CN101899077A

CN101899077A - 朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷i的提取方法及应用

Info

Publication number: CN101899077A
Application number: CN2010102060314A
Authority: CN
Inventors: 刘忠英; 刘志强; 丁一迪
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS; Jilin University
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS; Jilin University
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2010-12-01

Abstract

本发明涉及朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法及应用。所述的提取方法，不仅可以避免因为色谱柱的的不可逆吸附而导致产率低，而且可以大量提取高纯度的淫羊藿次苷I。所述的提取方法，经高效液相色谱法进行含量测定，淫羊藿次苷I的质量提取率在60％以上，质量易控，方法简便快速。本发明对淫羊藿次苷I进行了药理方面的研究，证实淫羊藿次苷I具有对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血的保护作用。其具体表现在可以抑制T波的作用；可以抑制J点位移变化的作用。淫羊藿次苷I对豚鼠离体心脏有保护作用。其具体表现在可以增加豚鼠的冠脉流量。本发明得到的淫羊藿次苷I，其用于制备治疗心脏病的药物。

Description

朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法及应用

技术领域

本发明涉及朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法及应用。

背景技术

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epim edium brevi2cornum Maximl)、箭叶淫羊藿[E1 sagitta tum(Sieblet Zuecl)Maximl]、柔毛淫羊藿(E1 pubescen sMax2iml)、巫山淫羊藿(E1 wushanense T1 S1 Ying)或朝鲜淫羊藿(E1koreanam Nakai)的干燥地上部分，具补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿之功效，常用于治疗阳痿不举、小便淋漓、腰膝无力以及冠心病、慢性气管炎、神经衰弱和小儿麻痹等症。

现代化学成分研究显示，淫羊藿的主要有效成份是淫羊藿总黄酮(淫羊藿苷、淫羊藿次苷)和淫羊藿多糖，其总黄酮中的活性成分被认为是8位具有异戊烯基(及其衍生基团)的黄酮醇及其苷类。

现代药理学研究表明，淫羊藿黄酮具有调节机体免疫功能，增强雄性生殖功能，扩张血管，改善血液流变学，促进造血系统功能，抗氧化辐射，抗骨质疏松等多种功效。近年来，对淫羊藿苷的口服代谢研究表明，在肠道菌群的作用下，淫羊藿苷主要代谢成次苷和苷元，原型的生物利用度低。淫羊藿次苷I是淫羊藿苷的体内代谢产物之一，Lenoble等报道了淫羊藿次苷I对PDE-25酶具有很好的抑制作用。

目前，对淫羊藿总黄酮的提取工艺及淫羊藿苷的分离提取、理化性质、结构确证等研究已有大量报道，但对淫羊藿次苷I的提取方法研究甚少。

国内常以水或乙醇为溶剂(张琳，张瑾，现代中药研究与实践：Vol.18(5)2004，63-64)提取淫羊藿中总黄酮；采用柱色谱法(郑训海等，中草药：Vol.(11)2002，964-967)对淫羊藿中不同化学成分进行分离。国外也有采用柱色谱法分离提取淫羊藿次苷的报道(Lenoble，et al.″Compositions comprising icariside I and anhydroicaritin and methods for making the same″Unit States Patent 2002(6399579))。柱色谱分离纯化黄酮类化合物存在由不可逆吸附导致产率低的缺点，而且分离过程十分耗时、耗力，不利于黄酮化合物的大量分离提取。因此，虽然对淫羊藿中各类黄酮化合物的研究十分迫切，但由于分离提取困难，研究进展十分缓慢。

发明内容

为了消除因为柱色谱分离纯化黄酮类化合物存在由不可逆吸附导致产率低，而且分离过程十分耗时、耗力，不利于黄酮化合物的大量分离提取的缺点，本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法及应用，不仅可以避免因为色谱柱的的不可逆吸附而导致产率低，而且可以大量提取高纯度的淫羊藿次苷I，从而更加推动了对其研究的进展。

