CN101926844A

CN101926844A - 瑞香狼毒提取物及其抗肿瘤作用

Info

Publication number: CN101926844A
Application number: CN 200910150669
Authority: CN
Inventors: 朱晓新; 潘国凤; 刘安; 李玉洁; 杨庆; 翁小刚
Original assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: CN101926844B

Abstract

本发明涉及瑞香狼毒提取物及其抗肿瘤作用，本发明所述的瑞香狼毒提取物采用无水乙醇提取，得到一级提取物，将一级提取物进一步采用大孔树脂柱或聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到二级提取物，二级提取物中用大孔树脂柱分离的二级提取物进一步采用聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到三级提取物。

Description

瑞香狼毒提取物及其抗肿瘤作用

技术领域：

本发明涉及中药瑞香狼毒的新的提取物及其提取方法与用途。

背景技术：

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科狼毒属植物的根，是狼毒中的正品，始载于《神农本草经》，谓其性味辛、苦，平，有毒，入肺、肝、脾经，具有“逐水祛痰散结”的功能，主治“积聚饮食，寒热水气”。清·张志聪《本草崇原》注曰：“破积聚，则饮食壅滞而为寒热之病，亦可治矣。”孙思邈注：“积聚者，气道不行故耳。饮食寒热者，气失其治，气滞水蓄，此药辛可开之。”李时珍因其“有毒”故在《本草纲目》中将其列为下品。南北朝·梁·甄权的《药性论》定其性味为“苦，辛，有毒。”梁·陶弘景在《名医别录》中记载狼毒“除胸下积癖。”《圣惠方》以狼毒丸治积聚，心腹胀如鼓者，用狼毒为主药。《补阙肘后方》治卒心腹癥坚，两胁下有气结者，用狼毒为主药。

统计公元618-1911年间包含狼毒的方剂共约109张，其中以治疗痰证、积聚等疑难杂症者居多。在我国民间，也有不少利用狼毒治疗胃癌、肝癌、食管癌、乳腺癌肿瘤、甲状腺癌等恶性肿瘤的验方。临床上也有多篇文献报道，瑞香狼毒提取物治疗恶性肿瘤获得良效。现代医学研究发现其具有良好的抗肿瘤作用，故国内众多学者对该中药潜在的重要药用价值寄予厚望。

近年来，国内外来对瑞香狼毒化学与药理学研究方兴未艾。瑞香狼毒主要含有二萜类、香豆素类、木脂素类及黄酮类化学成分，其中瑞香烷类化合物等萜类化合物是该中药特有的且具备较好的抗肿瘤生物活性，目前尚未获得该类化合物的有效部位，

现有文献中的提取物有些属于治标不治本，有些使用价格昂贵的成分，有些在开发过程中由于疗效不确切而中断开发。

本发明提供了一种疗效确切、安全方便、副作用小、价格低廉的纯中药提取物。

发明内容：

本发明提供一种狼毒提取物，所述提取物采用无水乙醇提取，得到一级提取物，将一级提取物进一步采用大孔树脂柱或聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到二级提取物，二级提取物中用大孔树脂柱分离的二级提取物进一步采用聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到三级提取物，

全部三个级别的提取物均属于本发明的内容。

本发明的一级提取物制备方法如下：

狼毒药材加乙醇，回流提取，提取液减压回收乙醇，浓缩得到提取物2。

本发明的二级提取物制备方法如下：

提取物2上大孔树脂HPD100，依次用水、40％乙醇、80％乙醇洗脱，分别收集并分别浓缩得到提取物3、4、5。

提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇洗脱，分别收集并分别浓缩得到提取物15、16、17、18。

本发明的三级提取物制备方法如下：

取提取物5上聚酰胺柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇洗脱，分别收集并分别浓缩得到提取物11、12、13、14。

