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CN101888889A - 生物活性化合物的再生方法 - Google Patents

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CN101888889A CN2008801198366A CN200880119836A CN101888889A CN 101888889 A CN101888889 A CN 101888889A CN 2008801198366 A CN2008801198366 A CN 2008801198366A CN 200880119836 A CN200880119836 A CN 200880119836A CN 101888889 A CN101888889 A CN 101888889A
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Lang Technologies Pty Ltd
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Abstract

本发明涉及一种对来源于蔬果材料的生物活性化合物进行分离的方法。本发明还涉及一种从蔬果材料中提取生物活性化合物的方法。

Description

生物活性化合物的再生方法
技术领域
本发明涉及一种对从蔬果材料获得的生物活性化合物进行分离的方法。本发明同样涉及一种从蔬果材料提取生物活性化合物的方法。
背景技术
植物和蔬果物质含有一些在人体内具有生物活性的化合物，这些化合物能够提供有益的生理效应，包括降低发生癌症、心脏疾病和关节炎的风险。
在大量的植物和蔬果原料中都可以找到一些生物活性化合物。例如，柑橘类水果所含有的生物活性化合物可以包括在两大类中：柠檬苦素类化合物和黄酮类化合物。
柠檬苦素类化合物属于三萜类化合物，通常存在于柑橘类水果中。柠檬苦素类化合物可以以苷元的形式存在，或者链接于一个葡萄糖分子(葡萄糖苷)。最近发现，柠檬苦素类葡萄糖苷在动物体内具有强大的抗癌性能。
黄酮类化合物是一组苯并吡喃衍生物，广泛存在于植物中。典型地，黄酮类化合物是由一个苯环并上一个含氧原子的六元杂环组成的。许多黄酮类化合物也可以以糖苷的形式存在。在柑橘类水果中，最主要的黄酮类化合物是黄烷酮、芸香柚皮苷以及橘皮苷(橘子中)和柚皮苷(柚子中)。这些化合物能够降低高血脂个体的血液胆固醇水平。
柑橘中的黄酮类化合物同样包括多甲氧基黄酮。这组化合物以甲氧基取代黄酮为代表，并且只存在于柑橘中。多甲氧基黄酮具有广泛的生理效应，包括非常高的抗氧化能力，这提示了人们研究其作为有效的抗癌剂和抗炎剂的潜在用途。
多酚类化合物，如柑橘的柠檬苦素类化合物和黄酮类化合物，与其在能够提取果汁的内果皮中的浓度相比，其在果皮组织中具有极高的浓度。这些化合物在果皮组织中具有较高的浓度，有助于形成植物抵御细菌、真菌、酵母菌和昆虫的保护机制的基础。
柑橘皮是苦的，这通常是因为柠檬苦素类化合物以其苷元形式存在，而榨汁操作中除去的果皮通常会用石灰水处理、并通过压榨、脱水、制粒，用作原料进给。
最近，使用一些设备从柑橘类水果的果皮中提取水溶性化合物的柑橘加工行业已经在商业实践中兴起。所得到的稀释的水提取物(“果汁”)是苦的，通过流经一个合成的聚合物吸附剂进行净化(或部分净化)后，果汁可脱去苦味。这样，被聚合物吸附了的苦素能够与未被聚合物吸附的天然的糖类、酸性物质和一些风味化合物分离开。然而，大多数的柠檬苦素类化合物和黄酮类化合物同样可以与这些苦素一起被聚合物优先吸附。使用苛性钠溶液对聚合物进行处理，可以使这些化合物解吸附，从而使聚合物再生。然而，这种处理同样会破坏这些生物活性化合物，与没用的苛性钠溶液一起作为废液排走。
国际专利申请PCT/AU01/01113(WO 02/20112)已经公开了一种从柑橘类水果中提取生物活性化合物的方法。在该方法中，原始的柑橘提取物流经一个聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物，原料中的生物活性化合物会吸附在聚合物上。随后通过醇—水混合物的连续梯度洗脱，将这些生物活性化合物从脱苦味聚合物吸附剂上洗脱下来。由此可以从聚合物吸附剂上收集到三种不同的醇提取物，分别含有柠檬苦素类葡萄糖苷、黄烷酮糖苷和多甲氧基黄酮。
虽然这种方法能够从吸附剂聚合物中回收有价值的生物活性化合物，但是洗脱馏分中的生物活性化合物可能会发生混合，导致不同的生物活性化合物之间，特别是柠檬苦素葡萄糖苷与黄烷酮糖苷之间，没有完全分离开。这会引致较低的纯度，令配方困难。
解决这些问题中的部分或全部，并提供一种改进的方法用以从蔬果材料，如柑橘类水果中获得生物活性化合物，成为一种迫切的需要。
发明内容
本发明一方面涉及一种选择性分离生物活性化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使若干种生物活性化合物与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上，而至少一种生物活性化合物不吸附在该吸附剂上；以及
(b)收集含有至少一种未被该吸附剂吸附的生物活性化合物的溶液。
本发明另一方面涉及一种纯化生物活性化合物的方法，包括使生物活性化合物与一种离子交换树脂接触的步骤，其条件是生物活性化合物与该树脂之间发生离子相互作用，从而使生物活性化合物吸附在该树脂上。
本发明再一方面还涉及一种从蔬果材料中选择性提取生物活性化合物的方法，该方法包括使蔬果材料与一种溶剂接触的步骤，其条件是从蔬果材料中提取至少一种水溶性的生物活性化合物，由此提供一种含有该水溶性生物活性化合物的提取物以及含有至少一种水不溶性生物活性化合物的蔬果残渣。
本发明的又一方面是提供由上述方法制得的生物活性化合物。
本发明的再一方面是提供一种混合物，该混合物包括纯度在10％、50％或70％以上的柠檬苦素糖苷。
附图说明
图1是从橙皮中获得的一种典型原始提取物的HPLC色谱图，说明了其所含的化合物。
图2是橙皮提取物流经本发明的一个实施例所述的丙烯酸类聚合物吸附剂后，所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有糖类和有机酸类化合物。
图3是所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素葡萄糖苷(LG)。
图4是所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素葡萄糖苷、相关的柠檬苦素、诺米林葡萄糖苷和黄柏酮葡萄糖苷。
图5是所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有黄酮类橙皮苷和芸香柚皮苷。
图6是所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有黄酮类橙皮苷、芸香柚皮苷和新枳属苷。
图7是含有柠檬苦素类葡萄糖苷的溶液流经本发明的另一个实施例所述的阴离子交换树脂后，所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其并不含有柠檬苦素类葡萄糖苷。
图8是用一种盐溶液将阴离子交换树脂上的柠檬苦素类葡萄糖苷置换出来后，所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素类葡萄糖苷。
图9是在本发明的一个实施例所述的方法中，从丙烯酸类聚合物吸附剂(柱A)洗脱得到的橙皮提取物(OPE)馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素类葡萄糖苷。
图10是在本发明的一个实施例所述的方法中，从丙烯酸类聚合物吸附剂(柱A)洗脱得到的各个OPE馏分中，所获得的不同柠檬苦素类葡萄糖苷的相对含量曲线图。
图11是在本发明的一个实施例所述的方法中，采用40％的乙醇溶液对丙烯酸类聚合物吸附剂(柱A)进行洗脱后，所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有黄酮类化合物。
图12是在本发明的一个实施例所述的方法中，从丙烯酸类聚合物吸附剂(柱A)解吸附后获得的各个洗脱液馏分中，不同黄酮类化合物的相对含量曲线图。
图13是在本发明的一个实施例所述的方法中，从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(柱B)洗脱下一个OPE馏分后，所得到的残留果汁馏分的HPLC色谱图，说明其并不含有黄酮类化合物和柠檬苦素类葡萄糖苷。
图14是在本发明的一个实施例所述的方法中，采用30％的乙醇溶液对聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(柱B)进行洗脱后，所收集的一个洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素类葡萄糖苷化合物。
图15是在本发明的一个实施例所述的方法中，从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(柱B)解吸附后获得的各个洗脱液馏分中，不同的柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的相对含量曲线图。
图16是在本发明的一个实施例所述的方法中，采用0.5M的氯化钠溶液对一个弱碱性阴离子交换树脂(柱C)进行洗脱后，所收集的一个洗脱液的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素类葡萄糖苷。
图17是在本发明的一个实施例所述的方法中，从弱碱性阴离子交换树脂(柱C)解吸附后获得的各个洗脱液馏分中，不同的柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的相对含量曲线图。
图18是在本发明的一个实施例所述的方法中，采用50％的乙醇溶液对聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(柱D)进行洗脱后，所收集的洗脱液馏分的HPLC色谱图，说明其含有柠檬苦素类葡萄糖苷化合物。
图19是通过本发明的一个实施例所述的方法所获得的原始橙皮提取物(各个色谱图中的下方谱线)与浓缩的柠檬苦素类葡萄糖苷馏分(各个色谱图中的上方谱线)中，各成分的叠加的HPLC色谱图。
图20是本发明的一个实施例所述的，用于实现生物活性化合物的选择性分离的系统的示意图。
具体实施方式
本发明一方面涉及一种选择性分离生物活性化合物的方法。本发明的该方法能够将生物活性化合物从其它化合物中选择性地分离出来。
本文中所使用的术语“生物活性化合物”是指对活的有机体、组织或细胞具有某种效应的化合物或物质。本领域的技术人员可以理解，在大量的食物原料以及其它自然存在的物质中都能够找到生物活性化合物。根据本发明的一个实施例，生物活性化合物是从蔬果材料中获得的。
