CN101906163B

CN101906163B - 一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用

Info

Publication number: CN101906163B
Application number: CN2009100525954A
Authority: CN
Inventors: 徐晨; 吕正梅; 王旻
Original assignee: Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Shanghai Jiao Tong University
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CN101906163A

Abstract

本发明涉及一种免疫避孕的合成肽，所述的免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：1所示。免疫避孕的合成肽hESP_103-107，其氨基酸序列如序列表中SEQID：2所示。免疫避孕的合成肽hIzumo_216-220，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：3所示。本发明还提供了嵌合肽、合成肽hESP_103-107或合成肽hIzumo_216-220作为免疫避孕疫苗，观察了它们在避孕中的应用。本发明首次研究了由精子蛋白hESP、hIzumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组成的嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果。

Description

一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用

【技术领域】

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用。

【背景技术】

避孕原理，就是用科学的方法来阻止和干扰正常受孕过程中的某些环节，以避免怀孕，防止生育。目前所采用的避孕方法很多，国内外用于免疫节育的现有技术有：①抗促性腺激素释放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)疫苗；②抗卵透明带(ZP)蛋白疫苗；③抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗；④抗精子表面抗原疫苗。以上避孕方法存在：内分泌平衡和性功能紊乱、引起自身免疫性疾病、节育效果差等缺点。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种免疫避孕的嵌合肽。

本发明的再一的目的是，提供一种免疫避孕的合成肽hESP_103-107。

本发明的另一的目的是，提供一种免疫避孕的合成肽hIzumo_216-220。

本发明的另一的目的是，提供嵌合肽，合成肽hESP_103-107和合成肽Izumo_216-220的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：1所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种免疫避孕的合成肽ESP，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：2所示。

所述，免疫避孕的合成肽hESP_103-112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：4所示。

所述，免疫避孕的合成肽hESP_98-112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：5所示。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种免疫避孕的合成肽hIzumo_216-220，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：3所示

所述，免疫避孕的合成肽hIzumo_212-221，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：6所示。

所述，免疫避孕的合成肽hIzumo_212-227，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：7所示。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

嵌合肽，合成肽hESP_103-107或合成肽Izumo_216-220作为免疫避孕疫苗，在避孕中的应用。

需要说明的是，SEQ ID：1序列是NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGGTSIERLTETK GGG KGKEATLTKP；SEQ ID：2序列是TGGFT；SEQ ID：3序列是ATLTK；SEQ ID：4序列是TGGFTPEIGK；SEQ ID：5序列是TTTFPTGGFTPEIGK；SEQ ID：6序列是KGKEATLTKP；SEQ ID：7序列是KGKEATLTKPMVGPED。

本发明优点在于：

1，发明了精子蛋白hESP与UU436蛋白之间存在交叉反应抗原；

2，发明了短肽hESP_103-107具有抗生育作用；

3，发明了人精子蛋白hIzumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原ATLTK；

4，发明了短肽hIzumo_212-227具有抗生育作用，而UU474蛋白没有明显抗生育作用；

5，本发明首次研究了由精子蛋白hESP、hIzumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组成的嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果。

【附图说明】

图1：十五肽pp1/pp2/pp3/pp4的原核融合表达，十五肽pp1/pp2/pp3/pp4重组融合表达载体pTSA18-stv，通过E.coli原核表达后，经15％SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色。泳道M：蛋白markers；泳道1：诱导前全菌裂解物；泳道2，3，4，5：依次为pp1/pp2/pp3/pp4诱导后全菌沉淀裂解物。

图2：Western blot分析鉴定融合表达十五肽pp1-stv/pp2-stv/pp3-stv/pp4-stv交叉反应性，泳道0：空载体pTSA18-stv诱导全菌裂解物；泳道1，2，3，4：依次为融合肽段pp1-stv/pp2-stv/pp3-stv/pp4-stv诱导后全菌裂解物，上样量2μl/孔，兔anti-mESP-P1多抗，1∶8000；泳道5，6，7，8：依次为肽段pp1-stv/pp2-stv/pp3-stv/pp4-stv诱导后全菌裂解物，上样量2μl/孔，兔免疫前血清，1∶8000。

图3：rUU436蛋白的原核表达纯化，rUU436蛋白原核表达，亲和层析纯化后，分段收集各部洗脱液，经15％SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色，泳道M：蛋白marker；泳道1：最后洗脱液即蛋白样品；泳道2-5：前段洗脱液，含较多杂蛋白。

图4：Western blot分析鉴定rUU436蛋白与anti-rmESP-P1交叉反应性，rUU436蛋白，经15％SDS-PAGE分离后转PVDF膜，与兔anti-mESP-P1免疫反应，ECL显示。泳道1，2：兔anti-mESP-P1多抗1∶8000；泳道3，4：兔免疫前血清；泳道2，4：rUU436蛋白；泳道1，3：无抗原样品。

图5：ELISA检测免疫后小鼠血清中抗合成肽hESP_98-112和抗rUU436抗体，合成肽hESP_98-112及rUU436蛋白免疫小鼠抗血清及免疫前血清作为一抗，1∶100稀释，测定吸光值。

图6：ELISA检测合成肽hESP_98-112免疫后兔兔血清中anti-peptide抗体效价。

图7A：Western-blot验证兔anti-peptide抗体交叉反应性，泳道1，3：rUU436；泳道2，4：rmESP-P1；泳道1，2：兔anti-peptide抗体，1∶2000；泳道3，4：兔免疫前血清，1∶2000。

图7B：Western-blot验证兔ant i-pept ide抗体交叉反应性，泳道1，2：人精子蛋白提取物；泳道3，4：小鼠精子蛋白提取物；泳道1，3：兔anti-peptide抗体，1∶2000；泳道2，4：兔免疫前血清，1∶2000。

图8：Western-blot验证兔anti-rUU436抗体交叉反应性，泳道1，4：rUU436；泳道2，5：rmESP-P1；泳道3，6：小鼠精子蛋白提取物；泳道1，2，3：小鼠anti-rUU436抗体，1∶2000；泳道4，5，6：小鼠免疫前血清，1∶2000。

图9：竞争性ELISA验证共同抗原TGGFT为BCE。

图10：间接免疫荧光技术检测兔anti-peptide抗体与人精子免疫反应(标尺＝5μm)，A，B，C：兔抗-peptide免疫后血清，1∶50；A1，B1，C1：兔免疫前血清；FITC标记的羊抗兔IgG(1∶500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，A1：荧光图像；B，B1：光镜图像；C，C1：荧光与光镜复合图。

图11：间接免疫荧光技术检测兔anti-peptide抗体与小鼠精子免疫反应(标尺＝5μm)，A，B，C：兔抗-peptide免疫后血清，1∶50；A1，B1，C1：兔免疫前血清；FITC标记的羊抗兔IgG(1∶500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，A1：荧光图像；B，B1：光镜图像；C，C1：荧光与光镜复合图。

图12：间接免疫荧光技术检测小鼠anti-rUU436抗体与小鼠精子免疫反应(标尺＝5μm)，A，B，C：小鼠anti-rUU436免疫后血清，1∶50；A1，B1，C1：小鼠免疫前血清，1∶50；FITC标记的羊抗兔IgG(1∶500)检测，激光扫描共聚焦显微镜观察；A，A1：荧光图像；B，B1：光镜图像；C，C1：荧光与光镜复合图。

图13：抗合成肽hESP_98-112抗体及抗rUU436抗体对小鼠体外精-卵黏附影响。

图14：抗合成肽hESP98-112抗体及抗rUU436抗体对小鼠体外精-卵融合影响。

图15：兔抗合成肽抗体对小鼠体外精-卵相互作用影响，获能小鼠精子用兔抗合成肽抗血清(1∶10)预处理后，与小鼠去透明带卵子共孵育，经Hoechst33342(10μg/ml)染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图：荧光图像，右图：相差图像。

图16：兔免疫前血清对小鼠体外精-卵相互作用影响(对照)，获能小鼠精子用兔免疫前血清(1∶10)预处理后，与小鼠去透明带卵子共孵育，经Hoechst33342(10μg/ml)染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图：荧光图像，右图：相差图像。

图17：Stv-Izumo(Izumo_212-216，Izumo_216-220，Izumo_220-224)融合蛋白表达结果，Stv-Izumo(Izumo_212-216，Izumo_216-220，Izumo_220-224)融合蛋白在BL21(DE3)细菌中获得表达，通过15％SDS-PAGE电泳后，经考斯亮蓝染色分析。M：低分子量蛋白标准；1：Stv-Izumo_220-224；2：Stv-Izumo_216-220；3：Stv-Izumo_212-216；4：Stv-β8。

图18：Western blot分析B细胞表位，T0：Stv-β8不与anti-PB反应；T1：Stv-Izumo_220-224与anti-PB有弱反应；3：Stv-Izumo_216-220与与anti-PB有强反应；4：Stv-Izumo_212-216与anti-PB有弱反应。

