CN101918028A

CN101918028A - 赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的方法

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Publication number: CN101918028A
Application number: CN2008801166596A
Authority: CN
Inventors: 查尔斯·理查德森; 托马斯·S·维德维克; 托马斯·R·福伯特
Original assignee: Ligocyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Takeda Vaccine Montana Ltd By Share Ltd; Takeda Vaccines Inc
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2008-09-18
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2028-09-18
Also published as: JP2016196502A; CA2698397C; HK1211473A1; US20220143169A1; JP2019163328A; US10688174B2; CN101918028B; AU2008302276B2; JP2010539192A; US20110182975A1; SG184733A1; US10130696B2; US11040097B2; AU2008302276A1; SG10201601660YA; KR20150129042A; US20240316175A1; US11826415B2; WO2009039229A2; CN104740624B

Abstract

本发明涉及包含诺如病毒抗原和佐剂的疫苗组合物，特别是单价VLP的混合物和多价VLP的混合物，以及在人类受试者中赋予针对诺如病毒感染的保护性免疫的方法。

Description

赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年9月18日提交的美国临时申请No.60/973,389和2007年11月9日提交的美国临时申请No.60/986,826的优先权，通过述及将它们完整收入本文。

发明领域

本申请属于疫苗，特别是针对诺如病毒(norovirus)的疫苗的领域。另外，本发明涉及制备疫苗组合物的方法和诱导保护性免疫应答的方法。

关于政府支持的声明

本发明是在来自美国陆军医学研究和物资司令部的政府支持下产生的，合同号W81XWH-05-C-0135。政府对本发明可具有某些权利。

发明背景

诺如病毒是不可培养的人类杯状病毒，已经成为非细菌性胃肠炎的流行性爆发的单一最重要起因(Glass et al.，2000；Hardy et al.，1999)。在灵敏的分子诊断测定法的开发之前，对诺如病毒的临床意义的重视不够。原型基因小组I(genogroup I)诺沃克病毒(NV)基因组的克隆和自重组杆状病毒表达系统生成病毒样颗粒(VLP)引起了测定法的开发，其揭示了分布广泛的诺如病毒感染(Jiang et al.1990；1992)。

诺如病毒是单链、正义RNA病毒，含有不分段的RNA基因组。病毒基因组编码三个可读框，其中后两个分别规定主要衣壳蛋白和次要结构蛋白的生成(Glass et al.2000)。当在真核表达系统中以高水平表达时，NV和某些其它诺如病毒的衣壳蛋白自组装成在结构上模拟天然诺如病毒病毒粒(virion)的VLP。当通过透射电子显微术观看时，VLP在形态上与自人粪样品分离的感染性病毒粒不可区分。

针对诺如病毒的免疫应答是复杂的，而且现在正在阐明保护的关联(correlate)。用天然病毒实施的人志愿者研究证明了粘膜衍生的记忆免疫应答提供免于感染的短期保护并提示疫苗介导的保护是可行的(Lindesmith et al.2003；Parrino et al.1997；Wyatt et al.，1974)。

虽然由于VLP的可得性和它们以大量生成的能力，诺如病毒不能在体外培养，但是在限定诺如病毒衣壳的抗原拓扑学和结构拓扑学方面已经取得了可观的进步。VLP保留病毒衣壳蛋白的真实构象(authentic confirmation)，但是缺乏感染性遗传物质。结果，VLP模拟病毒与细胞受体的功能相互作用，由此引发适宜的宿主免疫应答，但是缺乏繁殖或引起感染的能力。与NIH联合，Baylor College of Medicine在学术性的、调查人发起的I期临床试验中研究了人志愿者中针对NV VLP的体液、粘膜和细胞免疫应答。口服施用VLP在健康成人中是安全的且有免疫原性的(Ball et al.1999；Tacket et al.2003)。在其它学术中心，在动物模型中进行的临床前实验已经证明了当与细菌外毒素佐剂一起鼻内施用时针对VLP的免疫应答的增强(Guerrero et al.2001；Nicollier-Jamot et al.2004；Periwal et al.2003；Souza et al.(2007)Vaccine，doi:10.1016/j.vaccine.2007.09.040)。然而，没有研究报告使用任何诺如病毒疫苗能够实现针对诺如病毒的保护性免疫。

发明概述

本发明提供了在受试者(特别是人类受试者)中诱导针对诺如病毒感染的保护性免疫的方法，包括施用包含至少一种诺如病毒抗原的疫苗。在一个实施方案中，所述抗原是诺如病毒病毒样颗粒(VLP)。本发明的方法中所使用的疫苗可进一步包含一种或多种佐剂。所述诺如病毒VLP可以选自基因小组I或基因小组II病毒或其混合物。在一个实施方案中，所述疫苗以约0.01％至约80％(以重量计)的浓度包含诺如病毒VLP。在另一个实施方案中，所述疫苗包含约1μg至约100mg每剂的诺如病毒VLP剂量。

在一些实施方案中，所述疫苗进一步包含投递剂，其功能为增强抗原摄取、提供贮存效应、延长抗原在投递部位的保留时间、或经由投递部位的细胞紧密连接的松弛来增强免疫应答。所述投递剂可以是生物粘着剂，优选选自下组的粘膜粘着剂：硫酸皮肤素、软骨素、果胶、粘蛋白、藻酸盐、聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛/伞毛蛋白质、和羧甲基纤维素。优选的是，所述粘膜粘着剂是多糖。最优选的是，所述粘膜粘着剂是壳聚糖或含有壳聚糖的混合物，诸如壳聚糖盐或壳聚糖碱。

在其它实施方案中，所述疫苗包含佐剂。所述佐剂可以选自下组：toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A

合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈(polyphosphazenes)、乳剂、病毒体、Cochleates、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、内毒素(例如细菌内毒素)和脂质体。优选的是，所述佐剂是toll样受体(TLR)激动剂。更优选的是，所述佐剂是

本发明的方法包括施用配制成液体或干粉的诺如病毒疫苗。干粉配制剂可含有直径约10至约500微米的平均粒度。适合于施用所述疫苗的路径包括粘膜、肌肉内、静脉内、表皮下(subcutaneous)、真皮内(intradermal)、真皮下(subdermal)、或经皮(transdermal)。具体而言，施用路径可以是肌肉内或粘膜，优选粘膜施用路径，包括鼻内、口服、或阴道施用路径。在另一个实施方案中，所述疫苗配制成鼻腔喷雾、滴鼻剂、或干粉，其中所述疫苗是通过鼻道内的快速沉积自靠近鼻通道的装有疫苗的装置施用的。在另一个实施方案中，所述疫苗是施用至一个或两个鼻孔的。

附图简述

图1显示了在用干粉VLP免疫的家兔中引发了诺沃克病毒(NV)特异性IgG。经鼻内施用路径在第1天、第22天和第43天(箭头)用50μg NV-VLP+50μg MPL给家兔给药3次。在所示日子通过ELISA对来自每只家兔的血清测试NV-VLP特异性IgG。只有接种VLP疫苗的家兔具有NV-VLP特异性IgG，而未处理组和安慰剂处理组没有检测到抗原特异性抗体(数据未显示)。显示了应答的算术均值，并以U/mL(1U～1μg)来表述。棒指示均值的标准误差。

图2描绘了测量来自用对照(佐剂/赋形剂)或含有三种剂量(5，15，50μg)之一的诺沃克病毒VLP的疫苗配制剂免疫的人志愿者的血清IgA(小图A)和IgG(小图B)水平的ELISA测定法的结果。为每个剂量水平显示了第二次免疫接种后35天(第56天)时抗VLP滴度的几何均值倍数增加。志愿者在第0天和第21天接受免疫接种。

图3显示了接受含50μg剂量诺沃克病毒VLP的疫苗配制剂或对照(佐剂/赋形剂)的人志愿者中的IgA(小图A)和IgG(小图B)抗体分泌细胞(ASC)的水平。将每106个外周血单核细胞(PBMC)的ASC几何均值(GMN)对研究天数(第7天或第28天)(具体是免疫接种后七天)绘图。志愿者在第0天和第21天接受免疫接种。

发明详述

本发明涉及在受试者中引发针对诺如病毒感染的保护性免疫的方法。具体而言，本发明提供了给人施用包含诺如病毒VLP和至少一种佐剂的疫苗的方法，其中所述疫苗赋予免于诺如病毒感染的至少一种症状的保护。另外或可选地，所述疫苗可进一步包含至少一种投递剂。

