的CVF处理的血清中检测到C3α-链的剪切产物，但在未处理的血清中或用EDTA中的CVF处理的血清中没有检测到该产物。C.图A和B中剪切的和完整的C3α-链的光密度测定。D.在野生型(WT)、血清灭菌蛋白^-/-和B因子敲除(fB^-/-)的小鼠血清或用抗人fB抗体处理的血清灭菌蛋白^-/-血清中对抗OVA/OVA诱导的经典途径补体激活的ELISA板测定；

图6显示体内和体外LOS和LPS诱导的补体激活。A和B.LOS(A)或LPS(B)处理后1hr野生型(WT)和血清灭菌蛋白^-/-小鼠中血浆C3激活产物的ELISA测定。LOS或LPS以20mg/kg给予(腹膜内)并且将PBS用作载体对照。N＝每组3只小鼠并且以两个重复孔进行ELISA测定。将体外用CVF处理的野生型小鼠血浆样品用作C3激活参照(100％)。C和D.GVB⁺⁺缓冲液中的野生型(WT)、血清灭菌蛋白-/-或B因子敲除(fB^-/-)小鼠血清中LOS诱导的(C)或LPS诱导的(D)总补体激活的ELISA测定；

图7显示血清灭菌蛋白敲除小鼠对关节炎发展具有抗性；

图8显示单克隆抗体克隆1.1、2.9和2.11是LPS-诱导的替代途径(AP)补体激活的封闭性抗体。单克隆抗体7.11是非封闭性抗体(图A)。EDTA封闭AP补体并在此处用作阳性对照(对于补体抑制)(图A)。培养基对照：用作阴性对照以显示抑制与mAb有关(图A)。mAb克隆2.9和2.11的剂量反应曲线(图B)。Calf IgG表明细胞培养基的IgG。方法：用作为AP补体激活剂的LPS包被ELISA板并在GVB-Mg⁺⁺-EGTA缓冲液中进行测定；

图9显示mAb克隆2.9和2.11，以及多克隆抗P抗体抑制酵母聚糖诱导的AP补体激活。将20mM EDTA用作酵母聚糖诱导的AP补体激活抑制的阳性对照。方法：将酵母聚糖与10％正常人血清(NHS)温育，其中含有或不含GVB-Mg++-EGTA中的抗-P抗体或EDTA，通过FACS测定酵母聚糖上C3沉积的量；

图10显示mAb克隆2.9和2.11剂量-依赖性地抑制人补体-介导的兔红细胞裂解。多克隆抗-P抗体和EDTA被用作兔红细胞裂解抑制的阳性对照。方法：将兔红细胞与在GVB-Mg++-EGTA中的7.5％正常人血清温育，其含有或不含抗P抗体或EDTA。使用分光光度计通过血色素释放来测定裂解的程度。通过低渗休克而完全裂解的细胞被用作对照(100％裂解)；

图11显示mAb都不(多克隆Ab也不)抑制经典途径(CP)补体激活(图A)。EDTA封闭CP补体并且在此用作阳性对照(对于补体抑制)(图A)。克隆2.9和2.11的剂量反应曲线显示缺乏抑制(图B)。方法：用OVA/抗OVA免疫复合物包被ELISA板并且在GVB-Mg⁺⁺缓冲液中进行测定；

图12显示mAb克隆2.9和2.11对液相经典途径补体激活没有影响，所述补体激活由免疫复合物(IC)诱导并且通过sC5b-9的产生来测量，将不包含免疫复合物(w/o IC)或在存在EDTA的情况下包含IC的样品用作阴性对照。正常人血清(NHS)与OVA/抗OVA温育；

图13显示mAb克隆2.9和2.11对液相经典途径补体激活没有影响，所述补体激活由免疫复合物(IC)诱导并且通过C3a的产生来测量，将不包含免疫复合物(w/o IC)或在存在EDTA的情况下包含IC的样品用作阴性对照。正常人血清(NHS)与OVA/抗OVA温育；

图14显示mAb克隆2.9和2.11对人补体介导的抗体敏化的羊红细胞裂解没有影响，经典途径补体激活的另一个已建立的测定——如多克隆抗-P抗体——也对人补体介导的抗体敏化的羊红细胞裂解没有影响。相反，EDTA抑制人补体介导的抗体敏化的羊红细胞裂解并且用作抑制作用的阳性对照。方法：将抗体敏化的羊红细胞与GVB-Mg⁺⁺缓冲液中的7.5％正常人血清温育，其含有或不含有抗-P抗体或EDTA。使用分光光度计通过血色素释放来测定裂解的程度。将通过低渗休克而完全裂解的细胞用作对照(100％裂解)；以及

图15显示血清灭菌蛋白在缺血再灌注损伤中起关键作用。将小鼠进行肾蒂闭塞22分钟，然后进行24hr再灌注。在处理前(0hr)和后(24hr)测定血液尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。与WT小鼠比较，DAF-CD59双敲除小鼠(DKO)导致更严重的损伤。这种肾损伤的恶化取决于C3，原因在于在它们的损伤方面，缺乏C3的DKO小鼠(DKO-C3)类似于WT小鼠。肾损伤的恶化也取决于B因子，原因在于在它们的损伤方面，缺乏B因子的DKO小鼠(DKO-fB)类似于WT小鼠。肾损伤的恶化也取决于血清灭菌蛋白，原因在于在它们的损伤方面，缺乏血清灭菌蛋白的DKO小鼠(DKO-P)类似于WT小鼠。

发明详述

在一个实施方式中，本发明涉及使用抗血清灭菌蛋白抗体选择性激活替代途径(AP)。在另一个实施方式中，本发明涉及通过将对象与抗血清灭菌蛋白抗体接触来治疗对象中AP补体介导的病症或AP介导的状况的方法。在一个实施方式中，本发明提供血清灭菌蛋白敲除的转基因非人哺乳动物及它们的应用。

在一个实施方式中，血清灭菌蛋白在结构上由N端结构域和六个I型血小板反应蛋白重复(TSR)结构域组成。在生理条件下，其作为环状聚合物(二聚体、三聚体、四聚体)存在于血浆中，通过单体的首尾相连而形成。在X染色体的短臂上编码人血清灭菌蛋白，在另一个实施方式中，人血清灭菌蛋白的缺乏——尤其当与C2、MBL或IgG2缺乏组合时——构成致死的奈瑟氏菌感染的高外显率风险因素。

在另一个实施方式中，本文提供的方法显示在AP补体激活中对血清灭菌蛋白的激活剂特异性要求，并在一个实施方式中表明血清灭菌蛋白作为AP补体引发剂的潜能。

免疫系统识别“自身”抗原和“非自身”抗原的能力对于免疫系统行使对抗侵入微生物的特异性防御的功能是重要的。“非自身”抗原是进入体内或存在于体内的物质上的那些抗原，其可检测到不同于或异源于动物自己的成分，而“自身”抗原是在健康动物中的那些抗原，其不能检测到不同于或异源于动物自己的成分。