图19：目的基因片段PCR扩增结果，M:DNA分子ladder；1：UU474(524bp)。

图20：UU474蛋白的表达和纯化结果，UU 474蛋白在BL21(DE3)细菌中获得表达，通过15％SDS-PAGE电泳后，经考斯亮蓝染色分析。M：低分子量蛋白标准；1：诱导前全菌；2：诱导后全菌；3：经Ni2+-NTA His-柱纯化后蛋白。

图21：抗血清效价滴度散点图，注：抗原用96孔板包被，抗血清的效价用Anthos Zenyth 1100 Multimode酶标仪检测，Izumo_212-227、UU474的抗血清在A485处吸光度的值明显高于免疫前血清(control)。

图22：Western blot的方法验证精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反应，1：anti-Izumo_212-227IgG能够与PB蛋白发生较强的反应；2：UU474蛋白与anti-Izumo_212-227IgG有较弱的反应。

图23：Western blot验证anti-UU474IgG或anti-Izumo_212-227IgG与人精子蛋白的交叉反应，1：免疫前血清为一抗；2：anti-Izumo_212-227IgG为一抗；3：anti-UU474IgG为一抗。

图24：人精子涂片间接免疫荧光定位，(a)anti-Izumo_212-227IgG荧光染色定位；(c)为a的自然光状态；(b)anti-CD46IgG荧光染色定位；(d)为a和b的重叠状态(比例尺：5μm)。

图25：人精子涂片间接免疫荧光定位，(a)anti-UU474IgG荧光染色定位；(c)为a的自然光状态；(b)anti-CD46IgG荧光染色定位；(d)为a和b的重叠状态(比例尺：5μm)。

图26：人精子涂片间接免疫荧光定位(免疫前血清)(e)免疫前血清荧光染色定位；(g)为a的自然光状态；(f)anti-CD46IgG荧光染色定位；(h)为a和b的重叠状态(比例尺：5μm)。

图27：小鼠精卵结合与精子穿卵实验结果，获能的小鼠精子和用不同浓度稀释的抗血清IgG及免疫前血清共孵育后，与去透明带的小鼠卵子孵育；(A)：不同浓度稀释的anti-Izumo_212-227IgG的精-卵融合实验；(B)：不同浓度稀释的anti-UU474IgG的精-卵融合实验；以免疫前血清处理组为对照，精-卵融合率在共聚焦显微镜下观察。Bars代表标准误。(N＝每组卵子的数目)。

图28：ELISA检测免疫后不同时间小鼠血清中anti-CP1抗体，以1μg/孔CP1包被96孔聚苯乙烯板，免疫小鼠结束后1周及第5周、第8周自眼内眦静脉取血，血清1∶100稀释作为一抗，测450nm吸光值，设免疫前血清及对照组血清为阴性对照。

图29：ELISA检测免疫后兔血清抗CP1抗体，以1μg/孔CP1包被96孔聚苯乙烯板，兔免疫后血清倍比稀释，检测兔血清中抗CP1抗体效价。

图30：ELISA检测CP1免疫后小鼠血清中各表位抗体，以0.5μg/孔重组小鼠精子蛋白rmESP-P1、rmtNASP、rmIzumo包被96孔聚苯乙烯板，CP1免疫后血清作为一抗，1∶500稀释，测450nm吸光值，设免疫前血清为对照。结果显示CP1免疫后血清与rmESP-P1，rmtNASP有明显免疫反应，与rmIzumo没有阳性反应。

图31：Western-blot分析兔抗CP1抗体与原重组原蛋白交叉反应，泳道1，4：rmIzumo；泳道2，5：rmESP-P1；泳道3，6：rmtNASP；泳道1，2，3：兔anti-CP1免疫后血清，1∶2000；泳道4，5，6：兔免疫前血清，1∶2000。

图32：Western-blot分析兔抗CP1抗体与精子蛋白提取物交叉反应，泳道1，3：人精子蛋白提取物上样60μg/孔；泳道2，4：小鼠精子蛋白提取物上样50μg/孔；泳道1，2：兔anti-CP1血清，1∶2000；泳道2，4：免疫前兔血清1∶2000。

图33：兔抗CP1抗体对小鼠体外精-卵黏附影响，Bars代表mean±SEM；Bars上方的数字代表每组平均卵子数；*p＜0.05。

图34：兔抗CP1抗体对小鼠体外精-卵融合影响，Bars代表mean±SEM；Bars上方的数字代表每组平均卵子数；*p＜0.05。

图35：兔抗CP1抗体对小鼠体外精-卵相互作用影响，获能小鼠精子用兔抗CP1抗血清(1∶10稀释)预处理后，与超排小鼠卵子共孵育，经Hoechst 33342(10μg/ml)染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图：荧光图像，右图：相差图像。

图36：兔免疫前血清对小鼠体外精-卵相互作用影响(对照)，获能小鼠精子用兔免疫前血清(1∶10稀释)预处理后，与超排小鼠卵子共孵育，经Hoechst33342(10μg/ml)染色后；压片，置激光扫描共聚焦显微镜观察，左图：荧光图像，右图：相差图像。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

ESP蛋白与溶脲脲原体交叉反应抗原对生育的影响

一，材料

1.1实验动物及标本

6月龄(体重约为2.5kg)雌性新西兰大白兔，BALB/c小鼠(8～12W)由上海交通大学医学院动科部购自中科院实验动物中心，正常人精液标本由上海交通大学医学院附属仁济医院人类精子库门诊提供。

1.2主要试剂

寡核苷酸序列及多肽由上海生工生物技术公司合成，钥孔血蓝蛋白(KLH)购自上海生工生物技术公司。质粒pTSA18购自上海市计划生育科学技术研究所。

2.2.1.3实验仪器Mini Protean 3 system SDS-PAGE电泳仪和MiniSemi-Dry Trans Blot转膜仪(Bio-Rad)，LSM-510激光共聚焦显微镜((CarlZeiss LSM-510，Jena，Germany)；Centrifuge 5415R低温离心机(Eppendorf)；CO₂培养箱(SANYO)；全自动精液分析仪(Hamilton-Thorn)。

二，方法

2.1Western blot鉴定ESP_7-242与UU交叉反应抗原

1.化学合成寡核苷酸单链

化学合成hESP蛋白中十五肽(包含共同五肽，下划线标识)编码寡核苷酸序列正义链、反义链各1OD。pp1：QVLENLVRSVPSGEP(aa38-52)

pp2：STENDVLTNPISEET(aa84-98)

pp3：TTTFPTGGFTPEIGK(aa98-112)

pp4：NVSIVLHAEEPYIEN(aa128-142)

两端分别加上SalI和BamHI酶切位点黏性末端。

2.退火

正义链，反义链各取10μl，终浓度5μM，95℃5min变性，自然恢复到室温退火。

3.构建重组十五肽融合表达载体

退火产物连接双酶切过的载体pTSA18-stv。反应体系如下：pTSA18-stv1μl，退火产物5μl，Ligation Solution Buffer 1.5μl，T₄DNA连接酶1μl，dd H₂O 6.5μl。总反应体系为15μl。16℃孵育8h。

取连接产物5μl转化E.coli DH5a感受态菌，取100μl转化产物均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平皿。37℃培养12～14h。挑出单个菌落至5mlLB培养基(含Amp)中。将试管在摇床中以250rpm，37℃摇菌过夜。取过夜菌1.5ml用质粒小量抽提试剂盒进行抽提质粒，即获得重组融合表达载体。

4.诱导融合表达十五肽

取1μl小抽质粒转化BL21(DE3)感受态菌，转化产物均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平皿。37℃培养12～14h。

挑出单克隆菌落至已加入5ml LB培养基(含Amp)的试管中。将试管在摇床中以250rpm，37℃摇菌过夜。取过夜菌100μ接种到5ml LB培养基(含Amp)的试管中，280rpm，37℃摇菌至OD值0.6～0.8，超净台中取出1ml菌液作为阴性对照。加入1mM IPTG 37℃继续摇菌4h诱导表达。设空载质粒为对照。

取1ml诱导后菌液及诱导前菌液离心6000g 5min，沥干培养基获取沉淀即菌体，加入400μl ddH₂O重悬细菌沉淀，取20μl全菌蛋白样品加入5μl5×变性蛋白上样缓冲液，经95℃，10min变性，；15％SDS-PAGE，120V恒压电泳约2h，直到染料走到胶底。

考马斯亮蓝R-250染色，脱色液脱色至条带清晰，观察诱导表达结果。

5.Western blot分析融合表达十五肽与抗mESP-P1抗体交叉反应性

取2μl全菌蛋白样品进行15％SDS-PAGE，按前述实验方法转PVDF膜，进行Western blot分析。以抗mESP蛋白重组片段P1抗体(anti-mESP-P1)为一抗，设空载质粒诱导表达产物及诱导前全菌蛋白为阴性对照。检测抗anti-mESP-P1抗体与上述十五肽的交叉反应情况。