本发明的一级提取物具体制备方法如下：

狼毒药材500g加无水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收

乙醇，水浴干燥后，减压干燥(70℃)，得提取物2。

本发明的二级提取物具体制备方法如下：

狼毒药材2000g，加无水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，上大孔树脂HPD100(3.3kg)，依次用水、40％乙醇、80％乙醇各2.5倍柱体积洗脱，水浴干燥后，减压干燥(70℃)，分别得到提取物3、4、5。

提取物2(10.0g)上聚酰胺柱(柱体积900ml，约280g，聚酰胺预处理)，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇分别洗3个柱体积，减压回收乙醇，水浴蒸干，真空常温干燥，分别得到提取物15、16、17、18。

本发明的三级提取物具体制备方法如下：

取提取物5(10.0g)上聚酰胺柱(柱体积900ml，约280g，聚酰胺预处理)，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇分别洗3个柱体积，减压回收乙醇，水浴蒸干，真空常温干燥，分别得到提取物11、12、13、14。

因此本发明的提取物包括，提取物2，提取物3，提取物4，提取物5，提取物15，提取物16，提取物17，提取物18，提取物11，提取物12，提取物13，提取物14。

以上本发明的提取物经过试验证明具有优良的抗肿瘤活性，

本发明还提供用本发明的提取物作为药物活性成分制备成的药物组合物，本发明的药物组合物，包括有效组分，根据需要该组合物还可以加入药物可接受的载体。

本发明的组合物，是单位剂量的药物制剂形式，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明的组合物其中的有效组分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。

本发明的组合物，通过将上述有效组分和药物可接受的载体混合制备得到。

本发明的组合物，其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。

以下通过实验数据说明本发明的有益效果。

瑞香狼毒提取物(提取物2、5、13、17)体内药效作用观察

1.实验材料

1.1实验动物

SPF级昆明种小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2007-004。饲养在清洁级实验动物房，室温20℃，相对湿度60％。

1.2移植瘤株：

小鼠H22肝癌细胞，购自中科院肿瘤细胞库，由中国中医科学院中药研究所实验动物中心传代保存。

1.3实验试剂

环磷酰胺(CTX)片：天津金世制药有限公司产品，批号：20070201；

氟尿嘧啶(5-Fu)注射液：上海旭东海普药业有限公司产品，批号：080401；

羧甲基纤维素钠：北京市东环联合化工厂生产，批号：971230；

吐温-80：广州南方化玻公司分装产品，批号：021204；

1.4受试药物

灌胃法给药时，受试药以适量吐温-80溶解后以0.5％羧甲基纤维素钠溶液混悬，吐温-80终浓度为0.5％；溶剂对照组为含0.5％吐温-80与0.5％羧甲基纤维素钠溶液。提取物5、13、17腹腔注射法给药时，受试药以适量吐温-80溶解后用无菌生理盐水定容至所需浓度，吐温-80终浓度为0.5％；溶剂对照组为含0.5％吐温-80的生理盐水溶液。环磷酰胺片为灌胃给药法阳性对照，研成粉末后用0.5％羧甲基纤维素钠溶液混悬；氟尿嘧啶注射液为腹腔注射给药法阳性对照，原包装浓度0.25g/10ml，用无菌生理盐水稀释至所需浓度。

2.实验方法

2.1皮下移植瘤模型建立

按无菌操作程序，取腹腔接种H22(第7-9天)的昆明种小鼠，腹部皮毛依次以碘酒消毒、医用酒精脱碘后，用无菌针筒从腹腔中抽取肿瘤细胞悬液，细胞悬液经0.2％台盼兰染色后计算活细胞数＞95％，加入无菌生理盐水调整瘤细胞悬液胞浓度为1×107/ml，接种至实验小鼠的右腋皮下，每只0.2ml。

2.3皮下移植瘤H22小鼠模型灌胃给药法肿瘤抑制作用观察

皮下移植瘤H22小鼠模型建立后，提取物2高、中、低剂量组剂量分别为2g/kg、1g/kg、0.5g/kg(以生药量计，下同)；提取物5、13、17高剂量组均取16g/kg，中、低剂量组分别为8g/kg、4g/kg。灌胃给药，每天1次，连续给药10d，末次给药次日称重、处死小鼠，剥取肿瘤、胸腺与脾脏并称重，计算抑制率、瘤重系数、脾脏与胸腺指数。计算公式如下：

