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CN101820909A - 增强疫苗组合物的佐剂活性的方法 - Google Patents

增强疫苗组合物的佐剂活性的方法 Download PDF

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CN101820909A CN200880111544A CN200880111544A CN101820909A CN 101820909 A CN101820909 A CN 101820909A CN 200880111544 A CN200880111544 A CN 200880111544A CN 200880111544 A CN200880111544 A CN 200880111544A CN 101820909 A CN101820909 A CN 101820909A
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Abstract

通过将一种合成的糖脂(命名为PBS-57)与疫苗共施用而增强疫苗的免疫原性。PBS-57具有刺激细胞-介导的和体液免疫应答二者的能力。PBS-57与疫苗的共施用可用于方法中，以刺激体液免疫应答、CD4+T细胞应答以及CD8+细胞毒性T细胞应答的一种或多种。

Description

增强疫苗组合物的佐剂活性的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年8月29日提交的美国临时专利申请号60/968,731的优先权的权益，通过引用将其全部并入本文。
引言
疫苗的根本目的是提供针对病理状态的持久的免疫力。理想地，疫苗提供功能上有活性的抗体，引发细胞-介导的免疫力，以及激活具有高度特异反应性的T-和B-淋巴细胞，还有提供针对进一步与病原体相遇的防护的“记忆”。
佐剂为疫苗添加剂，其非特异性地增加免疫应答。佐剂增强免疫系统的机制差别很大。佐剂可分类为“免疫调制的”或“抗原递送系统”。免疫调制佐剂通过调节免疫细胞的行为(通过改变淋巴因子生产)引发免疫系统。在另一方面，抗原递送系统发挥功能以递送抗原至适当的免疫细胞。此外，佐剂可增强免疫应答的速度或持续时间，调制抗体亲合力、特异性、同种型或亚类的分布，刺激细胞介导的免疫力，促进粘膜免疫力或增强免疫不成熟或老化个体中的免疫应答。佐剂能影响体液或细胞-介导的免疫应答，或二者的组合。
免疫调制(immunomodulation)指的是佐剂通过激活差异性免疫细胞子集而改变淋巴因子应答的能力。CD4+T淋巴细胞的两个主要子集——Th1和Th2——在确定免疫应答中起主要作用。典型地，Th1应答诱导补体固定抗体和强烈的迟发型超敏(DTH)反应，并且与γ-IFN、IL-2以及IL-12相关，而Th2应答导致高度循环及分泌的抗体水平，且与细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10相关。Th1细胞的激活还通过激活细胞毒性CD8+T细胞的增殖而调节细胞免疫应答，并增强靶标细胞的细胞裂解。
已经就佐剂属性研究了脂类。与肽抗原不同，脂质由β2微球蛋白-相关分子的CD1家族加工并呈递至免疫系统。CD1分子已经进化到能捕获并加工外来和自身的脂质抗原用于显示给T细胞的特定子集。通过激活两个互补的CD1限制性T细胞子集；行使佐剂功能的自然杀伤T(NKT)细胞；能行使辅助或细胞毒性功能的非-NKTT-细胞，CD1呈递途径触发先天性和适应性免疫应答。NKT细胞表达自然杀伤(NK)细胞表面标志物以及保守的半-不变T细胞受体(TCR)，小鼠中的Vα24-Jα18/Vβ8，人中的Vα24-Jα18/Vβ11。这样，NKT细胞在大量免疫功能中起重要作用，包括抗微生物应答、抗肿瘤免疫力以及调节免疫耐受和自身免疫之间的平衡。
