CN101899526A - 一种山羊产羔性状的分子标记选择方法 - Google Patents

Abstract

一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，以山羊基因组DNA序列为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1和P2在PCR条件下分别扩增KITL基因内含子1和6，根据琼脂糖凝胶电泳结果判定目的片段的大小；用限制性内切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR扩增产物后，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，引物P1的扩增产物存在2个碱基的突变；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物P2的PCR扩增产物，引物P2的扩增产物存在1个碱基的突变，然后对引物P1和P2的扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析，表明KITL基因由引物P1和P2检测的SNPs位点可作为山羊产羔数性状选择的分子标记。

Description

一种山羊产羔性状的分子标记选择方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，该方法采用检测山羊干细胞因子（Kit ligand，KITL）基因内含子1和6碱基突变多态性，并分析其对产羔数的影响，结果表明：KITL基因由引物P1和P2检测的SNPs位点可作为山羊产羔性状选择分子标记。 

背景技术

随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）技术的问世和电泳技术的改进，各种分子遗传标记技术随之兴起，这些技术给家畜的遗传改良和新品种的培育提供了新的途径和方法。特别是分子标记技术与常规育种技术相结合，孕育出一种全新的选种方式－标记辅助选择法 （Marker assistant selection）。它可以克服传统选种过程中根据表型选择导致的环境偏差和抽样误差，提高家畜选种的准确性和高效性，加快优良品种的选育，进一步推动我国畜牧业的发展。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换（以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤）以及颠换（嘌呤与嘧啶互换）所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG（核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后）二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs（cSNPs）、基因周边SNPs（pSNPs）和基因间SNPs（iSNPs）等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

Kit是976个氨基酸的蛋白，属于跨膜酪氨酸激酶受体家族III型，其成熟蛋白的分子量为125～160kDa。Kit的配体KitL（Kit ligand，stem cell factor，SCF）是248个氨基酸的单体，其中189个氨基酸在胞外域，23个氨基酸在跨膜部分，36个氨基酸在胞质区。KitL存在两种不同的形式，可溶性KitL（KitL1）和膜结合KitL（KitL2）。Kit和KitL在造血干细胞和肥大细胞的维持和生存上起作用。Kit和KitL还在配子形成、黑素形成、血细胞形成过程中起重要作用。Kit和KitL分别由Steel和White spotting基因编码，这两个位点突变的小鼠可以证明，Kit和KitL在PGCs的生存、迁移、增殖以及卵泡的发育中起作用。KitL通过与Kit结合，激活了调节细胞凋亡的信号通路，并激活了PI3K通路，PI3K通路在卵母细胞生长中起重要的调节作用。

在小鼠卵巢中，Kit在膜细胞和卵母细胞中表达，而KitL在颗粒细胞中表达。Kit 在卵子发生时期的卵原细胞有丝分裂过程中大量表达，并且在卵母细胞发育的所有时期都表达。KitL mRNA在早期有腔卵泡的颗粒细胞中表达很高，在后期有腔卵泡的颗粒细胞中表达下降。卵母细胞与颗粒细胞之间存在着重要的相互作用。卵母细胞在生长、增殖、成熟和受精的全过程中始终与颗粒细胞通过间隙连接保持着联系，这种联系对卵母细胞和颗粒细胞的生长和增生都很重要。因此，Kit 和KitL这一对受体-配体的相互作用，在卵母细胞和颗粒细胞的相互作用中也有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，该方法采用检测山羊干细胞因子（Kit ligand，KITL）基因内含子1和6碱基突变多态性，并分析多态性与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔性状之间的关系；结果表明：KITL基因由引物P1和P2检测的SNPs位点可作为山羊产羔性状选择的分子标记。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1和P2在PCR条件下进行扩增，筛查山羊KITL基因内含子2和6的碱基突变；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′- TTCCTATGAGGTTACCAATG -3′；

下游引物1R：5'- GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3'。

所述的引物P2如下：

上游引物2F：5′- AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3′；

下游引物2R：5'- ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3'。

所述的PCR扩增的条件是：15 μL反应体系，包括：10 μmol/L上下引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL；50 ng/μL DNA 模板0.6μL；超纯水7.25 μL；

所述的PCR反应程序如下：

利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，56.7℃退火35s，72℃延伸35s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