在一个实施方式中，本文提供治疗对象中AP补体介导的病症的方法，其包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤，该抗体在另一个实施方式中不损害经典途径。因此，本文描述的方法不影响经典途径补体，该方法在一个实施方式中利用所描述的mAb。

在一个实施方式中，经典途径由抗原-抗体复合物启动，而替代途径由特异性多糖激活，所述特异性多糖常见于细菌、病毒和寄生虫细胞表面。经典途径由成分C1-C9组成，而替代途径由成分C3和几个因子如B因子、D因子和H因子组成。包含经典补体途径的事件顺序由三个阶段组成：a.识别，b.酶激活，以及c.导致细胞死亡的膜攻击。补体激活的第一阶段始于C1。C1由三个不同的蛋白构成：识别亚基C1q以及丝氨酸蛋白酶亚成分C1r和C1s，它们一起结合在钙依赖性四聚体复合物C1r.sub.2s.sub.2中。完整的C1复合物对引起C1生理激活是必需的。当完整的C1复合物结合到复合有抗原的免疫球蛋白时，发生激活。该结合激活C1s，然后C1s剪切C4和C2蛋白以产生C4a和C4b以及C2a和C2b。C4b和C2a片段结合形成C3转变酶，C3转变酶进而剪切C3形成C3a和C3b。经典途径和替代途径都能够单独诱导C3转变酶的产生，以将C3转变成C3b，C3b的产生是补体途径的中心事件。C3b结合至存在于嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上的C3b受体，从而激活末端裂解的补体序列C5-C9。

当抗体结合抗原时经典途径的启动开始。C1g结合已结合抗原的IgG或IgM的改变的Fc区。一旦结合，C1r激活C1s，C1s通过剪切来自C4和C2的肽来启动激活单元。从而C1s将C4剪切成C4a和C4b，C1s将C2剪切成C2a和C2b。C2a结合C4b形成C4b2a。C4b2a——C3转变酶——是蛋白水解酶。它将C3剪切成C3b和C3a，其中C3b可以结合到激活的表面，C3a被释放入液相(9)中。C3转变酶具有剪切许多C3分子的能力。这可以导致大量C3b分子沉积在激活的表面上。但是，由于C3b的不稳定性，很少有分子实际结合。当剪切C3时，形成C4b2a3b——C5转变酶。C5转变酶——也是一种酶——可以将许多C5分子剪切成C5a和C5b。

因此，当靶向细菌和其它AP-补体激活剂时，必须维持这种免疫应答系统。在一个实施方式中，用于本文描述的方法的mAb不影响CP补体的激活。

由于替代途径C3转变酶的底物是C3，因此C3既是反应成分又是反应产物。随着C3转变酶产生越来越多量的C3b，放大环被建立。在一个实施方式中，经典途径也产生C3b，由此C3b结合B因子并且参与替代途径。在另一个实施方式中，这使得更多的C3b沉积在靶标上。在一个实施方式中，抗体结合到抗原启动经典途径。如果抗体附着在细菌上，则经典途径产生C3b，C3b偶联到靶向病原体。在一个实施方式中，用于本文描述方法和组合物中的抗体不影响经典途径补体的AP放大环。

因此，在一个实施方式中，本文提供治疗对象中AP补体介导的病症的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体或其功能片段、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

在另一个实施方式中，本文提供抑制对象中血清灭菌蛋白依赖性的，微生物抗原、非生物外源表面或改变的自身组织引发的AP补体激活的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体或其功能片段、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

在一个实施方式中，根据抗体的重链结构将抗体分为不同的种类。这些包括IgG、IgM、IgA和IgE。在一个实施方式中，具有相同重链结构的抗体是同一“同种型”(“isotype”)。在另一个实施方式中，由于不同等位基因的遗传而具有不同抗原决定簇的相同同种型的抗体称为“同种异型”(“allotypes”)。在一个实施方式中，主要(但不是全部)在抗体的抗原结合位点的高变区中发现的抗原决定簇称为“独特位”(“idiotopes”)。在另一个实施方式中，具有共用或共享的独特位的抗体被认为是相同独特型(idiotype)的成员。

在一个实施方式中，L链可变区上的抗原决定簇或在另一个实施方式中，H链可变区上的抗原决定簇——其与抗体的抗原结合位点结合——在某些实施方式中称为“独特型”。在另一个实施方式中，针对独特型(独特性)产生的抗体或在某些实施方式中与独特型(独特性)反应的抗体称为“抗独特型抗体”。

在一个实施方式中，术语“抗体”包括完全抗体(例如，二价的IgG，五价的IgM)或抗体片段，所述抗体片段在其它实施方式中包含抗原结合位点。在一个实施方式中，这些片段包括Fab、F(ab′)₂、Fv和单链Fv(scFv)片段。在一个实施方式中，这些片段可以包括或可以不包括抗体恒定结构域。在另一个实施方式中，Fab′s缺乏恒定结构域，所述恒定结构域对于补体结合是必需的。ScFvs由抗体可变轻链(V_L)组成，所述抗体可变轻链通过柔性铰链连接到可变重链(V_H)。ScFv能够结合抗原并且可以在细菌或其它系统中快速产生。本发明包括在细菌中和在哺乳动物细胞培养物中产生的抗体和抗体片段。从噬菌体文库获得的抗体可以是完全抗体或抗体片段。在一个实施方式中，在这种文库中存在的结构域是共同包含Fv或scFv的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)，在另一个实施方式中，外加重链恒定结构域(C_H1)和轻链恒定结构域(C_L)。四个结构域(即，V_H-C_H1和V_L-C_L)包含Fab。在一个实施方式中，一旦期望的V_H-V_L结合物已经被鉴定，通过替代缺失的恒定结构域从这种文库获得完全抗体。

在一个实施方式中，本发明的抗体可以是单克隆抗体(mAb)或在另一个实施方式中是多克隆抗体。用于本发明组合物、方法和试剂盒的本发明的抗体可以来自任意来源，以及另外可以是嵌合的。在一个实施方式中，抗体来源可以来自小鼠或大鼠，在其它实施方式中来自植物或人。用于本发明组合物和方法的本发明的抗体具有降低的人抗原性(以降低或消除形成抗人抗体的风险)，以及在另一个实施方式中，在人类中不具有抗原性。在一个实施方式中，用于本发明的嵌合抗体含有人氨基酸序列，并包含为非人抗体的人源化抗体，所述非人抗体被人来源的序列取代以降低或消除免疫原性，但其保留非人抗体的抗原结合特征。

