CN101906102B

CN101906102B - β-咔啉类生物碱衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101906102B
Application number: CN200910085123A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 吴建辉
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2009-06-02
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2029-06-02
Also published as: CN101906102A

Abstract

本发明公开了一类具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物及其制备方法和应用。将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与氨基酸苄酯缩合或者将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与谷氨酸二苄酯缩合，即得到本发明化合物；其中所述的氨基酸苄酯选自甘氨酸残基，丙氨酸残基，缬氨酸残基，亮氨酸残基，异亮氨酸残基，蛋氨酸残基，脯氨酸残基，苯丙氨酸残基，色氨酸残基，丝氨酸残基，苏氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酰胺残基，酪氨酸残基，天冬氨酸苄酯残基，N^ω-苄氧羰基甘赖氨酸残基，组氨酸残基。药理学试验表明，本发明化合物具有优秀的抗肿瘤细胞增殖活性，临床上可作为抗肿瘤剂应用。

Description

β-咔啉类生物碱衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物碱衍生物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物及其制备方法，本发明还涉及该β-咔啉类生物碱衍生物在作为抗肿瘤剂的应用，属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，人类因恶性肿瘤而引起的死亡率是所有疾病死亡率的第二位，仅次于心脑血管疾病。肿瘤的治疗方法有手术治疗，放射治疗和药物治疗(化学治疗)。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段。寻找抗肿瘤药物是新药研究的热点之一。β-咔啉类化合物是一类天然的吲哚生物碱，广泛的分布于自然界。这类化合物具有抗肿瘤活性已经引起了广泛关注。发明人认识到，在β-咔啉-3-羧酸的3位引入苄基并在1位引入氨基酸苄酯可能产生抗肿瘤作用。按照这种构想，发明人提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物；

本发明的目的之二是提供一种制备上述具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物的方法；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的；

具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物，其结构式为通式I或II所示：

通式I 通式II

其中，AA为甘氨酸残基，丙氨酸残基，缬氨酸残基，亮氨酸残基，异亮氨酸残基，蛋氨酸残基，脯氨酸残基，苯丙氨酸残基，色氨酸残基，丝氨酸残基，苏氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酰胺残基，酪氨酸残基，天冬氨酸苄酯残基，N^ω-苄氧羰基甘赖氨酸残基或组氨酸残基；R为谷氨酸内酰胺残基。

一种制备上述通式I化合物的方法，包括以下步骤：

(1)制备3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(2)将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与氨基酸苄酯缩合，即得；其中，所述的氨基酸苄酯选自甘氨酸苄酯，丙氨酸苄酯，缬氨酸苄酯，亮氨酸苄酯，异亮氨酸苄酯，蛋氨酸苄酯，脯氨酸苄酯，苯丙氨酸苄酯，色氨酸苄酯，丝氨酸苄酯，苏氨酸苄酯，天冬酰胺苄酯，谷氨酰胺苄酯，酪氨酸苄酯，天冬氨酸苄酯，N^ω-苄氧羰基甘赖氨酸苄酯或组氨酸苄酯；

一种制备上述通式II化合物的方法，包括以下步骤：

(1)在多聚磷酸和苄醇存在下将L-谷氨酸转变为氨氨酸二苄酯；

(2)制备3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(3)将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与谷氨酸二苄酯缩合，即得。

其中，所述的3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯可参考以下方法制备得到：

(1)在SOCl₂和甲醇存在下将L-色氨酸转变为L-色氨酸苄酯；

(2)在浓盐酸存在下将L-色氨酸苄酯与1，1，3，3-四甲氧丙烷缩合制备3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(3)在KMnO₄存在下将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯氧化为3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在NaOH的MeOH溶液中将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯皂化，制备3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸

(5)在K₂CO₃存在下用BrCH₂C₆H₅将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸的3位羧基酯化生成3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(6)在HOAc、HCl和H₂O存在将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯水解为3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯。

在肿瘤细胞模型和小鼠S₁₈₀肉瘤模型上评价本发明化合物的抗肿瘤活性，试验结果表明，本发明化合物具有优秀的抗肿瘤活性，可作为临床上潜在的抗肿瘤剂。

本发明的又一目的是提供一种含有本发明上述通式化合物的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的本发明化合物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂组成；即：将有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明化合物。