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％瘤重系数＝瘤重/小鼠体重；脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)重量/小鼠体重

2.3皮下移植瘤H22小鼠模型腹注给药法肿瘤抑制作用观察

皮下移植瘤H22小鼠模型建立后，提取物5、13、17高剂量组取250mg/kg，中、低剂量组分别为125mg/kg、62.5mg/kg。腹腔注射给药，每天1次，连续给药10d，末次给药次日称重、处死小鼠，剥取肿瘤、胸腺与脾脏并称重，计算抑制率、瘤重系数、脾脏与胸腺指数。

3.实验结果

3.1瑞香狼毒提取物2体内药效作用观察

实验结果表明：提取物2的高剂量组对小鼠皮下移植瘤H22有显著抑制作用(p＜0.01)，抑瘤率为36.24％；中剂量组对H22抑制作用也具有统计意义(p＜0.05)。见表1。

表1瑞香狼毒提取物提取物2灌胃给药对皮下移植瘤H22的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

3.2灌胃给药法提取物5、13、17对移植瘤H22的抑制作用

灌胃给药法提取物5、13、17对小鼠皮下移植瘤H22均有一定抑制作用，提取物5高剂量组与提取物13中剂量组具有显著抑瘤效果(P＜0.01)，提取物5中剂量组、提取物17中、高剂量组与提取物13低剂量组抑瘤作用具有统计学意义(P＜0.05)。提取物5对H22的抑制作用具有良好的剂量依赖关系；提取物17中剂量(8g/kg)的抑瘤率(32.36％)与提取物13中剂量(8g/kg)的抑瘤率(38.17％)。见表2。

表2瑞香狼毒提取物5、13、17灌胃给药对皮下移植瘤H22的影响

注：与浴剂对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

3.3腹注给药法提取物5、13、17对移植瘤H22抑制的作用

提取物5、13、17腹注给药法对移植瘤H22具有较好的抑制效果，且具有一定的剂量依赖关系，其中提取物17对H22的抑制作用最强，剂量250mg/kg(折合成生药量)时的抑瘤率为48.35％，且剂量依赖关系良好。提取物5、17在中高剂量时出现体重明显降低的情况。见表3。

表3瑞香狼毒提取物5、13、17腹腔注射给药对皮下移植瘤H22的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

瑞香狼毒提取物抑制人肝癌细胞株BEL-7402裸鼠皮下移植瘤的实验研究

1.实验材料

1.1细胞株

人肝癌细胞BEL-7402，为中国药科大学新药筛选中心惠赠。

1.2实验动物

SPF级BALB/C裸小鼠，雌性，日龄35-40天，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。合格证编号：沪动合证字122号。饲养在万级屏障系统(SPF级)，室温25℃，相对湿度60％。

1.3药物

受试药：提取物17。

配制：以适量吐温-80溶解后用无菌生理盐水定容至所需浓度，吐温-80终浓度为0.5％；溶剂对照组为含0.5％吐温-80的生理盐水溶液。阳性药物氟尿嘧啶注射液，上海旭东海普药业有限公司生产，批号：080401，原包装浓度0.25g/10ml，用无菌生理盐水稀释至所需浓度。

2.实验方法

2.1皮下移植瘤BEL-7402裸小鼠模型建立

由人肝癌BEL-7402细胞株接种于裸小鼠皮下而建立。细胞接种量为3×10⁶，接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。