在一个实施方式中，在应用噬菌体展示技术的PCR构建期间，重链和轻链被随意配对。在一个实施方式中，术语“噬菌体展示”或“噬菌体展示技术”指这样的方法学：其利用编码感兴趣的外源多肽的核酸序列与编码噬菌体外壳蛋白的序列的融合，以便在噬菌体颗粒的表面上展示外源多肽。在另一个实施方式中，该技术的应用包括利用亲和相互作用来从多肽文库(如在本文描述的组合物中提供的抗血清灭菌蛋白单克隆抗体)选择具体的克隆，所述多肽文库的成员展示在单独的噬菌体颗粒表面上。在一个实施方式中，多肽展示是由于来自噬菌体载体的编码它们的序列的表达，该序列已经插入噬菌体载体中。在一个实施方式中，多肽编码序列文库被转移到单独的展示噬菌体载体以形成噬菌体文库，其在另一个实施方式中可以用来筛选感兴趣的多肽。

在一个实施方式中，术语“噬菌体表面蛋白”指在噬菌体表面通常发现的任意蛋白，其可以适于作为具有异源多肽的融合蛋白而表达并且仍然可以装配入噬菌体颗粒中，以便在噬菌体表面上展示多肽。

如本领域的技术人员应理解的，在某些实施方式中，术语“抗体或它们的片段”所包括的免疫学上的结合试剂延伸至来自所有物种的所有抗体，包括二聚体、三聚体和多聚体抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；人和人源化抗体；重组和改造的抗体以及它们的片段。在另一个实施方式中，术语“抗体或它们的片段”指具有抗原结合区的任意抗体样分子，该术语包括小分子物质片段如Fab′、Fab、F(ab′)₂、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)、线性抗体、双抗体等等。制备和使用各种基于抗体的构建物和片段的技术在本领域中是公知的。在一个实施方式中，用于本文描述的方法和组合物的抗血清灭菌蛋白片段是Fc，或在其它实施方式中是Fab、F(ab′)、F(ab′)₂或其组合。在另一个实施方式中，用于本文描述的方法和组合物的抗血清灭菌蛋白片段是Fc，或在其它实施方式中是Fab、F(ab′)、F(ab′)₂或其组合。

术语“抗体片段”也包括任意合成的蛋白或基因工程蛋白，其通过结合到特异性抗原形成复合物来起到小分子剂的作用。在一个实施方式中，抗体片段包括分离的片段、“Fv”片段——由重链和轻链的可变区组成、重组单链多肽分子——其中轻链和重链可变区通过肽连接体(“sFv蛋白”)而连接，以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。在一个实施方式中，抗体是重链和轻链的可变区，或者在其它实施方式中，抗体是重组单链多肽分子——其中轻链和重链可变区通过肽连接体(“sFv蛋白”)而连接，以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。

在一个实施方式中，用于本文描述的方法和组合物的抗血清灭菌蛋白mAb选择性抑制AP补体激活并且对CP的AP放大环没有影响。在另一个实施方式中，本文描述的mAb不同于已开发的抗血清灭菌蛋白mAb，已开发mAb抑制AP和CP补体。

因此，在一个实施方式中，本文提供治疗对象中AP补体介导的病症的方法，或治疗血清灭菌蛋白依赖性的，微生物抗原、非生物外源表面或改变的自身组织引发的AP补体激活的方法，其包括下列步骤：给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体，从而抑制C3bBb蛋白产生，因此该抗体不影响经典途径补体的AP放大环。

在一个实施方式中，血清灭菌蛋白对于LPS诱导的和LOS诱导的AP补体激活是不可缺少的；在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白对AP补体介导的Crry缺乏红细胞的血管外溶血是不可缺少的。在一个实施方式中，通过缺乏血清灭菌蛋白，酵母聚糖诱导的AP补体激活被适当地削弱。在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白起无关紧要的作用，或者在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白在CVF引发的AP补体放大和经典途径引发的AP补体放大中没有任何作用。在一个实施方式中，血清灭菌蛋白与非依赖性AP补体启动的相关性大于与继发于其它激活途径的AP补体放大的相关性。在另一个实施方式中，在AP补体启动中对血清灭菌蛋白的需要是可变的并且取决于激活表面的性质。在一个实施方式中，外源和内源的AP补体激活剂的活性都关键取决于血清灭菌蛋白。

在一个实施方式中，在给定表面上的AP激活代表经由C3bBb稳定的血清灭菌蛋白依赖性促进和C3“慢速运转”的H因子(fH)-依赖性抑制之间的平衡。在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白对其不重要的AP激活剂可以具有与fH有限的相互作用，以及由于缺乏足够的fH-依赖性抑制，自发的C3激活和放大可以作为缺省过程发生而无需血清灭菌蛋白的协助。在另一个实施方式中，纯化的人血清灭菌蛋白恢复在血清灭菌蛋白^-/-血清中伤寒沙门氏菌LPS-诱导的AP补体活性，但不恢复明尼苏达沙门氏菌(S)或大肠杆菌LPS-诱导的AP补体活性(图3)。

在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白直接结合到AP激活剂，或在另一个实施方式中，血清灭菌蛋白经由最初沉积的C3b结合到AP激活剂——通过充当新C3bBb组装的平台引导补体激活。在一个实施方式中，表面结合的血清灭菌蛋白促进C3bBb形成；在另一个实施方式中，在血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清中，人血清灭菌蛋白恢复LPS-诱导的AP补体活性的能力与其LPS亲和力相关(图3)。在一个实施方式中，在不存在任何溶液血清灭菌蛋白的情况下，LPS结合的人血清灭菌蛋白激活缺乏血清灭菌蛋白的对象血清中AP补体(图3)。

在一个实施方式中，由于其对激活表面的亲和力，血清灭菌蛋白发挥AP补体启动的专性模式识别分子的作用。在另一个实施方式中，在缺乏血清灭菌蛋白的对象血清中，酵母聚糖引起剧烈的AP补体激活，这表明其它一个或多个因素以类似激活剂特异性的方式对AP补体启动发挥作用。

在一个实施方式中，缺乏血清灭菌蛋白的个体易遭受细菌感染。在另一个实施方式中，体内LOS-诱导的补体激活在血清灭菌蛋白-缺乏的个体中消失而由LPS诱导的补体激活仅仅部分被削弱(图6)。在另一个实施方式中，AP在LOS诱导的补体激活中而不是在LPS诱导的补体激活中是主要途径。在一个实施方式中，尤其是当在另一个实施方式中与低抗体组合或在另一个实施方式中与甘露糖结合凝集素水平组合时，血清灭菌蛋白的缺乏消除了对含有LOS的meningitide的补体介导的杀菌活性。

在一个实施方式中，血清灭菌蛋白在宿主防御中起作用。在另一个实施方式中，在炎症部位由白细胞产生的血清灭菌蛋白启动AP补体并扩大组织损伤。

因此，在一个实施方式中，本文提供治疗对象中AP补体介导的病症的方法，包括下列步骤：给予所述对象血清灭菌蛋白活性抑制剂，从而治疗对象中AP补体介导的病症。

在一个实施方式中，通过使对象与血清灭菌蛋白活性抑制剂接触来治疗的AP补体介导的病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在另一个实施方式中，AP补体介导的病症是缺血再灌注损伤。在另一个实施方式中，AP补体介导的病症是关节炎(参见图7)。在另一个实施方式中，AP补体介导的病症是阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征。在另一个实施方式中，AP补体介导的病症是非典型溶血尿毒(aHUS)综合征。