诺如病毒抗原

本发明提供了包含一种或多种诺如病毒抗原的组合物。“诺如病毒”(NOR)及本文中的语法等同物指杯状病毒科(Caliciviridae)的诺如病毒属的成员。在一些实施方案中，诺如病毒可包括一组相关的、正义单链RNA、无包被病毒，其对于人类或非人哺乳类物种可以是感染性的。在一些实施方案中，诺如病毒能在人类中引起急性胃肠炎。诺如病毒也可称作小圆结构病毒(SRSV)，当通过电子显微术观看时，其具有限定的表面结构或粗糙的边缘。诺如病毒内包括至少四个基因小组(GI-IV)，由核酸和氨基酸序列来限定，包含15个遗传簇。主要的基因小组是GI和GII。GIII和GIV已经提出但尚未普遍接受。GIII的代表是牛的耶拿(Jena)株。GIV目前含有一种病毒，即Alphatron。关于诺如病毒的进一步描述参见Vinje et al.J.Clin.Micro.41：1423-1433(2003)。“诺如病毒”在本文中还指重组诺如病毒病毒样颗粒(rNOR VLP)。在一些实施方案中，在细胞中至少重组表达由ORF2编码的诺如病毒衣壳蛋白(例如在Sf9细胞中使用杆状病毒载体)能导致衣壳蛋白自发地自组装成VLP。VLP在结构上与诺如病毒相似，但是缺乏病毒RNA基因组，因此没有感染性。因而，“诺如病毒”包括病毒粒，其可以是感染性的或非感染性的颗粒，包括缺陷型颗粒。

诺如病毒的非限制性例子包括诺沃克病毒(Norwalk virus，NV，GenBankM87661，NP₀₅₆₈₂₁)、南安普敦病毒(Southampton virus，SHV，GenBank L07418)、沙原病毒(Desert Shield virus，DSV，U04469)、海塞病毒(Hesse virus，HSV)、千叶病毒(Chiba virus，CHV，GenBank AB042808)、夏威夷病毒(Hawaii virus，HV，GenBank U07611)、雪山病毒(Snow Mountain virus，SMV，GenBank U70059)、多伦多病毒(Toronto virus，TV，Leite et al.，Arch.Virol.141：865-875)、布里斯托尔病毒(Bristol virus，BV)、耶拿病毒(Jena virus，JV，AJ01099)、马里兰病毒(Maryland virus，MV，AY032605)、海峡病毒(Seto virus，SV，GenBankAB031013)、坎伯威尔病毒(Camberwell，CV，AF145896)、Lordsdale病毒(LV，GenBank X86557)、格里姆斯比病毒(Grimsby virus，GrV，AJ004864)、墨西哥病毒(Mexico virus，MXV，GenBank U22498)、拳师(Boxer，AF538679)、C59(AF435807)、VA115(AY038598)、BUDS(AY660568)、休斯顿病毒(Houstonvirus，HoV，AY502023)、MOH(AF397156)、帕里什岛病毒(Parris Island，PiV；AY652979)、VA387(AY038600)、VA207(AY038599)、和自由伊拉克行动(Operation Iraqi Freedom，OIF，AY675554)。通过述及完整收录所有每一种的核酸和相应的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以出于鉴别目的使用密文，或者组织密文：分离病毒的宿主物种/属的缩写/种的缩写/株的名称/发现的年份/起源的国家(Green et al.，Human Caliciviruses，in Fields Virology Vol.1841-874(Knipe和Howley，editors-in-chief，4th ed.，Lippincott Williams &Wilkins 2001))。诺沃克病毒、雪山病毒、和休斯顿病毒在一些实施方案中是优选的。

诺如病毒抗原可以是肽、蛋白质、或病毒样颗粒(VLP)的形式。在一个优选的实施方案中，诺如病毒抗原包含VLP。如本文中所使用的，“病毒样颗粒或VLP”指自诺如病毒的衣壳蛋白编码序列生成的且包含与感染性诺如病毒颗粒相似的抗原特征的病毒样颗粒、其碎片、聚集物、或部分。诺如病毒抗原也可以是VLP的衣壳单体、衣壳多聚体、蛋白质或肽片段、或其聚集物或混合物的形式。诺如病毒抗原性蛋白质或肽也可以是使用本领域已知方法生成的变性形式。

本发明的VLP可以使用本领域标准技术自全长诺如病毒衣壳蛋白诸如VP1和/或VP2蛋白或者某些VP1或VP2衍生物形成。或者，用于形成VLP的衣壳蛋白是截短的衣壳蛋白。在一些实施方案中，例如，至少一个VLP包含截短的VP1蛋白。在其它实施方案中，所有VLP包含截短的VP1蛋白。截短可以是N端或C端截短。截短的衣壳蛋白是合适地功能性衣壳蛋白衍生物。功能性衣壳蛋白衍生物能够以与由全长衣壳蛋白组成的VLP引起免疫应答的方式相同的方式引起免疫应答(如果必要，当有合适的佐剂时)。

VLP可含有主要VP1蛋白和/或次要VP2蛋白。优选的是，每个VLP含有只来自一个诺如病毒基因小组的VP1和/或VP2蛋白，产生单价VLP。如本文中所使用的，术语“单价”指抗原性蛋白质衍生自单一诺如病毒基因小组。例如，VLP含有来自基因小组I病毒株的VP1和/或VP2(例如来自诺沃克病毒的VP1和VP2)。优选的是，VLP主要由VP1蛋白构成。在本发明的一个实施方案中，抗原是单价VLP的混合物，其中所述组合物包括由来自单一诺如病毒基因小组的VP1和VP2构成的VLP并混有由来自取自多种病毒株的不同诺如病毒基因小组(例如诺沃克病毒和休斯顿病毒)的VP1和VP2构成的VLP。纯粹举例来说，所述组合物可含有来自诺如病毒基因小组I一种或多种株的单价VLP以及来自诺如病毒基因小组II一种或多种株的单价VLP。优选的是，诺如病毒VLP混合物由诺沃克和休斯顿诺如病毒的多种株构成。

然而，在本发明的另一个实施方案中，VLP可以是多价VLP，其包含例如来自一个诺如病毒基因小组的VP1和/或VP2蛋白，其中混有来自第二个诺如病毒基因小组的VP1和/或VP2蛋白，其中所述不同的VP1和VP2蛋白不是嵌合VP1和VP2蛋白，但是在同一衣壳结构内联合到一起以形成免疫原性VLP。如本文中所使用的，术语“多价”指抗原性蛋白质衍生自两种或更多种诺如病毒基因小组或株。多价VLP可含有取自两种或更多种病毒株的VLP抗原。纯粹举例来说，所述组合物可含有由来自诺如病毒基因小组I(例如诺沃克病毒)一种或多种株的衣壳单体或多聚体以及来自诺如病毒基因小组II(例如休斯顿病毒)一种或多种株的衣壳单体或多聚体构成的多价VLP。优选的是，多价VLP含有来自诺沃克和休斯顿诺如病毒的多种株的衣壳蛋白。

组合物内单价或多价VLP的组合优选不会降低每种VLP类型的免疫原性。具体而言，优选的是，在本发明组合中的诺如病毒VLP间没有干扰，使得本发明的组合VLP组合物能够引发针对疫苗中所呈递的每种诺如病毒基因型的感染的免疫力。合适的是，针对组合中的给定VLP类型的免疫应答是当单独测量时针对同一VLP类型的免疫应答的至少50％，优选100％或基本上100％。免疫应答可以合适地测量，例如通过抗体应答，如本文实施例中所例示的。

可以如下生成多价VLP，即分开表达各衣壳蛋白，接着组合以形成VLP。或者，可以在同一细胞内自一种或多种DNA构建物表达多种衣壳蛋白。例如，可以将多种DNA构建物转化或转染入宿主细胞中，每种载体编码不同的衣壳蛋白。或者，可以使用具有在共享启动子或多个单独启动子控制下的多个衣壳基因的单一载体。在适宜的情况中，还可以将IRES元件掺入载体。使用此类表达策略，可以共纯化共表达的衣壳蛋白，用于后续VLP形成，或者可以自发形成多价VLP，然后可以纯化它们。

一种用于生成多价VLP的优选工艺包括制备来自不同诺如病毒基因型的VLP衣壳蛋白或衍生物，诸如VP1蛋白，混合所述蛋白质，并组装所述蛋白质以生成多价VLP。在混合之前，VP1蛋白可以是粗制提取物的形式，部分纯化的或纯化的。可以将不同基因小组的组装好的单价VLP解组装，混合到一起，并再组装成多价VLP。优选的是，在组合之前，所述蛋白质或VLP是至少部分纯化的。任选的是，可以在组装之后进一步纯化多价VLP。

合适的是，本发明的VLP是通过VLP的解组装和再组装而制备的，以提供同质的和纯的VLP。在一个实施方案中，可以通过将两种或更多种VLP解组装，接着在再组装之前的任何合适点组合解组装的VLP成分来制备多价VLP。当VLP自所表达的VP1蛋白自发形成时，如例如一些酵母菌株中发生的，这种办法是合适的。在VP1蛋白的表达不引起自发VLP形成的情况中，可以在组装成VLP之前组合VP1蛋白或衣壳体的制备物。

