CN1019165B - 通过胚胎发生法使向日葵再生的方法 - Google Patents
通过胚胎发生法使向日葵再生的方法Info
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Abstract
一种从未成熟胚胎出发的栽培品种再生的方法。它包括三个阶段：在含有一种细胞激动素型激素的培养基中胚胎发生愈伤组织的形成；在与前述同样性质的一种培养基中愈伤组织的培养；胚芽的培养。本方法应用于向日葵栽培品种。
Description
本发明是关于一项以细胞或组织开始通过体细胞胚胎发生法使向日葵植株再生的方法。
尽管我们已能从分离的细胞或组织出发使许多栽培品种的植株获得再生，但以向日葵（Helianthus annuus）进行的种种努力总是徒劳无益的。有关通过体细胞胚胎发生法使向日葵再生的数种方法在文献资料中曾有描述，但这些方法仅涉及稀有基因型，或杂交种。取下之活的植物组织是放在第一培养基中培植，这种培养基诱导愈伤组织的形成。接着，愈伤组织被转移到第二培养基中，这种培养基诱导体细胞胚胎和胚芽的形成。然后，胚芽被转移到第三培养基中，这种培养基诱导根部的形成，而在此阶段，可将再生的植株栽植入土中。
佩特森（Paterson）和埃弗雷特（Everett）[植物科学（Plant Sci.，）1985，42，125]配制了一种培养基，经乔治伊娃（Georgieva）、托多洛娃（Todorva）等人确定配制了最佳培养基[第九届国际向日葵学术讨论会论文集（Procqth Int.Sunflower Conference，托雷莫利诺斯，西班牙，1980，122）]，此培养基从胚轴的片段出发借助于体细胞胚胎法而诱导向日葵的一种栽培品种（SS 415B）的再生。取下之活的植物组织置于黑暗中培养2周，接着在光照下培养2-4周，所使用的是一种改性的穆拉布格和斯库格（MS）培养基，补充以40毫克/升的硫酸腺嘌呤、1毫克/升的6-苄氨基嘌呤（BAP）、1毫克/升的萘乙酸（ANA）和0.1毫克/升的赤雷素（GA3）。在头两周
期间，有一种易粉碎的愈伤组织的形成，在光照下观察到绿色的斑点出现，它会转变成芽。通过一项解剖研究揭示了这些绿色斑点是类似于接合子胚胎的体细胞胚胎。
钱德勒（Chanuder）和简[农业文摘（Agronomy Abstr.，1983，58）]叙述了从来自种间杂交的未成熟胚胎出发的向日葵的再生。未成熟的胚胎（4～5天）是置于由钱德勒（Chandler）和比尔德（Beayd）所描述的为抢救胚胎的生长培养基中[作物科学（Crop Sci1983，23 1004）]。经2～3周之后，变大的胚胎被转移到以MS培养基为基质的带有植物生长激素和细胞激素可变剂量的各种不同配方中。在这些培养基中植物的生产遵照不同的途径，包括直接发芽或诱导愈伤组织后续器管发生或胚胎发生。最好的结果是用液体在0～1ppm之间的吲哚乙酸（AIA）和激素而获得的。此系统的优点是从一个孤单胚胎出发进行无性繁殖系的多种生产。
库利（Cooley）和威尔科克斯（Wilcox）（欧洲专利申请0172377）提出一项应用于栽培向日葵植物品种HA89和RHA27的方法，其中包括上述的三个阶段，并在三种不同的培养基中进行，头两个阶段的培养基必须含有一种植物生长素型的激素。然而，这项方法具有几种缺点，一方面是仅可应用于一个尺寸范围狭小（从0.1到2毫米）的胚胎，因而灵活性较差，另一方面需要在第一阶段和第二阶段之间调换培养基，总之所得胚胎的再生率还是很不够的。
本发明涉及一项向日葵栽培品种的再生方法，比较简单，且可导致胚芽具有改善移栽入土的再生能力。
更为特别地，本发明涉及一项从未成熟的胚胎出发进行向日葵栽培品种的再生方法，该未成熟的胚胎组织的育龄为4-21天，其尺寸在0.1-5mm之间，具有大尺寸的未成熟胚胎可按照通过微胚芽根轴的平面被切割成数个等分，该再生方法包括以下几个阶段：