附图说明

图1本发明通式I化合物的合成路线图；i)SOCl₂，MeOH；ii)HCl，1，1，3，3-四甲氧丙烷，MeOH；iii)KMnO₄，DMF；iv)NaOH，H₂O，MeOH；v)K₂CO₃，BrCH₂C₆H₅，DMF/THF；vi)HCl，HOAc，H₂O；vii)NaOH，NaBH₃CN以及甘氨酸苄酯，L-丙氨酸苄酯，L-缬氨酸苄酯，L-亮氨酸苄酯，异亮氨酸苄酯，L-色氨酸苄酯，L-丝氨酸苄酯，L-苏氨酸苄酯，L-天冬酰胺苄酯，L-谷氨酰胺苄酯，L-酪氨酸苄酯，L-天冬氨酸二苄酯，L-N^ω-苄氧羰基赖氨酸苄酯，L-组氨酸苄酯。在6a中AA为甘氨酸残基，6b中AA为丙氨酸残基，6c中AA为缬氨酸残基，6d中AA为亮氨酸残基，6e中AA为异亮氨酸残基，6f中R＝CH₂CH₂SCH₃，6g中R＝NH＝NCH₂CH₂CH₂，6h中R＝CH₂C₆H₅，6i中AA为色氨酸残基，6j中AA为丝氨酸残基，6k中AA为苏氨酸残基，6l中AA为天冬酰胺残基，6m中AA为谷氨酰胺残基，6n中AA为酪氨酸残基，6o中AA为天冬氨酸苄酯残基，6p中AA为N^ω-苄氧羰基甘赖氨酸残基，6q中AA为组氨酸残基。

图2本发明通式II化合物的合成路线图。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 L-氨基酸苄酯盐酸盐的制备通法

将多聚磷酸(10g，29.60mmol)与50ml苯甲醇于90℃加热搅拌器溶解后，加入L-氨基酸20mmol。反应8小时。TLC显示无氨基酸剩余，停止反应，冷却至室温。加入10％的硫酸水溶液，并加入20ml乙醚，分液，水相5％的碳酸氢钠水溶液调整pH＝10。乙醚萃取三次(20ml×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液中通入HCl气体，得L-氨基酸苄酯盐酸盐为白色固体，收率在23-72％之间。

依此通法合成了HCl·Gly-OBzl、HCl·Ala-OBzll、HCl·Val-OBzl、HCl·Leu-OBzlHCl·Ile-OBzl、HCl·Met-OBzl、HCl·Pro-OBzl、HCl·Phe-OBzl、HCl·Trp-OBzl、HCl·Ser-OBzl、HCl·Thr-OBzl、HCl·Asn-OBzl、HCl·Gln-OBzl、HCl·Tyr-OBzl、HCl·Asp-OBzl、HCl·Lys(Z)-OBzl、HCl·His-OBzl、HCl·Glu-OBzl 18种L-氨基酸的苄酯盐酸盐。熔点、旋光等物理常数与已报道的数据一致。

实施例2 1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉羧酸苄酯(2)

在250ml的圆底烧瓶中加入L-色氨酸苄酯盐酸盐5g(19.6mmol)，50ml甲醇，1，1，3，3-四甲氧基丙烷6ml(23.6mol)，用5N盐酸调节pH至2，搅拌下升温到45℃，保温反应48小时，TLC监测原料斑点消失，将反应液降温至室温，滴加三乙胺调节pH大于8，减压回收溶剂，残余物中加入50ml三氯甲烷和50ml10％碳酸钠水溶液，分液后水层用三氯甲烷萃取(30ml×3)，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残余物用硅胶柱层析纯化得标题化合物，为黄色油状物5.4g(86％)。ESI-MS：m/e(M⁺)318

实施例3 1-(2，2-二甲氧乙基)-3-咔啉羧酸苄酯(3)

在250ml的圆底烧瓶中加入4.3g(13.783mmol)化合物(2)，溶解于100mlDMF中，搅拌至溶液澄清，然后在冰浴冷却下，分批加入高锰酸钾3.04g(19.296mmol)，大约半个小时全部加完后，室温反应3小时，TLC监测原料斑点消失，向反应瓶中加入20ml乙醇，搅拌20分钟后，过滤，滤饼用热乙酸乙酯提取后，废渣弃去，提取液冷却后，分别用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，得目标化合物的纯品，520mg。滤液回收溶剂后，剩余物用50ml三氯甲烷溶解后，分别用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，剩余物用丙酮重结晶得白色粉末3.47g，收率为80.32％。m.p.：134.5-136℃。ESI/MS(m/e)315[M+H]⁺。