在使用多价VLP的情况中，优选的是，将VLP的各成分以它们在最终混合VLP中的期望比例混合。例如，相同量的自诺沃克和休斯顿病毒(或其它诺如病毒株)部分纯化的VP1蛋白的混合物提供含大致相等量的每种蛋白质的多价VLP。

包含多价VLP的组合物可以通过本领域已知的解决方案来稳定，诸如WO 98/44944；WO 00/45841，通过述及收入本文。

在VP1和VP2蛋白或衍生物之外，本发明的组合物可包含其它蛋白质或蛋白质片段。其它蛋白质或肽也可以与本发明的组合物共施用。任选的是，组合物也可以与非诺如病毒抗原一起配制或共施用。合适的是，这些抗原能提供针对其它疾病的保护。

VP1蛋白或功能性蛋白质衍生物合适地能够形成VLP，而且VLP形成可通过标准技术来评估，诸如例如电子显微术和动态激光散射。

抗原制备

本发明的抗原性分子可以通过自它们天然存在于其中的生物体分离和纯化来制备，或者它们可以通过重组技术来制备。优选的是，自昆虫细胞诸如Sf9或H5细胞制备诺如病毒VLP抗原，尽管也可以使用任何合适的细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母细胞，例如酿酒酵母/啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastori)或其它毕赤氏酵母表达系统，哺乳动物细胞表达诸如CHO或HEK系统。当通过重组方法或通过合成来制备时，可以对构成肽的氨基酸进行一处或多处插入、缺失、倒位或取代。优选以基本上纯的状态使用上述每一种抗原。

在昆虫细胞培养物中生成诺如病毒VLP的规程先前已经披露于美国专利No.6,942,865，通过述及完整收入本文。简言之，克隆含有病毒衣壳基因(ORF2)和次要结构基因(ORF3)的来自基因组3′端的cDNA。自所克隆的cDNA构建携带病毒衣壳基因的重组杆状病毒。在Sf9或H5昆虫细胞培养物中生成诺如病毒VLP。

佐剂

本发明进一步提供了包含供与诺如病毒抗原一起使用的佐剂的组合物。大多数佐剂含有设计用于保护抗原免于快速代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的刺激物(诸如百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质)。合适的佐剂可通过商业途径获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Pifco Laboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸酰化糖的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；和QuilA。

合适的佐剂还包括但不限于toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、Cochleates、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、和脂质体。优选的是，佐剂是细菌衍生的外毒素。刺激Th1型应答的佐剂也是优选的，诸如3DMPL或QS21。

单磷酰基脂质A(MPL)，一种来自沙门氏菌(Salmonella)的脂质A无毒衍生物，是已经开发成疫苗佐剂的一种有力的TLR-4激动剂(Evans et al.2003)。在临床前鼠研究中，鼻内MPL显示出增强分泌性以及系统性体液应答(Baldridge et al.2000；Yang et al.2002)。还在超过120,000名患者的临床研究中证明了它作为疫苗佐剂是安全且有效的(Baldrick et al.，2002；2004)。MPL经由TLR-4受体刺激对先天免疫的诱导，并因此能够引发针对多种感染性病原体的非特异性免疫应答，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌二者、病毒、和寄生物(Baldrick et al.2004；Persing et al.2002)。在鼻内配制剂中包括MPL应当提供对先天应答的快速诱导，自病毒挑战(challenge)引发非特异性免疫应答，同时增强由疫苗的抗原性成分产生的特异性应答。

因而，在一个实施方案中，本发明提供了包含单磷酰基脂质A

或3De-O-酰化单磷酰基脂质A

(作为适应性和先天性免疫的增强剂)的组合物。在化学上，

是具有4、5或6条酰化链的3De-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。3De-O-酰化单磷酰基脂质A的一种优选形式披露于欧洲专利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)，通过述及收入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了包含合成脂质A、脂质A模拟物或类似物诸如BioMira的PET脂质A、或设计用于像TLR-4激动剂那样发挥功能的合成衍生物的组合物。

本领域技术人员会很好地理解术语“有效佐剂量”或“佐剂的有效量”，而且包括一种或多种佐剂能够刺激针对所施用抗原的免疫应答的量，即提高针对所施用抗原组合物的免疫应答的量，如就洗鼻液中的IgA水平、血清IgG或IgM水平、或B和T细胞增殖所测量的。免疫球蛋白水平的合适有效升高包括超过5％、优选超过25％、特别是超过50％，如与没有任何佐剂的相同抗原组合物相比。

投递剂

本发明还提供了包含功能为增强抗原摄取、提供贮存效应、或延长抗原在投递部位的保留时间(例如延迟抗原的排出)的投递剂的组合物。这样的投递剂可以是生物粘着剂。具体而言，生物粘着剂可以是粘膜粘着剂，诸如壳聚糖、壳聚糖盐、或壳聚糖碱(例如谷氨酸壳聚糖)。

壳聚糖，一种自甲壳类的壳中的几丁质衍生的带正电荷的线性多糖，是用于上皮细胞和它们的覆盖粘液层的生物粘着剂。用壳聚糖配制抗原延长它们与鼻膜接触的时间，由此依靠贮存效应提高摄取(Illum et al.2001；2003；Davis et al.1999；Bacon et al.2000；van der Lubben et al.2001；2001；Lim et al.2001)。已经在动物模型和人体二者中，作为用于数种疫苗的鼻投递系统测试了壳聚糖，包括流感、百日咳和白喉(Illum et al.2001；2003；Bacon et al.2000；Jabbal-Gill et al.1998；Mills et al.2003；McNeela et al.2004)。在这些试验中，壳聚糖显示出增强系统性免疫应答至与胃肠外疫苗接种等同的水平。另外，还在粘膜分泌中测量到显著的抗原特异性IgA水平。如此，壳聚糖能大大增强鼻疫苗的效力。此外，由于它的物理特征，壳聚糖特别适合于配制成粉末的鼻内疫苗(van der Lubben et al.2001；Mikszta et al.2005；Huang et al.2004)。

因而，在一个实施方案中，本发明提供了适应鼻内施用的抗原性组合物或疫苗组合物，其中所述组合物包括抗原和有效量的佐剂。在优选的实施方案中，本发明提供了包含与至少一种投递剂(诸如壳聚糖)和至少一种佐剂(诸如

CPG、咪喹莫特(imiquimod)、gardiquimod、或合成脂质A或脂质A模拟物或类似物)组合的诺如病毒抗原(诸如诺如病毒VLP)的抗原性组合物或疫苗组合物。

壳聚糖的分子量可以介于10kDa和800kDa之间，优选介于100kDa和700kDa之间且更优选介于200kDa和600kDa之间。壳聚糖在组合物中的浓度通常会高至约80％(w/w)，例如5％、10％、30％、50％、70％或80％。壳聚糖优选是至少75％脱乙酰化的，例如80-90％，更优选82-88％脱乙酰化的，具体的例子是83％、84％、85％、86％和87％脱乙酰化。

疫苗和抗原性配制剂

本发明的组合物可配制成供作为疫苗或抗原性配制剂来施用。如本文中所使用的，术语“疫苗”指如下的配制剂，其含有如上所述的本发明的诺如病毒VLP或其它诺如病毒抗原，其处于能够对脊椎动物施用并诱导保护性免疫应答的形式，该保护性免疫应答足以诱导免疫力来预防和/或改善感染和/或减轻感染的至少一种症状和/或增强另一剂VLP或抗原的功效。如本文中所使用的，术语“抗原性配制剂”或“抗原性组合物”指在对脊椎动物(例如哺乳动物)施用时会诱导免疫应答的制备物。如本文中所使用的，术语“免疫应答”指体液免疫应答和由细胞介导的免疫应答二者。体液免疫应答牵涉对B淋巴细胞生成抗体的刺激，该抗体例如中和传染剂、阻断传染剂进入细胞、阻断所述传染剂的复制、和/或保护宿主细胞免于感染和破坏。由细胞介导的免疫应答指由脊椎动物(例如人)展现的，针对传染剂的，由T淋巴细胞和/或其它细胞(诸如巨噬细胞)介导的免疫应答，其预防或改善感染或减轻其至少一种症状。具体而言，“保护性免疫”或“保护性免疫应答”指由脊椎动物(例如人)展现的，针对传染剂的免疫力或针对传染剂引发免疫应答，其预防或改善感染或减轻其至少一种症状。具体而言，自疫苗的施用诱导保护性免疫应答表现为消除或降低胃肠炎的一种或多种症状的存在或此类症状的持续时间或严重程度的降低。由诺如病毒引起的胃肠炎的临床症状包括恶心、腹泻、稀粪、呕吐、发烧、和全身不舒服。降低或消除疾病症状的保护性免疫应答会降低或终止诺如病毒爆发在人群中的传播。疫苗制备物一般性记载于Vaccine Design(″The subunit and adjuvant approach″(Powell M.F.和Newman M.J.编)(1995)Plenum Press New York)。本发明的组合物可配制用于例如投递至口、胃肠、和呼吸(例如鼻)粘膜中一项或多项。

