CN101891809A

CN101891809A - 一种藻蓝蛋白提取物的制备和应用

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Publication number: CN101891809A
Application number: CN2010102143872A
Authority: CN
Inventors: 陈英杰; 秦松; 李富超; 郭雪洁; 刘少芳; 董晓弟
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2010-11-24

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体说是一种藻蓝蛋白提取物的制备和应用。藻蓝蛋白提取物将螺旋藻粉在-20℃～4℃下通过反复冻融法破碎螺旋藻细胞壁得到粗提物；用质量分数为50-60％的硫酸铵沉淀粗提液得到蛋白质粗提物；而后采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，并用超渗除盐，即得藻蓝蛋白提取物溶液。主要由藻蓝蛋白组成，其水溶液的吸光度特点为A_620/280≈3.0±0.2，A_620/650≈2.2±0.1。本发明主要结合硫酸铵沉淀、双水相萃取和透析除盐等方法得到了藻蓝蛋白提取物，并将所得藻蓝蛋白提取物对S180肉瘤小鼠进行不同剂量给药，表现出良好的肿瘤抑制效果，并且对脾脏和胸腺并没有表现出明显的毒性。

Description

一种藻蓝蛋白提取物的制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体说是一种藻蓝蛋白提取物的制备和应用。

背景技术

螺旋藻是一种食品巨型藻，其营养价值得到了广泛报道。作为螺旋藻中的主要蛋白组成，藻蓝蛋白由α、β两种脱辅基蛋白和色基组成，在620nm具有最大吸收，在640nm具有较强的红色荧光特性。基于水溶性好，荧光强度高和抗氧化等性能，藻蓝蛋白既可以作为天然色素添加剂应用于食品和化妆品工业，同时又可以开发成荧光试剂用于医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域，另外作为一种重要的生理活性成分，还可以制成药品用于医疗保健上。目前，藻蓝蛋白的制备方法主要包括离子交换层析和凝胶过滤层析。这两种方法操作繁琐，很难实现大规模生产。因此，在保证蛋白活性的基础上，研发高效、经济可以大规模制备的分离技术成为藻蓝蛋白开发的关键。

鉴于藻蓝蛋白不仅可以提供人体必需的氨基酸，而且对肿瘤细胞有较强的亲和力，对多种肿瘤细胞表现出显著的杀伤效果，其营养及药学价值得到了广泛报道。最近的诸多数据表明，藻蓝蛋白具有抗氧化特性，并在涉及到活性氧的炎症，动脉粥样硬化，癌症等多种疾病的防治中表现出良好的药效。在十二种炎症模型中，藻蓝蛋白都表现出与剂量依存的消炎活性。利用其清除活性氧，抑制环氧酶-2活性和柱状细胞中组氨释放等作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种藻蓝蛋白提取物的制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种藻蓝蛋白提取物：将螺旋藻粉在-20℃～4℃下通过反复冻融法破碎螺旋藻细胞壁得到粗提物；用质量分数为50-60％的硫酸铵沉淀粗提液得到蛋白质粗提物；而后采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，并用超渗除盐，即得藻蓝蛋白提取物溶液。

所述藻蓝蛋白提取物水溶液的吸光度特点为A_620/280≈3.0±0.2，A_620/650≈2.2±0.1。所述藻蓝蛋白提取物为蓝色粉末状固体，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇和甲醇；其1mg/mL的水溶液在25℃时，相对黏度为1.03±0.01；在室温、避光、干燥的条件下可长期保存。

制备方法：将螺旋藻粉在-20℃～4℃下通过反复冻融法破碎螺旋藻细胞壁得到粗提物；用质量分数为50-60％的硫酸铵沉淀粗提液得到蛋白质粗提物；而后采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，并用超渗除盐，即得藻蓝蛋白提取物溶液。

所述藻蓝蛋白提取物溶液冷冻干燥，即得到藻蓝蛋白提取物。所述双水相萃取的水相质量组成分别为4％的PEG、15％的氯化钾和10％的pH7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾水溶液组成。所述超渗除盐采用30KDa的滤膜进行超渗除盐。

应用：所述藻蓝蛋白提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所具有的优点：本发明依次采用硫酸铵沉淀、双水相萃取和超渗除盐，避免了传统层析技术的弊端，可以大规模生产藻蓝蛋白提取物。将所得藻蓝蛋白提取物采用灌胃的方式将其对S180肉瘤小鼠进行不同剂量给药，结果表现出良好的肿瘤抑制效果，并且对脾脏和胸腺并没有表现出明显的毒性。与传统的化疗药物(环磷酰胺)相比较，其水溶性好、毒副作用低、给药方便。