大量天然及合成脂质分子由抗原-呈递细胞加工并由CD1分子呈递至NKT细胞。用于研究体外和体内NKT细胞激活的原型化合物为KRN7000，以及衍生自海生海绵体(海绵(Agelas mauritianus))的α-半乳糖苷神经酰胺(“αGalCer”)。最近鉴定的另外的化合物包括异球三己糖基神经酰胺(isoglobotrihexosylceramide，″iGB3″)，其为一种内源糖脂，以及PBS-57，一种修饰的6”氨基6”脱氧半乳糖神经酰胺，如PCT申请PCT/US07/66250中描述的，其公开通过引用并入本文。这些化合物激活NKT细胞且上调体外细胞因子应答。然而，在体内免疫接种的背景中，关于这些化合物的脂质佐剂活性知之甚少。
由于毒性副作用，很少的佐剂被批准用于人疫苗。最常见的佐剂为铝和油佐剂，但已知其诱导副作用如发热、头痛、肌肉痛以及疼痛或皮疹。其他的缺点包括免疫系统强烈的局部刺激导致在注射位点的疼痛、发红、发肿或小结块。佐剂还使得疫苗制备的方法复杂化，且可能无法增加弱抗原的免疫原性。现在，用于人免疫接种的佐剂选择反映了对佐剂活性以及可接受的副作用水平之间的妥协。有对具有更少副作用，仍然诱发长期持久保护性免疫力的新佐剂的需要。
发明概述
发明人已经发现当施用于受试者时，将一种合成的糖脂，命名为PBS-57，添加到施用于受试者的疫苗制备物中激活了体液和细胞免疫应答二者。这样，本发明提供增强受试者中疫苗免疫原性的方法，通过将PBS-57和疫苗共施用于受试者刺激受试者中体液免疫应答，刺激CD4+T细胞应答以及刺激CD8+细胞毒性T细胞应答。
附图简述
图1为显示在第7天，用不同量的佐剂糖脂αGalCer、PBS20、PBS25和PBS57处理的培养的外周血淋巴细胞(PBL)的CD3+T细胞群体中NKT的百分比的图。
图2为显示在第7天，用不同量的αGalCer、PBS25、PBS57和PBS83处理的培养的PBL的CD3+T细胞群体中NKT的百分比的图。
图3为显示了分离自用αGalCer、PBS20、PBS25、PBS57和PBS83处理的志愿者的PBL体外培养物中NKT细胞的增加的图。中值描绘于图之上。
图4A为描绘了在施用αGalCer、PBS57和PBS8324小时后，小鼠的脾脏中TCRαβ细胞的百分比的图。图4B为描绘在施用佐剂糖脂24小时后，小鼠的脾脏中TCRαβ细胞群体之中NKT细胞的百分比的图。对于每个佐剂计算了相比于对照的双尾p值。
图5A为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，来自小鼠脾脏的CD11c+CD8α-细胞群体中CD40+细胞的百分比的图。图5B为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，来自小鼠脾脏的CD11c+CD8α+细胞群体中CD40+细胞的百分比的图。图5C为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，来自小鼠脾脏的CD11c+CD8α-细胞群体中CD80+细胞的百分比的图。图5D为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，来自小鼠脾脏的CD11c+CD8α+细胞群体中CD80+细胞的百分比的图。图5E为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，小鼠脾脏的CD11c+CD8α-细胞群体中CD86+细胞的百分比的图。图5F为来自静脉内施用佐剂糖脂24小时后，小鼠脾脏的CD11c+CD8α+细胞群体中CD86+细胞的百分比的图。
图6为流式细胞术CFSE染色的结果的点作图和直方图，所述结果来自确定单独以卵清蛋白(Ova)或Ova和αGalCer免疫的小鼠的抗原呈递细胞的特异性裂解的测定法。