本文中所使用的术语“蔬果物质”和“蔬果材料”是指来源于植物的材料。在大量不同的蔬果物质或蔬果材料中都可以找到一些生物活性化合物。获得生物活性化合物的蔬果材料可以以任何形式存在。
在一个实施例中，蔬果材料来源于一种可食用的水果。可食用的水果包括西红柿、苹果、梨、葡萄、莓、核果和柑橘类水果。水果，例如葡萄，会含有大量的生物活性化合物，包括白藜芦醇等均二苯代乙烯，槲皮素和杨梅酮等黄烷酮，儿茶酚以及花青素。其它水果，例如苹果，也可以是儿茶酚、黄烷酮和二氢查尔酮等生物活性化合物的来源。此外，柑橘类水果会含有具有生物活性的柠檬苦素类化合物、黄酮类化合物以及多甲氧基黄酮。来源于可食用性水果的蔬果材料可以从水果的各个部分中获得，包括水果的果皮、果汁、内果皮、种子和果肉。
在另一个实施例中，蔬果材料来源于不属于可食用性水果的植物材料。这种植物材料包括植物的花、根、叶和茎。例如，甘蔗是一种非可食用性水果的植物材料，其含有多甲氧基黄酮和酚酸等生物活性化合物。
在另一个实施例中，蔬果材料是一种来源于植物材料的蔬果提取物。典型地，该蔬果提取物是含有从植物材料中回收的主要成分的液体或溶液。例如，该蔬果提取物为来源于橘皮的橘皮提取物。
尽管下文对本发明的详细论述将主要集中在从柑橘类水果中获得的生物活性化合物，应当理解的是，本发明并不限制于此，其同样适用于从其它植物和植物材料中获得的生物活性化合物。特别地，本发明可以用于分离具有不同物理特性的生物活性化合物。
本发明的一个方面提供一种分离生物活性化合物的方法，该方法包括步骤(a)，使若干种生物活性化合物与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上，而至少一种生物活性化合物不吸附在该吸附剂上。若干种生物活性化合物是指至少包括两种，优选的是包括两种以上的生物活性化合物。这些生物活性化合物优选的是以溶液的形式提供，这可以采用任何技术来制备。在一个实施例中，该溶液是一种从蔬果材料获得的提取物。
在一个实施例中，蔬果材料来源于一种柑橘类水果，例如橙子、柠檬、莱蒙、柚子、柑桔、橘子等。柑橘类水果的各个部分，包括水果的果皮和内果皮都可以提供这种蔬果材料。优选地，蔬果材料来源于柑橘皮。在按照本发明的一个方面所述的方法进行处理前，也可以采用任何合适的方法对蔬果材料进行预处理。
通过使蔬果材料与一种溶剂接触，将生物活性化合物从蔬果材料中提取出来，即可获得一种含有若干种生物活性化合物的溶液。这可以采用任何合适的溶剂。优选的溶剂是水。通过溶剂对蔬果材料的提取，可以采用本领域公知的任何合适的方法进行。对于来源于柑橘类水果的提取物溶液，该溶液将包含由柠檬苦素类和黄烷酮生物活性化合物、天然的糖类以及有机酸形成的混合物。若有需要，在按照本发明所述的方法进行处理前，可以先对该溶液进行预处理。例如，可采用的预处理有离心和过滤。这种预处理可以使溶液中悬浮的固体或者其它不想要的材料最少化。
这些生物活性化合物与聚合物吸附剂接触。该聚合物吸附剂至少对一种存在于该混合物中的生物活性化合物具有选择亲和力。由此，该生物活性化合物大量地吸附在该聚合物吸附剂上，从而被该吸附剂保留。再者，该聚合物吸附剂至少对一种存在于该混合物中的其它生物活性化合物不具有亲和力。因此，根据本发明，至少一种生物活性化合物不吸附在该吸附剂上。
可以使用任何合适的、能够选择性吸附至少一种生物活性化合物的聚合物吸附剂。解除理论的约束，相信有利的相互作用，例如离子或氢键作用，能增强给定的生物活性化合物在聚合物吸附剂上的吸附能力。在一个实施例中，该聚合物吸附剂为丙烯酸树脂。在一个实施例中，合适的聚合物吸附剂为丙烯酸酯。例如，聚甲基丙烯酸甲酯是其中的一种丙烯酸酯。聚甲基丙烯酸甲酯可以与一种合适的交联剂相交联，如乙二醇。优选的是，该聚合物吸附剂是非离子型的。其中一种适用于本发明的聚合物吸附剂是由Bucher Foodtech公司提供的Alimentech P495惰性吸附聚合物(Inert Adsorbent Polymer)。
聚合物吸附剂可以采用任何合适的形式和排布方式。在一个实施例中，该聚合物吸附剂是一种珠子状的丙烯酸树脂。这些珠子可以采用任何合适的形状或尺寸。该聚合物吸附剂可以采用任何合适的方法排布。在一个优选的实施例中，聚合物吸附剂排布在通道中，可以是柱子、容器或导管。例如，合适的排布方式有重力送料柱和快速色谱柱。也可以使用其它排布方式，例如移动床色谱装置。柱子的长度与其直径的比例至少为4∶1，优选地，至少为8∶1。该通道可以包含任何合适体积的吸附剂。
在一个实施例中，含有若干种生物活性化合物的溶液，施加在一个垂直排布的含有丙烯酸类聚合物吸附剂的柱子的顶部。尽管本发明所述的实施例，是将不同的溶液施加在一个垂直排布的柱子的顶部，本领域的技术人员可以理解，其它的排布方式以及引入溶液的方法，同样可以使用。例如，溶液可以从一个垂直排布的柱子的底部进料。可选地，若柱子是以完全水平的方式排布，则溶液可以从该水平柱的一端进料。
随后，溶液可渗透流过吸附剂。吸附剂上可以施加任意用量的溶液，而相关领域的技术人员可以理解，溶液的用量会取决于所使用的吸附剂的柱型和类型。溶液可以以任意的流速流过通道，只要能够使溶液与吸附剂充分接触。本领域的技术人员可以理解，合适的流速会取决于许多因素，包括装置的尺寸以及该方法是在实验室执行的还是在工业规模上执行的。
随着含有若干种生物活性化合物的溶液流经含有聚合物吸附剂的柱子，至少一种生物活性化合物充分吸附在聚合物吸附剂上。通过该吸附剂对至少一种生物活性化合物的保留，从而将该化合物从溶液中除去。
溶液流过柱子后，流出柱子并被收集。存在于溶液中的至少一种未被聚合物吸附剂吸附的生物活性化合物，同样随着该溶液流出柱子。洗脱并流出柱子的溶液也就是洗脱液。因此本发明的这一方法还包括步骤(b)，收集含有至少一种未被吸附剂吸附的生物活性化合物的溶液。该至少一种未被吸附剂吸附的生物活性化合物，可以收集在一个单一的洗脱液馏分中或者收集在多个馏分中。其它未被聚合物吸附剂吸附的成分，也会存在于所收集的馏分中。可以通过任何合适的方法对所收集的溶液(洗脱液)进行分析，判断其中是否存在生物活性化合物。优选的方法包括使用高效液相色谱法(HPLC)。如下文所述，所洗脱的生物活性化合物可以进行附加的处理，以进一步纯化该生物活性化合物。
在一个实施例中，该若干种生物活性化合物包含由黄酮类和柠檬苦素类生物活性化合物组成的混合物，而该聚合物吸附剂是一种能够分离黄酮类和柠檬苦素类化合物的吸附剂。优选地，该聚合物吸附剂是一种丙烯酸树脂，更优的是一种丙烯酸酯，而甚至更优的是聚甲基丙烯酸甲酯。已经发现，丙烯酸类聚合物吸附剂能选择性结合具有生物活性的黄烷酮及其衍生物，例如黄烷酮糖苷，其结合力远强于与柠檬苦素类化合物的结合力，例如柠檬苦素类葡萄糖苷。这种选择性吸附使得黄烷酮能够充分保留在吸附剂上，而柠檬苦素类葡萄糖苷化合物则不被该吸附剂所保留。在这种方法中，两组生物活性化合物被充分分离开。在该方法的一种形式中，这两组生物活性化合物被完全分离开。其它化合物，如天然的糖类和有机酸，也不被该吸附剂所保留。因此，当丙烯酸树脂吸附剂设置在一个柱子中，天然的糖类和有机酸会在柠檬苦素类葡萄糖苷之前，快速地流出该柱子，而黄酮类化合物则不流出该柱子。因此，根据本发明的一个方面，黄烷酮糖苷与柠檬苦素类葡萄糖苷可充分地分离开。
在另一个实施例中，除了黄酮类化合物和柠檬苦素类葡萄糖苷以外，该若干种生物活性化合物还可以包含其它的生物活性化合物，例如多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷。在本实施例中，该聚合物吸附剂能够连同黄酮类化合物一起吸附多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷。因此，本发明的这一方法能够将这些化合物与柠檬苦素类葡萄糖苷以及天然存在的糖类和有机酸等极性小分子成分充分地分离开。
根据本发明的一个方面，该方法可包括步骤(c)，使吸附在步骤(a)的聚合物吸附剂上的至少一种生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物能从该吸附剂上解吸附下来；以及步骤(d)，将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
当聚合物吸附剂被排布在一个通道中，例如一个柱子中时，洗脱剂通常是以等分试样或者作为一种连续蒸汽，被引入到柱子的顶部，并渗透流过吸附剂。引入等分试样时，可以采用洗脱剂的一个或多个等分试样。洗脱剂将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来，并携带该生物活性化合物流出柱子。优选地，以一个预设的流速将洗脱剂送进通道中，该流速可以在每小时1-5倍床体积之间变动，优选的流速是每小时1-2倍床体积。
洗脱剂可以包括任何合适的溶剂或混合溶剂。优选的是，选用那些可允许用于食物产品中的溶剂或混合溶剂。一种优选的溶剂是水溶性溶剂。在一个实施例中，洗脱剂包括醇和水。
洗脱剂含有醇时，任何浓度的醇都可以使用。在一个实施例中，洗脱剂中的醇浓度大约在10％(v/v)至80％(v/v)之间的范围内。本领域的技术人员可以理解，所使用的醇浓度可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。此外，任何合适的醇都可以使用在洗脱剂中。在一个实施例中，所使用的醇为乙醇。
在一个实施例中，将至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是基本保持不变的。一个优选的醇浓度约为40％(v/v)。在另一个实施例中，将至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。优选地，醇浓度从约为20％(v/v)递增至约为80％(v/v)。醇浓度可以以一个基本不变的速率递增，或者以一个阶梯式的方式递增。当洗脱剂设有梯度变化的醇浓度时，醇含量逐步递增的洗脱剂等分试样可以连续引入到柱子的顶部。
流出柱子后，所得到的洗脱液随后可以收集在多个馏分中。至少收集一个对应于含有解吸附的生物活性化合物的馏分，优选的是收集多个这样的馏分。
尽管在本方法的一些实施例中，强调分级收集法是有利的，然而非分级收集法也包括在本发明的范围内。例如，目标生物活性化合物可吸附在聚合物吸附剂上，而杂质分子则简单地流过柱子成为废弃物。当所有杂质分子都从聚合物吸附剂基质上除去以后(例如采用一种不会解吸附目标生物活性化合物的溶液对基质进行洗涤)，可以应用一种适当的溶液将目标生物活性化合物解吸附下来，目标化合物批量收集在一个单一的容积中。
对馏分或批量收集的容积进行分析，测定其中的生物活性化合物的量。优选的分析方法包括使用高效液相色谱法(HPLC)。在一个实施例中，黄烷酮及其衍生物吸附在聚合物吸附剂上，因此所收集的馏分含有解吸附的黄酮类化合物。