附图说明

图1a.为本发明实施例制备过程各样品的紫外可见光谱表征图。

图1b.为本发明实施例制备藻蓝蛋白提取物的荧光光谱表征图。

图2a.为本发明实施例制备所得藻蓝蛋白提取物硫酸锌染色紫外成像电泳表征图。

图2b.为本发明实施例制备所得藻蓝蛋白提取物考马斯亮蓝染色成像电泳表征图。

图3a.为本发明实施例例制备所得藻蓝蛋白提取物在4℃时不同pH值磷酸盐溶液中的光谱稳定性图。

图3b.为本发明实施例例制备所得藻蓝蛋白提取物在25℃时不同pH值磷酸盐溶液中的光谱稳定性图。

具体实施方式

藻蓝蛋白提取物：

以螺旋藻藻粉为原料制备的藻蓝蛋白提取物主要由藻蓝蛋白组成。其水溶液的吸光度特点为A_620/280≈3.0±0.2，A_620/650≈2.2±0.1。

所述藻蓝蛋白提取物为蓝色粉末状固体，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇和甲醇；其1mg/mL的水溶液在25℃时，相对黏度为1.03±0.01；在室温、避光、干燥的条件下长期保存。

实施例1

制备：

称取10g市售螺旋藻藻粉(深圳生物科技公司)，悬浮于150mL水中搅拌混匀后，于-20～4℃反复冻融三次，破碎螺旋藻细胞壁，得到粗提物。将所得粗提物在9000rpm下离心10min取上清。将上清液中加入约44克硫酸铵，充分搅拌溶解，4℃静置4h后，9000rpm，离心10min弃上清。所得沉淀用30mL纯水溶解后，采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，其中双水相萃取条件为1.2kg双水相体系，其中各组成的质量分数分别为4％的PEG、15％的氯化钾、10％的pH 7.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾水溶液，充分振荡后，在40℃静置2小时充分分层取上相。将上清液利用30KDa的滤膜超渗除盐，纯化后蛋白溶液冷冻干燥得到可以室温保存的螺旋藻藻粉提取的藻蓝蛋白提取物。藻蓝蛋白提取物中主要成分为藻蓝蛋白，(参见图1a、b和图2a、b)，其水溶液的吸光度特点为A_620/280≈3.0±0.2，A_620/650≈2.2±0.1。

该方法将硫酸铵沉淀、双水相萃取和超渗等多种方法结合，避免了传统层析柱技术的弊端，有利于规模放大和工业生产。此外，本方法中硫酸铵沉淀后样品无需除盐，直接溶解进而通过一次双水相萃取技术，共同透析除盐实现了藻蓝蛋白提取物的制备，将藻蓝蛋白的纯度提高了6倍，与文献对比，提高了纯度效率，同时简化了操作步骤。

其中文献为Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2001，76：1273-1280.

图1a为室温下测定的制备过程中所得提取物水溶液的紫外可见吸收光谱。如图所示，反复冻融法破碎螺旋藻细胞后离心上清在260nm处具有较强的吸收峰，其A_620/280约为0.5，表明藻蓝蛋白的纯度很低，其中含有较多的核酸分子；经过硫酸铵沉淀的蛋白质粗提物在260nm处的吸收峰相对降低，A_620/280相对提高，这表明硫酸铵沉淀除去了部分核酸分子和杂蛋白；经过双水相萃取并超渗除盐后得到的藻蓝蛋白提取物在280nm和620nm处有明显的吸收峰，A_620/280约为3.0，A_620/650约为2.2，这表明双水相萃取和超渗步骤进一步出去了核酸分子和杂蛋白，所得到藻蓝蛋白提取物中主要成分为藻蓝蛋白。

图1b为室温下测定的藻蓝蛋白提取物水溶液的荧光光谱。如图所示，该藻蓝蛋白提取物在500nm的光激发条件下，其荧光发射峰在640nm处，这进一步证明了藻蓝蛋白提取物中主要成分为藻蓝蛋白。。

图2a、b分别为藻蓝蛋白提取物的5-12％SDS-PAGE不连续电泳的硫酸锌染色和考马斯亮蓝染色结果。电泳泳道从左到右依次为：反复冻融法破碎螺旋藻细胞破壁后的粗提物；制备所得藻蓝蛋白提取物；蛋白质Ma rker。如图所示，硫酸锌染色和考马斯亮蓝染色均可看到明显的α、β亚基条带。证明两种亚基上均连有色基，亚基的分子量大小约为18kDa和20kDa。