图7为描绘用佐剂伴有Ova或无Ova免疫的小鼠脾脏中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图8为描绘静脉内注射(“IV”)与不同浓度αGalCer组合的Ova的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图9为描绘IV注射与不同浓度PBS57组合的Ova的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图10为描绘IV注射与不同浓度Ova组合的PBS57的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图11为描绘肌肉内注射(“IM”)与不同浓度αGalCer组合的Ova的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图12为描绘IM注射与不同浓度PBS57联合的Ova的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图13为比较IV或IM注射不同Ova和佐剂的组合的小鼠血液中Ova-特异性靶标细胞的特异性裂解的百分比的图。
图14为条形图，其描绘了用含有PBS-57的破伤风类毒素(TT)疫苗组合物免疫小鼠的增强的抗体生产。
图15为条形图，其描绘了在用与PBS57组合的卵清蛋白(OVA)肌肉内免疫的小鼠中增强的CD8+T细胞应答性。
图16为条形图，其描绘了用与PBS57组合的OVA皮下免疫的小鼠中增强的CD8+T细胞应答性。
几个实施方式的详述
在疫苗制备物中，佐剂以多种方式增强了抗原的免疫原性。在毒素的情况下，需要好的体液免疫应答。在细胞内细菌的情况下，重要的是主要由细胞毒性T细胞及Th1细胞介导的细胞-介导反应。在病毒感染的情况下，体液和细胞应答是控制感染的根本。佐剂不仅增强体液而且增强细胞-介导的免疫应答的能力，增加了发展长期持久免疫力的可能性。有效的佐剂还将用于与广泛多种抗原组合。发明人发现一种鞘糖脂，PBS-57，其具有刺激体内细胞-介导以及体液免疫应答二者的能力。此外，PBS-57能够刺激对弱的表观抗原(nominal antigen)的免疫应答，以产生抗体并同时提供表达特异性表面抗原的细胞的细胞-介导的裂解。
在一个实施方式中，本发明提供通过将PBS-57和疫苗共施用于受试者而增强受试者中疫苗的免疫原性的方法。如本文中使用的，“受试者”为哺乳动物，例如，小鼠，更合适地为人。“增强疫苗的免疫原性”指与合适的对照比较，PBS-57增强受试者对疫苗的体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。为了确定与对照比较，免疫原性是否增强，能将来自用抗原和PBS57免疫接种的受试者的样品的信号与单独用抗原免疫接种的受试者的样品的信号进行定量比较。如本文中使用的，免疫原性能通过本领域技术人员使用的，以测量体液或细胞-介导的免疫应答的任何测定法来测量。例如，免疫原性可通过用于多种细胞因子水平的ELISA测定而进行测量，其实行对本领域技术人员是常规的。
在特定实施方式中，免疫应答相对于合适的对照增强了至少25％，至少30％，至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少100％，至少150％，至少200％，或至少400％。合适的对照可以为用不含PBS57的疫苗组合物处理的受试者。使用以下公式可计算增强的百分比
[(代表用含有PBS57的组合物处理后的受试者的免疫应答的值)-(代表对照的免疫应答的值)/(代表用含有PBS57的组合物处理后的受试者的免疫应答的值)]x100。