本发明的目的是提供朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，其步骤和条件如下：

a将朝鲜淫羊藿叶用是其质量15倍的体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用是朝鲜淫羊藿叶质量10倍的体积浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；

b滤液在50℃下减压蒸出溶剂，得到提取物，提取物中所含的水分不多于其质量的5％；

c用朝鲜淫羊藿叶质量2倍的无水乙醇溶解步骤b中所得到的提取物，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.05～0.15，在50℃水浴加热15～25小时，室温放置过夜，过滤；

d滤液在50℃减压浓缩至其体积的20％，加入朝鲜淫羊藿叶质量2倍的蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用体积浓度为20％的乙醇溶液洗涤，洗涤后的沉淀在50℃下真空干燥，得到淫羊藿次苷I粉末。

本发明的淫羊藿次苷I具有对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血的保护作用。其具体表现在可以抑制T波的作用；可以抑制J点位移变化的作用。还证实淫羊藿次苷I对豚鼠离体心脏有保护作用。其具体表现在可以增加豚鼠的冠脉流量，具体见实施例8-9。

本发明的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的应用，其用于制备治疗心脏病的药物。

有益效果：本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，不仅可以避免因为色谱柱的的不可逆吸附而导致产率低，而且可以大量提取高纯度的淫羊藿次苷I，从而更加推动了对其研究的进展。

本发明提供了朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法。经高效液相色谱法含量测定，淫羊藿次苷I的质量提取率在60％以上，质量易控，方法简便快速。

本发明对淫羊藿次苷I进行了药理方面的研究，证实淫羊藿次苷I具有对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血的保护作用。其具体表现在可以抑制T波的作用；可以抑制J点位移变化的作用。淫羊藿次苷I对豚鼠离体心脏有保护作用。其具体表现在可以增加豚鼠的冠脉流量。本发明的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的应用，其用于制备治疗心脏病的药物。

附图说明

图1实施例1的总黄酮含量测定的HPLC谱图。

图2为实施例2的200-600nm波长范围内的淫羊藿苷标准品的扫描图。

图3为实施例3的标准品淫羊藿苷在270nm下的标准曲线。

图4为实施例4所得到的淫羊藿次苷I单体200-800nm的紫外扫描图。

图5为实施例5所得到的淫羊藿次苷I的HPLC谱图。

图6为实施例6所得到的淫羊藿次苷I的HPLC谱图。

图7为实施例7所得到的淫羊藿次苷I的HPLC谱图。

上述图1、图5-图7中的液相条件如下：

梯度洗脱：波长272nm，流速：1ml/min，柱温：30℃，色谱柱：采用ODS-C₁₈填料色谱柱(4.6×250mm，5μm)岛津公司

具体实施方式

实施例1

称取朝鲜淫羊藿叶5克，用75mL体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用50mL的体积浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液，将滤液定溶至200mL。精密量取0.2mL滤液定溶至25mL的容量瓶中，在270nm下测定吸光度值为0.730；取10uL该溶液测其HPLC色谱图，HPLC色谱图结果见附图1。

实施例2

取2.30mg淫羊藿苷标准品于25mL容量瓶中，用甲醇定溶，其浓度为0.092mg/mL的淫羊藿苷标准溶液。在200～600nm下进行紫外扫描，270nm为淫羊藿苷最大吸光度值。结果见附图2。

实施例3

根据实施例2制备浓度为0.092mg/mL的淫羊藿苷标准溶液。分别取此标准溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于5mL的容量瓶中，甲醇定溶，配置成浓度分别为0.0184mg/mL、0.0276mg/mL、0.0368mg/mL、0.0460mg/mL、0.0552mg/mL的溶液，测定其吸光度值。绘制淫羊藿苷浓度相对于吸光度的标准曲线。根据标准曲线可以得出，实施例1中朝鲜淫羊藿总黄酮的提取率可达12％。结果见附图3。