-从细胞或组织出发通过在一种含有激素的诱导培养基中的培
养而使胚胎发生的愈伤组织和细胞胚胎形成，及使所述胚胎生长的第一阶段，该诱导培养基含蔗糖浓度为8-12%，6-苄氨基嘌呤浓度为0.5-1毫克/升（2.2-4.4微摩尔）;
-使所述胚胎萌发及发育成可具有根部的植株的胚胎发生的愈伤组织培养的第二阶段，在该阶段中，所述胚芽生长培养基中的蔗糖浓度为2-4%，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1-0.5毫克/升（0.44-2.2微摩尔），以便其在一种含有激素的培养基中生长、发育和发芽;
-可能还有一个第三阶段，包括使植株生长和发育的培养;
其特征在于;头两个阶段是在同样性质的一种培养基中进行，且这种培养基含有一有效量的一种细胞激动素型的激素，而不含有植物生长激素。
下述说明中，百分比以重量，体积表示之，明确规定的例外。
植物组织（从中可为体细胞胚胎的生产提取活的植物组织）基本上来自在选择程序中所使用的向日葵的栽培品种Helianthus annuus。举例说明是使用了以下8个栽培品种：HA89、HA290 HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe（巨灰条纹）。品种HA89来自Dode Counts（达德地区）佛罗里达州，品种HA290、HA291、HA300、HA303、T76和RT26是来自国际种子技术公司（Seed tec InternatianalInc.，伍德兰，加利福尼亚州），以及品种Gicnt Gray Slripe是来自北鲁帕金种子公司（Northyus King Seeds.弗雷斯诺，加利福尼亚州）。
活的植物组织是来自暖房栽培的植株，并经受受控授精。对于愈伤组织的产生来说，优选的活植物组织是未成熟的胚胎。带果皮的未成熟胚胎是从向日葵的头状花序上分离的，当后者为4～21日龄时;其尺寸一般包括在0.1～5毫米之间。具有大尺寸的未成熟胚胎可按照通过微胚芽根轴的平面被切割成数个相等部份，这就从一
个孤单胚胎出发获得倍增数量的无性繁植系。
根据本发明的方法是按以下方式实行的：
向日葵品种HA89、HA290、HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe是在暖房内（26℃，40，000勒克司，光周期为每日15小时）栽培的，并经受受控授精。未成熟的胚胎在传粉后4～21天中采取。从头状花序中取下的种子是通过在添加有数滴润湿剂的3°Cl的市售次氯酸钠（或钾）消毒液中浸渍20分钟来进行灭菌的，然后用无菌蒸馏水洗涤3次。接着，胚胎在无菌条件下进行分离，或许还要切割，以及置放在所述胚胎诱导的第一培养基上。
第一培养基包括无机盐类、维生素类、氨基酸类、蔗糖和为愈伤组织体形成所需的足够量的一种激素。无机盐包括常量元素的盐类和痕量元素的盐类。在此第一培养基中所使用的常量元素可在例如以下化合物中进行选择：硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、硝酸钾和硝酸铵。痕量元素为基的盐类，我们可列举如：硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、以及铁-Na-EDTA（乙二胺四乙酸）的螯合物。这种无机盐类的组合为众所周知的叫做穆拉希格和斯库格（MS）的培养基。
对于1升培养基来说，常量元素和痕量元素的优选量如下：
-370毫克的硫酸镁七水合物，
-440毫克的氯化钙二水合物，
-170毫克的磷酸二氢钾二水合物，
-1900毫克的硝酸钾，
-1650毫克的硝酸铵，
-6.2毫克的硼酸，
-22.3毫克的硫酸锰四水合物，
-8.6毫克的硫酸锌七水合物，
-0.25毫克的钼酸钠二水合物，
-0.025毫克的硫酸铜五水合物，
-0.025毫克的氯化钴六水合物，