除了具有生物活性的黄酮类化合物以外，多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷同样吸附在聚合物吸附剂上时，用于除去黄酮类化合物的洗脱剂不会将多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷从吸附剂上解吸附下来。由此，在黄酮类化合物的解吸附过程中，多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷会保持结合在聚合物吸附剂上。因此，根据本发明的另一个方面，黄酮类化合物可以与多甲氧基黄酮和/或柠檬苦素苷充分地分离开。
若有需要，在黄酮类化合物解吸附以后，可以采用一种合适的溶液对聚合物吸附剂进行洗涤，以将任何吸附在其上的多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷除去，从而使聚合物吸附剂再生以再次使用。任何合适的溶液都可以用于除去吸附在聚合物吸附剂上的多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷。一种可以用于解吸附多甲氧基黄酮和柠檬苦素苷的溶液是0.5M的氢氧化钠溶液。
在本发明的另一个方面，未被聚合物吸附剂所吸附的生物活性化合物可以作进一步的纯化。根据本发明的这个方面，该方法可以包括步骤(e)，使从步骤(b)获得的含有至少一种生物活性化合物的溶液与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上；以及步骤(f)，收集从该聚合物吸附剂上洗脱下来的溶液。
与之前使用的聚合物吸附剂不同，用于步骤(e)中的聚合物吸附剂是选用那些能够与溶液中存在的生物活性化合物相结合的任何聚合物吸附剂。优选地，该聚合物吸附剂能够吸附非极性的化合物。一种优选的聚合物吸附剂是聚苯乙烯—二乙烯基苯。可能同时存在于该溶液中的极性成分，如天然的糖类和简单的有机酸，不会被该聚合物吸附剂所吸附，并随着溶液一起流出该聚合物吸附剂，被洗脱出来。一种市售的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂是由罗门哈斯(Rohm and Haas)公司生产的Amberlite XAD-16。
用于步骤(e)中的聚合物吸附剂，可以采用任何合适的形式和排布方式。在一个实施例中，该聚合物吸附剂是一种珠子状的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物。这些珠子可以采用任何合适的形状或尺寸。这些珠子可以采用任何合适的方法排布。优选的是将这些珠子排布在通道中，也就是将珠子包裹在柱子、容器或导管中。该通道可以包含任何合适体积的吸附剂。在本发明的一个优选的实施例中，用于步骤(e)中的聚合物吸附剂的床体积与用于上述步骤(a)中的聚合物吸附剂的床体积相等。例如，若用于步骤(a)中的聚合物吸附剂的床体积至少约为250升，则用于步骤(e)中的聚合物吸附剂的床体积同样至少约为250升。然而，相关领域的技术人员可以理解，用于步骤(e)中的聚合物吸附剂的体积，可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。
在一个实施例中，从步骤(b)获得的含有至少一种生物活性化合物的溶液，被施加在一个含有聚合物吸附剂的柱子的顶部，并渗透流过该吸附剂，再与步骤(e)中的聚合物吸附剂接触。在一个实施例中，当溶液含有具有生物活性的柠檬苦素类化合物及其衍生物，如柠檬苦素类葡萄糖苷时，在溶液流过该聚合物吸附剂通道的过程中，柠檬苦素类化合物会与该聚合物吸附剂结合，并由此从溶液中除去。溶液穿过该通道，流出该通道和聚合物吸附剂后，收集为一个洗脱液。在一个实施例中，所收集的溶液(或洗脱液)含有糖类和简单的有机酸，洗脱的溶液可以称为一个纯化的“果汁”成分。已经发现，根据本发明的方法所获得的果汁是中性的而且没有苦味。预期的是，该纯化的“果汁”成分可以被离析，并且若有需要，可以作进一步的处理，以用作食物产品中的增补剂，例如饮料。
根据本发明的一个实施例，一旦溶液从吸附剂洗脱下来，可以将至少一种生物活性化合物从步骤(e)的聚合物吸附剂上解吸附下来。由此，本发明可进一步包括步骤(g)，使吸附在步骤(e)的聚合物吸附剂上的至少一种生物活性化合物，与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及步骤(h)，将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。洗脱剂的一个或多个等分试样，或者洗脱剂的一个连续蒸汽，都可以用于将至少一种生物活性化合物从聚合物吸附剂上解吸附下来。
与上述将生物活性化合物从步骤(c)中的聚合物吸附剂上解吸附下来所使用的洗脱剂类似，步骤(g)所使用的洗脱剂可以包括任何合适的溶剂或混合溶剂。优选的是，选用那些可允许用于食物产品中的溶剂或混合溶剂。一种优选的溶剂是水溶性溶剂。在一个实施例中，洗脱剂包括醇和水。洗脱剂含有醇时，任何合适浓度的醇都可以使用。在一个实施例中，洗脱剂中的醇浓度大约在10％(v/v)至80％(v/v)之间的范围内。本领域的技术人员可以理解，所使用的醇浓度可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。此外，任何合适的醇都可以使用。一种优选的醇是乙醇。
在一个实施例中，将至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是基本保持不变的。优选的是，洗脱剂约含40％(v/v)的乙醇。在另一个实施例中，将至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。优选地，醇浓度从约为10％(v/v)递增至约为80％(v/v)。醇浓度可以以一个基本不变的速率递增，或者以一个阶梯式的方式递增。当洗脱剂设有梯度变化的醇浓度时，醇含量逐步递增的洗脱剂等分试样可以连续引入到含有聚合物吸附剂的柱子的顶部。
根据步骤(h)，从聚合物吸附剂上洗脱下来的生物活性化合物通常收集在一个洗脱液馏分中。洗脱液馏分是指一种由生物活性化合物以及用于将该生物活性化合物从聚合物吸附剂上洗脱下来的溶剂所组成的溶液。至少收集一个对应于含有该生物活性化合物的馏分，优选的是收集多个这样的洗脱馏分。在本发明的一个优选的实施例中，所收集的洗脱馏分含有柠檬苦素类化合物，例如柠檬苦素葡萄糖苷。若收集多个洗脱馏分，这些洗脱馏分可以合并在一起以形成一个单一的馏分。此外，如上所述，若有需要，也可以使用非分级收集法，使得目标生物活性分子收集在一个单一的总容积中。
在含有柠檬苦素类化合物的情况下，若需要将所选择的柠檬苦素类化合物彼此分离开，则使用一种醇浓度在柠檬苦素类化合物的解吸附过程中逐步递增的洗脱剂会较有利。不同的柠檬苦素类化合物具有不同的化学结构，因此拥有不同的极性。因此，使用浓度梯度变化的醇，会有助于根据柠檬苦素类化合物的不同极性而将它们分离开。根据洗脱剂中的醇浓度递增的顺序，极性最大的柠檬苦素葡萄糖苷最先从聚合物吸附剂上洗脱下来，随后为诺米林葡萄糖苷、诺米林酸葡萄糖苷和黄柏酮葡萄糖苷。相关领域的技术人员可以调整洗脱剂中的醇浓度，并通过采用HPLC等分析方法对柠檬苦素类化合物的洗脱进行监控，判断是否达到理想的分离。
在本发明的一些实施例中，从聚合物吸附剂上洗脱下来的生物活性化合物，可以作进一步的处理，以纯化和浓缩这些生物活性化合物。
在另一个方面，本发明涉及一种纯化生物活性化合物的方法，该方法包括使生物活性化合物与一种离子交换树脂接触的步骤，其条件是生物活性化合物与树脂之间发生离子相互作用，从而使生物活性化合物吸附在树脂上。
根据本发明的一个方面所述的方法，至少一种生物活性化合物从一种聚合物吸附剂上洗脱下来，该方法可进一步包括使所洗脱的生物活性化合物与一种离子交换树脂接触的步骤，其条件是至少一种生物活性化合物与树脂之间发生离子相互作用，从而使至少一种生物活性化合物吸附在树脂上。
在一个实施例中，需要纯化的生物活性化合物是在上述的步骤(h)中，从聚合物吸附剂洗脱下来的生物活性化合物。在该实施例中，生物活性化合物通常是与洗脱液溶剂一起，以溶液的形式提供的。这是本发明的一个优点，该含有生物活性化合物的溶液(或洗脱液)可以直接施加在离子交换树脂上，在该生物活性化合物暴露于该离子交换树脂前，无需通过蒸发或者其它方法将多余的乙醇从溶液中除去。
在一个实施例中，该离子交换树脂是一种阴离子交换树脂，优选的是一种弱碱性阴离子交换树脂。例如，可用于本发明的弱碱性阴离子交换树脂有Supelo公司提供的Diaion WA-30树脂。
该离子交换树脂可以采用任何合适的形式和排布方式。一些合适的形式和排布方式对相关领域的技术人员来说是显而易见的。该树脂可以排布在通道中，也就是可以将树脂包裹在一个柱子中，例如重力送料柱或快速色谱柱。该通道可以包含任何合适体积的树脂。在一个实施例中，该离子交换树脂的床体积约为用于上述步骤(a)中的聚合物吸附剂的床体积的20％。例如，若用于步骤(a)中的聚合物吸附剂为100升，则该离子交换树脂可仅需要20升。然而，本领域的技术人员可以理解，该离子交换树脂所需要的体积，可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。
在一个实施例中，含有该生物活性化合物的溶液被引入到一种填装在柱子中的树脂的顶部，并渗透流过该树脂。在该方法中，可实现生物活性化合物与离子交换树脂之间的接触。
树脂与生物活性化合物之间的离子相互作用，使得例如柠檬苦素类葡萄糖苷的生物活性化合物选择性吸附在该树脂上。可能存在的，但不能参与这种离子相互作用的其它成分，将不会结合在该树脂上。由此，该生物活性化合物可以被浓缩，并且进一步与任何可能会污染这些生物活性化合物的、不想要的成分分离开。
吸附在离子交换树脂上的生物活性化合物，可以通过使离子交换树脂与一种含有合适溶质的溶液接触来进行回收，其条件是能将生物活性化合物从树脂上置换出来。溶质可以选用那些能够与生物活性化合物竞争离子交换树脂上的结合位点的物质。一种优选的溶质是盐，例如氯化钠。溶质可以以任何合适的浓度存在。在一个实施例中，该溶液是0.5M的氯化钠溶液。
在一个实施例中，该生物活性化合物为柠檬苦素类葡萄糖苷，一种含有盐溶质的溶液流过一个含有离子交换树脂的通道。该溶液的一个或多个等分试样，或者该溶液的一个连续蒸汽，可以被引入到含有离子交换树脂的通道中。其中的盐竞争性地结合到该树脂上，并将柠檬苦素类葡萄糖苷从该树脂上置换出来。随后，随着溶液流出该通道，可收集到解吸附的柠檬苦素类葡萄糖苷。解吸附的柠檬苦素类葡萄糖苷可以收集在一个单一的馏分中或收集在多个馏分中，也可以收集在洗脱溶液的总容积中。
收集该生物活性化合物以后，优选的是除去所收集馏分中存在的所有溶质。溶质可以通过任何合适的方法除去。在一个优选的实施例中，通过使馏分与一个聚合物吸附剂接触，将溶质除去，其条件是该生物活性化合物吸附在该吸附剂上。