实施例4

用质量含量为99％以上的淫羊藿次苷I单体配置浓度分别为0.0404mg/mL、0.1212mg/mL、0.2020mg/mL、0.2828mg/mL、0.3636mg/mL的淫羊藿次苷I标准溶液，分别取10uL进行高效液相考察。以峰面积对标准溶液浓度进行线性回归，得出工作曲线方程。结果见附图4。

质量含量为99％以上的淫羊藿次苷I单体的制备方法如下：

a按体积比为5∶5∶4.5∶5.5分别量取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水于1000mL的分液漏斗中，充分震荡，静置，放置过夜；

b以澄清的上相为固定相，下相为流动相，以10mL/min的流速使固定相充满螺旋管柱，然后螺旋管柱以1600rpm/min的速度旋转，稳定10min后，以1.0mL/min的速度泵入流动相，使体系达到流体动力学平衡；

c根据高速逆流色谱的进样系统选择进样体积，以1.0mg/mL的溶液浓度进样，下相溶解淫羊藿次苷I提取物样品，检测器波长为272nm，温度为10℃。其中所述的体积不得少于3mL；

d第一个出现的大峰不是淫羊藿次苷I，第二个出现的峰为朝鲜淫羊藿叶中提取的淫羊藿次苷I单体，溶液颜色呈荧黄色，经过冷冻干燥，得淫羊藿次苷I单体粉末。

实施例5

a称取朝鲜淫羊藿叶100克，用1500mL体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的质量浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；

b滤液在50℃下减压蒸出溶剂，，提取物中所含的水分不能多于其质量的5％；

c用200mL无水乙醇溶解b步骤中所得的提取物，用朝鲜淫羊藿叶质量2倍的无水乙醇溶解步骤b中所得到的提取物，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.05，在50℃水浴加热15小时，室温放置过夜，过滤；

d滤液在50℃减压浓缩至原体积的20％，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用浓度为20％乙醇溶液洗涤四次，每次用100mL，洗涤后的沉淀在50℃下真空干燥，得到得到淫羊藿次苷I提取物。该提取物称重为5.6760克。其HPLC色谱图结果见附图5。

实施例6

a称取朝鲜淫羊藿叶100克，用1500mL质量浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的质量浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；

b滤液在50℃下减压蒸出溶剂，得到的提取物中所含的水分不能多于其质量的5％；

c用200mL无水乙醇溶解b步骤中所得的提取物，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.15，在50℃水浴加热25小时，室温放置过夜，过滤；

d滤液在50℃减压浓缩至原体积的20％，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用浓度为20％乙醇溶液洗涤四次，每次用100mL，洗涤后的沉淀在50℃下真空干燥，得到得到淫羊藿次苷I提取物。该提取物称重为5.3560克。其HPLC色谱图结果见附图6。

实施例7

a称取朝鲜淫羊藿叶100克，用1500mL体积浓度为70％乙醇回流4小时，滤出乙醇提取液，将回流过的药渣用1000mL的体积浓度为70％乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，合并两次滤液；

c用200mL无水乙醇溶解b步骤中所得的提取物，加入浓盐酸，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.1，在50℃水浴加热20小时，室温放置过夜，过滤；

d滤液在50℃减压浓缩至原体积的20％，加入200mL蒸馏水析出沉淀，沉淀在50℃下用浓度为20％乙醇溶液洗涤四次，每次用100mL，洗涤后的沉淀在50℃下真空干燥，得到得到淫羊藿次苷I提取物。该提取物称重6560克。其HPLC色谱图结果见附图7。

实施例8

淫羊藿次苷对垂体后叶素诱发大鼠心肌缺血的保护作用

将雄性Wistar大鼠(180g-220g)40只，随机分成4组，每组10只，分别为模型对照组淫羊藿次苷组、复方丹参滴丸组。复方丹参滴丸组和1、2号样品组以200mg/kg的剂量灌胃相应的药物，每天一次，共7天，模型对照组灌胃等体积的蒸馏水。