-0.83毫克的碘化钾，
-36.7毫克的铁-Na-EDTA螯合物。
第一培养基还含有维生素类，诸如烟酸、硫胺素（维生素B）、吡哆醇（维生素Bb）、肌醇以及一种氨基酸，诸如丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、色氨酸、半胱氨酸，以及较好地为甘氨酸。对于1升的培养基来说，维生素类和氨基酸类的优选量如下：
-0.5毫克的烟酸，
-0.1毫克的硫胺素盐酸，
-0.5毫克的吡哆醇盐酸，
-100毫克的肌醇，
-2毫克的甘氨酸。
第一培养基同时可含有维生素类和氨基酸类的增补量;此增补量对于体细胞胚胎的形成来说并不是必不可少的，但它能增加体细胞胚胎形成的频率。对于1升的培养基来说，在此可能性中，维生素类和氨基酸类的优选量如下：
-0.5毫克的烟酸，
-0.1毫克的硫胺素盐酸，
-0.5毫克的吡哆醇盐酸，
-4000毫克的肌醇，
-1000毫克的L-丙氨酸，
-800毫克的L-谷氨酰胺，
-160毫克的L-丝氨酸，
-50毫克的L-色氨酸，
-10毫克的L-半胱氨酸，
-2毫克的甘氨酸。
在第一培养基中所含的蔗糖是按照8～12%（较好地为9%）出现的。
第一培养基的激素（其选择是本发明的一个特征）是细胞激动素型的，例如激动素或6-苄氨基嘌呤，且以后者为较好。一般地说，每升培养基含有0.5～1毫克（2.2-4.4微摩尔）的激素量是合适的。一种琼脂（如Phytagar或Gelrite）是用于使培养基成为固态。对于Phytagar来说0.6%的最终浓度或对于Gelrite来说0.3%的最终浓度可给出良好的结果。培养基的pH值可在5.0～6.3之间变化，且较好地为5.0。
培养基在高压灭菌器内进行灭菌，除了激素类是在微孔膜上借助过滤法进行灭菌的。
未成熟的胚胎，如以上所述那样进行分离的，是置放于第一培养基上，且在黑暗中于26℃下培养约2～3周。在此期间，合子胚胎发育以及体细胞胚胎出现在胚轴水平和在子叶的内表面上（在HA291栽培品种的情况下）之后，可分离体细胞胚胎，并将体细胞胚胎放在所谓胚芽生长培养基的第二培养基中。胚胎发生的愈伤组织或分离的胚胎是在第二培养基中培养2～3周，温度26℃，光照为1500勒克司，使用光周期为10～16小时/天，较好地为16小时/天。在此期间，胚胎萌发以及形成胚芽，或许还有根部发育。
第二培养基（如同第一种培养基）含有无机盐类、维生素类，一种氨基酸，一些蔗糖和一种激素。无机盐类包括常量元素的盐类和痕量元素的盐类。常量元素、痕量元素、维生素类以及氨基酸是同在第一种培养基中一样的，按同等的浓度而无补量。蔗糖是按低于第一种培养基的优选量（例如2～4%，较好地为3%）而出现的。所用的激素是一种细胞激动素，较好地是与第一培养基的激素是同样的（但可以是与之不同的），优选6-苄氨基嘌呤。一般0.1～0.5毫克/
升（0.44-2.2毫摩尔）的量是合适的。一种琼脂（如Phytagar或Gelrite）是用于使培养基成为固态。对于Phytagar来说0.6%的最终浓度以及对于Gelrite来说0.3%的最终浓度能给出良好的结果。培养基如前述那样进行灭菌，所具pH值为5.0～6.3，较好地为pH＝5.0。
经过在第二培养基中培养2～3周之后，分离的体细胞胚胎已萌发，并转化成2～5厘米的胚芽。已发育了根部的胚芽可以转移植入土中，（放在含有泥炭、蛭石、细砂的一种灭菌混合物（3∶2∶1）的Jiffy罐内）。Jiffy罐是放置在一个装有满湿砂的袋内，在它的上面复盖着一个透明的聚乙烯袋以保持其高湿度。然后再把它们整个地放入15℃（600勒克司）的人工气候室内，使用的光周期为12～16小时/天，较好地为15小时/天。经10天之后，将植株转移进较大的罐内，并在暖房内（26℃40，000勒克司）栽培，使用的光周期为12～16小时/天，较好地为15小时/天。