任何合适的聚合物吸附剂都可以使用。优选地，该聚合物吸附剂能够吸附非极性的化合物。一种优选的聚合物吸附剂是聚苯乙烯—二乙烯基苯。例如，合适的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂有罗门哈斯(Rohm and Haas)公司生产的Amberlite XAD-16。与上文所述的聚合物吸附剂类似，该吸附剂可以呈珠子状，排布在一个通道中，例如一个柱子中。该聚合物吸附剂可以采用任何合适的体积。在一个实施例中，该聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物树脂的床体积可以约为上述步骤(a)中使用的聚合物吸附剂的床体积的20％。然而，本领域的技术人员可以理解，该聚合物树脂所需要的体积，可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。
在一个实施例中，所收集的含有该生物活性化合物的溶液被施加到柱子的顶部，并渗透流过吸附剂。若该生物活性化合物含有柠檬苦素类化合物，该柠檬苦素类化合物会结合于聚合物吸附剂，并充分保留在该聚合物吸附剂上。同时，溶质不会结合于吸附剂并会从吸附剂上洗脱下来。在该方法中，柠檬苦素类生物活性化合物与不想要的溶质分离开。
随后可以按照前述的步骤，通过使该聚合物吸附剂与一种洗脱剂接触，并将该生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来，从而将该生物活性化合物从该聚合物吸附剂上解吸附下来。一种优选的洗脱剂包括由醇和水组成的混合物。任何合适浓度的醇都可以使用。在一个实施例中，洗脱剂的含醇量大约在10％(v/v)至80％(v/v)的范围内。此外，任何合适的醇都可以使用。一种优选的醇是乙醇。
洗脱剂中的醇浓度可以是基本保持不变的。在一个优选的实施例中，洗脱剂至少约含有40％(v/v)的乙醇，更优的是，约含有70％(v/v)的乙醇。可选地，在至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，醇的浓度是递增的。若醇的浓度在生物活性化合物的解吸附过程中是递增的，则醇含量可以以一个基本不变的速率递增，或者以一个阶梯式的方式递增。在一个实施例中，在至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度可以从约为10％(v/v)递增至约为80％(v/v)。
所洗脱的生物活性化合物随后收集在至少一个对应于含有该生物活性化合物的馏分中，优选的是收集在多个这样的馏分中。该生物活性化合物的存在可以通过任何合适的方法进行分析。例如，一种合适的方法是高效液相色谱法(HPLC)。已经发现，所获得的生物活性化合物的纯度比使用现有方法制得的生物活性化合物的纯度更高。
在另一方面，本发明涉及由本文所述的方法制得的纯化的生物活性化合物。在一个实施例中，该生物活性化合物为柠檬苦素类化合物，更优的是柠檬苦素类葡萄糖苷。在另一个实施例中，该纯化的生物活性化合物为黄酮类化合物，更优的是黄烷酮糖苷。
在再一方面，本发明涉及一种从蔬果材料中选择性提取生物活性化合物的方法，该方法包括使蔬果材料与一种溶剂接触的步骤，其条件是从蔬果材料中至少提取一种水溶性的生物活性化合物，由此提供一种含有该水溶性生物活性化合物的提取物以及至少含有一种水不溶性生物活性化合物的蔬果残渣。在一个优选的实施例中，用于接触该蔬果材料的溶剂为水。由此，在该实施例中，会形成一种至少含有一种水溶性生物活性化合物的水提取物。
本文所使用的术语“蔬果材料”是指来源于植物的材料。该蔬果材料可以以本文所述的任何形式存在。在按照本发明所述的方法进行处理前，也可以采用任何合适的方法对该蔬果材料进行预处理。在一个实施例中，蔬果材料可以来源于一种可食用的水果，例如本文所述的那些水果。蔬果材料可以来源于一种柑橘类水果，例如橙子、柠檬、莱蒙、柚子、柑桔、橘子等。柑橘类水果的各个部分，包括水果的果皮和内果皮都可以提供这种蔬果材料。在一个实施例中，该蔬果材料可以来源于柑橘皮。该蔬果材料也可以是一种来源于植物材料的蔬果提取物。
可以采用任何合适的技术使溶剂与蔬果材料接触。在一个实施例中，采用一种逆流提取器使溶剂与蔬果材料接触，由此从该蔬果材料中至少提取一种水溶性的生物活性化合物。在另一个实施例中，对该蔬果材料进行处理，使得该蔬果材料以粒状的形式放置。浸渍的蔬果材料随后被滚压机辗压，以将含有水溶性生物活性化合物的果汁压榨出来。在一个实施例中，该蔬果材料含有柠檬苦素葡萄糖苷等柠檬苦素类化合物以及黄烷酮糖苷等黄酮类化合物，这些都是水溶性的生物活性化合物。
从蔬果材料中提取水溶性的生物活性化合物，可以在任何合适的条件下进行。在一个实施例中，蔬果材料是在至少70℃的温度下进行处理，通常是一个短时间的处理。在该方法的一个实施例中，蔬果材料是在至少70℃的温度下处理2min。不受理论的约束，我们认为：高温处理的步骤虽然有助于破坏氧化酶和微生物，但可能对想要的终产物不利。高温同样可以促进蔬果材料的细胞结构的破裂，使得蔬果材料中的水溶性化合物能够分散到逆流的溶剂中。随后，可以将该蔬果材料的温度降低，从而使目标化合物的提取最优化。
从蔬果材料中提取了水溶性的生物活性化合物以后，会留下蔬果残留物。该蔬果残留物可以至少含有一种水不溶性生物活性化合物，该水不溶性生物活性化合物不会在初始的溶剂提取步骤中被除去。该蔬果残留物可以是固体的形式或液体的形式，这取决于该蔬果材料的初始形式。
在本发明的另一个方面，所得到的蔬果残留物可以与一种含有醇的提取溶液接触，从而从该蔬果残留物中至少提取一种水不溶性生物活性化合物。该溶液可以在任意条件下，与该蔬果残留物接触任意时间，只要足以从该残留物中提取至少一种水不溶性生物活性化合物即可，由此可提供一种至少含有一种水不溶性生物活性化合物的醇提取物。在一个实施例中，蔬果材料以及由此获得的蔬果残留物，含有作为水不溶性生物活性化合物的多甲氧基黄酮。
可以采用任何合适的技术使提取溶液与蔬果残留物接触，并由此从该残留物中提取至少一种水不溶性生物活性化合物。在一个优选的实施例中，采用逆流提取器。
与蔬果残留物接触的提取溶液可以含有任何合适含量的醇。在一个实施例中，提取溶液包括由醇和水组成的混合物。优选地，提取溶液至少约含有10％的醇，而更优的是，至少约含有20％的醇。任何合适的醇都可以使用。一种优选的醇是乙醇。
若有需要，随后可以使至少含有一种水不溶性生物活性化合物的醇提取物，与一种聚合物吸附剂接触，其条件是该水不溶性生物活性化合物吸附在该吸附剂上。这通过将该水不溶性生物活性化合物与不被吸附剂保留的所有杂质分离开，有助于进一步纯化该水不溶性生物活性化合物。优选地，该聚合物吸附剂吸附非极性的化合物。一种优选的聚合物吸附剂是聚苯乙烯—二乙烯基苯。例如，一种合适的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂是由罗门哈斯(Rohm and Haas)公司生产的Amberlite XAD-16。
该聚合物吸附剂可以采用任何合适的形式和排布方式。在一个实施例中，该聚合物吸附剂是珠子状的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物。这些珠子可以采用任何合适的形状或尺寸。这些珠子可以排布在通道中，也就是将珠子包裹在柱子、容器或导管中。例如，合适的柱子有重力送料柱和快速色谱柱。该通道可以包含任何合适体积的珠子。本领域的技术人员可以理解，所采用的聚合物吸附剂的体积会取决于许多因素，例如，需要施加到吸附剂上的材料的用量。也可以使用其它排布方式，例如移动床色谱装置。
在一个实施例中，含有至少一种水不溶性生物活性化合物的醇提取物，被引入到一个含有吸附剂的柱子的顶部，并渗透流过该树脂。在该方法中，至少一种水不溶性生物活性化合物能够与聚合物吸附剂接触。该水不溶性生物活性化合物通常是非极性的，会保留在吸附剂上，提取物中可能存在的极性成分则不会被保留，而是流过该通道并被收集。在一个实施例中，该至少一种水不溶性生物活性化合物包括多甲氧基黄酮。因此，该多甲氧基黄酮被吸附在聚合物吸附剂上。
随后可以通过使该吸附剂与一种洗脱剂接触，其条件是水不溶性生物活性化合物能够从吸附剂上解吸附下来，并将该水不溶性生物活性化合物从吸附剂上洗脱下来，从而将该水不溶性生物活性化合物从吸附剂上除去。
若聚合物吸附剂排布在一个柱子中，洗脱剂可以以等分试样或者以连续蒸汽的方式，引入到柱子的顶部，并渗透流过吸附剂。当洗脱剂设有梯度变化的醇浓度时，醇含量逐步递增的洗脱剂等分试样可以连续引入到柱子的顶部。洗脱剂将生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来，并携带之流过柱子。优选地，以一个预设的流速将洗脱剂送进通道中，该流速可以在每小时1-5倍床体积之间变动。然而，本领域的技术人员可以理解，合适的流速会取决于许多因素，包括装置的尺寸以及该方法是在实验室执行的还是在工业规模上执行的。
洗脱剂可以包括任何合适的溶剂或混合溶剂。优选的是，选用那些可允许用于食物产品中的溶剂或混合溶剂。在一个实施例中，洗脱剂包括醇和水。洗脱剂含有醇时，任何浓度的醇都可以使用。优选的醇浓度是在10％(v/v)至80％(v/v)的范围内。然而，技术人员应该知道，所使用的醇浓度可以根据生物活性化合物的性质以及所希望获得的效果而进行变动。此外，任何合适的醇都可以使用在洗脱剂中。一种优选的醇是乙醇。
洗脱剂中的醇浓度可以是基本保持不变的。在一个优选的实施例中，洗脱剂至少约含有40％(v/v)的醇，优选的是至少约含有50％(v/v)的醇，而更优的是约含有70％(v/v)的醇。可选地，在至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，醇的浓度是递增的。醇浓度可以以一个基本不变的速率递增，或者以一个阶梯式的方式递增。在一个实施例中，在至少一种生物活性化合物从吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度可以从约为10％(v/v)递增至约为80％(v/v)。
流出柱子后，洗脱剂被收集。至少收集一个对应于含有解吸附的水不溶性生物活性化合物的馏分，优选的是收集多个这样的馏分。此外，也可以使用非分级收集法。可以对所收集的溶液进行分析，判断其中是否存在生物活性化合物。一种优选的分析方法包括使用高效液相色谱法(HPLC)。
在一个实施例中，来源于蔬果材料和蔬果残留物的水不溶性生物活性化合物包括多甲氧基黄酮。因此，在一个实施例中，从聚合物吸附剂上收集到的馏分含有解吸附的多甲氧基黄酮类化合物。该多甲氧基黄酮与蔬果材料中存在的其它生物活性化合物分离开。
在再一个方面，本发明涉及由本文所述的方法制得的纯化的多甲氧基黄酮。
根据图20，显示了一个用于实现本发明的一个实施例所述的方法的系统示意图。在该实施例中，从柑橘皮获得的蔬果提取物被送进一个逆流提取器(1)中，并与水接触，从而将水溶性化合物从柑橘皮提取物中提取出来。水溶性化合物，包括具有生物活性的黄酮类和柠檬苦素类化合物，被分离在水提取物中。水提取物随后被送进一个过滤器(2)中，从而将提取物中的所有固体材料除去。过滤后的水提取物加载在一个填装有丙烯酸类聚合物吸附剂(3)的柱子上。黄酮类化合物会吸附在丙烯酸类吸附剂(3)上，而柠檬苦素类化合物基本不会附着在丙烯酸类吸附剂(3)上，而是流过吸附剂(3)并被收集。