在意图将组合物投递至呼吸(例如鼻)粘膜的情况中，通常将它配制成水溶液(用于作为气雾剂或滴鼻剂施用)或干粉(例如用于在鼻道内快速沉积)。用于作为滴鼻剂施用的组合物可含有一种或多种通常包括在此类组合物中的赋形剂类型，例如防腐剂、粘度调节剂、张度调节剂、缓冲剂、等等。粘度剂可以是微晶纤维素、壳聚糖、淀粉、多糖、等等。用于作为干粉施用的组合物还可含有一种或多种通常包括在此类组合物中的赋形剂，例如粘膜粘着剂、填充剂、和提供适宜粉末流动和大小特征的药剂。填充剂和粉末流动和大小剂可包括甘露醇、蔗糖、海藻糖、和木糖醇。

在一个实施方案中，本发明的诺如病毒疫苗或抗原性配制剂含有一种或多种诺如病毒基因小组抗原(作为免疫原)、佐剂(诸如

)、用于促进对粘膜表面的粘着的生物聚合物(诸如壳聚糖)、和填充剂(诸如甘露醇和蔗糖)。例如，诺如病毒疫苗可配制成含有一种或多种诺如病毒基因小组抗原(例如诺沃克病毒、休斯顿病毒、雪山病毒)、

佐剂、壳聚糖粘膜粘着剂、和甘露醇和蔗糖(作为填充剂和提供适当的流动特征)的10mg干粉。配制剂可包含约7.0mg壳聚糖(25-90％w/w范围)、约1.5mg甘露醇(0-50％w/w范围)、约1.5mg蔗糖(0-50％w/w范围)、约25μg

(0.1-5％w/w范围)、和约100μg诺如病毒抗原(0.05-5％w/w范围)。

诺如病毒抗原可以以约0.01％(w/w)至约80％(w/w)的浓度存在。在一个实施方案中，可以以约5μg、约15μg、约25μg、约50μg、约100μg、约200μg、约500μg、和约1mg每10mg干粉配制剂(0.05、0.15、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、和10.0％w/w)(用于施用入两个鼻孔，每个鼻孔10mg)或约10μg、约30μg、约50μg、约100μg、约200μg、约400μg、约1mg、和约2mg(0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0％w/w)每20mg干粉配制剂(用于施用入一个鼻孔)的剂量配制诺如病毒抗原。在每次施用期间可以在一个或两个鼻孔中给予配制剂。第一次施用后1-12周可以有强化施用以改善免疫应答。疫苗和抗原性配制剂中每种诺如病毒抗原的含量可以是1μg至100mg的范围，优选1-1000μg的范围，更优选5-500μg，最通常的是10-200μg的范围。每剂施用的总诺如病毒抗原可以是约10μg、约30μg、约200μg、约250μg、约400μg、约500μg、或约1000μg。可以将总疫苗剂量施用入一个鼻孔中，或者可以对半拆分，施用至两个鼻孔。干粉特征是这样的，即少于10％的颗粒的直径小余10μm。粒度均值的范围为直径10-500μm。

在另一个实施方案中，抗原性和疫苗组合物可配制成液体，供随后对受试者施用用。意图用于鼻内施用的液体配制剂会包含诺如病毒基因小组抗原、佐剂、和投递剂诸如壳聚糖。用于肌肉内(i.m.)施用的液体配制剂会包含诺如病毒基因小组抗原、佐剂、和缓冲剂，没有投递剂(例如壳聚糖)。

优选的是，上文所述抗原性和疫苗组合物是冻干和无水保存的，直至它们准备使用，那时用稀释剂重建它们。或者，可以在试剂盒中分开保存组合物的不同成分(任何或所有成分是冻干的)。所述成分可保持冻干形式，用于干配制剂或重建液体配制剂，而且或是在使用前混合或是分开对患者施用。对于干粉施用，可以将疫苗或抗原性配制剂预载入鼻内投递装置中并保存，直至使用。优选的是，此类鼻内投递装置会保护和确保其内容物的稳定性。

抗原性配制剂和疫苗的冻干是本领域公知的。典型的是，在存在在冻干过程中保护抗原及产生具有期望粉末特征的块状物(cake)的药剂的情况中冷冻干燥液体抗原。糖(诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖、或乳糖)(以10-200mg/mL的初始浓度存在)常常用于蛋白质抗原的冷冻保护及产生具有期望粉末特征的冻干块。冻干组合物理论上产生更稳定的组合物。虽然大多数配制工艺的目的是使蛋白质聚集和降解最小化，但是发明人发现聚集抗原的存在增强针对诺如病毒VLP的免疫应答(见实施例3和4)。因此，发明人开发了能在冻干过程期间控制抗原聚集百分比以生成最佳的聚集抗原对完整抗原比以诱导最大免疫应答的方法。

如此，本发明还涵盖制备诺如病毒抗原配制剂的方法，包括(a)制备包含诺如病毒抗原、蔗糖、和壳聚糖的冻干前溶液，其中蔗糖对壳聚糖的比率为约0∶1至约10∶1；(b)用液氮冷冻溶液；和(c)将冷冻后的溶液于环境温度冻干48-72小时，其中最终的冻干产物含有一定百分比的聚集形式的所述诺如病毒抗原。在一个实施方案中，冻干前溶液还包含填充剂。在另一个实施方案中，所述填充剂是甘露醇。

可以通过下列指导方针来确定产生想要的聚集百分比的蔗糖与壳聚糖的适宜比率。含有范围为约2.5∶1至约10∶1的蔗糖对壳聚糖重量比的冻干前混合物会在冻干后产生多于95％的完整诺如病毒抗原(即少于5％的聚集抗原；见实施例13)。约1∶1至约2.1∶1的蔗糖对壳聚糖重量比范围会产生约50％至约90％的完整诺如病毒抗原(即约10％至约50％的聚集抗原)。0∶1的蔗糖对壳聚糖重量比会产生少于30％的完整诺如病毒抗原。省略蔗糖和壳聚糖二者会产生少于5％的完整抗原(即多于95％的聚集抗原)。使用这些指导方针，熟练技术人员能调整冻干前混合物中蔗糖对壳聚糖的重量比以获得产生最佳免疫应答所必需的期望量的聚集。

另外，在冻干前溶液中包括蔗糖和壳聚糖提升完整诺如病毒抗原随时间的稳定性。当作为干粉保存约12个月或更长的时间段时，配制剂中聚集的抗原/完整的抗原的比率不升高(见实施例10)。如此，此冻干规程确保具有可预测的和可控制的聚集对完整诺如病毒抗原比率的稳定配制剂。

刺激免疫应答的方法

将每种抗原性或疫苗配制剂剂量中抗原的量选择成诱导强烈免疫应答而没有显著不良副作用的量。这样的量会随采用哪种具体抗原、施用路径、和所使用的佐剂而变化。一般而言，在本发明的语境中，对患者施用的剂量应当足以随时间在患者中招致保护性免疫应答，或诱导抗原特异性抗体的生成。如此，以足够的量对患者施用组合物以引发针对特定抗原的免疫应答和/或预防、减轻、降低、或治愈来自疾病或感染的症状和/或并发症，并如此减轻或终止诺如病毒爆发在人群中的传播。足以实现这一点的量定义为“治疗有效量”。

对于基本上纯的形式的诺如病毒抗原，预期每剂会包含约1μg至10mg，优选约15-500μg配制剂中的每种诺如病毒抗原。在一种采用本发明的抗原性制备物的典型免疫接种方案中，可以以数剂(例如1-4剂)来施用配制剂，每剂含有1-1000μg每种抗原。剂量由组合物产生的免疫学活性和患者的状况以及要治疗的患者的体重或表面积决定。剂量的大小还会由在特定患者中施用特定组合物可伴随的任何不良副作用的存在、性质、和程度决定。

可以经非粘膜或粘膜路径施用本发明的抗原性和疫苗配制剂。这些施用可以包括体内施用，其经由胃肠外注射(例如静脉内、表皮下、和肌肉内)或其它传统直接途径，诸如含服/舌下、直肠、口、鼻、表面(诸如经皮和眼)、阴道、肺、动脉内、腹膜内、眼内、或鼻内路径或直接进入特定组织。或者，可以通过多种路径之任一种来施用本发明的疫苗，诸如口、表面、表皮下、粘膜、静脉内、肌肉内、鼻内、舌下、经皮、真皮下、真皮内和经栓剂。可以简单地通过使用针、导管或相关装置在单个时间点或多个时间点进行的直接施用来实现施用。