根部尚未发育的植株上按照一项传统方法可以嫁接在暖房栽培的年轻植株上[参见，例如，Habermann和Wallace，美国植物学杂志（Amer.J.Bot.，1958，45，479）]，或者转移到一种生根培养基上，或三种培养基上，为期10～20天。
第三培养基包括无机盐类、维生素类和一些蔗糖。无机盐类包括常量元素的盐类和痕量元素的盐类。在第三种培养基中所使用的常量元素可以在以下化合物中进行选择：
硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、硝酸钾以及硫酸铵。在痕量元素为基的盐类中，我们可列举如硼酸、硫酸镁、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾和铁-Na-EDTA的螯合物。这种无机盐类的组合叫做B5为众所周知的。对于1升培养基来说，常量元素和痕量元素的优选量如下：
-250毫克的硫酸镁七水合物，
-150毫克的氯化钙二水合物，
-169毫克的磷酸二氢钠一水合物，
-3000毫克的硝酸钾，
-3毫克的硼酸，
-13.2毫克的硫酸锰四水合物，
-2毫克的硫酸锌七水合物，
-0.25毫克的钼酸钠二水合物，
-0.025毫克的硫酸铜五水合物，
-0.025毫克的氯化钴六水合物，
-0.75毫克的碘化钾，
-40毫克的铁-Na-EDTA的螯合物
第三培养基也含有维生素类。它们是烟酸、硫胺素、吡哆醇和肌醇。对于1升的培养基来说，维生素类的优选量如下：
-1毫克的烟酸，
-10毫克的硫酸胺素盐酸，
-1毫克的吡哆醇盐酸，
-100毫克的肌醇。
第三培养基同时含有一些蔗糖以及活性碳/或一种植物生长素型的激素。蔗糖是按照例如1～2%（较好地为1%）以及活性碳是按照0.1%而出现的。如果乐于使用一种激素来代替活性碳，我们将选用3-吲哚乙酸，剂量为0.1～0.2毫克/升。一种琼脂（例如Phytager或Gelrite）是用于使培养基变成固态。对于Phytager来说0.5%的最终浓度以及对于Gelrite来说0.25%的最终浓度是足够的。培养基的pH值可在5.0～6.0之间变化，较好地为5.0。培养基是用高压灭菌进行灭菌的。
植株是在此培养基上进行栽培的，历时2～3周（26℃和1500勒克司光照下），使用的光周期为12～16小时/天，且较好地为16
小时/天。此时，植株形成了根部，从而可以转移入土中。
通过此方法所得的植株在表型上可以不同于起始材料，这是由于应激。植株以手工传粉，并保存到收获种子为止。其中对某些种子进行栽培以便对向日葵新植株进行分析以及选择引人注目的可能得到的突变种，（它是结合在品种选择程序中的）。
本发明将以更完整的但非限制性的方式在以下实例中进行描述。实例Ⅰ-母液的制备
a）B5母液
把一小袋流动实验室（Flow Laboratories）的无蔗糖B5培养基（含有B5无机盐类、1毫克的烟酸、1毫克的吡哆醇盐酸、10毫克的硫胺素盐酸和100毫克的肌醇，具有最终浓度）溶解在1000毫升（最终容积）的去离子的蒸馏水中，制备得10倍浓缩的B5母液。将其分成100毫升的等分部分，并保存于-20℃
b）BAP母液
把100毫克的6-苄氨基嘌呤溶解在数毫升0.15N的盐酸中，轻微加热，并用去离子的蒸馏水稀释至100毫升，而制得1克/升浓度的BAP溶液。此溶液在加入于第一和第二培养基之前，通过在一种0.2微米（Sartorius）的Minisart NML膜上进行过滤而灭菌。
c）AIA母液
把20毫克的3-吲哚乙酸溶解在数毫升的纯乙醇中，并用去离子的蒸馏水稀释至100毫升，制备成浓度为0.2克/升的AIA溶液。此溶液在加入第三培养基之前，通过在一种0.2微米（Sartorius）的Minisart NML膜上进行过滤而灭菌。
d）维生素类及氨基酸类补充液
根据钱德勒（Chandler）和比尔德（Beard）[作物科学（Crop.Sci.，1983，23，1004）]
把39克的肌醇、10克的L-丙氨酸、8克的L-谷氨酰胺、1.6克