实施例4 1-(2，2-二甲氧乙基)-3-咔啉羧酸羧酸(4)

冰浴下，在250ml的圆底烧瓶中加入1.59mmol 1-(2，2-二甲氧乙基)-3-咔啉羧酸苄酯，溶解于7ml甲醇溶液中，搅拌至澄清，用2N的氢氧化钠水溶液调整反应液的pH至11.冰浴下反应3.5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10∶1)监控反应无1-(2，2-二甲氧乙基)-3-咔啉羧酸苄酯剩余。用KHSO₄溶液调pH至7.减压回收甲醇后，剩余物用KHSO₄溶液调pH至2，用乙酸乙酯萃取(30ml×3)，合并有机相，分别用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，得到浅黄色油状物，未经纯化直接应用于下一步反应。

实施例5 1-(2，2-二甲氧乙基)-3-咔啉羧酸羧酸苄酯(5)

在250ml的圆底烧瓶中加入化合物(4)3.81g(12.7mmol)，20ml无水DMF和20ml无水THF，搅拌至溶液澄清，加入K₂CO₃2.6g(19mmol)室温搅拌4h，缓慢滴加溴苄2.37g(13.97mmol)，室温反应8h，过滤反应液，减压回收溶剂。剩余物经硅胶柱层析纯化得白色固体粉末3.51g，收率为70.7％。Mp℃；ESI/MS(m/e)391[M+H]⁺。

实施例6 S-1-(2-羰乙基)-9-H-β-咔啉-3-羧酸苄酯(6)

在100ml的圆底烧瓶中加入化合物(4)3.2g(8.26mmol)、80ml醋酸、10ml水和10ml盐酸，室温搅拌4h，TLC监测原料斑点消失，加入300ml冰水，冰浴下搅拌10min.后过滤，滤饼用水-5％碳酸氢钠水溶液-水洗涤，晾干，直接应用到下一步反应。

实施例7 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基氨基酸苄酯的合成通法(6a-r)

在100ml的圆底烧瓶中加入8.7mmol氨基酸苄酯盐酸盐，2.4mmol氢氧化钠，25ml甲醇，室温搅拌30min，然后加入5.79mmol化合物3S-1-(2-羰乙基)-9-H-β-咔啉-3-羧酸苄酯(6)，10min后，加入2.9mmol氰基硼氢化钠，室温搅拌19h，TLC监测原料斑点消失，加入3N盐酸调节pH至2，减压回收溶剂，剩余物中加入50ml水和50ml乙酸乙酯溶解，用2N氢氧化钠水溶液调节pH至8，分液，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合并有机相，干燥，减压回收溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化得标题化合物。

实施例8 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基甘氨酸苄酯(6a)

收率：77.20％；ESI/MS(m/e)494[M+H]⁺。

实施例9 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基丙氨酸苄酯(6b)

收率：68.02％.[α]_D ²⁰＝30.49(c＝0.01，CHCl₃)，ESI/MS(m/e)508[M+H]⁺。

实施例10 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基缬氨酸苄酯(6c)

收率：64.95％.[α]_D ²⁰＝3.80(c＝0.01，CHCl₃)，ESI/MS(m/e)536[M+H]⁺。

实施例11 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基亮氨酸苄酯(6d)

收率：70.25％.[α]_D ²⁰＝-3.03(c＝0.01，CHCl₃)，ESI/MS(m/e)550[M+H]⁺。

实施例12 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基异亮氨酸苄酯(6e)

收率：65.32％.[α]_D ²⁰＝6.57(c＝0.01，CHCl₃)，ESI/MS(m/e)550[M+H]⁺。

实施例13 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基蛋氨酸苄酯(6f)

收率：68.82％.[α]_D ²⁰＝-26.55(c＝0.01，DMSO)，ESI/MS(m/e)568[M+H]⁺。

实施例14 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基脯氨酸苄酯(6g)