在一个优选的实施方案中，通过鼻内路径来施用本发明的抗原性和疫苗配制剂。经粘膜表面进行的免疫接种提供优于其它免疫接种路径的众多潜在优点。最明显的好处是1)粘膜免疫接种不需要针或训练有素的人员来进行施用，和2)在病原体进入部位以及系统性地产生免疫应答(Isaka et al.1999；Kozlowski et al.1997；Mestecky et al.1997；Wu et al.1997)。

在另一个方面，本发明提供了通过对患者的粘膜表面施用(优选鼻内)包含一种或多种诺如病毒抗原、至少一种有效的佐剂和/或至少一种投递剂的抗原性或疫苗组合物来引发IgA粘膜免疫应答和IgG系统免疫应答的方法。

本发明还涵盖提供用于分配上文所定义的诺如病毒抗原和上文所定义的至少一种佐剂或至少一种投递剂的鼻内配制剂的手段。分配装置可以采取例如气雾剂投递系统的形式，而且可以安排成只分配单剂或多剂。这样的装置会对鼻道投递一剂计量的疫苗或抗原性配制剂。适宜装置的其它例子包括但不限于点滴器(droppers)、拭子(swabs)、雾化器(aerosolizers)、吹入器(insufflators)(例如Valois Monopowder鼻施用装置，单剂Bespak UniDose DP干粉鼻内投递装置)、喷雾器(nebulizers)、和吸入器(inhalers)。所述装置可以通过要求受试者将配制剂吸入鼻腔的被动手段来投递抗原性或疫苗配制剂。或者，所述装置可以通过将一剂泵或喷入鼻腔中来主动投递配制剂。可以通过一个或多个此类装置将抗原性配制剂或疫苗投递入一个或两个鼻孔中。施用可以包括每名受试者两个装置(每个鼻孔一个装置)。活性成分(诺如病毒抗原)的实际剂量可以是约5-1000μg。在一个优选的实施方案中，通过鼻道内的快速沉积自靠近鼻通道的装有配制剂的装置将抗原性或疫苗配制剂施用至鼻粘膜。

本发明还提供了生成针对一种或多种诺如病毒抗原的抗体的方法，所述方法包括对受试者施用如上所述的本发明疫苗或抗原性配制剂。可以通过本领域例行方法来分离和纯化这些抗体。可以在诊断性免疫学测定法的开发中使用分离的对诺如病毒抗原特异性的抗体。可以采用这些测定法来检测临床样品中的诺如病毒及鉴定引起感染的具体病毒(例如诺沃克、休斯顿、雪山、等)。或者，可以向对诺如病毒感染易感的受试者施用分离的抗体以赋予被动或短期免疫。

本发明提供了用于在受试者中针对诺如病毒感染引发保护性免疫的方法，包括对受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含诺如病毒VLP和至少一种佐剂。在一个实施方案中，所述受试者是人，而所述疫苗赋予免于诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。虽然其他人报告了用诺如病毒抗原诱导免疫应答的方法(参见美国专利申请公开文本No.US 2007/0207526)，但是无人证明在人中诱导保护性免疫应答。与当前在美国得到许可的数种疫苗不同(其中疫苗的有效性与血清抗体有关)，研究显示了免疫应答的标志(诸如针对诺沃克病毒的血清抗体滴度升高)与人中的保护性免疫无关(Johnson et al.(1990)J.Infectious Diseases 161：18-21)。此外，另一项在人中检查诺沃克病毒考验(challenge)的研究指示对诺沃克感染的易感性是多因子的，而且包括诸如分泌者状态和记忆粘膜免疫应答等因素(Lindesmith et al.(2003)NatureMedicine 9：548-553)。因为诺如病毒不能在体外培养，所以当前没有病毒中和测定法可用。一项充当中和测定法的替代法的功能测定法是血细胞凝集抑制(HAI)测定法。HAI测量由诺如病毒疫苗诱导的抗体抑制诺如病毒VLP凝集有抗原包被的红细胞(因为诺如病毒VLP结合红细胞抗原)的能力。在此测定法中，将固定量的诺如病毒VLP与固定量的红细胞和来自经免疫受试者的血清混合。如果血清样品含有功能性抗体，那么所述抗体会与VLP竞争对红细胞的结合，由此抑制红细胞凝集。

对针对其它病毒(诸如轮状病毒)的疫苗观察到相似的发现。对于轮状病毒，关于血清抗体是直接牵涉保护还是仅仅反映最近的感染存在争论(Jiang，2002；Franco，2006)。在腹泻疾病(诸如轮状病毒或诺如病毒)的背景中确定保护的此类关联是特别困难的，其中临床前研究推断保护可以因来自粘膜免疫(诸如肠IgA)、细胞因子精调(elaboration)、和由细胞介导的免疫的贡献而丰富多彩(multifaceted)。在临床发生期间测量此类免疫应答的困难及与血清抗体测量的关联的缺失要求疫苗对这些类型的病毒的有效性只能经由人体临床考验实验来证明。

如上所述，本发明的疫苗的施用预防和/或减轻诺如病毒感染的至少一种症状。诺如病毒感染的症状是本领域公知的，而且包括恶心、呕吐、腹泻、和胃部绞痛。另外，有诺如病毒感染的患者可具有低烧、头痛、寒战、肌肉痛、和疲劳。本发明还涵盖在经历诺如病毒感染的受试者中诱导保护性免疫应答的方法，其通过对受试者施用本发明的疫苗配制剂，使得至少一种与诺如病毒感染有关的症状得到减轻和/或降低来进行。症状的降低可以主观地或客观地确定，例如由受试者自己评估、由临床医师评估或进行适宜的测定法或测量(例如体温)，包括例如生活质量评估、诺如病毒感染或别的症状的进展减缓、诺如病毒症状的严重程度降低或合适测定法(例如抗体滴度、RT-PCR抗原检测、和/或B细胞或T细胞活化测定法)。也可以通过直接测量(例如RT-PCR)大便样品中的病毒负载(这反映了自肠脱落的病毒的量)来确定有效应答。客观评估包括动物和人评估二者。

国际申请No.PCT/US07/79929(通过述及完整收入本文)中报告了本文中所公开的疫苗和抗原性配制剂在动物模型中的稳定性和效能。

实施例

现在要通过参照下列实施例中描述的具体实施方案来更为详细地例示本发明。实施例意图纯粹为例示本发明，而非意图以任何方式限制其范围。

实施例1：诺如病毒疫苗配制剂在家兔中的GLP毒性研究

此项研究的目的是评估诺沃克病毒病毒样颗粒(NV-VLP)疫苗在家兔中三次鼻内给药后的潜在毒性。所述NV-VLP疫苗含有(每10mg干粉)25μg基因小组I VLP、25μg MPL、7mg谷氨酸壳聚糖、1.475mg甘露醇、和1.475mg蔗糖。在八周时间段里进行该研究。在四周、无处理恢复时间间隔后评估任何效果的持久性、可逆性、或延迟发作。将60只新西兰白色家兔(每种性别30只)随机指派三个小组(10只家兔/性别/组)。小组1动物不给药(即不处理(naive))。给小组2动物施用10mg/鼻孔(总共20mg)的安慰剂(即佐剂/赋形剂：MPL、壳聚糖、蔗糖、和甘露醇)。给小组3动物施用10mg/鼻孔(总共20mg)的NV-VLP疫苗，其代表25μg抗原/鼻孔(总共50μg)。小组2和3中的动物在研究第1、22、和43天(SD)使用Bespak Unidose鼻内干粉装置通过鼻内施用给药。在SD 46和74对动物(5/组/性别)进行完整总体尸检。研究期间评估的参数包括死亡率、临床和笼侧观察、体重、体重变化、食物消耗、体温、眼科检查、临床病理学(临床化学、血液学、和尿液分析)、总体病理学、器官重量数据、和组织病理学。研究概要总结于表1中。研究结论总结于表2中。

表1：诺沃克疫苗配制剂的GLP毒性研究的研究参数

物种	带耳标ID的SPF新西兰白色家兔
		动物数/性别/剂量组	10只雄性和10只雌性/组
研究中的动物总数	60
		小组1	未处理的对照
小组2	佐剂/赋形剂
		小组3	佐剂/赋形剂中的1x最大人剂量VLP