的L-丝氨酸、0.5克的L-色氨酸和0.1克的L-半胱氨酸全部溶解在500毫升（最终容积）的去离子的蒸馏水中，制备成20倍浓缩的维生素类和氨基酸类的母液。该母液分成为50毫升的等分，并保存于-20℃。
实例Ⅱ-培养基的制备
a）第一培养基或胚胎诱导培养基
它是通过把一小袋流动实验室（Flow Laboratories）的无蔗糖穆拉希格和斯库格（MS）的培养基（含有MS的无机盐类、0.1毫克的硫胺素盐酸、0.5毫克的烟酸、0.5毫克的吡哆醇盐酸、2毫克的甘氨酸和100毫克的肌醇）和90～120克的蔗糖溶解在去离子的蒸馏水中而制备的。在可能添加50毫升的维生素类和氨基酸类补充液之后，pH值用0.1N苏打调节至5.0，使容积达到1升，并在添加6克的phytagar（Gibco）或3克的Gelrite（Kelco）琼脂之后，混合物在120psi（磅/英寸）下经受高压灭菌20分钟。当培养基有点温热时，将0.5～1毫升的如上描述的经灭菌的BAP溶液（2.2～4.4微摩尔）加进培养基中。接着，把混合物倾注入陪替氏培养皿中。
b）第二培养基或胚芽生长培养基
第二培养基是按照第一培养基同样的方法进行制备的，即把一小袋的培养基MS、30克的蔗糖和6克的phytagar琼脂或3克的Gelrite琼脂全部溶解在1升水中并在经过高压灭菌器后，增添0.1～0.5毫升的无菌BAP溶液（0.44～2.2微摩尔）。该培养基被倾注入普氏培养皿（Flow Laboratories）中。
c）第三培养基或生根培养基
把在100毫升B5母液中的10～20克的蔗糖增添入去离子的蒸馏水中，制备成第三培养基。其pH值是通过0.1N苏打而调节到5.0，然后使容积达到1升，并向混合物添加5克的Phytagar琼脂和1克的活性碳。在经过高压灭菌器之后，将培养基注入马氏罐
（Mason jars）中。如果希望利用含有AIA的一种第三培养基，则在制备第三培养基时，省掉活性碳。在经过高压灭菌之后，向温和的培养基中增添0.5～1毫升的无菌AIA溶液（0.5～1.14微摩尔）。将培养基按上述同样的方法注入马氏罐中。
第三培养基的一种变体液仅仅包括B5无机盐类和1%的蔗糖（pH值为5.0），根据钱德勒（Chandler）和比尔德（Beard）所描述的方法[作物科学（Crop.Sci.，1983，23，1004）]，将混合物按每份10毫升分配在含有滤纸桥的玻璃管内，然后通过高压灭菌器。
实例Ⅲ
带果皮的未成熟胚胎是从向日葵（Helianthus annuus，Var.T 76 B）的头状花序分离出来，当它们达到0.5～1.5毫米时。种子在3°Cl（氯量测定度）的次氯酸钠（或钾）消毒液中进行灭菌20分钟，并以蒸馏水洗涤之。未成熟的胚胎与其胞质鞘（被膜）分离，并放置于陪替氏培养皿内第一培养基上。第一培养基是按上述方法用90克/升的蔗糖和0.5毫克/升的BAP（2.2微摩尔）进行制备的。
陪替氏培养皿是在黑暗中培育3周以便诱导体细胞胚胎的形成。
在此阶段，开始萌发的体细胞胚胎是与合子胚胎分离的，并放置于第二培养基上（在普氏培养皿内）。如上所述那样制备的第二培养基含有0.1毫克/升的BAP，即0.44微摩尔。胚胎在光照下培育3周，且分化成胚芽。
接着，将高度为2～5厘米的胚芽转移到第三培养基上以促使根部的形成。如前文所述那样制备的第三培养基较好地含有10克的蔗糖。在胶凝化培养基的场合下，1克/升的活性碳的添加消除了由前一培养基提供的BAP的残留影响[马埃讷（Maene）和德培尔格（Debergh），植物细胞组织器官培养（Plant Cell Tissue OrganCulture，1985，5 23～33）]，且有利于根部的迅速生长。约经2周之后，
胚芽可以转移入土。
如果胚芽已开始在第二培养基上发育根部，根据钱德勒（Chandler）和比尔德（Beard）所叙述的技术[作物科学（Crop.Sci.，1983，23，1004）]它们可与液体的第三培养基接触这种处置可使根系得到大量发育，并避免在迁移入土时伤害根部。