如本文中使用的，术语“共施用”指的是同时，即在时间上同时施用至少佐剂和疫苗，或顺序地，即施用佐剂，之后施用疫苗。那就是，在施用佐剂后，能立刻在佐剂之后施用疫苗，或疫苗在佐剂的有效时间段内施用；有效时间段为实现佐剂施用的最大受益的时间量。备选地，佐剂和疫苗可以共配制。
合适地，疫苗组合物配制为包括PBS-57。
“疫苗”指的是组合物，当施用于受试者时，其诱导如本文所描述的细胞或体液免疫应答。疫苗组合物可包括抗原或抗原组合；抗原可以为多肽或碳水化合物部分或其组合，例如，糖蛋白。合适地，抗原衍生自感染性试剂(例如，病原微生物体)，肿瘤，内源性分子(例如，“自身”分子)或，用于研究目的，表观抗原，例如卵清蛋白(本文称为“Ova”)。疫苗组合物还可包括灭活或减弱的感染性试剂。合适地，与本发明结合使用的疫苗组合物包括PBS57和抗原，PBS-57如下显示：
Figure GPA00001096842400061
PBS57在体内和体外激活NKT细胞。PBS57在半乳糖C6位置含有一个酰胺基，在神经酰胺部分的酰基链处有一个顺式双键。不受限于任何理论，认为在神经酰胺侧链的双键促进了对CD1d分子的沟的结合且增加鞘糖脂的溶解性。还显示PBS57在体外诱导INF-γ和IL-4的释放。
包括PBS57的疫苗组合物可使用本领域技术人员已知的多种制备性方法及无活性成分进行配制。见Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，(2000)，其通过引用并入本文。疫苗还可含有合适的抗原递送系统以将抗原靶向免疫细胞。合适的抗原递送系统在本领域已知，包括但不限于MVA(修饰的病毒安卡拉株(Modified virus ankara))、腺病毒、慢病毒、百日咳或致贺氏毒素的易位亚基或包裹抗原的脂质体。疫苗组合物中PBS57的合适有效剂量可由本领域技术人员确定，但一般的范围为从每千克体重大约1微克-大约10,000微克，尽管一般地为每千克体重大约1,000微克或更少。在一些实施方式中，有效剂量范围为从每千克体重大约10微克-大约5,000微克。在另一个实施方式中，有效剂量范围为从每千克体重大约50微克-大约1,000微克。在另一个实施方式中，有效剂量范围为从每千克体重大约75微克-大约500微克。用于研究目的，用于小鼠的合适剂量为每100μl剂量1μg PBS57。PBS57组合物能以单剂量施用，或者可以以多剂量在数周或数月的时期内施用。
一种或多种抗原可与PBS57一同包括在组合物内，或独立进行配制。如本文使用的，抗原指的是刺激免疫应答的分子。应当理解抗原的剂量将依赖于特定的抗原，以及受试者免疫状态，以及能由本领域技术人员确定的其他相关因素。
合适地，抗原衍生自减弱或灭活的感染性试剂。可利用整个微生物或其部分(例如，膜血影(membrane ghost)；粗膜制备物、裂解物和微生物体的其他制备物)。可从其中衍生抗原的合适的感染性试剂包括但不限于，病原体和微生物体如细菌、寄生虫和病毒。在一些上下文中，合适的抗原是从与相关的病毒病原体得到或衍生而来的，所述人类疾病包括但不限于，HIV/AIDS(逆转录病毒科(Retroviridae)，例如，HIV-1和HIV-2分离株的gp120分子，HTLV-I，HTLV-11)，流感病毒(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，例如，A、B和C型)，疱疹(例如，单纯性疱疹病毒，HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH)，轮状病毒感染(呼肠孤病毒科(Reoviridae))，呼吸性感染(副流感菌以及呼吸道融合病毒)，脊髓灰质炎(小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，例如，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，麻疹和流行性腮腺炎(