通过使含60％乙醇的乙醇—水洗脱剂流过柱子(3)，将所吸附的黄酮类化合物从丙烯酸类吸附剂(3)上解吸附下来。对应于解吸附的黄酮类化合物的洗脱液馏分随后被收集。所收集的馏分流过醇回收蒸发器(4)，将大部分的乙醇除去，以收集纯化的黄酮类化合物。除去的乙醇可以储存在一个乙醇罐中，若有需要，随后可进行蒸馏以回收使用。
从丙烯酸类聚合物吸附剂(3)上洗脱下来的，含有柠檬苦素类化合物的溶液，随后加载在一个填装有聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(5)的柱子上。柠檬苦素类化合物(以及其它可能存在的非极性化合物，如黄酮类化合物)被吸附在聚苯乙烯—二乙烯基苯吸附剂(5)上，而极性的成分，例如天然的糖类和简单的有机酸，不会被吸附，而是从聚合物吸附剂(5)中流出。含有天然糖类和简单有机酸的洗脱溶液，形成一种纯化的“果汁”成分并随后被收集。然后使用一种含30％乙醇的乙醇—水洗脱剂，将所吸附的柠檬苦素类化合物从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(5)上除去，并收集对应于含有解吸附的柠檬苦素类化合物的馏分。
从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(5)解吸附下来以后，含有柠檬苦素类化合物的馏分，随后加载在一个含有阴离子交换树脂(6)的柱子上。阴离子交换树脂(6)会吸附柠檬苦素类化合物，而不与该阴离子交换树脂结合的所有成分，则流过含有树脂(6)的柱子并被收集。然后，将一种盐溶液加载在该阴离子交换树脂(6)上，以将柠檬苦素类化合物从树脂(6)上解吸附下来。收集含有解吸附的柠檬苦素类化合物和盐的馏分。所收集的馏分对应于含有柠檬苦素类化合物。
含有从阴离子交换树脂(6)解吸附下来的柠檬苦素类化合物的馏分，随后加载在一个含有聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(7)的柱子上。聚合物吸附剂(7)是用于除去与柠檬苦素类化合物一同存在于溶液中的盐。柠檬苦素类化合物吸附在聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(7)上，而不被吸附的盐流过含有该聚合物吸附剂(7)的柱子。然后，通过使用一种醇溶液流过吸附剂(7)，将柠檬苦素类化合物从聚合物吸附剂(7)上解吸附下来。随后收集对应于含有解吸附的柠檬苦素类化合物的洗脱液馏分。
所收集的含有解吸附的柠檬苦素类化合物的馏分，可以流过醇回收蒸发器(4)，以将乙醇从该馏分中除去，并收集纯化的柠檬苦素类化合物。所除去的乙醇可以储存在一个乙醇罐中，若有需要，随后可进行蒸馏以回收使用。
提取了水溶性化合物以后，可以将柑橘皮提取物送进第二逆流提取器(8)中，并与10％的乙醇水溶液接触，对该柑橘皮提取物作进一步的提取，从而将水不溶性化合物从柑橘皮提取物中提取出来。该方法提供了一种含有水不溶性化合物的醇提取物，包括多甲氧基黄酮生物活性化合物。
该醇提取物加载在一个含有聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂(9)的柱子上。非极性的水不溶性化合物，例如多甲氧基黄酮，会吸附在聚苯乙烯—二乙烯基苯吸附剂(9)上并被该吸附剂保留，而不能吸附于该聚合物吸附剂的成分则会流过该吸附剂(9)。
随后通过使一种96％的醇—水溶液流过该柱子，将吸附的多甲氧基黄酮从聚苯乙烯—二乙烯基苯吸附剂(9)中除去。然后将解吸附的多甲氧基黄酮化合物收集在对应于含有该生物活性化合物的洗脱液馏分中。所收集的洗脱液馏分可以流过醇回收蒸发器(10)，将乙醇除去以收集纯化的多甲氧基黄酮。若有需要，所除去的乙醇可以储存在一个乙醇罐中，随后进行蒸馏以回收使用。
上述系统可以作为一个连续的程序进行操作，也可以采用分批处理的方式进行操作。在一个连续程序中，含有各种必需的聚合物吸附剂和阴离子交换树脂的柱子，可以连续排布，这样，一旦想要的生物活性化合物从一个柱子上洗脱下来，所获得的洗脱液可直接送进紧接的柱子上。
本发明所获得的生物活性化合物也可以采用任何合适的方式进行处理，使得这些化合物的后续使用或储存更方便。在一个优选的实施例中，该生物活性化合物可以进行蒸发处理，例如冷冻干燥，以从该化合物中除去多余的溶剂，并由此将该生物活性化合物放置在一个适合于储存或进一步使用的形式中。
本发明的再一方面提供一种由本文所述的方法生产的生物活性化合物。再一方面提供一种含有柠檬苦素类葡萄糖苷的组合物。本发明可明显提高从蔬果材料和蔬果提取物中回收的生物活性化合物的纯度。本发明还可以提高纯化的生物活性化合物的回收率。例如，从柑橘类水果中回收的柠檬苦素类葡萄糖苷，其在干的柑橘类水果中的浓度可约达50％至70％。在现有技术中，柠檬苦素类葡萄糖苷的回收量通常较低，约为10％至15％，而本发明与现有技术相比，更为有利。此外，本发明的方法有利地提高了回收的生物活性化合物的纯度。由此，回收的多甲氧基黄酮混合更少的具有苦味的柠檬苦素。
由于根据本发明的方法制得的生物活性化合物具有更高的纯度，它们更容易配方成功能性食物，只需更小的总剂量即可达到目标生物活性化合物的有效剂量，因此降低了不想要的风味剂掺和到食物组方中的可能性。
实施例
下述的实施例是对本发明进行更详细的说明，然而，这些实施例并非是对本发明的保护范围的限定。
材料和方法
橙皮提取物
通过朗氏(Lang)的技术，将橙皮提取物(OPE)制备成一种锤度为20.4的溶液。锤度是通过测量比重并利用换算表而测定的。简言之，在一个电子天平上称量25ml OPE的质量。通过使用相同体积的去离子水对该质量进行划分界定，测定其比重，所测得的比重值为1.085。由换算表可知，该比重值相当于20.4的锤度。OPE的pH值约为4.0(默克广泛试纸)。图1是橙皮提取物的一个代表性样品的HPLC色谱图。
醇
用于洗脱溶剂中的醇为95％的未变性乙醇。
高效液相色谱法(HPLC)
采用HPLC，对生物活性化合物从吸附剂聚合物树脂上洗脱下来的进程进行监控。HPLC是在以下条件下进行的：
●仪器：岛津VP7HPLC系统，包括低压混合系统、SPD-M10A VP二极管阵列检测器以及用于控制梯度和检测器的VP软件；
●流动相D：0.1％(v/v)的磷酸水溶液；
●流动相A：乙腈；
●运行时间：55分钟；
●柱子：带有保护柱的Alltima C1 8 5u柱，零件号码是88056；
●监控波长：210nm和280nm(在200nm至350nm之间每隔2nm采集的数据)；
●柱温：30℃；
●流速：1.0ml/min(反压为2915kgf/cm2)；
●进样体积：20μl；
●表1列出了用于判断是否存在柠檬苦素类化合物的HPLC梯度。
Figure GPA00001153397700181
  0.01   90.0％
  35.00   70.0％
  45.00   60.0％
  46.00   90.0％
  55.00   停止
每次运行都对柱反压进行监控，以保证柱子的性能是一致的。
实施例1-生物活性化合物与丙烯酸类聚合物吸附剂的分离
一个内直径为40mm、高为540mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱，填装有350mm高的非离子型乙二醇交联聚甲基丙烯酸甲酯吸附剂聚合物树脂(CAS 25777-18-5)(由BucherFoodtech公司提供的Alimentech P495惰性吸附聚合物)。该树脂的床体积为400ml，其中柱隙死体积为180ml。使用前，该丙烯酸类聚合物吸附剂通常用10倍床体积的水进行清洗。
将三份250ml的OPE等分试样(总共750ml)施加在含有丙烯酸类聚合物吸附剂的柱子的顶部，每个等分试样以4ml/分钟的速度向下渗透流过该柱子。在该速度下，每个等分试样大约需要一个小时洗脱流过该柱子。施加OPE以后，用两份250ml的水等分试样对该柱子进行清洗。
然后，以250ml的等分试样，将含有醇水混合物的洗脱溶剂施加在该柱子的顶部。洗脱溶剂中的醇浓度，在所施加的每份等分试样中是逐步递增的。洗脱溶剂流过该柱子，随后收集在若干个馏分中，并通过HPLC进行分析。
需要注意的是，洗脱馏分的醇浓度稍低于施加在柱子顶部的洗脱溶剂的醇浓度，因为洗脱溶剂随后会与保留在聚合物吸附剂的柱隙“死体积”内的液体相混合。经估算，醇的浓度约降低当前洗脱馏分与被替代的前一馏分的醇浓度差值的三分之一。因此，例如，若使用一个醇浓度为10％的溶液后，添加一个醇浓度为20％的溶液，则洗脱液中的醇浓度约为17％。
一共收集了十二个馏分，通过HPLC进行分析。表2对其进行了说明。
Figure GPA00001153397700191
  3   施加第三份250mL的OPE后的洗脱液
  4   第一次的水洗液
  5   第二次的水洗液
  6   10％的乙醇水溶液
  7   20％的乙醇水溶液
  8   30％的乙醇水溶液
  9   40％的乙醇水溶液
  3   施加第三份250mL的OPE后的洗脱液
  10   50％的乙醇水溶液
  11   60％的乙醇水溶液
  12   80％的乙醇水溶液
结果
图2至图6是对应于上述馏分的HPLC分析结果的色谱图。OPE中的成分通过保留时间进行鉴别。这些图表明，流出柱子的馏分中存在多种成分。
图2是从馏分1获得的色谱图。如图2所示，色谱峰都较小，大部分的物质在4分钟内洗脱出来。在2分钟处的第一色谱峰对应于糖类；在4分钟处的第二色谱峰为根皮苷，它是橙皮提取物的一个主要构成。馏分2至馏分6也获得类似的结果。
如图3所示，在馏分7中，色谱峰的大小开始增大。在25.48处的色谱峰是柠檬苦素葡萄糖苷(LG)。
在馏分8和馏分9中，对应于柠檬苦素葡萄糖苷的色谱峰也在增大。此外，如馏分9所获得的色谱图(图4)所示，观察到有4个色谱峰，分别是一个典型的柠檬苦素类似物，即柠檬苦素葡萄糖苷(25.39分钟)，一个相关的柠檬苦素类化合物(29.9分钟)，诺米林葡萄糖苷(NG)(34.16分钟)以及在36.98分钟处的黄柏酮葡萄糖苷(OG)。
在馏分10中，在34分钟处仍然观察到明显的柠檬苦素类化合物，但那些在其之前洗脱出来的色谱峰，其大小明显减小了。
由于馏分11中的醇浓度增加至60％左右，黄酮类化合物开始洗脱出来，如图5所示。此处两个主要的色谱峰是黄酮类橘皮苷(28.13分钟)和芸香柚皮苷(30.36分钟)。
在馏分12中，醇浓度在80％左右。如图6所示，馏分12中的主要化合物是橘皮苷和芸香柚皮苷，以及在40.04分钟处出现的另一种黄酮类化合物，推测为新枳属苷(香蜂草苷)。
柠檬苦素葡萄糖苷浓度的测定
由于没有市售的柠檬苦素葡萄糖苷标准品，柠檬苦素葡萄糖苷的浓度是以柠檬苦素(Sigma Aldrich)为对照品，通过比较峰面积以及应用一个换算值(1.4)来进行测定的，应用该换算值是考虑到葡萄糖的分子量。
HPLV系统的线性检查是使用柠檬苦素标准品进行的。表3列出了线性检查和校准的结果。
表3：线性检查和校准的结果
  浓度  210nM处的峰面积
  150  9848525
  300  19645424
  浓度  210nM处的峰面积