第七天给药后30min，将大鼠用25％乌拉坦(1.2g/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，记录标准II导联心电图。5min后舌下静脉注射垂体后叶素0.5U/kg。在10s内推完。分别记录注射前(0s)及注射后第15，30s及1，2，5，10min的心电图，观察T波和J波的变化。

统计学处理：数据结果以

表示，进行F检验和组间t检验。

1.淫羊藿次苷I对T波的影响。结果见表1。

结论：淫羊藿次苷I组在注射PIT后的T波抬高均明显低于模型组，淫羊藿次苷有抑制T波的作用。

2.淫羊藿次苷I对J波的影响。结果见表2。

结论：淫羊藿次苷I在注射PIT后的J点位移变化均明显低于模型组，结果显示淫羊藿次苷I具有抑制J点位移变化的作用。

实施例9

淫羊藿次苷I对豚鼠离体心脏的保护作用

健康雄性豚鼠30只，体重为350g-380g，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，固定，打开胸腔，剪断腔静脉、主动脉及心脏周围组织，迅速摘出心脏置于4℃Krebs-Henseleit液(K-H液)中轻轻挤出心脏余血并适当修剪后，主动脉插管，置于Langendorf灌注装置行经主动脉灌注，K-H液灌流(K-H液成分如下(g/L)：NaCl 6.92，KCl 0.35，CaCI₂·2H₂O 0.38，KH₂PO₄ 0.16，MgSO₄0.29，NaHCO₃ 2.1，葡萄糖2.0，pH 7.4)装入密闭灌流瓶中，下放出一定量的灌流液，上与氧气瓶相连充入相应量的氧气(95％O₂，5％CO₂)，用力摇匀。超级恒温器维持灌流液恒温37℃，排尽灌流管道内空气。灌流压力由一插入灌流瓶底与大气相通的玻璃管维持恒定(灌流液面距心脏70cm)。用蛙心夹夹住心尖，经滑轮与弹簧装置连接到张力换能器，用BL-420生物机能实验系统记录心率；调节灌流液流速使心脏冠脉流量为5-8ml/min，心脏灌流适应10min后趋于稳定，测量每分钟冠脉流量，连续测3min，若相差不大，则取其平均值作为给药前冠脉流量。然后分别给淫羊藿次苷(6mg/ml)和阳性药(西地兰0.8mg/ml)，给药体积1mL，给药结束后连续测量10min内每分钟冠脉流量并开始记录心跳，以其平均值作为给药后的冠脉流量和心率。

统计学处理：数据结果以

表示，进行F检验和组间t检验。结果见表3。

结论：淫羊藿次苷I可以使大鼠离体心脏冠脉流量比给药前明显增加，具有显著性差异，淫羊藿次苷I有增加大鼠心脏冠脉流量的作用。

表3受试药物对豚鼠离体心脏冠脉流量的影响

组别

数量(只)

冠脉流量(ml/min)给药前给药后

心率(BPM)给药前给药后

淫羊藿次苷西地兰组

1010

6.64±0.67 7.72±0.71*6.73±0.76 7.86±0.66*

188.16±43.81 213.89±50.65186.56±37.66 218.18±46.28

与给药前比较：*P＜0.05。

Claims

1.朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，其步骤和条件如下：

2.如权利要求1所述的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的步骤c，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.05，在50℃水浴加热15小时，其余的同权利要求1。

3.如权利要求1所述的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的步骤c，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.15，在50℃水浴加热25小时，其余的同权利要求1。

4.如权利要求1所述的朝鲜淫羊藿叶中淫羊藿次苷I的提取方法，其特征在于，所述的步骤c，朝鲜淫羊藿叶质量克∶浓盐酸的体积mL为1∶0.10，在50℃水浴加热20小时，其余的同权利要求1。