2.2皮下移植瘤模型肿瘤观察瑞香狼毒提取物体内对人来源肝癌BEL-7402的抑制作用

参考文献^[19]取生长旺盛期的BEL-7402瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100～300mm³后将动物体重与肿瘤体积进行配对后随机分5组，溶剂对照组动物12只，阳性对照组与提取物17给药组各6只。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周3次，每次测量同时称鼠重。提取物17给药剂量分别为250mg/kg(高剂量，折合成生药量，下同)、187.5mg/kg(中剂量)、125mg/kg(低剂量)；阳性对照组5-Fu注射液20mg/kg；溶剂对照组同时给等量含助溶剂的溶液，均为腹腔注射给药，每周给3次，给药第21天，解剖裸鼠，剥取肿瘤与脾脏，称重，并按后续实验要求留取肿瘤标本。

附：检测指标及计算方法

1)肿瘤体积(tumor volume，TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b²(其中a、b分别表示长宽)；

2)相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝TVt/TV₀(其中TV0为分笼给药时，即d₀肿瘤体积，TVt为每一次测量时的肿瘤体积)。

3)相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为：T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100(T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV)。

试验结果以相对肿瘤增殖率T/C(％)作为抗肿瘤活性的评价指标(参考《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》)。

3.实验结果

提取物17腹腔注射给药高、中剂量对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤有较强的生长抑制作用，T/C分别为52.65％、59.94％；低剂量对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤抑制作用较弱，T/C为71.60％。阳性对照组5-Fu腔注射给药20mg/kg对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤有较强的生长抑制作用，T/C为46.11％。

提取物17对荷瘤裸小鼠的体重影响很大，高剂量组体重下降非常明显，第一次给药后体重与溶剂对照组低2.5g左右(平均体重分别为17.47g、19.94g)，之后，每次给药前称取的体重均在17.5g左右波动；中、低剂量组在给药初期体重也见明显降低，之后略有回升，一般在隔2天给药时称重发现体重回升明显，而连续两次隔天给药后小鼠体重丢失现象又重现，以致根据时间-体重绘制的曲线呈现波形变化趋势。见表4、5，图5、6与图7。

表4提取物17用药前后人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤相对增殖率变化

注：d0为分笼给药时间，d21为给药第21天；

与溶剂对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与阳性对照组相比，^△△P＜0.01。

表5.提取物17对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的抑制作用与脾脏指数的影响

注：与溶剂对照组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

瑞香狼毒提取物对体外培养人来源肝癌细胞的抑制作用的半数有效浓度

瑞香狼毒提取物2对人来源的肝癌细胞HepG2、BEL-7402、SMMC-7721的抑制作用较弱，在200μg/ml时抑制率能达到80％左右，但100μg/ml以下药物浓度对肿瘤细胞的抑制率急剧下降，线性回归法计算IC₅₀＞100μg/ml；提取物5、13、17对肝癌细胞HepG2、BEL-7402、SMMC-7721均有较好的抑制作用，100μg/m药物浓度时其抑制率均在80％以上，IC₅₀均在40μg/ml以下，其中提取物17抑制作用最强。见表6。

表6瑞香狼毒提取物体外对人来源肝癌细胞的抑制作用的IC₅₀(单位：μg/ml)