副粘病毒科(Paramyxoviridae))，风疹(披盖病毒科(Togaviridae)，例如，风疹病毒)，肝炎(例如，甲、乙、丙、丁、戊和/或己型肝炎病毒)，巨细胞病毒(例如，gB和gH)，胃肠炎(杯状病毒科(Caliciviridae))，黄热病及西尼罗河热(黄病毒科(Flaviviridae)，狂犬病(弹状病毒科(Rhabdoviridae))，朝鲜出血热(布尼亚病毒科(Bunyaviridae))，委内瑞拉热(沙粒病毒科(Arenaviridae))，疣(乳头状瘤病毒)，猿免疫缺陷病毒，脑炎病毒，水痘-带状疱疹病毒，EB病毒以及其他病毒科，包括冠状病毒科(Coronaviridae)，双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)以及丝状病毒科(Filoviridae)。
合适的细菌性以及寄生虫抗原还能从导致疾病的已知试剂获得或衍生而来，包括但不限于，白喉，百日咳，破伤风，肺结核，细菌或真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍乱，伤寒症，脑膜炎，单核细胞增多症，瘟疫，志贺菌病或沙门氏菌病，军团病，莱姆病，麻风病，痢疾，钩虫病，盘尾丝虫病，血吸虫病，锥虫病，利什曼病，贾第鞭毛虫病，阿米巴病，丝虫病，疏螺旋体属，以及旋毛虫病。还进一步的抗原可从非常规病原体中获得或衍生而来，如库鲁病、Creutzfeldt-Jakob综合征(CJD)，疯痒病，传染性水貂脑病以及慢性消耗症的成因试剂，或来自类蛋白质感染性颗粒，如与疯牛病相关的朊病毒。
另外的可从中得到抗原的特异性病原体包括结核分枝杆菌，衣原体，淋病奈瑟菌，致贺氏菌，沙门氏菌，霍乱弧菌，梅毒密螺旋体，假单胞菌，百日咳博德特氏菌，布鲁氏菌，土拉热弗朗西斯杆菌，幽门螺旋杆菌，问号钩端螺旋体，嗜肺军团杆菌，鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)，链球菌(A和B型)，肺炎球菌，脑膜炎球菌，流感嗜血杆菌(b型)，弓形虫，卡它莫拉菌，腹股沟肉芽肿，以及放线菌病；真菌病原体，包括念珠菌病及曲菌病；寄生虫病原体，包括绦虫，吸虫，蛔虫，阿米巴病，贾第鞭毛虫病，隐孢子虫属，血吸虫属，卡氏肺囊虫，毛滴虫病，以及旋毛虫病。本发明还能用于提供针对大量兽医病的合适的免疫应答，所述兽医病如口蹄疫，冠状病毒，多杀性巴斯德菌，螺杆菌属，寻常圆线虫属，类鼻疽放线杆菌，牛病毒性腹泻病毒(BovineViral Diarrhea Virus，BVDV)，肺炎克雷白氏杆菌，大肠杆菌，以及百日咳、副百日咳和支气管败血博德特氏菌。
在其他实施方式中，可在本方法中使用的用于包含在疫苗组合物中的抗原为肿瘤-衍生的抗原或自体或同种异体的整个肿瘤细胞。合适地，肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。几种肿瘤抗原及其表达模式在本领域已知且能基于要处理的肿瘤类型而选择。肿瘤抗原的非限制性实例包括cdk4(黑色素瘤)，β-连环蛋白(黑色素瘤)，半胱天冬酶-8(鳞状细胞癌)，MAGE-1及MAGE-3(黑色素瘤，乳腺癌，胶质瘤)，酪氨酸酶(黑色素瘤)，表面Ig独特型(例如，BCR)(淋巴瘤)，Her-2/neu(乳腺癌，卵巢癌)，MUC-1(乳腺癌，胰腺癌)以及HPV E6和E7(子宫颈癌)。另外的合适的肿瘤抗原包括前列腺特异性抗原(PSA)，唾液酸Tn(STn)，热休克蛋白质以及相关肿瘤肽(例如，gp96)，神经节苷脂质分子(例如，GM2、GD2和GD3)，癌胚抗原(CEA)以及MART-1。