  450  2935005
  600  3918728
  750  4886204
构建柠檬苦素的浓度对应峰面积(210nm处)的校准图表，并用以测定所收集的馏分中柠檬苦素类化合物的含量。
表4列出了馏分7至馏分10中柠檬苦素类化合物含量的原始数据，以及一个对照例中柠檬苦素类化合物含量的原始数据：
表4：原始数据(面积)
通过对照校准图表，可以获得橙皮提取物中柠檬苦素类葡萄糖苷含量的估算值。这些结果在表5中列出。
表5：OPE中的柠檬苦素类葡萄糖苷的浓度(ppm)
  馏分   LG   NG   OG
  7   375   36
  8   679   66   286
  9   1110   193   387
  10   387
  对照例   1077
由于其它化合物的干扰，原始材料中的诺米林葡萄糖苷和黄柏酮葡萄糖苷未能测定。
如本实施例所见，与黄酮类化合物相比，柠檬苦素类化合物在丙烯酸类聚合物树脂上的保留能力较弱，较低的醇浓度即可将其从丙烯酸树脂上洗脱下来。这使得柠檬苦素类化合物与黄酮类化合物分离开，所收集的馏分不会出现明显的交叉污染。
实施例2-生物活性化合物与阴离子交换树脂柱的分离
一个直径为2cm、长度为20cm的柱子，填装有200mm高的弱碱性阴离子交换树脂(由Supelco公司提供的Diaion WA-30树脂，其平均粒径为0.47mm，总交换容量为1.5meq/mL)。该树脂的床体积为50mL。使用前，该阴离子交换树脂(WA-30)依次用2倍床体积(100mL)的0.5M氢氧化钠溶液、5倍床体积(250mL)的水、2倍床体积的0.5M盐酸溶液以及5倍床体积的水进行清洗，以对其进行调节。最后清洗的水，其pH值为4.2。
对实施例1所获得的馏分8和馏分9进行处理，以进一步纯化这些馏分中的柠檬苦素类葡萄糖苷。这些馏分，醇含量分别为30％和40％，含有较高比例的柠檬苦素类葡萄糖苷。
将馏分8倒入调节好的弱碱性阴离子交换树脂(WA-30)的顶部。该溶液流过该柱子，收集洗脱液并通过HPLC进行分析。
以类似的方式，将馏分9倒入WA-30树脂的顶部，类似地收集洗脱液并通过HPLC进行分析。
随后使用250ml 30％的醇溶液对该阴离子交换树脂进行清洗。然后使三份150mL 0.5M的NaCl溶液等分试样流过该阴离子交换树脂，收集所洗脱的盐溶液馏分，并通过HPLC进行分析。
结果
表6列出了HPLC所进行的各项分析。
Figure GPA00001153397700231
图7是将馏分9施加在WA-30柱后所获得的洗脱液的色谱图。先前在图4中观察到的对应于柠檬苦素类化合物的色谱峰，在馏分9中并未出现，这是因为WA-30树脂保留了这些化合物。其它成分则不被该树脂保留并从该柱子上洗脱下来。将馏分8施加在WA-30树脂后，也观察到类似的结果。这表明，柠檬苦素类化合物结合在WA-30树脂上。
使0.5M的NaCl溶液等分试样流过WA-30树脂，从而将柠檬苦素类化合物从该树脂上解吸附下来。图8是300ml 0.5M的NaCl溶液流过WA-30树脂后，所获得的洗脱液的色谱图。如图8所示，该洗脱液馏分富含柠檬苦素类葡萄糖苷。柠檬苦素类葡萄糖苷的紫外(UV)消光系数不如黄酮类化合物高，因此，该馏分中的柠檬苦素类葡萄糖苷的纯度似乎高于75％。
这一结果表明，可以通过将柠檬苦素类化合物选择性地吸附在一个离子交换树脂上，对其进行纯化。然后，盐溶液可以有效地将所结合的柠檬苦素类葡萄糖苷从该树脂中除去。所得到的纯化的柠檬苦素类葡萄糖苷，其纯度似乎超过50％。此外，纯化的柠檬苦素类葡萄糖苷不会受糖类或者芸香柚皮苷、橙皮苷和新枳属苷等黄酮类化合物的污染。
实施例3-从橙皮提取物(OPE)中回收生物活性化合物的方法
对一种将生物活性化合物从橙皮提取物(OPE)中分离出来的方法进行说明。该方法使用了以下4个分离柱：
柱A：此柱子是一个内直径为40mm、高为540mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其部分填装有200mm高的丙烯酸树脂(由Bucher Foodtech公司提供的Alimentech P495惰性吸附聚合物)。该树脂的床体积为250mL，其中柱隙死体积为110mL。
柱B：此柱子是一个内直径为23mm、高为180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其部分填装有180mm高的聚苯乙烯—二乙烯基苯树脂(由Sigma-Aldrich公司提供的AmberliteXAD-16，其表面积为800m2/g，平均孔径为100埃)。该树脂的床体积为50mL。
柱C：此柱子是一个内直径为23mm、高为180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其部分填装有200mm高的弱碱性阴离子交换树脂(由Supelco公司提供的Diaion WA-30树脂，其平均粒径为0.47mm，总交换容量为1.5meq/mL)。该树脂的床体积为50mL。
柱D：此柱子是一个内直径为23mm、高为180mm、配有聚四氟乙烯活塞的玻璃柱。其部分填装有180mm高的树脂(由Sigma-Aldrich公司提供的Amberlite XAD-16，其表面积为800m2/g，平均孔径为100埃)。该树脂的床体积为50mL。
所提供的OPE和聚合物吸附剂树脂可直接使用，或者使用前先按照上述的一般程序进行制备。
通过高效液相色谱法(岛津VP7 HPLC系统，包括低压混合系统FCV-10AL、脱气系统DGU-14A、溶剂输送系统LC-10AD、自动进样器SIL-10AD、二极管阵列检测器SPD-M10A VP以及VP软件)，对生物活性化合物在各个柱子上的洗脱进行监控。
柱A(丙烯酸类聚合物吸附剂)：
在本实验中，采用丙烯酸类聚合物吸附剂将柠檬苦素类葡萄糖苷从黄酮类化合物中分离出来。
以每等分试样1升，将6升锤度为4.1的OPE施加在含有丙烯酸类聚合物吸附剂的柱子(柱A)上。施加各个等分试样后，OPE可渗透流过该柱子。
开始时，1升OPE流过柱子后，并没有柠檬苦素类或黄酮类化合物从柱子上洗脱下来。将2升OPE施加在柱子上以后，观察到有柠檬苦素类化合物从柱子上洗脱下来(主要是柠檬苦素葡萄糖苷，保留时间为19分钟)。将总共的3、4和5升OPE施加在丙烯酸树脂上以后，观察到更多的柠檬苦素类化合物从丙烯酸树脂上洗脱下来，主要是柠檬苦素葡萄糖苷(LG)、去乙酰诺米林葡萄糖苷(DANG)(保留时间为24.5分钟)，诺米林葡萄糖苷(NG)(保留时间为28.4分钟)以及诺米林酸葡萄糖苷(NAG)(保留时间为29分钟)。将6升OPE施加在柱子上以后，除了先前鉴别的柠檬苦素类化合物以外，还观察到有黄柏酮葡萄糖苷(OG)从柱子上洗脱下来(保留时间为31分钟)。
图9是6升OPE洗脱流过柱(A)后所获得的洗脱液的HPLC色谱图。可以测定从丙烯酸类聚合物树脂上洗脱下来的各个柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的相对含量，图10是各个柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的相对含量曲线图。
在所收集的洗脱液中，并没有检测到任何主要的黄酮类化合物。由此表明，丙烯酸类聚合物吸附剂能够充分地将黄酮类化合物从OPE中除去，而不被丙烯酸树脂吸附的柠檬苦素类化合物可以流过该树脂。
如下文所述，从柱(A)上洗脱下来的OPE馏分随后可以加载在柱(B)上，从而对柠檬苦素类葡萄糖苷进行纯化，并从存在于OPE中的天然糖类和其它大极性的化合物中制备出一种美味的“果汁”。
一旦OPE流出了该丙烯酸树脂，即用2倍床体积的水对该柱子进行清洗。进一步地，大量的柠檬苦素类化合物随着水从该柱子上洗脱下来，然而，在该水洗脱液中并没有观察到黄酮类化合物。
然后将一种乙醇—水洗脱剂溶液施加在该柱子的顶部，以将吸附在该丙烯酸类聚合物树脂上的黄酮类化合物洗脱下来。按照表7，所施加的醇的梯度浓度，以一个阶梯式的方式从20％(v/v)递增至60％(v/v)。施加后，每个洗脱剂等分试样渗透流过该柱子，以将具有生物活性的黄酮类化合物从该丙烯酸树脂上解吸附下来。随后收集解吸附的化合物并通过HPLC进行分析。
表7
  馏分   浓度(乙醇％)   床体积
  15   20   1
  16   30   1
  17   40   1
  18   50   1
  19   60   1
  20   80   1
采用含有20％乙醇的溶液对丙烯酸树脂(柱(A))进行解吸附以后，所获得的洗脱液不含有任何的黄酮类化合物。然而，当洗脱剂中的乙醇浓度增加至30％时，所得到的洗脱液确实含有少量的黄酮类化合物。进一步地，洗脱液中的乙醇浓度增加至40％和50％时，会将大量的黄酮类化合物芸香柚皮苷(保留时间为22分钟)和橘皮苷(保留时间为24.35分钟)从丙烯酸树脂上解吸附并洗脱下来。当洗脱剂中的乙醇含量增加至60％时，所得到的洗脱液含有大量的芸香柚皮苷和橘皮苷以及保留时间为27分钟的香蜂草苷。
图11是使用40％的乙醇溶液将黄酮类化合物从柱(A)上解吸附下来后，所获得的洗脱液馏分的HPLC色谱图。可以测定通过各个洗脱剂馏分，从丙烯酸类聚合物树脂上解吸附下来的各个黄酮类化合物的相对含量，图12是随着醇浓度的递增，所收集的黄酮类化合物的相对含量曲线图。
已经发现，丙烯酸类聚合物树脂会保留黄酮类化合物，而柠檬苦素类葡萄糖苷会随着极性更大的多酚、糖类和有机酸一起流出该树脂。然后可以使用乙醇水溶液将黄酮类化合物从丙烯酸树脂上解吸附下来。
柱B(聚苯乙烯—二乙烯基苯吸附剂)：
在本实验中，采用聚苯乙烯—二乙烯基苯柱，将从柱(A)洗脱得到的柠檬苦素类葡萄糖苷与天然的糖类和极性更大的化合物分离开。
在本试验中，将从柱(A)获得的总共6升锤度为4.1的OPE加载在含有聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂的柱(B)上，其中每1升等分试样从丙烯酸树脂柱流出后即加载在柱(B)上。OPE等分试样可渗透流过该聚苯乙烯—二乙烯基苯树脂，收集洗脱得到的等分试样并通过HPLC进行分析。
将第一和第二份OPE等分试样施加在柱(B)上后，未观察到有柠檬苦素类葡萄糖苷从该柱子上洗脱下来。施加并洗脱第三和第四份OPE等分试样后，观察到有少量的柠檬苦素类葡萄糖苷(但没有黄酮类化合物)流出该柱子。将第五和第六份OPE等分试样施加在柱(B)上后，有一些柠檬苦素葡萄糖苷以及少量其它的柠檬苦素类葡萄糖苷从该柱子上洗脱下来。然后用4倍床体积的水对该柱子进行清洗，以将天然的糖类和其它大极性的物质从该柱子上除去。收集各个水馏分，并与洗脱得到的OPE馏分结合，从而形成一种美味的、不含任何苦味化合物的“果汁”成分。图13是从柱(B)获得的“果汁”成分的HPLC色谱图。从柱(B)获得的OPE洗脱液没有显著的黄酮类化合物(主要是橘皮苷、芸香柚皮苷和香蜂草苷)，也不含有柠檬苦素葡萄糖苷、去乙酰诺米林葡萄糖苷、诺米林葡萄糖苷、诺米林酸葡萄糖苷和黄柏酮葡萄糖苷这五种柠檬苦素类葡萄糖苷。从柱(B)获得的OPE洗脱液含有多酚、糖类和有机酸。该洗脱液适合于混合进橙汁等食物产品中，以增补该食物产品。