2）根据琼脂糖凝胶电泳对引物P1和P2的PCR扩增产物进行大小判定，用限制性内切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR扩增产物之后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，发现引物P1的PCR扩增产物存在2个碱基的突变，即316bp处有一个T→C的突变（L1位点），363bp处有一个G→T的突变（L2位点）；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测P2的PCR扩增产物，引物P2PCR扩增产物存在1个碱基的突变，即249bp处有一个G→C的突变（L3位点）。

3）然后对引物P1和P2的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析结果如下：

在L1位点，纯合型T₁T₁在316bp位的碱基是T，杂合型T₁C₁在316bp位的碱基是T\C，纯合型C₁C₁在316bp位的碱基是C；

在L2位点，纯合型G₂G₂在363bp位的碱基是G，杂合型G₂T₂在363bp位的碱基是G\T，纯合型T₂T₂在363bp位的碱基是T；

在L3位点，纯合型G₃G₃在249bp位的碱基是G，杂合型G₃C₃在249bp位的碱基是G\C，纯合型C₃C₃在249bp位的碱基是C。

本发明与现有技术相比，具有以下技术效果：

明确了与山羊产羔性状相关的功能基因KITL基因内含子1和6的3个SNPs，这3个突变能够作为一个山羊产羔数分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

本发明的方法为KITL基因的SNPs与山羊产羔性状关系的建立奠定了基础，以便用于山羊产羔性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

附图说明

图1是利用引物P1扩增KITL基因内含子1的琼脂糖电泳图，图中M表示：Marker；

图2是利用引物P2扩增KITL基因内含子6的琼脂糖电泳图，图中M表示：Marker；

图3是利用引物P1扩增KITL基因内含子1的RFLP检测图，图中，M表示：Marker；1，8和12表示：L₁（T316C）位点-T₁T₁ （316bp/170bp），L₂（G363T）位点-G₂T₂ （170bp/121bp/49bp）；2和10表示：L₁（T316C）位点-T₁T₁ （316bp/170bp），L₂（G363T）位点-T₂T₂ （170bp）；3表示：L₁（T316C）位点-T₁C₁ （486bp/316bp/170bp），L₂（G363T）位点-G₂G₂ （121bp/49bp）；4和9表示：L₁（T316C）位点-T₁C₁ （486bp/316bp/170bp），L₂（G363T）位点-T₂T₂ （170bp）；5表示：L₁（T316C）位点-T₁T₁ （316bp/170bp），L₂（G363T）位点-G₂G₂ （121bp/49bp）；6，7和11表示：L₁（T316C）位点-C₁C₁ （486bp），L₂（G363T）位点-T₂T₂ （486bp）；

图4是利用引物P1扩增KITL基因内含子6的SSCP检测图，图中，1，2和3表示：GG基因型；4和6表示：CC基因型；5表示：GC基因型；

图5是KITL基因内含子1的L₁位点的测序图；

图6是KITL基因内含子1的L₂位点的测序图；

图7是KITL基因内含子6的测序图（L₃位点）。

以下通过对山羊样本采集及基因组DNA提取、检测和浓度分析、山羊KITL基因内含子1和6扩增产物的聚丙烯凝胶电泳分析实施例来进一步对本发明作详细说明。

具体实施方式

 A、KITL基因内含子1和6的PCR扩增及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样5 mL，加入0.2 μL的ACD （柠檬酸2.4g；柠檬酸三钠6.6g；葡萄糖7.35g；定容至50mL，高压灭菌）抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本实施例采用了3个山羊群体共计681个母羊血样，具体为：西农萨能羊血样290份，采自陕西省千阳萨能羊种羊场；关中奶山羊血样193份，采自陕西周至绿色新世纪生物有限公司；布尔山羊血样198份，采自陕西麟游县波尔山羊种羊场。

 2、血样基因组DNA的提取、纯化

1）将冷冻血样室温解冻，转移500 μL至1.5 mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000 r/min离心10 min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

（2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1 h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

（3）加蛋白酶K 3μL（20 mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1 μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

（4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20 min，使其充分混匀；4℃，12000 r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

（5）加氯仿500μL，充分混匀20 min，4℃，12000 r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

（6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

（7）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用浓度为70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

（8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

（9）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

（10）500μL的DNA溶液中加入10% SDS 使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

（11）5℃保温10h左右。

（12）用苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合物和氯仿分别抽提一次，其中的苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合物和氯仿等体积。