实例Ⅳ
向日葵（Helianthus annuus，var，HA 89）的未成熟胚胎达到0.1～0.5毫米时被提取，并带着内胚乳放置于第一培养基上。第一培养基每升含有90克的蔗糖和0.5毫克的BAP（即2.2微摩尔）。经在黑暗下3周之后，体细胞胚胎被分离和放置于新鲜的第一培养基上，始终是处于黑暗之下。次级体细胞就在分离的胚胎上形成。在黑暗下经3周之后，次级体细胞胚胎被分离，且置于第二培养基上。第二培养基每升含有30克的蔗糖和0.1毫克的BAP（即0.44微摩尔）。
接着可把即将发育的胚芽，转移到第三培养基上（液体的或胶凝化的）以便生根。然后，将其迁移入土中。
实例Ⅴ
向日葵（Hel anthus annuus，var.HA 89）的未成熟胚胎在授粉后21天时提取;它们具有5毫米的尺寸。它们与其胞质鞘（被膜）分离，以及在放置于第一培养基上之前，按它们之间彼此垂直且平行于胚芽-胚根轴的两个平面纵向地把未成熟的胚胎切割成四等份。在此情况下，第一培养基每升含有90克的蔗糖和1毫克的BAP。经3周处于黑暗下之后，体细胞胚胎被分离并置放在第二培养基上。第二培养基每升含有30克的蔗糖和0.5毫克的BAP。
然后把即将发育的胚芽转移到第三培养基上（液体的或胶凝化的）以便生根，接着，迁移入土。尚未发根的胚芽可嫁接在新生的植物株上，这是根据哈培尔曼（Habormaun）和弗拉斯（Wallace）阐述
的[美国植物学杂志（Amer.J.Bot.，1958，45，479）]方法。实例6-27
以下实例给出组合的不完整概念，我们可以利用所描述的各种不同的方式来实行。
Claims (7)
1、从细胞或未成熟胚胎组织出发，通过体细胞胚胎发生法使向日葵的栽培品种(Helianthus annuus)再生的方法，该细胞或未成熟胚胎组织的育龄为4-21天、尺寸在0.1-5毫米之间，且可切割成可再生的数个片段，所述的方法相继地包括；
一在一诱导培养基中向日葵组织的培养阶段，该诱导培养基含有一种激素以使胚胎发生愈伤组织和细胞胚胎形成以及所述胚胎的生长，且它含蔗糖浓度为8-12%，6-苄氨基嘌呤浓度为2.2-4.4微摩尔；
一一个能使所述胚胎萌发及发育成可能具有根部的植株的培养的第二阶段；在所谓胚芽生长培养基上，该培养基中蔗糖浓度为2-4%，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.44-2.2微摩尔；
一可能还有一个在所谓生根培养基上使所述植株的根部生长或形成的第三阶段；
其特征在于：头两个阶段是在一种同一性质的培养基上实行的，此培养基含有一种有效量的细胞激动素型激素。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于：使用含有维生素类和氨基酸类补充液的一种穆拉希格和斯库格（MS）型培养基作为第一培养基。
3、根据权利要求1或2的方法，其特征在于：第二培养基含有无机盐类、维生素类和一种氨基酸，上述无机盐类、维素素和一种氨基酸的量相同于第一培养基的量，而无维生素和氨基酸类的补充。
4、根据权利要求1到3之一的方法，其特征在于：使用向日葵栽培品种T76、RT26、HA89、HA290、HA291、HA300、HA303或Gi-ant Gray Stripe。
5、根据权利要求1和4的方法，其特征在于：第二阶段之后，对所提植株是进行根部诱导培养。
6、根据权利要求1～5之一的方法，其特征在于：在第二阶段之后，持有根部的植株被迁移入土，并培育于15℃的人工气侯室内，所使用的具光强度为6，000勒克司，光周期为每天15小时。
7、根据权利要求1～4之一的方法，其特征在于：在第二阶段之后，对所得植株进行嫁接。
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