在一个实施方式中，使用治疗对象中AP补体介导的病症的方法抑制的血清灭菌蛋白活性，或在另一个实施方式中，由脂寡糖(LOS)诱发的AP补体激活；或在另一个实施方式中，抑制模式识别受体-介导的AP补体激活；或在另一个实施方式中，抑制替代途径(AP)补体激活的启动是C3bBb蛋白的产生。在另一个实施方式中，用于本文提供的方法的血清灭菌蛋白活性抑制剂不抑制所述对象中经典途径引发的补体激活；在一个实施方式中，其不抑制凝集素途径引发的AP补体激活、酵母聚糖诱导的AP补体激活或眼镜蛇毒因子诱导的AP补体激活。在一个实施方式中，用于本文提供的方法的血清灭菌蛋白活性抑制剂不抑制凝集素途径引发的AP补体激活、酵母聚糖诱导的AP补体激活或眼镜蛇毒因子诱导的AP补体激活。

在一个实施方式中，术语“补体激活”指补体放大。在另一个实施方式中，用于本文提供的方法的血清灭菌蛋白活性抑制剂阻止AP补体的激活。在一个实施方式中，用于治疗或抑制或阻抑或减轻AP补体介导的病症症状的方法——包括给予所述对象血清灭菌蛋白活性抑制剂的步骤——的抑制剂可以是抗体，诸如，在另一个实施方式中，可以是结合血清灭菌蛋白的抗体，或在其它实施方式中是小分子、肽、拟肽(peptidomimetic)、环肽或它们的组合。

在一个实施方式中，本文提供治疗AP补体介导的病症的方法，包括向所述对象给予组合物的步骤，所述组合物降低所述对象组织或体液中的血清灭菌蛋白水平。在另一个实施方式中，本文提供抑制对象中替代途径(AP)补体介导的红细胞或血小板破坏的方法，包括给予所述对象本文描述的血清灭菌蛋白活性抑制剂的步骤。

在另一个实施方式中，本发明的方法显示这样的优势：其保存对象使用经典补体激活途径抗击感染的能力。在另一个实施方式中，本文提供抑制对象中由细菌脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活的方法，包括下列步骤：给予所述对象血清灭菌蛋白活性抑制剂，从而抑制对象中细菌LOS诱导的AP补体激活。在另一个实施方式中，用于抑制对象中细菌脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活的方法的抑制剂是本文描述的抑制剂实施方式中任意一个。因此，在另一个实施方式中，本文提供抑制细菌LPS诱导的AP补体激活的方法。在一个实施方式中，AP补体激活由伤寒沙门氏菌LPS诱导，以及用于本文提供的方法的抑制剂不抑制由明尼苏达沙门氏菌(S)或大肠杆菌LPS或两者诱导的AP补体活性。

在一个实施方式中，本文提供抑制对象中模式识别受体介导的AP补体激活的方法，包括下列步骤：给予所述对象血清灭菌蛋白活性抑制剂，从而抑制对象中模式识别受体介导的AP补体激活。

在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别产生；所述微生物抗原是胞壁酰二肽(MDP)。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别产生；其中微生物抗原是来自细菌DNA的CpG基序。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别产生；其中微生物抗原是肽聚糖。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别产生；其中微生物抗原是脂磷壁酸质。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别产生；其中微生物抗原是来自伯氏疏螺旋菌(Borreliaburgdorferi)的外表面蛋白A。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是合成的支原体巨噬细胞激活的脂蛋白-2，三棕榈酰基-半胱氨酰基-丝氨酰基-(赖氨酰基)3-赖氨酸(P3CSK4)。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是二棕榈酰基-CSK4(P2-CSK4)。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是单棕榈酰基-CSK4(PCSK4)。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是两性霉素B。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是三酰基化的或二酰基化的细菌多肽。在另一个实施方式中，AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生；其中微生物抗原是它们的组合。

在一个实施方式中，本文提供抑制对象中替代途径(AP)补体激活启动的方法，包括下列步骤：给予所述对象血清灭菌蛋白活性抑制剂，从而抑制对象中AP补体激活启动。

在另一个实施方式中，本发明的方法显示这样的优势：其保存了对象经由经典激活途径激活补体的能力。在另一个实施方式中，本发明的方法显示这样的优势：其保存了对象经由凝集素激活途径激活补体的能力。

在一个实施方式中，本文提供转基因敲除动物，所述动物的基因组包含内源血清灭菌蛋白基因中的纯合破坏，其中所述纯合破坏阻止血清灭菌蛋白的功能并且导致所述转基因敲除小鼠显示与野生型小鼠相比减少的AP补体。

在另一个实施方式中，本文提供选择用于治疗对象中AP补体介导的病症的潜在治疗化合物的方法，或在另一个实施方式中，本文提供选择用于治疗脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活的潜在治疗化合物的方法；或者在另一个实施方式中，本文提供选择用于抑制模式识别受体介导的AP补体激活的潜在治疗化合物的方法；或者在另一个实施方式中，本文提供选择用于抑制替代途径(AP)补体激活启动的潜在治疗化合物的方法，其包括：a)将化合物给予野生型动物或具有AP补体介导病症的动物，或在另一个实施方式中，将化合物给予具有脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活的动物；或在另一个实施方式中，将化合物给予具有模式识别受体-介导的AP补体激活的动物；或在另一个实施方式中，将化合物给予具有替代途径(AP)补体激活启动的动物；b)测量野生型动物或所述动物形成的表型，所述动物具有AP补体介导的病症，或在另一个实施方式中，具有脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活；或在另一个实施方式中，具有模式识别受体-介导的AP补体激活；或在另一个实施方式中，具有替代途径(AP)补体激活的启动；以及c)将野生型动物或所述动物形成的表型与血清灭菌蛋白-/-敲除动物的表型进行比较，其中所述动物具有AP补体介导的病症，或在另一个实施方式中，具有脂寡糖(LOS)诱导的AP补体激活；或在另一个实施方式中，具有模式识别受体-介导的AP补体激活；或在另一个实施方式中，具有替代途径(AP)补体激活的启动。

在一个实施方式中，本文提供制备转基因非人哺乳动物的方法，其包括：将多核苷酸导入非人哺乳动物的胚胎中，所述多核苷酸包含编码血清灭菌蛋白编码基因的破坏的内含子的编码区；将胚胎转移到代孕母体小鼠中；使所述胚胎妊娠；以及选择所述代孕母体小鼠生出的转基因小鼠，其中所述转基因非人哺乳动物的特征在于当与非转基因哺乳动物比较时，其具有降低的AP补体激活。