（13）12000r/min 离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

（14）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

（15）倒掉液体，用浓度为70%乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

 3、DNA池的构建

（1）1%琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

（2）OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（μg/mL）= 50×OD₂₆₀值×稀释倍数

（3）品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50 ng/μL，然后从西农萨能奶山羊290个个体、浓度为50ng/μL的DNA的样品中取5μL混合构建成DNA池；按照同样的方法构建关中和布尔山羊的DNA池。

 4、PCR扩增引物设计

根据NCBI上GenBank提供的山羊KITL基因的序列（登录号：NC_007303）设计引物P1和P2，在PCR条件下分别扩增内含子1和6，筛查山羊KITL基因内含子1和6的突变。

引物P1如下：

上游引物1F：5′- TTCCTATGAGGTTACCAATG -3′；

下游引物1R：5'- GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3'。

引物P2如下：

上游引物2F：5′- AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3′；

下游引物2R：5'- ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3'。

 5、PCR扩增山羊KITL基因内含子1和6

分别以3个山羊群体的DNA池为模版，以引物P1和P2进行PCR扩增，反应条件及程序如下所示：

所述的PCR扩增的条件是：15 μL反应体系，包括：10 μmol/L上下引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL（2.5 U/μL）； 50 ng/μL DNA 模板0.6 μL；超纯水7.25 μL。

所述的PCR反应程序如下：

利用引物P1的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

利用引物P2的PCR反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，56.7℃退火35s，72℃延伸35s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

 6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1和2所示，可以清楚看到486bp（图1）和430bp（图2）的条带，说明目的基因片段扩增成功；

然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5 mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

（1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

（3）向胶块中加入等体积溶液PC，60 ℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

（5）向吸附柱中加入700 μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

（6）向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50 ℃温箱数分钟，彻底晾干。

（7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min，收集DNA溶液。

（8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上以3个山羊群体DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序，对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰是发生了单核苷酸突变；在西农萨能和关中奶山羊群体中，发现引物P1的扩增产物存在2个碱基的突变，即316bp处有一个T→C的突变（L1位点），363bp处有一个G→T的突变（L2位点）；在西农萨能奶山羊、关中奶山羊和布尔山羊群体中，引物P2扩增产物存在1个碱基的突变，即249bp处有一个G→C的突变（L3位点）。

 B、山羊KITL基因内含子1和6的3个SNPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

（1）利用引物P1对3个山羊群体681份基因组DNA进行PCR扩增，在西农萨能和关中奶山羊群体中，获得483个包含山羊KITL基因内含子1的DNA片段；然后利用如下方法对每个山羊的KITL基因内含子2进行基因分型，具体方法如下：

取引物P1的 PCR产物5 μL，10×NEB缓冲液0.2 μL，CviAⅡ内切酶0.5 μL，加超纯水至20μL，在37℃的条件下，孵育2h。取5 μL的酶切产物与1 μL上样缓冲液混合，点样于10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液中，在 4℃的条件下，110V衡压条件下电泳1.5h。电泳结束后，加入0.1%的硝酸银溶液中，于摇床上轻摇 10 min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2次，加入显色液（5g 的NaOH、0.1g的 Na₂CO₃，加入0.5mL甲醛，定容至250 mL），于摇床上轻摇 15min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2，拍照保存（图3）。

（2）利用引物P2对3个山羊群体681份基因组DNA进行PCR扩增，获得681个包含山羊KITL基因内含子6的DNA片段；然后利用如下方法对每个山羊的KITL基因内含子6进行基因分型，具体方法如下：

取引物P2的 PCR产物各5 μL，与5 μL的变性缓冲液（95%的甲酰胺、0.5mol/L的EDTA、0.025%二甲苯青FF和0.025%的溴酚蓝）混合， 95℃变性10 min，然后迅速放入冰水混合物中作用10 min，最后点样于10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液中，在 4℃的条件下， 250V电泳10min，之后150 V衡压条件下电泳4h。电泳结束后，加入0.1%的硝酸银溶液中，于摇床上轻摇10min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2次，加入显色液（5g的NaOH、0.1g的Na₂CO₃，加入0.5mL甲醛，定容至250mL），于摇床上轻摇15min，然后用蒸馏水洗涤凝胶2，拍照保存（图4）。