表2：诺沃克疫苗配制剂的安全性和毒理学发现

观察	死亡率、临床或笼侧观察没有处理相关影响。
		体重和体重变化	对体重或体重变化没有不良影响。
食物消耗	对食物消耗没有处理相关不良影响。
		体温	对体温没有处理相关不良影响。
眼科学	在研究过程里在任何动物中没有注意到眼科损伤。
		临床病理学	接受NV-VLP疫苗或佐剂/赋形剂的家兔中在第3-76天注意到B淋巴细胞群的多克隆活化。接受NV-VLP疫苗或佐剂/赋形剂的家兔中绝对单核细胞值在第3-46天升高。对所选择的尿液分析参数没有处理影响。
总体病理学	没有处理相关观察结果。
		器官重量	对绝对或相对器官重量没有不良影响。

组织病理学

不同程度的炎性浸润物，或是在鼻甲的固有层内或是游离在鼻道内的(free within the nasal passages)，和/或接受NV-VLP疫苗或佐剂/赋形剂的家兔的鼻道内的出血。所观察到的损伤是那些预期在免疫反应中会发生的。两个组中的损伤在性质上是有限的，而且到SD 74时完全解决了(resolved)。

笼侧观察没有揭示重大发现。血液学测量(球蛋白和总蛋白质的升高)对于B淋巴细胞多克隆活化是典型的，而且可归于佐剂效应。组织病理学发现包括不同程度的炎性浸润物，或是在鼻甲的固有层内或是游离在鼻道内的，和/或两个组中的家兔的鼻道中的轻度出血。预期所观察到的损伤在免疫反应中会发生。两个组中的损伤在性质上是有限的，而且到SD 74时完全解决了。

通过ELISA分析NV-VLP特异性IgG的血清学样品显示30％的经免疫动物在单次给药后在第10天有可测量的抗NV-VLP滴度(见图1)。第22和43天的强化处理提高血清转化动物数和产物特异性抗体水平二者，而且到第73天，90％的经免疫动物是血清转化的。未处理的或用基质处理的对照无一具有可定量水平的NV-VLP特异性抗体(数据未显示)。

通过在另一组在第1、15和29天用同一配制剂鼻内免疫的家兔中评估记忆B细胞应答，进一步表征免疫应答。如国际申请No.PCT/US07/79929(通过述及完整收入本文)中所述，测量记忆B细胞应答。最后一次强化后156天收集的组织显示外周血、脾、和(最值得注意的)肠系膜淋巴结中存在NV-VLP特异性记忆B细胞。肠系膜淋巴结中的抗原特异性记忆B细胞呈IgA阳性。另外，骨髓中存在NV-VLP特异性抗体分泌长命浆细胞。

实施例2：诺沃克疫苗配制剂在人中的剂量放大安全性研究

进行了诺如病毒基因小组1疫苗的一项双盲、有对照的、剂量放大1期安全性和免疫原性研究。所述疫苗由设计用于鼻内施用的干粉基质中的冻干的诺沃克病毒样颗粒(VLP)组成。疫苗接种者包括H型1抗原分泌者的健康成人志愿者。H型1抗原分泌者入选的基本原理是H型1抗原分泌者对诺沃克病毒感染易感而非分泌者有抵抗力。作为对照，每种剂量水平的另外2名志愿者只接受基质。所述干粉基质包括25μg

佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇、和1.5mg蔗糖。志愿者在第0天和第21天给药，并被要求在每次给药后记7天症状日记。收集血液(供血清学、抗体分泌细胞(ASC)用)、及大便和唾液样品(供粘膜抗体评估用)。

表3中列出了诺沃克VLP疫苗的成分。将疫苗包装到鼻内投递装置中。将单次施用的诺沃克VLP疫苗包装到单剂Bespak(Milton Keynes，UK)UniDose DP干粉鼻内投递装置中。每个装置投递10mg干粉疫苗配制剂。每剂疫苗由两个投递装置组成，每个鼻孔中一个。总疫苗剂量是20mg干粉。佐剂/赋形剂的配制剂与诺沃克VLP疫苗相同，只是配制剂中不包括诺沃克VLP抗原。佐剂/赋形剂的配制剂(也称作干粉基质)总结于表4中。

表3：诺沃克VLP疫苗组合物

成分	分子类别	每10mg干粉的量	％最终配制剂
				诺沃克VLP	重组蛋白	2.5，7.5，25，或50μg	0.025，0.075，0.25，或0.50％
单磷酰基脂质A	磷脂	25μg	0.25％
				壳聚糖	多糖	7.0mg	70％
甘露醇	糖	1.5mg	15％^*
				蔗糖	糖	1.5mg	15％

表4：佐剂/赋形剂(干粉基质)

成分	分子类别	每10mg干粉的量	％最终配制剂
				单磷酰基脂质A	磷脂	25μg	0.25％
壳聚糖	多糖	7.0mg	70％
				甘露醇	糖	1.5mg	15％
蔗糖	糖	1.5mg	15％

具体而言，如下进行疫苗的剂量放大：适当筛选健康优良后，对一组3名志愿者随机指派以通过鼻内路径接受5μg诺沃克VLP疫苗加干粉基质(n＝2)或单独的干粉基质(n＝1)。对这3名志愿者跟踪安全性21天，并由独立安全监视人(Independent Safety Monitor，ISM)审查他们的安全性数据。在ISM批准之后，这些个体在第21天接受他们的第二剂疫苗或基质，并对另外4名志愿者随机指派以通过鼻内路径接受5μg VLP蛋白加干粉基质(n＝3)或单独的基质(n＝1)。ISM审查来自这第二组的安全性数据，并且在ISM批准后，在第一剂后21天给予鼻内第二剂。志愿者在每次给药后记7天症状日记。在ISM决定放大至下一个更高剂量是可接受的之后，对另一组7名志愿者随机指派以在第0天和第21天通过鼻内路径接受含有15μg VLP蛋白的诺沃克VLP疫苗(n＝5)或单独的干粉基质(n＝2)。再次，记录7天症状日记，并在第21天第二剂之前由ISM审查。最后，审查来自前两个剂量分组的安全性数据后，ISM决定剂量放大是可接受的，并且对最后一组7名志愿者随机指派以在第0天和第21天通过鼻内路径接受含有50μg VLP蛋白的诺沃克VLP疫苗(n＝5)或单独的干粉基质(n＝2)。第21天第二剂之前由ISM再次审查七天症状日记和其它安全性数据。

志愿者在接受诺沃克VLP疫苗或单独的干粉基质后7天里记症状日记(包括局部症状：诸如鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛；和系统症状：诸如每日口腔温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻、和食欲不振)。在每次随访(第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天和第180±14天)时获得期中(interim)医学史；对志愿者询问期中的疾病、药疗、和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包括在随访期间未请求的(solicited)事件。在第7天和第28天(每次免疫接种后7天)对志愿者评估CBC和血清肌酸酐、葡萄糖、AST、和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所述测试变成正常或稳定。

盲试数据提示在接受低剂量(n＝5)或基质(n＝2)的志愿者中，7人中有4人在疫苗接种后的前24小时里报告了一些或所有下列各项：鼻涕、鼻痛、不通气、痒、打喷嚏、头痛、和/或咽喉痛。一名受试者在第1天和第6天都报告了轻微鼻出血。在接受中剂量(n＝5)或基质(n＝2)的受试者中，7人中有5人在前24小时里报告了轻度鼻涕、不通气、痒、打喷嚏、和/或头痛。症状一般在前72小时里解决，但是不通气在一名志愿者中持续至第7天。下文表5呈现了对非盲试数据的发现的汇总，它还包括在高剂量中报告的不良事件。这些发现指示鼻内诺如病毒VLP疫苗与局部的、通常为轻度的、短期的症状有关，它们表现出不依赖VLP浓度。在佐剂/赋形剂(或基质)对照组与诺沃克VLP疫苗组之间没有看到关于不良事件、血液学、血液化学和/或体格检查结果的差异。

表5：具有针对诺沃克VLP疫苗或佐剂/赋形剂的不良事件的志愿者的数目

^*分组3中的一名受试者没有接受第二剂。

在免疫接种前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天、和第180±14天收集血液以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量针对诺沃克VLP疫苗的血清抗体。在施用每剂疫苗或单独的干粉基质之前及之后第7天收集外周血淋巴细胞以通过ELISPOT测定法检测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及之后第21±2天、第56±2天、和第180±14天获得全血以分离细胞并冷冻，供未来研究由细胞介导的免疫用，包括响应诺沃克VLP抗原而发生的细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫接种前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天、和第180±14天收集全大便样品，供抗诺沃克VLP sIgA筛选用。在免疫接种前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天用商品化装置(Salivette，Sarstedt，Newton，NC)收集唾液，而且如果第56天粘膜抗体呈阳性，那么收集第180±14天样品并筛选抗诺沃克VLP sIgA。最后，在第0天、第21天、第56天和第180天对来自接受最高剂量的诺沃克VLP(50μg，上文所述第三分组)的志愿者的血液筛选记忆B细胞。