然后采用一种乙醇—水洗脱剂溶液，将保留在柱(B)上的柠檬苦素类葡萄糖苷从柱子上解吸附下来。如表8所示，洗脱剂设有递增的乙醇梯度，从10％(v/v)递增至80％(v/v)。
表8
  馏分   浓度(乙醇％)   床体积
  21   10   2
  22   20   2
  23   30   2
  24   50   2
  馏分   浓度(乙醇％)   床体积
  25   80   2
施加后，每个洗脱剂等分试样渗透流过该柱子，以将柠檬苦素类葡萄糖苷化合物从柱(B)上解吸附下来，随后将其收集并通过HPLC进行分析。
采用含有10％乙醇的溶液对聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物树脂(柱B)进行解吸附以后，所获得的洗脱液含有一些柠檬苦素类葡萄糖苷，主要是去乙酰诺米林葡萄糖苷(保留时间为25分钟)和诺米林葡萄糖苷(保留时间为29分钟)。
当洗脱剂中的醇浓度增加至20％时，观察到有其它柠檬苦素类葡萄糖苷化合物，即柠檬苦素葡萄糖苷、诺米林酸葡萄糖苷和黄柏酮葡萄糖苷，从柱(B)上洗脱下来。当洗脱剂中的乙醇浓度进一步增加至30％、50％和80％时，从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物树脂上解吸附下来的五种柠檬苦素类葡萄糖苷的含量更高。
图14是将柠檬苦素类葡萄糖苷化合物从柱(B)上解吸附下来后，所获得的洗脱液馏分的HPLC色谱图。可以测定在各个洗脱液馏分中，从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物树脂上解吸附下来的各个柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的相对含量，图15是所收集的各个柠檬苦素类葡萄糖苷的相对含量曲线图。
柱C(弱碱性阴离子交换树脂)：
本实验表明，可使用弱碱性阴离子交换树脂柱，将从柱(B)洗脱得到的柠檬苦素类葡萄糖苷与更中性的化合物分离开。
合并含有从柱(B)解吸附下来的柠檬苦素类葡萄糖苷的洗脱液，用水稀释至乙醇的浓度约为20％(v/v)。然后将合并后的洗脱液施加在柱(C)的顶部，使之以每小时约10倍床体积的速率渗透流过该柱子。流出该柱子的液体被丢弃。然而，在商业应用中，该液体可以被转移，随后将醇回收。HPLC分析表明，流出柱(C)的液体不含有任何的柠檬苦素类葡萄糖苷。
然后使用0.5M的氯化钠(盐水)溶液，将柠檬苦素类葡萄糖苷从柱(C)解吸附下来。几乎100％的柠檬苦素类葡萄糖苷都在流过该柱子的8倍床体积的盐水中洗脱出来。图16是盐水溶液流出柱(C)的阴离子交换树脂后，所获得的洗脱液的HPLC色谱图。图17是随着施加在该树脂上的盐水用量的增加，从该阴离子交换树脂上解吸附下来的各个柠檬苦素类葡萄糖苷的含量曲线图。
柱D(聚苯乙烯—二乙烯基苯吸附剂)：
本实验表明，可使用聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂，将从柱(C)洗脱得到的柠檬苦素类葡萄糖苷化合物中的氯化钠盐除去。可观察到，氯化钠盐流过柱(D)的聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物吸附剂，而柠檬苦素类葡萄糖苷被该聚合物保留。
将从柱(C)获得的含有解吸附的柠檬苦素类葡萄糖苷化合物的盐水溶液，施加在柱(D)的聚苯乙烯—二乙烯基苯树脂的顶部，使之渗透流过该聚合物树脂。可观察到，柠檬苦素类葡萄糖苷吸附在该聚合物吸附剂上，而盐水中的氯化钠不发生吸附。然后用4倍床体积的水对柱(D)进行清洗，以除去氯化钠盐。
然后采用含50％乙醇的乙醇—水洗脱剂溶液，将柠檬苦素类葡萄糖苷从聚苯乙烯—二乙烯基苯聚合物树脂上解吸附下来。图18是解吸附柠檬苦素类葡萄糖苷后，所收集的洗脱液馏分的HPLC色谱图。
本方法的一个成果是，可获得浓缩的柠檬苦素类葡萄糖苷馏分。如图19叠加的HPLC色谱图所示，图中显示了原始的橙皮提取物(各个色谱图中的下方谱线)和浓缩的柠檬苦素类葡萄糖苷馏分(各个色谱图中的上方谱线)，原始OPE中的柠檬苦素类葡萄糖苷的总浓度约为1000ppm，单独的色谱峰难以观察到。然而，在所得到的浓缩馏分中，柠檬苦素类葡萄糖苷的含量总计为浓缩物成分的80％以上。假定锤度为12的OPE总共含有1000ppm的柠檬苦素类葡萄糖苷，每1升含有100mg纯的柠檬苦素类葡萄糖苷。因此，对于本方法的每一个循环，每1升丙烯酸树脂可以生产1克柠檬苦素类葡萄糖苷。
上述实施例表明，可以采用不同的聚合物吸附剂树脂，对来源于橙皮提取物的生物活性化合物进行分离和纯化，而不会造成目标化合物的明显损失。
应当理解，在不违背本发明的精神的前提下，可以对本发明进行各种其它的修改和/或变换。

Claims (93)

1.一种生物活性化合物的分离方法，该方法包括以下步骤：
(a)使若干种生物活性化合物与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上，而至少一种生物活性化合物不吸附在该吸附剂上；以及
(b)收集含有至少一种未被该吸附剂吸附的生物活性化合物的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为丙烯酸类聚合物吸附剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为丙烯酸酯。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为聚甲基丙烯酸甲酯。
5.根据权利要求1至4的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个通道中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个柱子中。
7.根据权利要求1至6的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的若干种生物活性化合物包括黄烷酮糖苷和柠檬苦素类葡萄糖苷，其中，黄烷酮糖苷与柠檬苦素类葡萄糖苷被充分地分离开。
8.根据权利要求1至7的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的若干种生物活性化合物包括黄烷酮糖苷和柠檬苦素类葡萄糖苷，其中，黄烷酮糖苷完全吸附在步骤(a)的聚合物吸附剂上，而柠檬苦素类葡萄糖苷不吸附在该吸附剂上。
9.根据权利要求1至8的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂将黄烷酮类化合物与柠檬苦素类化合物充分地分离开。
10.根据权利要求1至9的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(c)使吸附在步骤(a)的聚合物吸附剂上的至少一种生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及
(d)将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的洗脱剂包括醇和水。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是完全保持不变的。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度从20％(v/v)递增至80％(v/v)。
15.根据权利要求11至14的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
16.根据权利要求1至15的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(e)使从步骤(b)获得的含有至少一种生物活性化合物的溶液与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上；以及
(f)收集从该聚合物吸附剂上洗脱下来的溶液。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：步骤(e)的聚合物吸附剂具有吸附非极性化合物的能力。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：步骤(e)的聚合物吸附剂是聚苯乙烯—二乙烯基苯。
19.根据权利要求16至18的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个通道中。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个柱子中。
21.根据权利要求16至20的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(g)使吸附在步骤(e)的聚合物吸附剂上的至少一种生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及
(h)将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：步骤(g)的洗脱剂包括醇和水。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是完全保持不变的。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度从10％(v/v)递增至80％(v/v)。
26.根据权利要求22至25的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
27.根据权利要求21至26的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(i)使从步骤(h)洗脱获得的至少一种生物活性化合物与一种离子交换树脂接触，其条件是至少一种生物活性化合物与该树脂之间发生离子相互作用，从而使至少一种生物活性化合物吸附在该树脂上。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂为阴离子交换树脂。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。
30.根据权利要求27至29的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂排布在一个通道中。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂排布在一个柱子中。
32.根据权利要求27至31的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(j)使吸附在步骤(i)的离子交换树脂上的至少一种生物活性化合物与一种含有溶质的溶液接触，其条件是溶质将至少一种生物活性化合物从该树脂上置换出来；以及