瑞香狼毒提取物对TGF-β信号通路的影响

实验一：

1.实验材料

1.1细胞株

HepG2细胞系(转染TGF-β基因的稳定细胞株)由美国耶鲁大学医学院药理系建立；人肝癌细胞BEL-7402，由中国药科大学新药筛选中心惠赠。

1.2试剂仪器

荧光素酶试剂盒：美国Promega产品Cat.#4550；

报告基因被动裂解液：美国Promega产品Cat.#E153A；

TECAN Safire-2多功能酶标仪：瑞士帝肯公司。

1.3药物

受试药：提取物2、5、13、17。

配制：样品精确称量后溶于DMSO中，然后以PBS液配成10×母液，DMSO终浓度＜0.1％，现配现用。加药时以细胞培养溶液稀释成不同浓度。

2.实验方法

荧光报告基因法筛选瑞香狼毒提取物对肿瘤细胞作用的靶标基因

1)铺板：在96孔板中种入HepG2细胞(转染了TGF-β的稳定细胞株)，5×10⁴/孔，培基采用无酚红的RPMI与10％FBS；

2)在恒温培养箱(37℃，4％CO₂)孵育48h，细胞融合；

3)换液，加药：受试药终浓度为0、0.375μg/ml、1.25μg/ml、3.75μg/ml；

4)继续孵育1h；

5)加入2ng/mlTGF-β到经药处理后的细胞内；

6)孵育4h；

7)加入20μl 5×报告基因被动裂解液；

8)培养板-70℃冷冻过夜；。

9)小心刮下所有的裂解细胞，用移液器将30μl裂解上清移入96孔酶标板；

10)加入30μl荧光素酶在激发波长430nm、发射波长550nm设置下，使用TECAN公司的多功能酶标仪检测荧光强度。

3.实验结果：

提取物5、13、17对高浓度的TGF-β具有显著下调作用，结果见图8。

实验二：

1.提取物17对体外培养的BEL-7402细胞Smad4与p-Akt蛋白表达的影响

提取物17能显著抑制体外培养的肝癌细胞BEL-7402内TGF-β信号通路下游因子p-Akt与Smad4蛋白表达。用药后p-Akt蛋白表达下降极其显著，在12.5μg/ml时表达与对照组相比就下降了1/2左右，药物浓度在25μg/ml时p-Akt表达下降幅度最大，为对照组的1/7左右。Smad4用药后下降具有明显的剂量依赖关系：在12.5μg/ml药物浓度时Smad4表达下降不明显，25μg/ml时降至对照组的1/3左右，50μg/ml时Smad4蛋白含量极低。可见，用药后p-Akt与Smad4蛋白表达均呈现下降趋势，p-Akt在较低药物浓度即出现明显抑制的改变；药物浓度25μg/ml时，p-Akt与Smad4相对含量都显著降低且前者较后者低，可能是提取物17通过TGF-β信号通路网络对细胞成活与死亡调节很关键的药物浓度。见图9、10与表7。

表7提取物17用药前后体外培养BEL-7402细胞Smad4与p-Akt蛋白相对含量

实验三：

1.提取物17对BEL-7402皮下移植瘤组织Smad4与TβR-I阳性表达的影响

裸小鼠皮下人肝癌BEL-7402移植瘤组织内，Smad4与TβR-I的阳性表达分级在“+～++”指间，受试药各剂量组阳性表达下降，并出现1/6～1/3的阴性表达。见表8，9与图11，12。

表8提取物17对BEL-7402移植瘤组织Smad4阳性表达的影响(n＝6)

表9提取物17对BEL-7402移植瘤组织TβR-I阳性表达的影响(n＝6)

2.提取物17对BEL-7402皮下移植瘤组织Smad4mRNA表达的影响

裸小鼠皮下移植瘤BEL-7402Smad4mRNA与GAPDH mRNA的比值为0.92±0.09，提取物17各剂量组均能下调Smad4mRNA的表达，低剂量组比值降至0.77±0.14，且有统计学差异(P＜0.05)。药物可能通过作用于信号通路Smad4上游的因子而下调了Smad4mRNA的表达，但在一定剂量下Smad4mRNA达到一个坪值，继续提高药物剂量不再继续下降；且mRNA表达下降的幅度没有体外培养细胞蛋白表达水平明显，可见受试药对Smad4的抑制并非主要在转录环节，可能对蛋白的合成与降解产生了重要影响。见表10。

表10提取物17用药前后BEL-7402移植瘤组织Smad4/GAPDH比值的变化(n＝6)