2.2合成短肽

十五肽TTTFPTGGFTPEIGK(hESP_98-112)由上海生工生物技术公司合成。部分耦联KLH作为抗原免疫动物，少量不耦联KLH作为抗原用于EILSA检测抗体效价。

2.3克隆、表达rUU436蛋白

取血清-8型UU培养产物，用水煮法(95℃，10min)获得其总DNA作为模板。由于TGGFT位于UU436蛋白aa90-94，截短蛋白片段克隆表达aa78-246(UU436_78-246)，包含TGGFT，UU436_78-246的PCR扩增引物sense：5’GC-GGATCCattaaaaattttgttatagctgat3’，antisense：5’GC-CTCGAGttcatgcttttgtaaaaatatcat 3’，目标片段长507bp。GGATCC为BamH I酶切位点，CTCGAG为Xho I酶切位点。克隆、构建、扩增带有His标签的重组表达载体pET-28a(+)。重组表达载体pET-28a(+)转化E.coli BL21(DE3)，15％SDS-PAGE电泳分析确认目标蛋白是否表达。通过Western blot分析rUU436_78-246蛋白片段与anti-mESP-P1的交叉反应性。

rUU436_78-246蛋白大量表达及Ni²⁺-NTA-His亲和层析纯化实验操作步骤：

按Ni-NTA柱亲和层析试剂盒说明书对表达的重组目的蛋白进行纯化。将菌液离心10000rpm×10min，收取菌体沉淀。用双蒸水重悬沉淀，冰上超声破菌，再次离心10000rpm×10min，弃上清。每克沉淀加Lysis Buffer B 5ml，将沉淀重悬于Buffer B裂解，吸出上清备用。裂解产物上清过Ni-NTA柱，弃滤液。Wash Buffer C洗脱柱中杂蛋白，4ml×3次，收集每次的流出液。Elution Buffer D洗脱柱中目的蛋白，1.5ml×4次，收集每次的流出液。BufferE洗脱柱中目的蛋白，1.5ml×4次，收集每次的流出液。10ml Buffer B平衡柱子，柱子放4℃保存，可重复使用。15％SDS-PAGE鉴定流出液中是否含有目的蛋白。

2.4抗血清制备

用耦联KLH的合成肽hESP_98-112作为免疫原，免疫新西兰雌性大白兔，按前述实验方法进行，免疫接种三次，每次接种抗原量约0.8mg。第一次接种后第35天自颈动脉放血获取免疫后血清。

2.5小鼠交配实验

经过生育能力验证的BALB/c雌、雄小鼠(10～12W)用于本实验，随机分组。耦联KLH的合成肽hESP_98-112和纯化的rUU436蛋白作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。每次接种抗原量约100μg，共三次。具体步骤见第一章。第一次接种后第35天自眼内眦静脉取血获取免疫后血清，并合笼交配，雌雄比例为2∶1，合笼一周。定期称量雌鼠体重监测怀孕情况，计数孕鼠产仔数。

2.6竞争性ELISA

参考其他实验，anti-mESP-P1抗体1∶1000稀释，与不同浓度(0.1～1mM)合成肽hESP_98-112共孵育，37℃1h。将吸收处理后的抗体作为一抗，与预先包被重组mESP-P1的96孔聚苯乙烯板反应，按前述ELISA实验步骤操作。另设两组对照：一组同样稀释度但未经处理的anti-mESP-P1抗体作为阳性对照；另一组anti-mESP-P1抗体以不同浓度(0.1～1mM)的重组mESP-P1片段同样孵育吸收后作为一抗进行ELISA，测定吸光值。计算未被吸收的残余抗体百分率。

2.7Western blot分析

重组rUU436蛋白和mESP-P1片段及精子全蛋白提取物进行SDS-PAGE，以抗合成肽hESP_98-112(anti-peptide)血清及抗rUU436(anti-rUU436)血清作为一抗，按前述方法进行Western blot，分析anti-peptide抗体及anti-rUU436抗体的特异性及交叉反应性。

2.8人和小鼠精子涂片间接免疫荧光染色

将正常人精液标本37℃，30min液化后，离心(1000g，15min)弃精浆。用45％Percoll上层离心法分离精子，1000g，15min。最后用PBS重悬洗涤两次，用于制作精子涂片。小鼠附睾尾部精子涂片制作方法如下：顶体反应后精子制备：10～12周龄BALB/c雄性小鼠颈椎脱臼处死，取出附睾尾部，置于预热的M16(含3％BSA)中，用手术剪将组织稍微剪切后，于37℃，5％CO₂培养箱中静置30min后(精子会从附睾尾部组织中自动游出)，随后加入A23187(5μM)继续于37℃，5％CO₂培养箱中孵育1.5h诱导顶体反应。将上述不同的精子即附睾尾部精子和顶体反应后精子分别涂片，室温晾干。以anti-peptide抗体及anti-rUU436抗体为一抗，1∶50稀释，以FITC标记羊抗兔IgG为二抗，进行人和小鼠精子间接免疫荧光染色，以免疫前血清为阴性对照，实验方法：预冷的丙酮固定15min。PBS柔和冲洗。用含5％BSA的PBS于室温封闭1h。以抗P1/P2/P3兔血清为一抗，1∶500稀释，4℃孵育过夜。兔免疫前血清作为阴性对照，不加一抗的样品作为空白对照。PBS柔和冲洗，以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，1∶500稀释，37℃孵育1h。柔和冲洗后PBS封片，激光扫描共聚焦显微镜下观察。

2.9小鼠精子体外穿卵实验

小鼠超排卵、配子准备及体外穿卵实验步骤

1.卵子获取

8～10周龄BALB/c雌性小鼠腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)，48h后注射等剂量的hCG，15～16h后从输卵管壶腹部取卵。

2.精子获取及抗体处理

10～12周龄BALB/c雄性小鼠颈椎脱臼处死，取出附睾尾部，置于预热M16(含3％BSA)中，用手术剪将附睾组织稍微剪切后，于37℃，5％CO₂培养箱中静置10min，用上游法制备精子悬液，调精子密度为1.0×10⁶/ml，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育1h，加入Ca²⁺诱导A23187溶液，使终浓度为5μmol/L，继续孵育20min。分别用不同稀释浓度的anti-P1、anti-P2、anti-P3抗血清及免疫前血清与获能精子共孵育30min。血清使用前用56℃，30min灭活补体。

3.小鼠精子体外穿卵实验

将去透明带卵细胞与不同处理的精子悬液于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育3-4h后，吸出卵细胞，去除松散地附着在卵细胞上的精子，2％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后Hoechst 33342(10μg/ml)染色，37℃，15～20min；PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共聚焦显微镜观察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判断精卵融合的标准为：卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。

抗合成肽血清及抗rUU436血清56℃30min灭活补体，以不同稀释度1∶10，1∶20，1∶100与精子共孵30min。处理后精子再与去透明带小鼠卵子共孵育37℃，5％CO₂，3-4h。去除松散地附着在卵细胞上的精子，2％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤后Hoechst 33342(10μg/ml)染色15～20min；PBS洗涤后置载玻片压片，激光扫描共聚焦显微镜观察。倒置相差显微镜下计数黏附于卵膜的精子数，荧光镜下观察精卵融合，判断精卵融合的标准为：卵细胞内看到膨胀的精子头部或原核。实验共重复3次。

2.10统计学分析

体外实验重复三次以上，各组结果以均数±标准误(mean±SEM)表示。小鼠交配实验产仔数以均数±标准差(mean±SD)表示。实验组与对照组差异采用团体t检验，运用SAS6.12软件进行统计学分析，p＜0.05认为有统计学意义。

三，结果

1hESP与UU蛋白的共同五肽及与小鼠ESP(mESP)序列同源性比较

生物信息学技术搜索Swiss-prot数据库，分析发现hESP蛋白的N-端(aa7-243)与UU蛋白有五个共同五肽，与对应位置的mESP序列有程度不等的同源性。hESP蛋白aa41-45与UU488aa135-139有共同五肽ENLVR；对应于mESP的QNLIM，40％一致性，20％相似性。hESP的aa87-91与UU019aa180-184有共同五肽NDVLT；对应于mESP的SDVLI，60％一致性，20％相似性。hESP的aa103-107与UU436aa90-94有共同五肽TGGFT；对应于mESP的TRGFT，80％一致性。hESP的aa123-127与UU301aa79-83有共同五肽SIKPN。人的CASC5蛋白(Cancer susceptibility candidate gene 5protein)也有五肽SIKPN(aa1582-1586)，mESP为SIRPN，80％一致性，20％相似性。CASC5高表达于睾丸内的精子细胞，也可在其他组织检测到表达，因此不适合作为免疫避孕研究。hESPaa129-133与UU513aa44-48有共同五肽VSIVL；对应于mESP的ISVVL，60％一致性，40％相似性。人PKDREJ蛋白(Polycystic kidney disease and receptorfor egg jelly-related protein)也有五肽VSIVL(aa1077-1081)。PKDREJ蛋白只表达于睾丸，可能通过形成钙离子通道启动顶体反应而在受精过程中发挥重要作用。