在另一个实施方式中，本文提供转基因非人哺乳动物及其子代，其基因组包含血清灭菌蛋白编码基因的破坏，以便所述哺乳动物缺乏功能性血清灭菌蛋白或具有降低的功能性血清灭菌蛋白水平。

在一个实施方式中，本文提供转基因非人哺乳动物及其子代，其基因组包含血清灭菌蛋白编码基因的破坏，以便所述哺乳动物缺乏功能性血清灭菌蛋白或具有降低的功能性血清灭菌蛋白水平，其中新霉素盒(NEO)插入在所述血清灭菌蛋白基因的外显子5和6之间，在一个实施方式中，这导致外显子5和6之间内含子的破坏。

在另一个实施方式中，本文提供从本文描述的转基因非人哺乳动物获得的细胞、器官、组织或它们的组合。在一个实施方式中，本文提供培养源自本文描述的转基因非人哺乳动物的转基因细胞的方法，包括下列步骤：提供非人转基因哺乳动物的细胞以及在允许所述细胞生长的条件下培养所述细胞。

在一个实施方式中，本文提供制备转基因非人哺乳动物的方法，其包括：将多核苷酸导入非人哺乳动物的胚胎中，所述多核苷酸包含编码血清灭菌蛋白编码基因的破坏的内含子的编码区；将所述胚胎转移到代孕母体小鼠中；使所述胚胎妊娠；以及选择所述代孕母体小鼠生出的转基因小鼠，其中所述转基因非人哺乳动物的特征在于当与非转基因哺乳动物比较时，其具有降低的AP补体激活。在一个实施方式中，在本文描述的方法中，选择所述代孕母体小鼠生出的转基因小鼠的步骤包括：将两只选择的转基因小鼠交配；使胚胎妊娠；以及选择转基因母体生出的转基因小鼠。在一个实施方式中，制备转基因非人哺乳动物的方法被重复一代以上。

在另一个实施方式中，使用本文描述的转基因动物，通过选择潜在治疗化合物的方法来鉴定用于本文提供的方法的抑制剂。

在一个实施方式中，术语“对象”指哺乳动物，其需要对状况或其后遗症进行治疗或对状况或其后遗症易感，包括人。所述对象可以包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠以及人。术语“对象”不排除在所有方面正常的个体。

提供下述实施例以便更充分地说明本发明的优选实施方式。但是，它们决不应该解释为限制本发明的宽范围。

实施例

材料和方法：

血清灭菌蛋白基因靶向

为了构建靶向载体，使用pND1载体，其包含新霉素(NEO)和白喉毒素(DT)，分别作为阳性和阴性选择标记(由Dr Glen Radice，University of Pennsylvania善意提供)。该载体含有用于Cre重组酶介导的基因移除的两个LoxP位点，以及NEO侧面是用于FLPe重组酶潜在移除的两个FRT位点。使用129/Sv小鼠基因组DNA作为模板以及用Expand Long Template PCR System(Roche)通过PCR扩增血清灭菌蛋白基因片段。对于3′同源臂，使用5′-CTCGAGCATTCATCTTTGCCAGAAATC-3′(SEQ ID NO.1)和5′-TCCCCATACTCAGCACTATTG-3′(SEQ ID NO.2)作为引物，将含有外显子6-9的3.5kb基因片段扩增，克隆至PCR 2.1载体(Invitrogen，CA)，以及然后亚克隆至pND1中的EcoRI位点(NEO盒的下游，图1B)。对于5′同源臂，使用下列引物对：5′-GATATCATAACTTCGTATAATGT-ATGCTATACGAAGTTATGTTCAATCACCCACCATCCCT-3′(SEQ ID NO.4)和5′-CTCGAGCATTCATCTTTGCCAGAAATC-3′(SEQ ID NO.5)；5′-GCGGCCGATTCC-GGCTGTATCTGAGTC-3′(SEQ ID NO.6)和5′-GATATCAGGAAGAAGTGAA-TATACAGG-3′(SEQ ID NO.7)，扩增两个片段——含有外显子1-2的4kb NotI-EcoRV片段和含有外显子3-5的1.6kb EcoR V-XhoI片段——以及掺入34bp LoxP位点(5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′(SEQ IDNO.3)。在3段连接实验中，在NotI-XhoI位点(Neo的上游)将这2段克隆至pND1载体中。

在转染之前，通过Not I消化将靶向载体线性化。用G418(0.2mg/ml)选择ES细胞并且使用Hinc II和Sea I消化的基因组DNA和位于右侧同源臂3′的513bp探针通过DNA印迹来筛选阳性克隆(图1，A-D)。ES细胞培养、载体转染、克隆选择和嵌合体小鼠产生如所述进行。将雄性同窝出生的幼仔(littermate)用于全部实验。为了PCR基因型分型，将5′-GGGTGGGATTAGATAAATGCC-3′(P1，NEO-特异性；(SEQ ID NO.8))和5′-CAAGGTACGGCTTTGTTACACA-3′(P2，血清灭菌蛋白-特异性；(SEQ ID NO.9))用于NEO检测(700bp产物)，将5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′(SEQ ID NO.10)和P2用于LoxP检测(400bp产物)。将5′-CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC-3′(SEQ ID NO.11)和5′-CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG-3′(SEQ ID NO.12)用于FLPe转基因检测。所有动物实验获得宾夕法尼亚大学动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)批准。

其它小鼠和试剂

C3^-/-和FLPe-Tg(B6；SJL-Tg(ACTFLPe)9205Dym/J)小鼠来自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。fB^-/-小鼠、兔抗OVA和兔抗C3c抗体由Dr J.Lambris(University of Pennsylvania)善意提供。Crry^-/-C3^-/-小鼠由Dr H.Molina(Washington University)善意提供。酵母聚糖A(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)、伤寒沙门氏菌、明尼苏达沙门氏菌(S)、大肠杆菌026：B6 LPS、OVA和HRP抗小鼠IgG来自Sigma-Aldrich。人血清灭菌蛋白来自Quidel(San Diego，CA)。抗核心LPS mAb—WN1 222-5——来自Cell sciences(Canton，MA)。山羊抗人血清灭菌蛋白和fB抗体来自Complement Technologies(SanDiego，CA)。HRP山羊抗C3抗体来自MP Biomedicals(Solon，OH)。脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)LOS由Dr.Sanjay Ram(University ofMassachusetts，Worcester)善意提供。

RNA印迹和免疫扩散测定

RNA印迹分析如[Miwa T，Zhou L，Hilliard B，Molina H，Song WC.Crry，but not CD59 and DAF，is indispensable for murine erythrocyteprotection in vivo from spontaneous complement attack.Blood.2002；99：3707-3716.]所述进行，其使用700bp小鼠血清灭菌蛋白cDNA作为探针。血浆血清灭菌蛋白通过免疫扩散测定来检测，如CurrentProtocols in Immunology(John Wiley and Sons，Inc.)中描述的那样，其使用抗-人血清灭菌蛋白抗体。