注：与溶剂对照组相比，^*P＜0.05

“其它提取物对小鼠皮下移植瘤H22的抑瘤率在30％左右”。

本发明的有益效果为：

1.本发明的提取分离工艺中有效地除去了杂质，提高有效成分的含量，能快速准确的得到有效成分。

2.本发明提供的提取物化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。

本发明提供的方法首次从药材中得到有效组分，并首次将其在多种肿瘤细胞株上进行药效筛选，由于成分确切，含量明确，制备工艺便捷，活性好，适宜开发成抗肿瘤中药新药。

附图说明：

图1提取物2化学指纹图谱

图2提取物5化学指纹图谱

图3提取物13化学指纹图谱

图4提取物17化学指纹图谱

图5提取物17对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的实验治疗作用

图6提取物17对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的实验治疗作用

图7提取物17对荷瘤裸小鼠体重增长的影响

图8提取物2、5、13、17对高浓度的TGF-β具有显著下调作用

图9提取物17用药前后体外培养BEL-7402细胞Smad4与p-Akt蛋白表达

图10提取物17用药前后BEL-7402细胞Smad4与p-Akt蛋白相对含量比较

图11BEL-7402移植瘤组织Samd4免疫组化图片(×200)

图12BEL-7402移植瘤组织TβR-I免疫组化图片(×200)

具体实施方式：

下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。

实施例1

狼毒药材500g加无水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇，水浴干燥后，减压干燥(70℃)，得提取物2。

Claims

1.一种瑞香狼毒的提取物，包括三级提取物，其特征在于，瑞香狼毒药材采用无水乙醇提取，得到一级提取物，将一级提取物进一步采用大孔树脂柱或聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到二级提取物，二级提取物中用大孔树脂柱层析分离的二级提取物进一步采用聚酰胺柱层析，用水和乙醇洗脱得到三级提取物。

2.权利要求1的提取物，其特征在于，其中

一级提取物制备方法如下：

狼毒药材加乙醇，回流提取，提取液减压回收乙醇，浓缩得到提取物2；

二级提取物制备方法如下：

提取物2上大孔树脂HPD100，依次用水、40％乙醇、80％乙醇洗脱，分别收集并分别浓缩得到提取物3、4、5；

提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇洗脱，分别收集并分别浓缩得到提取物15、16、17、18；

三级提取物制备方法如下：

3.权利要求2的提取物，其特征在于，其中

一级提取物制备方法如下：

狼毒药材500g加无水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇，水浴干燥后，减压干燥，得提取物2；

二级提取物制备方法如下：

狼毒药材2000g，加无水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，上大孔树脂HPD100，依次用水、40％乙醇、80％乙醇各2.5倍柱体积洗脱，水浴干燥后，减压干燥，分别得到提取物3、4、5；

提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇分别洗3个柱体积，减压回收乙醇，水浴蒸干，真空常温干燥，分别得到提取物15、16、17、18；

三级提取物制备方法如下：

取提取物5上聚酰胺柱，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇分别洗3个柱体积，减压回收乙醇，水浴蒸干，真空常温干燥，分别得到提取物11、12、13、14。

4.权利要求3的提取物，其特征在于，其中

一级提取物制备方法如下：

狼毒药材500g加无水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收乙醇，水浴干燥后，减压干燥(70℃)，得提取物2；

二级提取物制备方法如下：

狼毒药材2000g，加无水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至1/5体积，加等体积的水，挥发至无醇味，上大孔树脂HPD100(3.3kg)，依次用水、40％乙醇、80％乙醇各2.5倍柱体积洗脱，水浴干燥后，减压干燥(70℃)，分别得到提取物3、4、5；

提取物2(10.0g)上聚酰胺柱(柱体积900ml，约280g，聚酰胺预处理)，依次用水、30％乙醇、60％乙醇、100％乙醇分别洗3个柱体积，减压回收乙醇，水浴蒸干，真空常温干燥，分别得到提取物15、16、17、18；

三级提取物具体制备方法如下：

5.权利要求1的提取物，其特征在于，包括，提取物2，提取物3，提取物4，提取物5，提取物15，提取物16，提取物17，提取物18，提取物11，提取物12，提取物13，提取物14。

6.含有权利要求1的提取物的药物组合物。

7.权利要求6的药物组合物，其特征在于，是任何可药用的剂型。

8.权利要求7的药物组合物，其特征在于，是注射剂。

9.权利要求1的提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.权利要求1的提取物在制备对TGF-β具有下调作用的药物中的应用。