2交叉反应抗原鉴定

化学合成包含共同五肽的十五肽PP1(含ENLVR)，PP2(含NDVLT)，PP3(含TGGFT)，PP4(含VSIVL)的寡核苷酸链，变性、退火后形成双链，通过酶切位点黏性末端与载体pTSA18连接构建重组表达载体。经克隆扩增、IPTG诱导，十五肽与链霉亲和素(stv)融合表达表达，SDS-PAGE分析诱导前后全菌蛋白显示近11kDa处有新条带(图1)。以抗重组mESP的P1肽段的抗体(anti-rmESP-P1)为一抗，以融合表达十五肽为抗原，通过Western blot分析二者的交叉反应性。结果显示PP3与anti-rmESP-P1抗体免疫反应最强，PP3包含hESP的aa103-107与UU436的aa90-94之间的共同五肽TGGFT；提示共同五肽TGGFT为交叉反应抗原(图2)。

3UU436蛋白克隆表达

SDS-PAGE分析UU436蛋白表达，分子量19kDa，由于重组蛋白带有His标签，故实际分子量略大于理论分子量。与诱导前细菌相比，诱导后全菌裂解物在预计位置有蛋白表达条带，但表达量不够高，经亲和层析纯化获得目标蛋白(图3)。Western blot分析anti-rmESP-P1抗体与rUU436蛋白的交叉反应性，包含TGGFT的rUU436片段出现免疫反应条带，诱导前菌总蛋白、免疫前血清对照无免疫反应条带(图4)。这个结果说明rUU436蛋白可以与anti-rmESP-P1抗体发生交叉反应。

4合成十五肽hESP_98-112及rUU436蛋白免疫后血清抗体效价检测

利用化学方法合成十五肽hESP_98-112，首先要预测合成肽的亲水性、抗原性及表面可及性。为此我们用DNAstar分析软件对hESP的N-端进行分析，显示hESP_98-112具备良好的亲水性、抗原性及表面可及性。合成肽耦联KLH以增强免疫原性，免疫兔及小鼠后获得的血清抗体经ELISA测定效价。以免疫前血清作对照，以rUU436和未耦联KLH的十五肽hESP_98-112作为抗原包被96孔ELISA板。免疫后小鼠及兔血清均产生特异性抗体，兔血清抗体效价约1∶10000(图5，6)。

5抗合成肽hESP_98-112抗体及抗rUU436抗体的交叉反应性

以抗合成肽hESP_98-112兔血清为一抗，以rmESP-P1、人及小鼠精子蛋白提取物为抗原，进行Western blot分析，在目标蛋白位置处有阳性反应条带，rmESP-P1、rUU436分子量分别约为25kDa，24kDa，hESP和mESP理论分子量分别为38kDa，45kDa(图7A，图7B)。说明合成肽hESP_98-112产生的抗体有特异性，能识别原重组和天然蛋白mESP。

以抗rUU436血清为一抗，以rUU436、rmESP-P1及小鼠精子蛋白提取物为抗原，进行Western blot分析，在目标蛋白位置处有阳性反应条带，rmESP-P1、rUU436分子量分别约为25kDa，24kDa，mESP理论分子量为45kDa(图8)。结果说明anti-rUU436抗体即能识别rUU436蛋白，也与mESP具有交叉反应性。

6交叉反应抗原TGGFT为BCE

为了进一步验证UU436蛋白和hESP蛋白的交叉反应抗原TGGFT是否为BCE，以rmESP-P1包被ELISA板作为抗原，将不同浓度的合成肽与anti-rmESP-P1孵育吸收后作为一抗。另一组以同样浓度的rmESP-P1孵育吸收抗体作为对照。测吸光值与未经吸收抗体免疫反应的吸光值之比值计算残余抗体百分率(图9)。竞争性ELISA显示合成肽能部分中和anti-rmESP-P1抗体，说明合成肽具有模拟表位功能，能与anti-rmESP-P1发生免疫反应，TGGFT为线性BCE。

7间接免疫荧光检测

人射出精子和小鼠附睾尾精子涂片后，以兔anti-peptide抗体及小鼠anti-rUU436抗体为一抗，进行间接免疫荧光染色。结果显示人和小鼠精子赤道段有特异性荧光信号，分别与hESP和mESP蛋白定位一致。尾部和头部其他区域没有荧光信号，免疫前血清对照结果也是阴性的(图10，11，12)。说明合成肽hESP_98-112产生的抗体能识别人和小鼠精子内天然ESP蛋白。anti-rUU436抗体与小鼠精子蛋白ESP也具有交叉反应，但与人精子提取物无特异性反应条带。

8抗合成肽hESP_98-112抗体对小鼠精-卵相互作用影响

用不同浓度稀释anti-peptide、anti-rUU36抗血清及免疫前血清处理获能小鼠精子后，与去透明带的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能力的变化。与免疫前血清相比，1∶10稀释的抗血清处理精子后，每个卵子的平均结合和融合精子数明显减少。1∶20稀释的anti-peptide抗血清也能抑制精卵融合。当稀释度增大时，对精子与卵子的黏附和融合无显著影响(图13，14，15，16)。这一结果表明抗体抑制作用呈浓度依赖性。不同浓度稀释的抗血清及免疫前血清处理后的精子与对照组比较，精子活力和运动参数没有明显的变化，也没有发生精子凝集现象。

9合成肽hESP_98-112、UU436免疫小鼠后对生育功能影响

合成肽hESP_98-112免疫组雌鼠33.3％(3/9)不育，rUU436免疫组不育率为44.4％(4/9)，而对照组均生育。免疫组的孕鼠平均产仔数也显著低于对照组(表1)。说明合成肽hESP_98-112和rUU436蛋白免疫动物后产生了抗生育作用。

表1合成肽hESP_98-112及重组蛋白rUU436免疫BALB/c雌鼠后对生育影响*p＜0.05

实施例2

UU的UU474蛋白与人精子蛋白IZUMO之间交叉反应抗原的鉴定

1.实验动物及取材：

小鼠体内、体外生殖实验都使用性成熟的且有生育史的雄性和雌性BALB/c小鼠(由中科院上海实验动物中心提供)。

6月龄(体重2.5kg左右)雄性新西兰大白兔，购自上海交通大学医学院动物科学部。

2.主要试剂：

UU液体培养基和固体培养基(上海同济医院铁道部性病重点实验室)；限制性内切酶BamH I、Hind III、EcoR I、T4DNA连接酶、凝胶回收DNA试剂盒、逆转录试剂盒、La Taq酶(大连宝生物公司)；预染低分子量标准蛋白质Marker、低分子量标准蛋白质Marker(Fermentas)；Agorose(Promega)；质粒小量抽提试剂盒(上海华舜公司)；Ni²⁺-His柱(Qiagen)；BCA法蛋白定量试剂盒(Pierce)；ECL荧光染色剂、PVDF膜、抗体纯化PROSEP-A Kit(Millipore)；完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂、anti-hCD46单克隆抗体、Rhodamine(TRITC)羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG、FITC标记羊抗兔IgG、孕马血清(PMSG)、M16液、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、透明质酸酶、蛋白酶K、Hoechst33342、A23187(Sigma)；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Tween-20、TEMED、Tris、BSA、氯化钠、抗生素等一般化学试剂购自上海化学试剂有限公司。

3.主要仪器：

ND-1000紫外分光光度计(NanoDrop)，Mastercycler ep系列PCR仪(Eppendorf)，Anthos Zenyth 1100 Multimode酶标仪(Anthos)，凝胶图像分析系统，Mini Protean 3 system SDS-PAGE电泳仪和Mini Semi-Dry TransBlot转膜仪、1000/500型电泳仪和转移仪(Bio-Rad)，J2-21型高速离心机(Beckman)，LSM-510激光共聚焦正置双光子显微镜(Carl Zeiss)。

2.2.2实验方法

2.2.2.1UU培养：

①将在-20℃冻存的UU标本在37℃水浴锅中复苏。

②取100μl接种于pH 5.5～6.5含有1％酚红和0.1％尿素的1ml UU液体培养基中，37℃培养16～24h，观察颜色变化，指示剂由橘黄色变为橙红色，并且培养基澄清，表明UU生长。

③取100μl UU悬液转种于固体培养基中，95％空气和5％CO₂，37℃恒温箱内培养36～72h后，在低倍镜下观察菌落呈“油煎蛋”状。

④经液体培养基37℃，16～24h培养阳性后，在液体培养基中传代三次扩增。

2.2.2.2重组Izumo蛋白的Ig-like结构域(PB)蛋白的质谱鉴定：

①纯化的重组PB蛋白进行SDS-PAGE电泳。

②考马斯亮蓝染色，脱色。

③进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定(Finnigan LCQ Mass spectrometer 4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems，Foster City，CA)。