 C、不同基因型个体PCR产物的测序验证

将利用引物P1和P2的PCR产物的纯合基因型和杂合基因型个体各挑出10个送至上海生工进行正反向测序，测序结果如图5、6和7所示。

 D、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋……＋N_Aan）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai 表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；3个羊群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率的统计分析结果如表1所示。

 E、群体平衡性检验

某基因位点的Hardy-Weinberg平衡性检测采用皮尔逊  χ 2 统计量，其公式为：

,………………………

其中， m 为某一遗传位点基因型应有个数； i 为基因型序号； f i 代表第 i 个基因型的实际个体数量； n 为样本数量； p i 代表第 i 个基因型的理论频率。

山羊KITL基因内含子1和内含子6的SNPs的基因型分布、等位基因频率和Hardy-Weinberg平衡如表1所示。

表1：3个山羊品种的KITL基因的遗传结构分析

Note: LD = linkage disequilibrium. ^a represents strong linkage disequilibrium （r ²> 0.33）

由表1可以看出，在L₁位点，布尔山羊群体中不存在多态性，西农萨能奶山羊和关中奶山羊群体均处于哈代温伯格不平衡状态；在L₂位点，西农萨能奶山羊、关中奶山羊和布尔山羊群体均处于哈代温伯格不平衡状态，说明这3个山羊品种具有巨大的选种潜力。

 F、山羊KITL基因效应的关联分析

生产数据：西农萨能奶山羊、关中奶山羊和布尔山羊第1、2、3和4胎的产羔数。

关联分析样本：有完整产羔性状记录的关中奶山羊193头、西农萨能奶山羊290头和布尔山羊198头。

关联分析模型：

利用SPSS（13.0）软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影产羔性状的因素不同，考虑到场效应（Farm）、品种效应（Breed）、种公畜效应（S）、种公畜内母畜间效应（SD）、年龄（Age）、基因型效应（Genotype）及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijkmnpq =μ+ Farm_i + Breed_j + S_p+SD_q+Age_k+ Genotype_m +X_n＋e_ijkmnpq

其中：y_ijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应； Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应,如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Genotype，Breed×Age， Breed×Genotype， Age×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijkmnpq：随机误差；运用SPSS（13.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间产羔性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表2和3所示：

表2：西农萨能和关中奶山羊品种的KITL基因内含子1不同基因型组合与产羔数的关联分析

同一列中不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下表同。

表3：西农萨能奶山羊、关中奶山羊和布尔山羊品种的KITL基因内含子6不同基因型与产羔数的关联分析

统计结果显示，采用引物P1和P2扩增的山羊KITL基因内含子1和6与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数显著相关，因此，用引物P1和P2检测的SNPs位点可用作山羊产羔性状选择的分子标记。

Claims (1)

1. 一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1和P2在PCR条件下进行扩增，筛查山羊KITL基因内含子1和6的碱基突变；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′- TTCCTATGAGGTTACCAATG -3′；

下游引物1R：5'- GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3'。

所述的引物P2如下：

上游引物2F：5′- AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3′；

下游引物2R：5'- ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3'；

所述的PCR扩增的条件是：15μL反应体系，包括：10μmol/L的引物P1、P2的上下游引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL（2.5 U/μL）；50 ng/μL DNA 模板0.6 μL；超纯水7.25 μL。

所述的PCR扩增反应程序如下：

利用引物P1的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

利用引物P2的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30s，56.7℃退火35s，72℃延伸35s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2）根据琼脂糖凝胶电泳对引物P1和引物P2的PCR扩增产物进行大小判定，用限制性内切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR扩增产物之后，再采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，发现引物P1的PCR扩增产物存在2个碱基的突变，即316bp处有一个T→C的突变L1位点，363bp处有一个G→T的突变L2位点；采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测P2的PCR扩增产物，引物P2扩增产物存在1个碱基的突变，即249bp处有一个G→C的突变L3位点；

3）对引物P1和引物P2的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析结果如下：

在L1位点，纯合型T₁T₁在316bp位的碱基是T，杂合型T₁C₁在316bp位的碱基是T\C，纯合型C₁C₁在316bp位的碱基是C；

在L2位点，纯合型G₂G₂在363bp位的碱基是G，杂合型G₂T₂在363bp位的碱基是G\T，纯合型T₂T₂在363bp位的碱基是T；

在L3位点，纯合型G₃G₃在249bp位的碱基是G，杂合型G₃C₃在249bp位的碱基是G\C，纯合型C₃C₃在249bp位的碱基是C。

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