使用下列方法来分析自经免疫个体或接受单独的干粉基质的个体收集的血液、大便、和唾液样品：

A.通过ELISA测量血清抗体

在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集20mL血液供通过ELISA测量针对诺沃克病毒的抗体用，其中使用纯化的重组诺沃克VLP作为靶抗原来筛选有编码的标本。简言之，使用碳酸盐包被缓冲液pH9.6中的诺沃克VLP包被微量滴定板。将经包被的板清洗，封闭，并与连续两倍稀释的测试血清一起温育，接着清洗，并与酶偶联的对人IgG、IgM、和IgA特异性的二抗试剂一起温育。添加适宜的底物溶液，显色，读板，并测定IgG、IgM、和IgA终点滴度，与参照标准曲线比较每种抗体类别。阳性响应定义为疫苗接种后的滴度升高4倍。图2显示了每种疫苗剂量第56天(第二次免疫接种后35天)的血清滴度。结果显示了IgG和IgA的血清滴度的剂量依赖性升高。在接受含有50μg诺如病毒抗原的疫苗的志愿者中观察到IgG和IgA的显著血清滴度。

B.抗体分泌细胞测定法

自肝素化血液(30mL分组1和2，25mL分组3)收集PBMC供ASC测定法用，以检测分泌针对诺沃克VLP的抗体的细胞。在施用诺沃克VLP疫苗或单独的干粉基质后在第0天、第7±1天、第21±2天、和第28±2天实施这些测定法。记载每种剂量每个时间点的应答率和每10⁶个PBMC的ASC数的均值。阳性响应定义为疫苗接种后每10⁶个PBMC的ASC计数超出所有受试者疫苗接种前计数的均值至少3个标准偏差(SD)(以对数计量计)和至少8个ASC斑点，这对应于用介质刺激的阴性对照孔的均值(2个斑点)加3个SD，如相似测定法中所测定的。

图3描绘了50μg剂量诺沃克VLP的ASC测定法的结果。初始和强化疫苗接种后七天观察到循环中的IgG和IgA抗体分泌细胞，提示疫苗是有免疫原性的。

C.测量功能性抗体应答

进一步分析如上文段落B中所述收集的血清以测定抗诺沃克病毒抗体的功能特性。对连续两倍稀释的测试血清分析其抑制诺沃克VLP对红细胞的血细胞凝集的能力(一项指示保护性免疫应答的功能测定法)。阳性响应定义为疫苗接种后的滴度升高4倍。表6显示了五名接受50μg剂量诺沃克VLP疫苗的受试者第56天(强化后35天)的血清滴度和血细胞凝集抑制滴度。结果显示了百分之七十五(75％)的展现血清转化应答(如通过血清IgG滴度所测量的)的个体也发生能够阻断人红细胞上的结合受体的功能性抗体应答(如通过血细胞凝集抑制所测量的)。

表6：第0天和强化后第35天(第35PB天)五名人志愿者的血清IgG和血细胞凝集抑制(HAI)(功能性)滴度。

D.测量诺沃克病毒特异性记忆B细胞

疫苗接种后在第0、21、56和180天自分组3(30mL第0天和第21天，50mL第56天和第180天)收集肝素化血液以使用ELISpot测定法测量记忆B细胞，之前有体外抗原刺激。相似的测定法成功地用于测量家兔中由诺沃克VLP配制剂引发的记忆B细胞的频率(参见国际申请No.PCT/US07/79929，通过述及收入本文)。将外周血单核细胞(5x10⁶细胞/mL，1mL/孔，24孔板)与诺沃克VLP抗原(2-10μg/mL)一起温育4天以容许抗原特异性记忆B细胞克隆扩增和分化成抗体分泌细胞。对照包括在相同条件中在没有抗原的情况中温育的细胞和/或与无关抗原一起温育的细胞。刺激后，清洗细胞，计数并转移至经诺沃克病毒VLP包被的ELISpot板。为了测定病毒特异性记忆B细胞/总Ig分泌B淋巴细胞的频率，还将扩增的B细胞添加至经抗人IgG和抗人IgA抗体包被的孔。用HRP标记的抗人IgG或抗人IgA，接着用True Blue底物揭示结合的抗体。也可以使用针对IgA和IgG亚类(IgA1、IgA2和IgG1-4)的偶联物来测定抗原特异性亚类应答，这可能与不同效应器机制和免疫引发位置有关。用ELISpot读数器对斑点计数。通过流式细胞术为每名志愿者检查扩增细胞群以确认他们的记忆B细胞表型，即CD19+、CD27+、IgG+、IgM+、CD38+、IgD-。

E.细胞免疫应答

作为有编码的标本收集肝素化血液(50mL分组1和2，25mL分组3)，分离外周血单核细胞(PBMC)，并在液氮中冷藏，供未来可能评估针对诺沃克VLP抗原的CMI应答用。可以实施的测定法包括针对诺沃克VLP抗原的PBMC增殖和细胞因子应答，而且可以通过依照已建立的技术测量干扰素(IFN)-γ和白介素(IL)-4水平来测定。

F.收集大便和唾液供抗诺沃克VLP sIgA用

在大便和唾液样品中测量抗重组诺沃克病毒IgA。将唾液标本用蛋白酶抑制剂(即AEBSF、亮抑酶肽(leupeptin)、苯丁抑制素(bestatin)、和抑酶肽(aprotinin))(Sigma，St.Louis，MO)处理，保存于-70℃，并使用一种先前记载的测定法的改良形式测定(Mills et al.(2003)Infect.Immun.71：726-732)。在疫苗接种后的多个日子收集大便，并将标本保存于-70℃直至分析。融化标本，并添加蛋白酶抑制剂缓冲液以制备10％w/v大便悬浮液。如下所述，通过ELISA对大便上清液测定重组诺沃克病毒(rNV)特异性粘膜IgA。

在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集大约2-3mL的全唾液。通过商品化装置(Salivette，Sarstedt，Newton，NC)收集唾液，其中咀嚼Salivette拭子或将Salivette拭子在舌下放置30-45秒，直至拭子被唾液饱和。通过离心自拭子收集唾液。

G.测量大便和唾液中的抗诺沃克VLP

利用用抗人IgA抗体试剂或靶rNV VLP抗原涂层包被的板实施ELISA以为每份标本测定总IgA和滴定特异性抗VLP IgA应答。如上所述，用HRP标记的抗人IgA揭示总的或特异性的IgA。包括一条内部总IgA标准曲线来对IgA含量定量。响应定义为特异性抗体升高4倍。

实施例3：两种剂量的鼻内诺沃克VLP疫苗在人中的安全性和免疫原性研究

在健康成人中进行了一项随机化、双盲研究以与佐剂/赋形剂和安慰剂对照(空装置)比较两种剂量水平的诺沃克病毒样颗粒(VLP)疫苗的安全性和免疫原性。所述疫苗由实施例2中所述设计用于鼻内施用的干粉基质中的诺沃克病毒样颗粒(VLP)组成。疫苗接种者包括H型1抗原分泌者的健康成人志愿者。将人志愿者随机指派四个小组之一，而且每个小组接受下列处理之一：一剂50μg诺沃克VLP疫苗，一剂100μg诺沃克VLP疫苗，佐剂/赋形剂、或安慰剂。志愿者在第0天和第21天给药，并被要求在每次给药后记7天症状日记。收集血液(供血清学、抗体分泌细胞(ASC)用)、及大便和唾液样品(供粘膜抗体评估用)。

实施例2表3中列出了疫苗的成分。将疫苗包装到鼻内投递装置中。将单次施用的诺沃克VLP疫苗包装到单剂Bespak(Milton Keynes，UK)UniDoseDP干粉鼻内投递装置中。每个装置投递10mg干粉疫苗配制剂。每剂疫苗由两个投递装置组成，每个鼻孔中一个。总疫苗剂量是20mg干粉。因此，50μg疫苗剂量由两个装置组成，每个投递10mg干粉配制剂，其中每10mg干粉配制剂由25μg诺沃克VLP、25μg

佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇、和1.5mg蔗糖组成。类似地，100μg疫苗剂量由两个装置组成，每个投递10mg干粉配制剂，其中每10mg干粉配制剂由50μg诺沃克VLP、

佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇、和1.5mg蔗糖组成。佐剂/赋形剂的配制剂与诺沃克VLP疫苗相同，只是配制剂中不包括诺沃克VLP抗原。佐剂/赋形剂的配制剂(也称作干粉基质)总结于实施例2表4中。安慰剂组接受两个空装置。

志愿者在接受两剂诺沃克VLP疫苗、单独的干粉基质、或安慰剂任一剂后7天里每天记症状日记(包括局部症状诸如：鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛；和系统症状诸如：每日口腔温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻、和食欲不振)。在每次随访(第7+1天、第21+2天、第28+2天、第56+2天和第180+14天)时获得期中医学史；对志愿者询问期中的疾病、药疗、和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包括在随访期间未请求的事件。在第7天和第28天(每次免疫接种后7天)对志愿者评估CBC和血清肌酸酐、葡萄糖、AST、和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所述测试变成正常或稳定。