2.2.2.3用Western blot的方法鉴定Izumo与UU之间的交叉反应抗原是否是B细胞表位：

①根据3个交叉反应抗原Izumo_212-216(KGKEA)、Izumo_216-220(ATLTK)、Izumo_220-224(KPMVG)的肽序列设计3对互补的核苷酸基因序列，分别设计EcoRI/HindIII的粘性末端，3对互补的核苷酸基因序列如下：

Izumo_212-216(KGKEA)正义链：aattcg-AAGGGTAAGGAGGCCTAA-ta

反义链：agctta-TTAGGCCTCCTTACCCTT-cg

Izumo_216-220(ATLTK)正义链：aattcg-GCCACCCTTACCAAGTAA-ta

反义链：agctta-TTACTTGGTAAGGGTGGC-cg

Izumo_220-224(KPMVG)正义链：aattcg-AAGCCAATGGTTGGTTAA-ta

反义链：agctta-TTAACCAACCATTGGCTT-cg

②pTSA18-Stv质粒双酶切：反应体系：10×Buffer M 1.5μl，EcoRI 1μl，HindIII1μl，pTSA18-Stv质粒11.5μl总反应体系为15μl；反应程序：37℃孵育2h；酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳验证；目的片段用胶回收试剂盒回收。

③合成的3对核苷酸引物退火：正义链与反义链用去离子水分别稀释成5μmol/l；退火反应：20μl正义链引物、20μl反义链引物，99℃孵育5min，自然降温到室温。

④退火产物与双酶切的pTSA18-Stv质粒连接：双酶切的pTSA18-Stv质粒1μl，退火产物2μl，Ligation Solution Buffer 1.5μl，T4DNA连接酶1μl，dd H₂O 9.5μl；总反应体系为15μl；反应程序：16℃过夜。

⑤转化入E.coli DH5a感受态菌：连接产物转化DH5a感受态菌，转化产物均匀涂布于含Kan的LB培养板上；37℃培养12～14h；挑出阳性克隆至5ml LB培养基(已加Kan)中；将试管在摇床中以300rpm，37℃孵育过夜；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提。

⑥转化入E.coli BL21(DE3)感受态菌：取1μl小抽质粒转化入BL21(DE3)感受态菌中，转化产物均匀涂布于含Kan的LB培皿；37℃培养12～14h；在超净工作台中，挑出阳性单克隆菌至已加入5mlLB培养基(已加Kan)的试管中；将试管在摇床中以300rpm，37℃孵育5h；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海华大基因公司测序。

⑦诱导表达Stv-Izumo(Izumo_212-216，Izumo_216-220，Izumo_220-224)融合蛋白：取经测序验证的各菌液100μl分别加入5ml LB培养基(已加Kan)的试管中；将试管在摇床中以300rpm，37℃孵育3h，测得OD值为0.5，在超净工作台中取出1ml菌液为诱导前对照；在剩余的菌液中加入4μl IPTG，在摇床中以280rpm，37℃孵育4h后取诱导后菌液1ml；诱导前与诱导后菌液离心13000rpm，30sec；离心后弃上清，加300μl dd H₂O重悬；取诱导前全菌液、诱导后全菌液各80μl，加5×sample buffer 20μl，95℃孵育10min变性，上样，进行SDS-PAGE电泳(120V电压)，直到染料走到胶底；电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker观察诱导效果。

①Western blot：以Stv-Izumo(Izumo_212-216，Izumo_216-220，Izumo_220-224)融合蛋白为样品，进行SDS-PAGE电泳；电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min；将PVDF膜在甲醇中浸润15sec，ddH₂O漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡10min；用湿转法转膜，80V恒压转膜2h；用5％(W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜2h；以anti-PB IgG为一抗(按比例1∶2000用1％脱脂奶粉配)，4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次10min；二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶20000)，室温孵育1h；用TBST洗涤3次，每次10min；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。

2.2.2.4人工合成肽

在上海生工合成肽Izumo_212-227(包含ATLTK)，用血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)偶联增强其抗原性。

2.2.2.5克隆表达UU474蛋白并制备其多克隆抗血清：

①设计克隆UU474第465～638蛋白(包含交叉反应抗原ATLTK)，根据GenBank中Ureaplasma parvum serovar 3 str.(gi 13357558)基因序列设计引物。

UU474蛋白引物序列如下：

UU474蛋白正义链引物：5’GC GGATCC AAT CGT TTG GGA ACT GCT 3’

下划线部分是BamH I酶切位点

负义链引物：5’GC AAGCTT GCT TCT GAT GCG TCA TAA AT 3’

下划线部分是Hind III酶切位点

预期扩增片段为524bp；

②PCR：将UU煮沸10min后释放的总DNA作为模板；PCR体系如下：UUDNA 5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTPMixtrue(200mM)0.5μl，dd H₂O 14μl，Taq酶1μl；总反应体系为25μl；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，循环30cycles；72℃延伸10min，4℃10min；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳验证后，用凝胶回收DNA纯化试剂盒回收。

③克隆：TA克隆：连接体系：pMD-18T Vector 1μl，回收DNA 4μl，SolutionI 5μl，总反应体系为10μl，反应程序：16℃孵育8h；连接产物转化入DH5a感受态细胞；通过X-gal筛选和挑取阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒；质粒双酶切：10×Buffer K 1.5μl，BamH I 1μl，HindIII1μl，小抽质粒11.5μl(pMD-18T-UU474)，总反应体系为15μl；酶切目的片段胶回收产物与pET-28a(+)Vector连接，构建表达载体：pET-28a(+)Vector 1μl，酶切胶回收产物8μl，Ligation Solution Buffer 1.5μl，T4DNA连接酶1μl，dd H₂O 3.5μl，总反应体系为15μl，16℃过夜；连接产物转化入E.coli DH5a感受态细胞；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海华大基因公司测序。

④表达：将pET-28a(+)-UU474转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞；用IPTG，在摇床中以280rpm，37℃孵育4h诱导表达目的蛋白，取诱导前全菌液、诱导后全菌液加5×sample buffer 20μl，95℃孵育10min变性，上样，进行SDS-PAGE电泳(120V电压)，电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker观察诱导效果；按照以上诱导表达过程，诱导250ml菌液表达目的蛋白，用Pierce公司Ni²⁺-NTA柱经亲和层析方法对表达的目的蛋白进行纯化；纯化后蛋白用BCA法定量。

⑤制备多克隆抗体：纯化的重组UU474蛋白和合成肽Izumo_212-227分别免疫一只6月龄(体重为2.5kg)雄性新西兰大白兔，按每只兔子每次0.5～1.0mg的蛋白量来确定免疫蛋白注射体积，方法参照文献；用ELISA法(酶联免疫吸附法)检测兔抗血清效价；用PROSEP-A试剂盒进行抗体纯化。

2.2.2.6精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原的生物学验证：

①以重组PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域)和重组UU474蛋白为样品，进行SDS-PAGE电泳；电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min；将PVDF膜在甲醇中浸润15sec，ddH₂O漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡10min；用湿转法转膜，80V恒压转膜2h；用5％(W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜1h；以anti-Izumo_212-227IgG为一抗(按比例1∶2000用1％脱脂奶粉配)，4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次10min；二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶35000)，室温孵育1h；用TBST洗涤3次，每次10min；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。

②以人精子蛋白(人精子蛋白提取方法同小鼠精子蛋白)为样品进行SDS-PAGE电泳，电泳后，取下凝胶，去除浓缩胶，湿转转膜buffer中浸泡15min；将PVDF膜在甲醇中浸润15sec，ddH₂O漂洗两次，浸入湿转转膜buffer平衡10min；用湿转法转膜，80V恒压转膜2h；用5％(W/V)脱脂奶粉在室温封闭PVDF膜1h；分别以anti-Izumo_212-227IgG和anti-UU474IgG为一抗(按比例1∶2000用1％脱脂奶粉配)，4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次10min；二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶35000)，室温孵育1h；用TBST洗涤3次，每次10min；ECL显色剂显色，曝光后自动洗片仪洗片。

2.2.2.7人精子双标免疫荧光定位：

①正常人精子由仁济医院人类精子库提供，按Mandal的方法通过上游法收集精子。

②收集好的精子悬液置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育1.5h获能，然后加入5μM的Ca²⁺诱导剂A23187继续孵育1h诱导精子的顶体反应。

③顶体反应后的精子被点到涂了多聚赖氨酸的玻片上，自然干燥后，用PBS洗一次。

④用5％BSA室温封闭1h.。

⑤anti-Izumo_212-227IgG(或anti-UU474IgG)和anti-hCD46分别以1∶50的稀释度孵育，阴性对照用免疫前血清孵育，在4℃过夜。