图3a、b分别为4℃和25℃时，pH 3.0～10.0磷酸盐溶液中，藻蓝蛋白提取物在620nm处的吸光度随时间的变化。由图可见，4℃时，该提取物的pH 5.0～7.0磷酸盐溶液在一周内吸收光谱基本稳定，其他pH值溶液在620nm的吸光度均表现不同程度的降低，且在第一天的降低最为明显，其中pH 10.0的磷酸盐溶液最不稳定。25℃时，该提取物pH 5.0的磷酸盐溶液在一周内的光谱较为稳定，pH 4.0、6.0、7.0的磷酸盐溶液从第三天开始620nm的吸光度显著降低，其他pH值溶液从第一天开始620nm的吸光度显著降低，其中pH 10.0的磷酸盐溶液最不稳定。由此可见，该提取物的水溶液适于在中性或者偏酸性环境低温避光保存。

实施例2

采用上述提取所得藻蓝蛋白提取物对移植S 180肉瘤小鼠的灌胃给药效果实验：

SPF昆明小鼠，18～22g，雄性，青岛药检所动物中心提供。S 180肉瘤瘤株移自中国医学科学院，本室传代，在无菌操作下，每鼠右前腋窝部皮下接种肿瘤细胞悬液0.2ml(镜检含瘤细胞数9×10⁷个/ml)。小鼠接种肿瘤细胞次日，按体重随机分5组，每组8只，于接种后24h给药。小鼠灌胃或腹腔注射药品均以生理盐水溶解，容积均按体重为0.1ml/10g。阴性对照组灌胃生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(CY)25mg/kg·d，大、中、小3个剂量给药组分别灌胃给药藻蓝蛋白提取物50mg/kg·d，100mg/kg·d和200mg/kg·d，连续给药10d。末次给药后24h，小鼠称重，处死后剥取瘤块、胸腺、脾脏，电子天平称湿重，按下列公式求出肿瘤抑制率、胸腺指数和脾指数，并用SPSS软件进行显著性检验(t检验)。

表1藻蓝蛋白提取物灌胃给药对小鼠S180肉瘤的抑制效果。

*代表与对照组对比有显著性差异，P＜0.05。

表1表明，与阴性对照组相比，25mg/kg·d环磷酰胺腹腔注射给药和50mg/kg·d，100mg/kg·d，200mg/kg·d藻蓝蛋白提取物灌胃给药10天，均能达到明显抑制S180肉瘤生长的效果，具有显著性差异。

表2藻蓝蛋白提取物灌胃给药对S180肉瘤小鼠的胸腺指数和脾指数的影响。

*代表与对照组对比有显著性差异，P＜0.05。

表2表明，与阴性对照组相比，25mg/kg·d环磷酰胺腹腔注射给药对小鼠的胸腺指数和脾指数造成显著性影响，而50mg/kg·d，100mg/kg·d，200mg/kg·d藻蓝蛋白提取物灌胃给药10天，未对小鼠的胸腺指数和脾指数造成显著性影响。

Claims

1.一种藻蓝蛋白提取物，其特征为：将螺旋藻粉在-20℃～4℃下通过反复冻融法破碎螺旋藻细胞壁得到粗提物；用质量分数为50-60％的硫酸铵沉淀粗提液得到蛋白质粗提物；而后采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，并用超渗除盐，即得藻蓝蛋白提取物溶液。

2.按权利要求1所述的藻蓝蛋白提取物，其特征为：所述藻蓝蛋白提取物水溶液的吸光度特点为A_620/280≈3.0±0.2，A_620/650≈2.2±0.1。

3.按权利要求1所述的藻蓝蛋白提取物，其特征为：所述藻蓝蛋白提取物为蓝色粉末状固体，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇和甲醇；其1mg/mL的水溶液在25℃时，相对黏度为1.03±0.01；在室温、避光、干燥的条件下可长期保存。

4.一种按权利要求1所述的藻蓝蛋白提取物的制备方法，其特征为：将螺旋藻粉在-20℃～4℃下通过反复冻融法破碎螺旋藻细胞壁得到粗提物；用质量分数为50-60％的硫酸铵沉淀粗提液得到蛋白质粗提物；而后采用双水相萃取纯化蛋白质粗提物，并用超渗除盐，即得藻蓝蛋白提取物溶液。

5.按权利要求4所述的藻蓝蛋白提取物的制备方法，其特征为：所述藻蓝蛋白提取物溶液冷冻干燥，即得到藻蓝蛋白提取物。

6.按权利要求4所述的藻蓝蛋白的制备方法，其特征为：所述双水相萃取的水相质量组成分别为4％的PEG、15％的氯化钾和10％的pH7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾水溶液组成。

7.按权利要求4所述的藻蓝蛋白提取物的制备方法，其特征为：所述超渗除盐采用30KDa的滤膜进行超渗除盐。

8.一种按权利要求1所述的藻蓝蛋白提取物的应用，其特征在于：所述藻蓝蛋白提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。