收率：77.32％.[α]_D ²⁰＝-1.13(c＝0.01，DMSO)，ESI/MS(m/e)534[M+H]⁺。

实施例15 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基苯丙氨酸苄酯(6h)

收率：70.29％.[α]_D ²⁰＝10.92(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)584[M+H]⁺。

实施例16 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基色氨酸苄酯(6i)

收率：64.38％；[α]_D ²⁰＝1.13(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)623[M+H]⁺。

实施例17 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基丝氨酸苄酯(6j)

收率：55.67％；[α]_D ²⁰＝-7.89(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)524[M+H]⁺。

实施例18 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基苏氨酸苄酯(6k)

收率：60.39％；[α]_D ²⁰＝-11.02(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)538[M+H]⁺。

实施例19 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基天冬酰胺苄酯(6l)

收率：50.28％.[α]_D ²⁰＝-31.14(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)551[M+H]⁺。

实施例20 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基谷氨酰胺苄酯(6m)

收率：67.5％；[α]_D ²⁰＝-5.8(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)474[M+H]⁺。

实施例21 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基酪氨酸苄酯(6n)

收率：92.76％.[α]_D ²⁰＝8.83(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)600[M+H]⁺。

实施例22 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基天冬氨酸苄酯(6o)

收率：49.73％.[α]_D ²⁰＝-7.96(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)642[M+H]⁺。

实施例23 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基-N’-(苄氧羰基)赖氨酸苄酯(6p)

Yield：70.28％；[α]_D ²⁰＝2.53(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)699[M+H]⁺。

实施例24 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基组氨酸羧酸苄酯(6q)

收率：42.29％；[α]_D ²⁰＝-7.99(c＝0.01，CHCl₃)；ESI/MS(m/e)574[M+H]⁺。

实施例25 N-(3-苄氧羰基-9-H-β-咔啉-1-基)乙基5-氧代四氢吡咯-2-羧酸苄酯(6r)

收率：56.96％.[α]_D ²⁰＝-30.05(c＝0.01，DMSO)，ESI/MS(m/e)548[M+H]⁺。

实验例1本发明化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性评价实验

1)受试样品

实施例中所制备的化合物6a-r，用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。

2)人癌细胞株

Hela(上皮来源的宫颈癌细胞)、HepG₂(肝细胞癌细胞)、Bel7402(肝细胞癌细胞)、K562(人白血病细胞)、B16(黑色素瘤细胞)、Eahy926(人肺腺癌细胞株A549和人脐静脉内皮细胞杂交的融合细胞株)。

3)主要仪器

酶标仪：450，Biorad公司

高压灭菌锅：400Ep-Z，Bruckmanning公司

细胞孵育箱：INC153，memmer公司

低温离心机：SPD111V，Thermo公司

96孔细胞培养板：Costar公司

石英自动双重纯水蒸馏器：1810-B，江苏荣华仪器制造有限公司

4)主要试剂

MTT：四噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)(Flka)，溶于PBS中，浓度为5mg/ml，过滤除菌，4℃避光保存。

PBS：每升溶液中含有NaCl 8.2g，KCl 0.20g，Na₂HPO₄H₂O1.56g，KH₂PO₄0.2g，pH为7.4

RPMI-1640培养基：Gibco公司

DMEM培养基：Gibco公司

改良的Mccy’s 5A medium+L-Glutamine培养基：Gibco公司

胎牛血清：Hyclone公司

青霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司

链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司

DMSO：Hyclone公司。

其余所用试剂均为市售分析纯。

5)实验方法。

分别将生长状态良好、处于对数生长期的肿瘤细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl，按预设的浓度梯度加入待测、经灭菌处理的样品，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续置于37℃孵育四个小时，小心吸出孔内培养液，每孔加入100μl的DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，振荡约15min结晶物全部溶解，于570nm酶标仪上测定各孔O.D.值(吸收值)。

按照公式“相对生存率＝(D 含药-D 空白)/(D 对照-D 空白)×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。

实验重复3次，以绘制细胞活力曲线，求出IC₅₀值。

6)实验结果

在体外细胞毒试实验中，评价了本发明化合物6a-r对HepG2、Hela、Bel7402、K562、eahy926、B16等六种人类肿瘤细胞系的增值能力的作用，实验结果见表1。