⑥用PBS洗三次后，分别以用1∶200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG和Rhodamine(TRITC)羊抗小鼠IgG在暗盒中孵育2h，再用PBS洗三次后，用50％甘油封片，用激光共聚焦显微镜观察。

2.2.2.8anti-UU474IgG与anti-Izumo_212-227IgG的体外抗生育实验：

①卵子制备：8～10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射10IU孕马血清(PMSG)，48～72h后注射等剂量的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12～16h后从输卵管壶腹部取卵。卵细胞周围颗粒细胞层用0.1％透明质酸酶消化，卵透明带用0.6％蛋白酶K去除。

②精子获能及抗体处理：10周龄以上的雄性BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死后取出附睾尾精子置于含0.3％BSA的M16液中，用上游法制备精子悬液，调精子密度为1.0×10⁶/ml，于37℃，5％CO₂培养箱中孵育1.5～2h，加入Ca²⁺诱导剂A23187溶液，使终浓度为5μmol/L，继续孵育1h，分别用不同稀释浓度的anti-UU474IgG或anti-Izumo_212-227IgG及免疫前血清与获能精子共孵育30min。

③受精：将无透明带卵细胞与不同处理的精子悬液于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育3h后，吸出卵细胞，去除松散地附着于卵细胞的精子，移至载玻片上，压片后置相差显微镜下观察。精卵的融合通过Hoechst33342染色后，激光共聚焦显微镜观察。判断受精的标准为：看到雄原核或膨胀的精子头部及相应的尾。受精实验均包括一个实验组和一个对照组，共重复3次。

2.2.2.9抗Izumo_212-227抗体对小鼠精子运动功能的影响：

①用50μg/ml纯化的抗Izumo_212-227IgG或纯化的正常兔血清IgG与小鼠精子共孵育1h。

②取样经精液自动分析仪检测，精子运动参数分别选定活动精子百分率(％Motile)、曲线速度(curvilinear velocity，VCL)、直线速度(straight-line，VSL)。

2.2.2.10UU474蛋白和合成肽Izumo_212-227的体内抗生育实验：

①选择24只雌性BALB/c小鼠和12只雄性BALB/c小鼠，都经验证具有生育能力。随机分成3组，2个是实验组(UU474蛋白免疫组、合成肽Izumo_212-227免疫组)，1个对照组。

②分别在第1天、第3天、第28天免疫小鼠，每次每只小鼠免疫100μg的蛋白量。

③在免疫第35天，实验组与对照组的雌性和雄性小鼠合笼，两组合笼都采用两雌配一雄的组合。

④合笼后的第7天，第14天，第21天对两组的雌性小鼠的体重进行称量。观察雌性小鼠体重的变化，判断雌性小鼠是否怀孕；

⑤并分别计算孕鼠的产仔数。

2.3结果

2.3.1人与小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域的序列比对与分析：

为了进一步研究Izumo Ig-like结构域的理化特性及其生物学功能，首先将人与小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域的序列通过DNAssist 2.0软件进行了比对和分析。人与小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域的氨基酸序列有64.84％完全一致，有15.38％相似，表明Izumo蛋白Ig-like结构域在种属之间的保守性是很高的。小鼠可以作为研究人精子蛋白Izumo与UU之间交叉反应抗原的理想动物模型。我们通过生物信息学技术发现人精子蛋白Izumo与UU之间存在交叉反应抗原：KGKEA、ATLTK、KPMVG都在human Izumo蛋白的Ig-like结构域中。结果也表明小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域有较强的抗原性和较好的亲水性。

2.3.2小鼠重组Izumo蛋白Ig-like结构域(PB)的质谱鉴定：

经质谱鉴定PB蛋白的确是小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域：

2.3.3用Western blot的方法鉴定Izumo与UU之间的交叉反应抗原：

pTSA18-Stv-Izumo(Izumo_212-216，Izumo_216-220，Izumo_220-224)融合蛋白在11kDa处获得表达(图17)。对照蛋白为Stv-β8融合蛋白，β8是β-hCG中的一个由12个氨基酸组成的表位肽，在电泳中，其融合蛋白分子量较大。

human Izumo的第212～216氨基酸(Izumo_212-216)KGKEA，对应的mouse Izumo氨基酸序列为KGKEP，其中A和P是相似氨基酸；human Izumo的第216～220氨基酸(Izumo_216-220)ATLTK，对应的mouseIzumo氨基酸序列为PYLTK，其中T和Y也是相似氨基酸；human Izumo的第220～224氨基酸(Izumo_220-224)为KPMVG，对应的mouseIzumo氨基酸序列为KSMVG。通过(图18)我们发现anti-PB(小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域)IgG可以与Stv-Izumo_216-220融合蛋白很强地识别，而与Stv-Izumo_220-224和Stv-Izumo_212-216融合蛋白发生较弱的识别。因此(Izumo_216-220)ATLTK是一个比较强的B细胞表位。UU474蛋白的第518～522氨基酸与人Izumo_216-220氨基酸序列一致，皆为ATLTK。

2.3.4克隆表达UU474蛋白并制备其多克隆抗血清：

UU474蛋白基因的PCR产物作1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，显示出现一条特异性区带，位于相对分子质量(M)500～600bp之间，与预期大小524bp相符(图19)。

在IPTG(工作浓度为200μg/ml)诱导下，pET-28a(+)表达质粒在具有T7RNA聚合酶的E.coli BL21(DE3)中经过37℃4h的培养后，进行超声破菌。经SDS-PAGE电泳分离并用考马斯亮蓝染色，结果显示诱导后全菌裂解物在23kDa(图20)处出现与预期目的蛋白大小一致的条带，且该表达蛋白在超声破菌后的沉淀里。诱导前全菌裂解物无目的蛋白表达。

用Ni²⁺-NTA柱对诱导后菌液进行亲和层。洗脱液经SDS-PAGE电泳后，在23kDa处出现了明显的条带，为纯化后的UU 474蛋白(图20)。

2.3.5ELISA法检测anti-Izumo_212-227、anti-UU474兔抗血清效价结果：

用ELISA法检测获得的抗体效价，分别以免疫前、后兔血清为一抗，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为二抗，用DAB显色反应后，终止反应，用酶标仪在A485检测。结果显示anti-Izumo_212-227、anti-UU474的IgG效价均大于1∶25600(表2)，表明所获得的抗体是高效价的(图21)。

表2抗血清效价滴度表

2.3.6精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反应抗原的生物学验证：

通过Western blot的方法验证精子蛋白Izumo与UU474蛋白之间存在交叉反，合成肽Izumo_212-227的抗体能够识别重组PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-like结构域)和重组UU474蛋白(图22)；anti-UU474IgG或anti-Izumo_212-227IgG也都能在37kDa处识别人精子Izumo蛋白(图23)。

2.3.7人精子双标免疫荧光定位：

通过用纯化的anti-Izumo_212-227IgG进行人精子的双标间接免疫荧光定位分析，我们发现：免疫荧光定位在顶体反应后人精子的顶体内膜上，与阳性对照的抗体CD46单克隆抗体的定位一致(图24)。anti-UU474IgG也能识别人精子的顶体内膜(图25。以免疫前血清为一抗的对照组，在激光共聚焦显微镜下未见荧光反应(图26)。

2.3.8anti-UU474IgG与anti-Izumo_212-227IgG的体外抗生育实验：

用不同浓度稀释的纯化后anti-UU474IgG、anti-Izumo_212-227IgG及免疫前血清与获能小鼠精子共孵育后，与去透明带的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子与卵子融合能力的变化。经过Hoechst 33342染色并在激光共聚焦显微镜下观察，结果发现50μg/ml anti-Izumo_212-227IgG使小鼠精-卵融合能力都有较明显的下降；相同浓度稀释的anti-UU474 IgG对小鼠精-卵融合能力没有明显影响(图27)。然而25μg/ml、10μg/ml浓度稀释的anti-Izumo_212-227IgG对小鼠精-卵融合能力也没有明显的影响。结果表明anti-Izumo_212-227IgG在体外具有一定的抑制精-卵融合的作用。

2.3.9抗体对小鼠精子运动功能的影响：

用纯化的anti-Izumo_212-227IgG或纯化的正常兔IgG与小鼠精子共孵育1h后，取样经精液自动分析仪检测，与对照相比，实验组中小鼠精子活动百分率、曲线速度(VCL)及直线速度(VSL)均无显著性差异，表明anti-Izumo_212-227IgG对小鼠精子运动功能无影响(表3)。

表3anti-Izumo_212-227IgG对小鼠精子运动的影响

2.3.10合成肽Izumo_212-227和重组蛋白UU474体内抗生育实验：

为了观察合成肽Izumo_212-227和重组蛋白UU474在体内对生殖的影响，分别用合成肽Izumo_212-227和重组蛋白UU474免疫雌鼠，在第六周可以取得较高效价的抗体，然后与已证实具备生育能力的雄鼠交配，抗体可以持续到第十周。合成肽Izumo_212-227免疫组(表4)与其它组比较，雌鼠的产仔数有较明显下降。

表4Izumo_212-227、UU474免疫对雌鼠受精的影响

注：*p＜0.05.