(k)将至少一种生物活性化合物从该树脂上洗脱下来。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于：所述的溶质为盐。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于：所述的盐为氯化钠。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其特征在于：盐的浓度为0.5M。
36.根据权利要求32至35的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(l)使从步骤(k)获得的至少一种生物活性化合物与一种聚合物吸附剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物吸附在该吸附剂上。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于：步骤(l)的聚合物吸附剂具有吸附非极性化合物的能力。
38.根据权利要求36所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为聚苯乙烯—二乙烯基苯。
39.根据权利要求36至38的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个通道中。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个柱子中。
41.根据权利要求36至40的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
(m)使吸附在步骤(l)的聚合物吸附剂上的至少一种生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及
(n)将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于：步骤(m)的洗脱剂包括醇和水。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是完全保持不变的。
44.根据权利要求42所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度从10％(v/v)递增至80％(v/v)。
46.根据权利要求42所述的方法，其特征在于：步骤(m)的洗脱剂含有70％的醇。
47.根据权利要求42至46的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
48.根据权利要求1至47的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的若干种生物活性化合物来源于柑橘类水果。
49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于：所述的若干种生物活性化合物来源于柑橘类水果的果皮。
50.一种生物活性化合物的纯化方法，包括使生物活性化合物与一种离子交换树脂接触的步骤，其条件是生物活性化合物与该树脂之间发生离子相互作用，从而使生物活性化合物吸附在该树脂上。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂为阴离子交换树脂。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。
53.根据权利要求50至52的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂排布在一个通道中。
54.根据权利要求53所述的方法，其特征在于：所述的离子交换树脂排布在一个柱子中。
55.根据权利要求50至54的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
使吸附在该离子交换树脂上的生物活性化合物与一种含有溶质的溶液接触，其条件是溶质将该生物活性化合物从该树脂上置换出来；以及
将该生物活性化合物从该树脂上洗脱下来。
56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于：所述的溶质为盐。
57.根据权利要求56所述的方法，其特征在于：所述的盐为氯化钠。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其特征在于：盐的浓度为0.5M。
59.根据权利要求55至58的其中之一所述的方法，还包括使洗脱得到的生物活性化合物与一种聚合物吸附剂接触，其条件是该生物活性化合物吸附在该吸附剂上。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂具有吸附非极性化合物的能力。
61.根据权利要求59所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为聚苯乙烯—二乙烯基苯。
62.根据权利要求59至61的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
使吸附在该聚合物吸附剂上的生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是该生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及
将该生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
63.根据权利要求62所述的方法，其特征在于：所述的洗脱剂包括醇和水。
64.根据权利要求63所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是完全保持不变的。
65.根据权利要求63所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。
66.根据权利要求65所述的方法，其特征在于：醇的浓度从30％(v/v)递增至80％(v/v)。
67.根据权利要求63至66的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
68.根据权利要求50至67的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的生物活性化合物为柠檬苦素类葡萄糖苷。
69.一种从蔬果材料中选择性提取生物活性化合物的方法，该方法包括使蔬果材料与一种溶剂接触的步骤，其条件是从该蔬果材料中提取至少一种水溶性的生物活性化合物，由此提供一种含有该水溶性生物活性化合物的提取物以及含有至少一种水不溶性生物活性化合物的蔬果残渣。
70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于：采用一种逆流提取器，使溶剂与蔬果材料接触，由此从该蔬果材料中提取至少一种水溶性的生物活性化合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其特征在于：所述水溶性生物活性化合物的提取是在70℃以上的温度下进行的。
72.根据权利要求69至71的其中之一所述的方法，该方法还包括使蔬果残渣与一种含有醇的提取溶液接触的步骤，其条件是从该蔬果残渣中提取至少一种水不溶性的生物活性化合物，并由此提供一种含有至少一种水不溶性生物活性化合物的醇提取物。
73.根据权利要求72所述的方法，其特征在于：所述的提取溶液含有10％的醇。
74.根据权利要求72所述的方法，其特征在于：所述的提取溶液含有20％的醇。
75.根据权利要求72至74的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
76.根据权利要求72至75的其中之一所述的方法，其特征在于：采用一种逆流提取器，使提取溶液与蔬果残渣接触，由此将水不溶性生物活性化合物从该蔬果残渣中提取出来。
77.根据权利要求72至76的其中之一所述的方法，还包括使该醇提取物与一种聚合物吸附剂接触的步骤，其条件是至少一种水不溶性生物活性化合物吸附在该吸附剂上。
78.根据权利要求77所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂具有吸附非极性化合物的能力。
79.根据权利要求77所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂为聚苯乙烯—二乙烯基苯。
80.根据权利要求77至79的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个通道中。
81.根据权利要求80所述的方法，其特征在于：所述的聚合物吸附剂排布在一个柱子中。
82.根据权利要求77至81的其中之一所述的方法，还包括以下步骤：
使吸附在该聚合物吸附剂上的水不溶性生物活性化合物与一种洗脱剂接触，其条件是至少一种水不溶性生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来；以及
将至少一种水不溶性生物活性化合物从该吸附剂上洗脱下来。
83.根据权利要求82所述的方法，其特征在于：所述的洗脱剂包括醇和水。
84.根据权利要求83所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是完全保持不变的。
85.根据权利要求83所述的方法，其特征在于：将至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度是递增的。
86.根据权利要求85所述的方法，其特征在于：在至少一种生物活性化合物从该吸附剂上解吸附下来的过程中，洗脱剂中的醇浓度从10％(v/v)递增至80％(v/v)。
87.根据权利要求83至86的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的醇为乙醇。
88.根据权利要求69至87的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的蔬果材料来源于柑橘类水果。
89.根据权利要求69至88的其中之一所述的方法，其特征在于：所述的蔬果材料含有作为水溶性生物活性化合物的柠檬苦素类葡萄糖苷和黄烷酮糖苷，以及作为水不溶性生物活性化合物的多甲氧基黄酮。
90.由权利要求1至89的其中之一所述的方法制得的生物活性化合物。
91.一种含有纯度在10％以上的柠檬苦素类糖苷的组合物。
92.一种含有纯度在50％以上的柠檬苦素类糖苷的组合物。
93.一种含有纯度在70％以上的柠檬苦素类糖苷的组合物。
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