在免疫接种前及在第7+1天、第21+2天、第28+2天、第56+2天、和第180+14天收集血液以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量针对诺沃克VLP疫苗的血清抗体。在施用每剂疫苗、单独的干粉基质、或安慰剂前及在施用每剂疫苗、单独的干粉基质、或安慰剂后第7天，收集外周血淋巴细胞以通过ELISPOT测定法检测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及在疫苗接种后第21+2天、第56+2天和第180+14天，获得全血以分离细胞并冷冻，供未来研究由细胞介导的免疫用，包括响应诺沃克VLP抗原而发生的细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫接种前及在第7+1天、第21+2天、第28+2天、第56+2天、和第180+14天收集全大便样品，供抗诺沃克VLP sIgA筛选用。在免疫接种前及在第7+1天、第21+2天、第28+2天、第56+2天用商品化装置(Salivette，Sarstedt，Newton，NC)收集唾液，而且如果第56天粘膜抗体呈阳性，那么收集第180+14天样品并筛选抗诺沃克VLP sIgA。还在第0、21、56和180天对血液筛选记忆B细胞。

用于分析自经免疫个体或接受单独的基质干粉或安慰剂的个体收集的血液、大便、和唾液样品的方法详细记载于实施例2中。

实施例4：用诺沃克病毒VLP疫苗配制剂免疫的人中的诺沃克病毒挑战研究

在80名用上文实施例2中所述诺沃克VLP疫苗免疫的人志愿者中进行了一项多部位、随机化、双盲、有安慰剂对照的1-2期挑战研究。合格的受试者包括那些年龄为18-50岁的，健康优良的，表达H型-寡糖1的(通过阳性唾液分泌者状态来测量)且B或AB型血型以外的。非H型-1分泌者的或具有B或AB型血的受试者据报告对诺沃克病毒感染更有抵抗力，被排除在研究之外。基于这两条标准，预期至少80％的志愿者是合格的。

筛选后，将达到所有接受标准的合格志愿者随机(1∶1)分入两个同等大小的分组之一，每个分组中有约40名志愿者。分组1用诺沃克VLP免疫而分组2接受安慰剂。在每个鼻孔中用10mg诺沃克VLP疫苗(总共20mg干粉)或安慰剂免疫志愿者。每10mg诺沃克VLP疫苗含有50μg诺沃克VLP、7mg壳聚糖、25μg

1.5mg蔗糖和约1.5mg甘露醇。如此，分组1中的每名志愿者在每次免疫接种时接受100μg诺沃克VLP抗原的总剂量。志愿者在第0天和第21天接受疫苗或安慰剂。

与安慰剂相比评估了诺沃克病毒VLP疫苗的安全性。志愿者在每次用疫苗或安慰剂免疫接种后7天里记日记以记录不良事件的严重程度和持续时间。最后一剂疫苗或安慰剂后6个月里和用感染性病毒考验后的4个月里跟踪严重的不良事件(SAE)和任何重大新医学状况的发生。

在第二剂疫苗或安慰剂后21-42天之间(研究第42-56天之间)用感染性诺沃克病毒考验所有志愿者。每名志愿者接受大于或等于50％人感染剂量(HID50)，即预期在安慰剂组的至少50％的志愿者中引起疾病的感染性病毒量。HID 50介于约48和约480病毒当量的诺沃克病毒之间。将诺沃克病毒与无菌水混合，并口服给药。接种之前摄取水中的500mg碳酸氢钠，以防止病毒被胃酸和胃蛋白酶分解。在口服接种感染性病毒后5分钟进行第二次碳酸氢钠溶液(水中的500mg碳酸氢钠)摄取。志愿者在考验机构逗留至少4天且在急性胃肠炎的症状/体征(呕吐、腹泻、稀粪、腹痛、恶心、和发烧)消失后至少18小时。

检测数项度量来测定诺沃克VLP疫苗在预防或减轻由病毒考验诱发的急性胃肠炎的症状/体征方面的效能。记录所有志愿者的急性胃肠炎临床症状，而且研究人员在研究场所将这些症状记入文件。将来自接受疫苗的分组1的疾病症状/体征与分组2安慰剂接受者比较。

在用疫苗或安慰剂免疫接种前和在考验后例行地自所有志愿者收集血清和大便样品。通过ELISA分析血清样品的IgA和IgG，针对诺沃克VLP的滴度。分别通过ELISA和PCR在大便样品中测试诺沃克抗原和诺沃克RNA，其指示病毒的存在、自肠脱落的病毒的量、和病毒脱落的持续时间。对在考验后生病的受试者进行别的实验室研究，包括血清化学、BUN、肌酸酐、和肝功能测试，直至症状/体征得到解决。

比较来自疫苗组(分组1)和安慰剂组(分组2)的结果以评估疫苗针对诺如病毒疾病总体的保护效能(主要终点)和/或其在改善症状/体征(疾病的严重程度和天数)和/或病毒脱落的存在、量和/或持续时间的降低中的效能(次要终点)。

本发明在范围上不受所描述的具体实施方案的限制，所描述的具体实施方案意图作为本发明各方面的单一例示，而且功能上等同的方法和成分在本发明的范围内。实际上，根据上述描述和附图，只不过使用例行实验，在本文所显示的和所描述的那些之外，对本发明的各种修饰对于本领域技术人员而言会变得显而易见。此类修饰和等同方案意图落在所附权利要求的范围内。

通过述及将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请收入本说明书，其程度就像具体且单独指明通过述及将每一篇单独的出版物、专利或专利申请收入本文一样。

本文中对参考文献的引用或讨论不应解释为承认它是本发明的现有技术。

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Claims

1.一种在人类中引发针对诺如病毒感染的保护性免疫的方法，包括对人施用包含诺如病毒病毒样颗粒(VLP)和至少一种佐剂的疫苗。

2.权利要求1的方法，其中所述诺如病毒VLP选自下组：诺如病毒基因小组I和基因小组II病毒株。

3.权利要求1的方法，其中所述诺如病毒VLP是单价VLP。

4.权利要求1的方法，其中所述诺如病毒VLP是多价VLP。

5.权利要求1的方法，其中所述疫苗包含第二种类型的诺如病毒VLP。

6.权利要求5的方法，其中所述第一种和第二种诺如病毒VLP是来自不同基因小组的单价VLP。

7.权利要求6的方法，其中所述第一种诺如病毒VLP是诺沃克病毒VLP且所述第二种诺如病毒VLP是休斯顿病毒VLP。

8.权利要求1的方法，其中所述疫苗进一步包含投递剂。

9.权利要求8的方法，其中所述投递剂是生物粘着剂。

10.权利要求9的方法，其中所述生物粘着剂是粘膜粘着剂。

11.权利要求10的方法，其中所述粘膜粘着剂选自下组：硫酸皮肤素、软骨素、果胶、粘蛋白、藻酸盐、聚丙烯酸的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、羟丙基甲基纤维素、凝集素、菌毛/伞毛蛋白质、和羧甲基纤维素。

12.权利要求11的方法，其中所述粘膜粘着剂是多糖。

13.权利要求12的方法，其中所述多糖是壳聚糖、壳聚糖盐、或壳聚糖碱。

14.权利要求1的方法，其中所述佐剂选自下组：toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、Cochleates、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、和脂质体。

15.权利要求14的方法，其中所述佐剂是toll样受体(TLR)激动剂。

16.权利要求14的方法，其中所述佐剂是MPL。

17.权利要求1的方法，其中所述佐剂不是毒素佐剂。

18.权利要求1的方法，其中所述疫苗在粉末配制剂中。

19.权利要求1的方法，其中所述疫苗在液体配制剂中。

20.权利要求1的方法，其中所述疫苗是通过选自下组的路径对人施用的：粘膜、鼻内、肌肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下、和经皮施用路径。

21.权利要求20的方法，其中所述疫苗是鼻内施用的。

22.权利要求21的方法，其中所述疫苗是通过鼻道内的快速沉积自一种或多种靠近鼻通道的包含疫苗的装置施用至鼻粘膜的。

23.权利要求22的方法，其中将所述疫苗施用至一个或两个鼻孔。

24.权利要求1的方法，其中所述诺如病毒VLP是以约0.01％(w/w)至约80％(w/w)的浓度存在的。

25.权利要求1的方法，其中所述诺如病毒VLP是以约1μg至约100mg每剂的量存在的。

26.权利要求25的方法，其中所述诺如病毒VLP是约1μg至约100μg每剂。

27.权利要求1的方法，其中所述疫苗赋予免于诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。