实施例3

嵌合肽免疫避孕疫苗功能研究

一，材料合成肽CP1由上海生工生物技术公司合成。

完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、FITC标记的羊抗兔IgG、Anti-His单克隆抗体(Sigma公司)PVDF膜(Millipore)，ECL生物发光显色剂(Millipore)。

6月龄(体重约为2.5kg)雌性新西兰大白兔，成熟BALB/c小鼠(8-12W)由上海交通大学医学院动科部购自中科院实验动物中心。

二，方法

1.设计、合成嵌合肽

精子蛋白Izumo，tNASP，ESP中的交叉反应抗原分别为ATLTK，IERLT，TGGFT，将三个短肽hESP_103-112(TGGFTPEIGK)、tNASP_396-405(TSIERLTETK)、Izumo_212-221(KGKEATLTKP)(包含交叉反应抗原)串联起来，在其N-端连接广谱T细胞表位牛核糖核酸酶aa94-104：NCAYKTTQANK，用于构建抗精子的嵌合肽疫苗。嵌合肽CP1：NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGG TSIERLTETK GGG KGKEATLTKP。由上海生工生物技术公司应用固相化学合成法合成上述50肽。

2.重组mIzumo，mtNASP，mESP-P1蛋白表达纯化

mESP三个片段P1/P2/P3克隆

用提取的BALB/c小鼠睾丸总RNA作为模板，RT-PCR的产物作1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示出现三条特异性区带，分别与P1/P2/P3片段的预期大小516bp、543bp、474bp相符。目标片段与pET-28a(+)载体连接，构建重组表达载体，并再次经DNA测序。在IPTG(工作浓度为200μg/ml)诱导下，pET-28a(+)表达质粒在E.coli BL21(DE3)中经过37℃4h的培养后，结果显示诱导后菌液在蛋白分子量约25kDa，36kDa，21kDa处大量表达出新的条带，对应于P1/P2/P3.P1、P2、P3的理论分子量分别为20kDa，21kDa，17kDa，考虑到重组蛋白带有载体的标签序列，实际显示的分子量会比理论分子量略大，故P1和P3判断为目标蛋白。P2显示分子量偏大，进一步经质谱分析验证为目的片段.在本实验的表达条件下，诱导后His标签重组蛋白以包涵体形式表达，因此用Ni-NTA柱对诱导后菌液进行亲和层析。洗脱液经SDS-PAGE电泳后，结果显示在预计蛋白分子量处获得了纯化后目的蛋白。

Izumo蛋白Ig-like domain与mtNASP的克隆表达与纯化

1引物：

Izumo基因Ig-like结构域(PB)上、下游引物。

正义链引物：5’GC GGATCC AAG CAG TTG CAC ATT TGT C 3’包含酶切位点BamH I(下划线部分)。

负义链引物：5’GC AAGCTT GTT CGG TGG TTG GTT TTC 3’包含酶切位点Hind III(下划线部分)。

预期扩增片段为336bp；

mtNASP上、下游引物。

上游引物5’GCGGATCCATGGAACTGCTAGGGCAAGA’3包含酶切位点BamH I(下划线部分)。

下游引物5’GCAAGCTT TTTGTCTTCAGGTGCTTTCT’3包含酶切位点Hind III(下划线部分)。

目的片段长339bp。

2①PCR：PCR体系如下：小鼠睾丸cDNA 5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP Mixtrue(200mM)0.5μl，dd H₂O14μl，Taq酶1μl；总反应体系为25μl。

②克隆：TA克隆：连接体系：pMD-18T Vector 1μl，回收DNA 4μl，SolutionI 5μl，总反应体系为10μl，反应程序：16℃孵育8h；连接产物转化入DH5a感受态细胞；通过X-gal筛选和挑取阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒；质粒双酶切：10×Buffer K 1.5μl，BamH I1μl，Hind III1μl，小抽质粒11.5μl(pMD-18T-DNA)，总反应体系为15μl；酶切目的片段胶回收产物与pET-28a(+)Vector连接，构建表达载体：pET-28a(+)Vector 1μl，酶切胶回收产物8μl，Ligation Solution Buffer 1.5μl，T4DNA连接酶1μl，dd H₂O 3.5μl，总反应体系为15μl，16℃过夜；连接产物转化入E.coli DH5a感受态细胞；扩增的质粒用质粒小量抽提试剂盒进行抽提；小抽质粒经PCR验证后，送上海华大基因公司测序。

③表达：将pET-28a(+)-DNA转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞；用IPTG，在摇床中以280rpm，37℃孵育4h诱导表达目的蛋白，取诱导前全菌液、诱导后全菌液加5×sample buffer 20μl，95℃孵育10min变性，上样，进行SDS-PAGE电泳(120V电压)，电泳结束后考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色，当蓝色条带清晰后，依据蛋白分子量Marker观察诱导效果；按照以上诱导表达过程，诱导250ml菌液表达目的蛋白，用Pierce公司Ni²⁺-NTA柱经亲和层析方法对表达的目的蛋白进行纯化；纯化后蛋白用BCA法定量。

3.免疫接种

经过生育能力验证的BALB/c雌、雄小鼠用于本实验。合成CP1作为免疫原，按第一章实验方法免疫雌性BALB/c小鼠，每次免疫抗原用量100μg。以PBS加佐剂按同样方法免疫小鼠作为对照。免疫结束后1周第一次合笼交配，第8周再次合笼交配。合笼1周后分开，定期称量体重判断小鼠是否受孕，计数孕鼠产仔数。同时免疫一只雌性新西兰大白兔制备抗CP1抗体用于后续体外穿卵实验。

4.ELISA

免疫结束后1周第一次合笼交配前自眼内眦静脉取血，免疫结束后第5周及第8周再次取血。用CP1包被96孔板，每孔1μg，按前述实验方法进行，以免疫前血清及对照组血清为对照，测定抗血清效价。以重组蛋白rmESP-P1，rmtNASP，rmIzumo分别包被96孔板，每孔0.5μg，1∶100稀释血清作为一抗，测定CP1中各组成表位的抗体反应。

5.人和小鼠精子蛋白提取

取4份正常人精液标本分离获取精子样品，取5只成年BALB/c雄鼠按前述方法获取附睾尾部精子样品。提取蛋白实验方法见第二章。

6.Western blot分析

以重组mIzumo，mtNASP，mESP-P1蛋白及精子全蛋白提取物作为抗原进行SDS-PAGE，以兔抗CP1抗体作为一抗，1∶2000稀释，按第一章实验方法进行Western blot分析CP1诱导产生的抗体与原蛋白的交叉反应。

7.小鼠精子体外穿卵实验

配子制备同前，以1∶10，1∶20，1∶100稀释CP1免疫后兔抗血清预处理精子，与去透明带小鼠卵子共孵育，观察精卵黏附、融合情况。

(1)卵子获取

(2)精子获取及抗体处理

(3)小鼠精子体外穿卵实验

8统计学分析

三，结果

1化学合成肽

CP1经DNAstar软件优化排列BCE顺序，分析其疏水性、抗原性及表面可及性均较强，CP1经HPLC纯化，纯度大于90％，经质谱仪鉴定荷质比与理论值一致。

2CP1免疫小鼠对生育功能影响

CP1免疫结束后1周第一次合笼交配，81.8％(9/11)雌鼠不育，而对照组均生育。第8-9周第二次合笼交配，实验组不育的雌鼠均恢复生育，孕鼠平均产仔数与对照组无显著差别(p＞0.05)(表5)。

表5CP1免疫BALB/c雌鼠对生育影响

3CP1抗体产生

用ELISA测定CP1免疫小鼠的免疫前及免疫后血清吸光值，用CP1包被96孔板，1∶100小鼠稀释血清作为一抗，显示免疫后小鼠血清中有特异性抗体产生。免疫前血清和对照组血清无免疫反应。免疫结束后第1周，第5周，第8周所取小鼠血清中IgG抗体的水平差异无显著性(图28)。小鼠抗CP1抗体水平的个体之间差异不太大。血清抗体水平与其生育状态并不平行，第1和9号小鼠分别产5只和7只仔，其余小鼠不育，但第1和9号小鼠血清抗体水平并非比其他小鼠明显低。兔免疫后血清抗CP1抗体效价达1∶10000(图29)。