结合板的LPS检测

为了比较不同细菌物种(伤寒沙门氏菌、明尼苏达沙门氏菌和大肠杆菌)LPS的板包被效率，将板用稀释浓度的LPS包被。在用BSA(10mg/ml)封闭1h后，将板用PBS洗涤并且与WN1 222-5(0.5μg/ml)——鼠抗核LPS mAb—温育1h，然后用HRP-抗小鼠IgG(1∶6000)检测。BSA包被的孔用作背景对照。

补体激活的ELISA测定

将板用LPS(2μg/孔)或OVA/抗-OVA免疫复合物包被来进行补体激活测定，如前所述[Sfyroera G，Katragadda M，Morikis D，Isaacs SN，Lambris JD.Electrostatic modeling predicts the activities of orthopoxviruscomplement control proteins.J Immunol.2005；174：2143-2151.]。将稀释的小鼠血清(每孔50μl)在板上于37℃温育1h，然后使用HRP抗小鼠C3抗体(1∶4000)检测结合板的激活的C3。在Mg⁺⁺-EGTA中测定AP活性，在GVB⁺⁺中测定总活性或经典途径活性。对于重组实验，将1∶10稀释的(在Mg⁺⁺-EGTA中)C3^-/-血清与不同稀释的血清灭菌蛋白-/-血清预混合(以1∶1比例)。可选地，将人血清灭菌蛋白添加到血清灭菌蛋白^-/-血清(62.5ng至50μl血清)或用于预处理LPS包被的板(62.5ng在25μl Mg⁺⁺-EGTA中，在37℃1hr，然后洗涤)。为耗尽fB，将血清灭菌蛋白^-/-血清与抗人fB IgG(每1μl血清8μg)预温育，然后离心除去抗fB/fB免疫复合物。

LPS-血清灭菌蛋白结合

在第一个测定中，将板用不同浓度的LPS包被，用BSA(10mg/ml)封闭，然后与纯化的人血清灭菌蛋白(2.5μg/ml在Mg⁺⁺-EGTA中，25μl/孔)在室温(RT)温育1hr，接着洗涤并且用生物素化的抗血清灭菌蛋白IgG(2μg/ml)和抗生物素蛋白-HRP(1∶10,000)检测。将没有用血清灭菌蛋白处理的LPS包被的孔用作背景对照。在第二个测定中，将板用固定浓度的LPS(5μg/孔)包被，然后与递增浓度的纯化人血清灭菌蛋白温育。在酵母聚糖上进行AP激活的测量。将酵母聚糖(0.025或0.125mg/ml)与在Mg⁺⁺-EGTA中的血清于37℃温育15分钟，通过FACS评价C3沉积作用，如[Kim DD，Miwa T，Song WC.Retrovirus-mediated over-expression of decayaccelerating factor rescuesCrry-deficient erythrocytes from acute alternative pathway complementattack.J Immunol.2006；177：5558-5566.]所述。

体外CVF处理

将血清(5μl)与0.01μg或0.3μg CVF温育不同时间长度。在温育后，在还原条件下将0.5μl血清在8％凝胶上泳动并且进行蛋白印迹分析，如[Xu Y，Ma M，Ippolito GC，Schroeder HW，Jr.，Carroll MC，Volanakis JE.Complement activation in factor D-deficient mice.Proc NatlAcad Sci USA.2001；98：14577-14582.]所述，其使用HRP-偶联的兔抗小鼠C3抗体。通过激活的和完整的C3α-链的光密度扫描对C3剪切进行定量。

红细胞转输和存活测定

如[Miwa T，Zhou L，Hilliard B，Molina H，Song WC.Crry，but notCD59 and DAF，is indispensable for murine erythrocyte protection in vivofrom spontaneous complement attack.Blood.2002；99：3707-3716.]所述测定缺乏Crry的小鼠红细胞对AP补体攻击的体内敏感性。

LOS或LPS诱导的体内补体激活

用20mg/kg脑膜炎奈瑟氏菌LOS或伤寒沙门氏菌LPS注射小鼠(腹膜内)。在处理后1hr，如[Mastellos D，Prechl J，Laszlo G等.Novelmonoclonal antibodies against mouse C3 interfering with complementactivation：description of fine specificity and applications to variousimmunoassays.MoI Immunol.2004；40：1213-1221.]所述测定激活的C3的血浆水平。

实施例1：血清灭菌蛋白敲除(血清灭菌蛋白 ^-/- )小鼠的产生

小鼠血清灭菌蛋白基因位于X染色体上并且由9个外显子组成(http://www.informatics.jax.org/searches/accession_report.cgi？id＝MGI：97545)(图1A)。原计划是产生条件性血清灭菌蛋白基因敲除小鼠，以便可以研究其组织特异性产生的意义。为了实现该目的，通过将5′和3′同源臂序列克隆至pND1载体来构建靶向载体，如图1B中所说明。根据该策略，在正确靶向后，新霉素盒(NEO)应被插入在血清灭菌蛋白基因的外显子5和6之间，并且外显子3-5的两侧应是两个LoxP位点(图1B)，以使它们可通过组织特异性Cre重组酶而缺失。外显子3-5被靶向用于缺失，因为在人血清灭菌蛋白基因外显子4-6中的突变与血清灭菌蛋白缺乏相关。使用位于3′同源臂外侧的513bp探针，在对基因组DNA进行Hinc II和Sca I消化后(图1，C和D)，通过RNA印迹分析来选择靶向的胚胎干(ES)细胞。获得7个阳性ES细胞克隆并且将其中两个用于嵌合小鼠的产生。源自两个ES细胞克隆的嵌合体通过种系成功地传递了突变。

在突变小鼠和用于产生它们的两个ES细胞克隆中进行的重组血清灭菌蛋白基因等位基因的后续分析证实了在拟定位置的NEO插入，但无法检测到5′LoxP序列(图1C)。后者结果是没有预料到的，但是其很可能由于同源重组发生在5′LoxP位点的序列下游(即，外显子3-5)而非上游(即，外显子1-2和5′侧翼区)(图1A，B)。然而，RNA印迹和实时PCR分析在突变小鼠的各种组织中没有检测到血清灭菌蛋白mRNA表达(图1E)，以及免疫扩散分析证实在它们的血浆中缺少血清灭菌蛋白(图1F)。这些结果表明NEO插入至外显子5和6之间的小内含子(201bps)可能已经无意地破坏了血清灭菌蛋白基因。为了验证这个结论，将血清灭菌蛋白突变小鼠与FLPe转基因小鼠杂交。靶向构建物中NEO盒的侧翼是两个FRT位点，其可以被FLPe重组酶识别。FLPe重组酶的表达将NEO中从血清灭菌蛋白基因靶向小鼠的基因组除去，并且相应地恢复它们血浆中的血清灭菌蛋白(图2)。因此，通过NEO插入第5个内含子，意外地产生整体的血清灭菌蛋白基因敲除小鼠(血清灭菌蛋白^-/-)。