表1 本发明化合物6a-r体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀±SD，μM)

Compd^a

HepG₂

Hela

Bel7402

K562

eahy926

B16

6a

50.0±8.3

26.8±4.2

53.2±7.6

47.1±6.2

28.7±3.7

75.4±9.1

6b

＞100

76.4±1.2

100±5.2

48.2±8.4

4.6±1.3

20.5±2.3

6c

29.2±1.2

25.5±2.2

20.3±3.1

20.9±1.8

15.0±1.4

28.8±1.3

6d

25.2±2.1

22.5±3.1

43.5±1.4

21.5±1.8

17.8±2.1

50.2±3.2

6e

＞100

19.2±2.1

6f

18.7±1.2

28.8±1.5

25.8±2.1

13.5±1.0

18.5±2.9

61.1±2.8

6g

17.12±1.2

25.81±1.5

52.81±2.2

20.12±1.9

26.11±1.7

71.83±2.2

6h

＞100

23.0±2.1

28.1±2.1

6i

60.0±3.2

59.5±2.7

39.0±2.1

14.9±1.2

34.9±4.7

20.7±1.3

6j

19.9±1.1

20.3±2.0

54.6±6.8

19.7±2.1

13.2±2.3

60.3±8.4

6k

26.0±2.1

15.2±1.2

＞100

38.3±3.2

37.2±1.9

38.4±3.3

6l

＞100

97.2±15.2

＞100

63.6±10.3

＞100

17.1±4.5

6m

35.9±5.2

71.0±8.2

81.3±6.7

＞100

96.1±9.8

42.5±6.2

6n

＞100

16.7±2.0

23.7±2.3

18.9±1.9

16.6±2.3

24.5±2.8

6o

＞100

60.3±

＞100

69.5±8.7

11.1±4.5

6p

36.28±4.2

33.85±4.8

14.91±3.2

15.37±2.8

10.26±1.7

49.4±5.4

6q

＞100

63.56±7.2

36.85±5.3

14.43±3.1

26.17±2.8

60.02±4.6

6r

63.09±10.2

54.94±8.2

＞100

18.53±4.5

96.1±11.2

66.37±5.2

ADR

0.19±0.1

34.18±2.1

33.45±1.8

27.22±2.3

ADR＝阿糖胞苷

体外实验结果表明，本发明化合物6a-r均具有优秀的抗肿瘤活性。

实验例2 本发明化合物体内抗肿瘤活性实验

1)实验材料

受试化合物：实施例所制备的化合物6a-r。

阳性对照品为阿糖胞苷。

实验动物：昆明种小鼠(KM清洁级)，雄性，体重20±2g(x±s)；由北京大学医学部动物实验中心提供。每10只小鼠一组，空白及阳性对照各一组。

瘤源：小鼠S₁₈₀肉瘤，由北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持。

溶剂：生理盐水，0.5％CMC-Na溶液。

2)剂量设置

受试化合物6a-r设为高(89μmol/kg)、中(8.9μmol/kg)、低(0.89μmol/kg)三个剂量组，均采用腹腔单次给药。

3)药物配制

受试化合物6a-r在水中难溶，实验时加入少量的吐温80润湿助溶，逐渐加入0.5％CMC-Na溶液至所需要浓度即可。阳性对照品阿糖胞苷为水溶性，采用生理盐水溶解即可。

4)给药剂量及给药方案

受试化合物6a-r均以腹腔单次给药。按相应的给药剂量每天一次，0.2ml/鼠，连续给药7天，共给药7次。

阴性对照以等体积的相应溶液，均以腹腔给药。按相应的给药剂量每天一次，0.2ml/鼠，连续给药7天，共给药7次。

阳性对照品阿糖胞苷按89μmol/kg的剂量，腹腔给药。每天一次，0.2ml/鼠，连续给药7天，共给药7次。

5)动物模型的建立

采用体内抗肿瘤腋皮下接种模型：在无菌条件下抽取接种7d，后取生长旺盛S₁₈₀腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1×10⁷个/ml的细胞悬液，于相应宿主腋皮下接种0.2ml/鼠，制成实体瘤动物模型。