4CP1诱导产生的抗体与重组蛋白及精子中的原蛋白具有交叉反应性

以重组蛋白rmESP-P1，rmtNASP，rmIzumo分别包被包被96孔板，每孔0.5μg，1∶100稀释血清作为一抗。结果兔及所有小鼠免疫后血清与rmESP-P1，rmtNASP蛋白有免疫反应，与rmIzumo无免疫反应。免疫前血清及对照组小鼠血清与上述蛋白无交叉反应(图30)。进一步以兔抗血清为一抗，通过Westernblot分析抗CP1抗体能否识别重组蛋白。结果在rmESP-P1，rmtNASP蛋白目标分子量处见阳性条带，分别为25kDa和18kDa，在rmIzumo位置处没有免疫反应条带(图31)。人和小鼠精子中tNASP的理论分子量分别为85kDa和83kDa，人和小鼠精子中ESP蛋白的理论分子量分别为38kDa和45kDa，人精子和小鼠附睾尾成熟精子的蛋白提取物中显示的免疫反应条带位置与tNASP、ESP的理论分子量一致。免疫前血清与上述蛋白无交叉反应(图32)。说明组成CP1成分中的tNASP和ESP蛋白的BCE，能诱导产生特异性抗体，识别精子中原蛋白tNASP和ESP。在人和小鼠天然Izumo蛋白及rmIzumo的目标位置处没有免疫反应条带，说明抗体不能识别原蛋白或Izumo的BCE没有诱导产生特异性抗体。

5CP1诱导产生的抗体抑制小鼠体外精-卵相互作用

用不同浓度稀释的兔抗CP1血清及免疫前血清处理获能小鼠精子后，与去透明带的小鼠卵子孵育，观察经上述处理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能力的变化。与免疫前血清相比，1∶10稀释的抗CP1血清处理精子后，每个卵子的平均结合和融合精子明显减少。当稀释度增大到1∶20时，小鼠精卵黏附及融合数与对照组比较有差异，但无统计学意义(p＞0.05)。当稀释度增大到1∶100时，对精子与卵子的黏附和融合无显著影响(图33，34，35，36)。这一结果表明抗CP1抗体抑制作用呈浓度依赖性。不同浓度稀释的抗CP1抗体及免疫前血清处理后的精子与对照组比较，精子活力和运动参数没有明显的变化，也没有发生精子凝集现象。

本实验将经验证的三个精子蛋白(hIzumo、tNASP、hESP)与UU的交叉反应抗原组合起来，线性排列并在N-端连接广谱T细胞表位构成嵌合肽，免疫雌性BALB/c小鼠后，免疫组小鼠生育率下降81.8％。这三个交叉反应抗原已被验证为线性BCE，具有足够的抗原性，合成表位肽耦联KLH单独免疫均能诱导机体产生特异性抗体识别原蛋白，并产生一定的抗生育作用。将这三个BCE串联起来构成一种新形式的疫苗，免疫避孕效果增强。CP1产生的抗体能与重组和天然tNASP，ESP蛋白发生交叉反应。说明CP1组成成分中的BCE诱导机体产生了特异性的抗体，重要的是该抗体能识别原天然蛋白。众所周知，多肽疫苗诱导产生的抗体必需能与原天然蛋白交叉反应才有功能意义。有观点认为嵌合肽中同时包括几个抗原靶点能协同增强其中单个成分BCE的免疫效果。本实验中多肽疫苗基于的三个精子抗原都是精子特异性表达，与受精有关。ESP定位于精子顶体赤道段，参与受精过程中精卵相互作用。tNASP是精子特异的核自身抗原，在受精过程中的作用不清楚，但免疫攻击小鼠tNASP蛋白后能导致免疫性不育。Izumo定位于顶体内膜，参与精卵融合，基因敲除后导致完全不育，免疫后也可致部分不育。可以推测，本实验中CP1免疫后，小鼠参与受精过程中的两个靶点tNASP和ESP受到免疫攻击，这可能是其能有效诱导小鼠不育的原因。

CP1组成成分中的mIzumo的BCE耦联KLH单独免疫时能产生特异性抗体，识别重组和天然mIzumo，说明该表位抗原性强。本实验中抗CP1抗体不能与mIzumo发生交叉反应，一种可能原因是该BCE位于CP1的C-末端，易被机体内肽酶或蛋白酶水解；另一种可能是CP1形成了新的构象，形成了二级结构或产生了新的表位不能识别原蛋白。其他实验中也报道串联多个不同BCE时，有的BCE不能诱导产生相应抗体。Hardy等构建多表位疫苗，包括PLF、SP56、ZP1和ZP3的免疫显性BCE，免疫小鼠后可以致50％不育，但只诱导产生与SP56和ZP1反应的抗体。将几个表位肽简单混合起来作为多价免疫原，抗原肽成分往往不能激发机体产生免疫反应。设计构建多表位嵌合肽首要目的是以其为免疫原，嵌入各BCE均能产生抗体。多价疫苗理想的状况是疫苗中各组分都具有足够的免疫原性，产生识别原蛋白的抗体。目前尚不能准确预测多肽疫苗的免疫原性，即肽以何种构象能激起与原蛋白交叉反应的抗体。将多个不同表位组合起来构建线性多肽疫苗，不同表位之间尝试用GGG或GPSL序列分隔开，可以提高各个表位的柔韧性以利于其诱导免疫反应。最好以软件EpiSort优化表位间隔，以提高多肽的免疫原性。另有报道分支肽能提高免疫原性。各BCE抗体的产生可能与BCE和TCE之间的位置有关，因为一对BCE和TCE组合的化学合成嵌合肽研究表明，BCE安排在TCE的C-端产生抗BCE抗体，反之产生抗TCE抗体。当然，若组合更多BCE和TCE，情况肯定复杂得多。另外，嵌入表位能否诱导抗体产生可能还与插入的BCE肽段长短有关。由于目前化学合成多肽受序列长度限制，因此设计嵌合肽时，使之适合生物系统表达，也是生物合成多表位多肽疫苗研究的新课题。我们也正在尝试不同方法增强嵌合肽的免疫原性，如变动三个BCE的位置、增加表位拷贝数、利用原核表达系统获得多肽，以进一步研究其各表位抗体产生情况及免疫避孕效果。

与其他作者报道一样，嵌合肽诱导产生的不育是可逆的，在最后一次免疫结束后第8-9周再次合笼交配，所有诱导不育的雌鼠均恢复生育能力，产仔数与对照组差别无显著性意义。检测免疫结束后第1周、第5周及第8周小鼠血清，IgG抗体效价并无显著下降。推测实验小鼠组生育功能恢复，可能是由于生殖道局部免疫反应降低所致，血清抗体水平与小鼠生育状况无相关性。免疫后生殖道内的抗体水平和/或T细胞反应状况可能与生育状态密切相关，但准确检测小鼠子宫、输卵管内的抗体水平有难度。因此若要确切评价一个免疫避孕疫苗的避孕效果时，首先需要解决的一个问题是准确评价其在生殖道局部产生的免疫反应。目前可以在免疫后灵长类动物输卵管液内检测到特异性IgA和IgG抗体。

由于多肽疫苗普遍免疫原性弱，需要更好的载体与佐剂来提高免疫原性，增加免疫反应的深度和广度。不同来源的广谱TCE被尝试用于构建多肽疫苗，因此还需要可靠而简便的评价T细胞反应的方法。在动物实验中常用的是福氏佐剂，本实验中可见被免疫动物局部硬结、脱毛明显，说明局部副作用大，不可能适合于人类使用。如用于人体实验除了要设计特异的多肽免疫原，尚需探索更高效的疫苗接种方式。如将多肽抗原以生物可降解的微粒包裹后接种，设计脂类分子内佐剂等提高免疫原性。

本实验首次研究了由精子蛋白ESP、Izumo和tNASP与UU的交叉反应抗原组成的嵌合肽，免疫小鼠后可以产生较强的可逆性的抗生育效果，是探索新的抗精子多价免疫节育抗原的有益尝试。

<110>上海交通大学医学院

<120>一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>50

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln Ala Asn Lys Gly Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

Gly Phe Thr Pro Glu Ile Gly Lys Gly Gly Gly Thr Ser Ile Glu Arg

20 25 30

Leu Thr Glu Thr Lys Gly Gly Gly Lys Gly Lys Glu Ala Thr Leu Thr

35 40 45

Lys Pro

50

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Thr Gly Gly Phe Thr

1 5

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Ala Thr Leu Thr Lys

1 5

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

Thr Gly Gly Phe Thr Pro Glu Ile Gly Lys

1 5 10

<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Thr Thr Thr Phe Pro Thr Gly Gly Phe Thr Pro Glu Ile Gly Lys

1 5 10 15

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

Lys Gly Lys Glu Ala Thr Leu Thr Lys Pro

1 5 10

<210>7

<211>16

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

Lys Gly Lys Glu Ala Thr Leu Thr Lys Pro Met Val Gly Pro Glu Asp

1 5 10 15

Claims

1.一种免疫避孕的嵌合肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID：1所示。

2.根据权利要求1所述的免疫避孕的嵌合肽用途，其特征在于：用于制备避孕疫苗。