实施例2：血清灭菌蛋白 ^-/- 小鼠血清中LPS-诱导的AP补体激活的消除

为评价血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清中的AP补体活性，使用ELISA检测来测量在Mg⁺⁺-EGTA中LPS诱导的补体激活。将LPS包被在96孔板上并且在暴露于小鼠血清后，测定板上C3沉积的水平。使用广泛交叉反应的抗核心LPS mAb，首次证实三个不同细菌物种——伤寒沙门氏菌、明尼苏达沙门氏菌(S)和大肠杆菌——的LPS以类似的亲和力结合到ELISA板(图3A)。图3B-D显示这些LPS均激活了野生型(WT)小鼠血清中的AP补体。相反，同样的LPS没有引起血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清中或用EDTA处理的WT小鼠血清中(阴性对照)可检测到的AP补体激活(图3B-D)。添加C3^-/-小鼠血清(作为鼠血清灭菌蛋白来源)或纯化的人血清灭菌蛋白至血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清，这使伤寒沙门氏菌LPS诱导的AP补体活性恢复到WT水平或更高水平(图3B)。重要的是，用人血清灭菌蛋白预处理伤寒沙门氏菌LPS包被的板然后洗涤也在血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清中重建AP补体激活(图3B)。该结果表明：纯化的人血清灭菌蛋白能够以足够的亲和力结合到伤寒沙门氏菌LPS，以及固定化LPS-结合血清灭菌蛋白在不存在溶液血清灭菌蛋白的情况下激活AP补体。

通过与C3^-/-小鼠血清预混合，在血清灭菌蛋白^-/-血清中观察到明尼苏达沙门氏菌(S)和大肠杆菌LPS诱导的AP补体活性的类似重建(图3C、D)。令人惊讶的是，不像对伤寒沙门氏菌LPS观察的那样，纯化的人血清灭菌蛋白仅仅部分恢复血清灭菌蛋白^-/-血清中明尼苏达沙门氏(S)和大肠杆菌LPS-诱导的AP补体活性，这与是否添加蛋白至血清灭菌蛋白^-/-血清或使用蛋白预处理LPS包被的板无关(图3C、D)。接下来，比较纯化的人血清灭菌蛋白对三个细菌物种的LPS的相对结合亲和力。图3E、F显示，在缺乏LPS包被的情况下，人血清灭菌蛋白不结合到板上，但其显示明确的LPS浓度依赖性和血清灭菌蛋白浓度依赖性的对伤寒沙门氏菌LPS的结合。这与其对明尼苏达沙门氏(S)和大肠杆菌LPS的弱结合形成鲜明对比。因此，人血清灭菌蛋白恢复血清灭菌蛋白^-/-血清中LPS依赖性AP补体活性的能力与其对LPS的结合亲和力有关。

实施例3：非保护的自体细胞上的AP激活也取决于血清灭菌蛋白

为评价血清灭菌蛋白在该过程中的作用，将缺乏C^rry的小鼠红细胞转输入WT和血清灭菌蛋白^-/-小鼠中。图4A显示缺乏Crry的红细胞在WT而不是血清灭菌蛋白^-/-受体中很快消除。因此，非保护的自体细胞上自发的AP补体激活也需要血清灭菌蛋白来启动。

实施例4：血清灭菌蛋白对于酵母聚糖-或CVF-诱导的AP补体激活是 不重要的

将酵母聚糖与WT或血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清温育并且通过C3沉积的FACS分析来评价AP补体激活。如图4B、C中所示，可以发现，酵母聚糖诱导的AP补体激活在血清灭菌蛋白^-/-血清中仅仅被部分削弱。这与缺乏B因子的(fB^-/-)小鼠血清形成明显对比，其不支持AP补体激活(图4B)。眼镜蛇毒因子(cobra-venom factor，CVF)以高亲合力结合B因子并且CVFBb充当稳定的C3转变酶，以引起体内和体外广泛的AP补体激活。为评价血清灭菌蛋白在CVF诱导的AP补体激活中的作用，将WT或血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清用CVF处理并且通过蛋白印迹分析来分析C3激活动力学。可以发现，在20分钟内CVF(对于5μl血清，0.01μg)诱导两种血清类型中全部C3剪切，但血清灭菌蛋白^-/-血清中C3激活动力学似乎被略微延缓(图5A-C)。然而，当使用更高剂量的CVF时(对于5μl血清，0.3μg)，没有观察到WT和血清灭菌蛋白^-/-血清之间的差别。在这种情况下，两种血清中全部C3剪切在CVF处理的1分钟内完成。因此，血清灭菌蛋白在CVF-诱导的AP补体激活中不起重要作用。

实施例5：血清灭菌蛋白在经典途径引发的AP补体放大中起无关紧要 的作用

经典途径和凝集素途径的激活必然启动AP途径。为了确定血清灭菌蛋白在经典途径引发的AP补体放大中是否起作用，使用基于板的测定来测量WT和血清灭菌蛋白^-/-血清中抗OVA/OVA诱导的补体活性。在该实验中，fB^-/-血清作为AP放大的阴性对照而被融合。如图5D所示，观察到WT和fB^-/-小鼠血清之间补体激活的明显差别，这证明AP放大实质上有助于经由经典途径而启动的全面补体激活。相反，抗OVA/OVA诱导的补体激活在血清灭菌蛋白^-/-血清中被最低程度地降低(图5D)。该结果表明，在血清灭菌蛋白^-/-小鼠中AP放大环大部分是完整的或存在经典途径C3转变酶活性的补偿性上调。为了区别这两种可能性，使用抗人fB抗体将fB从血清灭菌蛋白^-/-血清中耗尽。可以发现，fB从血清灭菌蛋白^-/-血清的耗尽将抗-OVA/OVA-诱导的补体激活降低至相当于fB^-/-血清中所观察到的水平(图5D)。该结果确证，在血清灭菌蛋白^-/-小鼠中AP放大环大部分是完整的。

实施例6：血清灭菌蛋白和AP在体内LOS诱导的补体激活中起的作 用比在体内LPS-诱导的补体激活中更重要

缺乏人血清灭菌蛋白的个体易患致命的脑膜炎球菌感染。因为脑膜炎奈瑟氏菌细菌在它们的外膜中含有脂寡糖(LOS)而不含LPS，所以对血清灭菌蛋白在脑膜炎奈瑟氏菌LOS-诱导的补体激活中的作用在体内和体外进行考察。使用Mg⁺⁺-EGTA中LOS包被的板测定，可以发现，LOS——像LPS一样——诱导WT小鼠血清中AP补体激活而不诱导血清灭菌蛋白^-/-小鼠血清中AP补体激活。而且，通过测量激活的C3的血浆水平，可以发现：LOS注射在体内引起WT小鼠全身的补体激活却不引起血清灭菌蛋白^-/-小鼠全身的补体激活(图6A)。显著地观察到，血清灭菌蛋白^-/-小鼠中体内LPS诱导的全身补体激活被降低但没有消除(图6B)。这些结果表明LOS主要经由AP途径体内激活补体，而LPS通过AP依赖性和AP非依赖性途径激活补体。实际上，通过进行GVB⁺⁺缓冲液中LPS-或LOS-包被的板测定以实现所有三种补体激活途径，可以证明：fB或血清灭菌蛋白缺乏引起LOS诱导的补体激活降低比LPS诱导的补体激活更加明显(图6C，D)。