6)检测指标及方法

7)体内神经毒性观察

每日观察给药各组动物的反应小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食，粪便性状。

8)实体瘤抑瘤率和体重增长的测定

各组连续给药7d后，于第8d脱颈椎处死小鼠，称取体重(处死体重)，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率。

抑瘤率％＝[(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]×100％。

体重增长(g)＝处死体重-原始体重-瘤重。

10)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，以(x±SD)表示。

11)实验结果

化合物6a-r对荷S₁₈₀肉瘤的体内抗肿瘤活性实验结果如表2所示。给药剂量均为8.9μmol/kg的化合物6a-r给药组，经连续腹腔给药7天以后，平均肿瘤重量为从0.71±0.18g到1.70±0.55g；阴性对照组的平均肿瘤重量为1.62±0.28，化合物6a-r中有12个化合物具有显著的抗肿瘤作用，其中化合物6b，i，l，m(瘤重范围为0.74±0.09g到0.85±0.21g，与阿糖胞苷阳性对照组比较p＞0.05)抗肿瘤活性与阿糖胞苷相当。化合物6d，e，h，p(瘤重范围为1.08±0.15g到0.94±0.16g，与生理盐水组比较p＜0.05)抗肿瘤活性与空白对照组具有显著性差异。从实验数据分析发现此类型化合物的抗肿瘤活性与R的1-取代基的性质有关，例如，当R基团为小的脂肪基团(甲基或异丙基)或者酸性基团(羧甲基、苯酚基)或者碱性基团(胍基和吲哚基)的化合物具有相当好的体内抗肿瘤活性。

表2本发明化合物6a-p对荷S₁₈₀小鼠肿瘤重量的影响^a

Arc(阿糖胞苷和6a-r给药剂量为8.9μmol/kg，NS＝溶媒，n＝12，平均瘤重表示为x±SD g；b)与NS比较p＜0.05，c)与NS比较p＜0.01，与阿糖胞苷比较p＞0.05；d)与NS比较p＜0.01，与阿糖胞苷比较p＜0.05；e)与NS、阿糖胞苷比较，其p＜0.01。

化合物6b，j，q为本发明化合物6a-p中体内抗肿瘤活性最为理想的化合物。在0.89，8.9和89.0μmol/kg剂量时它们对肿瘤的抑制作用剂量依赖性地增强(表3)。

表3不同剂量6b，j，q对荷荷S₁₈₀小鼠肿瘤重量的影响^a

a NS＝溶媒，n＝12，平均瘤重表示为x±SD g。

Claims

1.具有抗肿瘤活性的β-咔啉类生物碱衍生物，其结构式为通式I或II所示：

2.一种制备权利要求1所述通式I化合物的方法，包括以下步骤：

(1)制备3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(2)将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与氨基酸苄酯缩合，即得；其中，所述的氨基酸苄酯选自甘氨酸苄酯，丙氨酸苄酯，缬氨酸苄酯，亮氨酸苄酯，异亮氨酸苄酯，蛋氨酸苄酯，脯氨酸苄酯，苯丙氨酸苄酯，色氨酸苄酯，丝氨酸苄酯，苏氨酸苄酯，天冬酰胺苄酯，谷氨酰胺苄酯，酪氨酸苄酯，天冬氨酸苄酯，N^ω-苄氧羰基甘赖氨酸苄酯或组氨酸苄酯。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：在NaOH和NaBH₃CN存在下将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与氨基酸苄酯缩合。

4.一种制备权利要求1所述通式II化合物的方法，包括以下步骤：

(1)在多聚磷酸和苄醇存在下将L-谷氨酸转变为谷氨酸二苄酯；

(2)制备3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在NaOH和NaBH₃CN存在下将3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与谷氨酸二苄酯缩合。

6.按照权利要求2或4所述的方法，其特征在于，所述的3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯按照以下方法制备得到：

(1)在SOCl₂和甲醇存在下将L-色氨酸转变为L-色氨酸苄酯；

(4)在NaOH的MeOH溶液中将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯皂化，制备3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸；

(6)在HOAc、HCl和H₂O存在下将3S-1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯水解为3S-1-(2-羰乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯。

7.一种治疗肿瘤的药物组合物，由有效量的权利要求1所述的β-咔啉类生物碱衍生物和药学上可接受的载体或辅料组成。

8.权利要求1所述的β-咔啉类生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。