实施例7：血清灭菌蛋白对于经典途径补体的AP放大环不是必需的

产生抗人血清灭菌蛋白的单克隆抗体。图8至图14中的数据证明：抗血清灭菌蛋白mAb选择性抑制AP补体激活而对经典途径补体的AP放大环没有影响。抗体的这些性质使得它们不同于以前公开的抗人血清灭菌蛋白抗体，其抑制AP途径补体和经典途径补体二者。

在图8至图10中，使用三种不同的AP补体测定来证明抗血清灭菌蛋白mAb的抑制效果。这些测定是：LPS诱导的AP补体激活(图8)；酵母聚糖诱导的AP补体激活(图9)以及兔红细胞诱导的AP补体激活(图10)。在图11至图14中，使用三种不同的经典途径补体激活测定来证明抗血清灭菌蛋白mAb对经典途径AP放大环的影响缺失。这些测定是：板结合的OVA/抗OVA免疫复合物诱导的经典途径补体激活(通过板C3沉积测量，图11)；在液相中OVA/抗OVA免疫复合物诱导的经典途径补体激活(通过sC5b-9和C3a的释放来测量，图12和13)以及抗体敏化的羊红细胞诱导的经典途径补体激活(图14)。

图15显示：使用血清灭菌蛋白敲除小鼠证明AP补体和血清灭菌蛋白在肾缺血再灌注损伤中是至关重要的。

因此，开发抗血清灭菌蛋白试剂(mAb、小分子抑制剂等)用于缺血再灌注损伤中的治疗。

通过参考附图对本发明的优选实施方式进行描述，可以理解的是本发明不限于所述精确的实施方式，本领域技术人员可以在其中进行各种变化和修改而不背离所附权利要求限定的本发明的范围和精神。

序列表

<110>宾夕法尼亚大学董事会

     W.宋

 

<120>替代途径的血清灭菌蛋白调节及其应用

 

<130>P-70000-PC

 

<160>12

 

<170>PatentIn 3.4版

 

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>鼠

 

<400>1

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<210>2

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<212>DNA

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<400>2

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<210>3

<211>34

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<213>鼠

 

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<210>4

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<213>鼠

 

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<210>6

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<213>鼠

 

<400>6

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<210>7

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<213>鼠

 

<400>7

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<212>DNA

<213>鼠

 

<400>8

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<211>22

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<213>鼠

 

<400>9

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<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>鼠

 

<400>10

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<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>鼠

 

<400>11

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<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>鼠

 

<400>12

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Claims (20)

1.治疗对象中AP补体介导的病症的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

2.权利要求2所述的方法，其中所述病症是黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型溶血尿毒(aHUS)综合征、哮喘、器官移植脓毒症或它们的组合。

3.抑制对象中血清灭菌蛋白依赖性的，微生物抗原、非生物外源表面或改变的自身组织引发的AP补体激活的方法，包括给予所述对象替代途径特异性的抗血清灭菌蛋白抗体、从而抑制C3bBb蛋白产生的步骤。

4.权利要求3所述的方法，其中所述AP补体激活由所述模式识别受体对微生物抗原的识别而产生，所述微生物抗原选自胞壁酰二肽(MDP)、细菌DNA的CpG基序、肽聚糖、脂磷壁酸质、伯氏包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A、合成的支原体巨噬细胞-激活的脂蛋白-2、三棕榈酰基-半胱氨酰基-丝氨酰基-(赖氨酰基)3-赖氨酸(P3CSK4)、二棕榈酰基-CSK4(P2-CSK4)、单棕榈酰基-CSK4(PCSK4)、两性霉素B、以及三酰基化的或二酰基化的细菌多肽、双链病毒RNA、心-肺旁路术和肾透析中的输血导管、凋亡的、坏死的和缺血-应激的自身组织和细胞或它们的组合。

5.权利要求1和3中任意一项所述的方法，其中所述抗体不影响补体经典途径的AP放大环。

6.转基因非人哺乳动物及其子代，其基因组包含血清灭菌蛋白编码基因的破坏，以便所述哺乳动物缺乏功能性血清灭菌蛋白或具有降低的功能性血清灭菌蛋白水平。

7.权利要求6所述的转基因非人哺乳动物，其中新霉素盒(NEO)插入在所述血清灭菌蛋白基因的外显子5和6之间。

8.权利要求7所述的转基因非人哺乳动物，其中所述NEO导致外显子5和6之间内含子的破坏。

9.权利要求6所述的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因小鼠相对于野生型小鼠显示降低的AP-补体激活。

10.权利要求6所述的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因小鼠是可繁殖的并且将所述转基因传递至其后代。

11.从权利要求6所述的转基因非人哺乳动物获得的细胞、器官、组织或它们的组合。

12.鉴定化合物体内生物活性的方法，所述方法包括下列步骤：

a.提供不能表达血清灭菌蛋白的转基因非人哺乳动物；

b.向所述非人哺乳动物给予所述化合物；

c.测定所述非人哺乳动物表现的病症；以及

d.鉴定所述化合物的体内生物活性。

13.权利要求12所述的方法，其中所述生物活性是AP-补体激活。

14.权利要求13所述的方法，其中所述非人哺乳动物表现的病症是黄斑变性、缺血再灌注损伤、关节炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)综合征、非典型溶血尿毒(aHUS)综合征、脓毒症、细菌脂寡糖(LOS)感染或它们的组合。

15.组合物，其包括通过权利要求14所述的方法鉴定的化合物。

16.治疗对象中AP补体介导的病症的方法，包括向所述对象给予权利要求15所述组合物的步骤。

17.制备转基因非人哺乳动物的方法，其包括：

a.将多核苷酸导入非人哺乳动物的胚胎中，所述多核苷酸包含编码血清灭菌蛋白编码基因的破坏的内含子的编码区；

b.将所述胚胎转移至代孕母体小鼠中；

c.使所述胚胎妊娠；以及

d.选择所述代孕母体小鼠生出的转基因小鼠，

其中所述转基因非人哺乳动物的特征在于当与非转基因哺乳动物比较时，其具有降低的AP补体激活。

18.权利要求17所述的方法，其中选择步骤包括将两只选择的转基因小鼠交配；使所述胚胎妊娠；以及选择转基因母体生出的转基因小鼠。

19.权利要求18所述的方法，其中将所述方法重复一代以上。

20.培养转基因细胞的方法，其包括下列步骤：

a.提供权利要求11所述的细胞；以及

b.在允许所述细胞生长的条件下培养所述细胞。

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