如本领域技术人员所理解的，疫苗合适地配制为与预期的施用途径兼容。合适的施用途径的实例包括肠道外，例如静脉内，真皮内，皮下，肌肉内，经口(例如吸入)，透皮(局部)，鼻内，腹腔间，透粘膜，以及经直肠施用。疫苗还可包括生理可接受载体。“生理可接受”载体为合适于体内施用(例如经口、透皮或肠道外施用)或体外用途(即细胞培养物)的任何载体。特别地，合适的用于体内施用的生理可接受载体包括水，缓冲溶液和葡萄糖溶液等等。合适地，除生理可接受载体及抗原之外，组合物的另外组分包括赋形剂如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂或润滑剂。具体而言，合适的赋形剂包括但不限于吐温20、DMSO、蔗糖、L-组氨酸、聚山梨酯20以及血清。
本发明另一个实施方式是刺激针对抗原的体液反应的方法。该方法包括对受试者共施用PBS-57和抗原，如上文描述的。如本文使用的，“体液免疫应答”是通过B细胞产生抗体，以及相伴随的辅助过程，包括但不限于，例如，Th2激活和细胞因子产生，生发中心形成以及同种型转换，亲和力成熟产生以及记忆细胞产生。为了确定体液免疫应答是否被激活，将来自用抗原和PBS57免疫接种的受试者的样品中信号与来自单独用抗原免疫接种的受试者的样品中信号进行定量比较。体液免疫应答可以通过测量抗体的效应子功能而进行估计，所述效应子功能包括抗原或毒素中和，经典补体激活以及吞噬作用的调理素促进和病原体消除。对共施用PBS-57和抗原的响应中产生的抗体可以是任何类型，例如，IgM、IgA或IgG。体液免疫应答可通过本领域已知的任何定量方法进行测定，例如，ELISA、单辐射免疫扩散SRID)、酶免疫测定(EIA)或血凝抑制测定(HAI)。
本发明的进一步的实施方式是激活受试者中CD4+T淋巴细胞的方法。如本领域理解的，CD4+T细胞，或“T辅助细胞”，是识别由抗原呈递细胞表面上的II类主要组织相容性标志物(MHC)呈递的抗原，并且分泌淋巴因子以刺激免疫系统的细胞-介导和抗体-介导的两种分支的细胞。CD4+T细胞激活促进淋巴因子分泌，免疫球蛋白同种型转换，抗体反应的亲和力成熟，巨噬细胞激活以及自然杀伤(NK)和细胞毒性T细胞(CTL)的活性增强。淋巴因子为由淋巴细胞分泌的蛋白质，影响其自身活性和/或其他细胞活性。淋巴因子包括但不限于，白介素和细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12或INF-γ。用于确定CD4+T淋巴细胞是否被激活，将来自用抗原和PBS57免疫接种的受试者的样品中信号能与来自单独用抗原免疫接种的受试者的样品中信号进行定量比较。测定激活CD4+T细胞的方法为本领域已知。
本发明的另一个实施方式是在受试者中激活CD8+T淋巴细胞的方法。CD8+T淋巴细胞识别由I类MHC分子(存在于所有有核细胞上)呈递的抗原。MHC I类-肽复合体的参与导致裂解性颗粒递送至靶标细胞，引起靶标细胞的裂解。用于测定CD8+T细胞的激活的方法在本领域已知，包括但不限于ELISPOT、ELISA以及细胞毒性测定。如本文使用的，小鼠模型被用于监视CD8+T细胞的激活，使用荧光测定法来测量细胞-介导的细胞毒性，如Hermans等人，2004，Journal of Immunologic Methods，285：25-40描述的，以其全部通过引用并入。在该测定法中，小鼠在第0天用疫苗(含/不含PBS57)进行免疫。如下产生同基因的靶标细胞，从另一组小鼠分离脾细胞，并用两种分离的细胞标记或单个荧光染料的高和低浓度标记细胞，所述荧光染料例如，CFSE或CMTMR。一组靶标细胞加载抗原特异性肽，而另一组靶标细胞加载不相关肽。两种靶标细胞群体等量混合，注射到免疫的小鼠中。24小时后，处死小鼠并得到脾细胞和血液样品。通过流式细胞仪分析每组靶标细胞的水平。通过比较用抗体和PBS57免疫接种的样品中靶标细胞数量与单独用抗体免疫接种的样品中靶标细胞数量而确定CD8+淋巴细胞的激活。
本发明的其他方面通过考虑以下非限制性实施例以及附图会变得清楚明了。
实施例
实施例1：在体外PBS57激活NKT细胞
为确定PBS-57是否能够刺激培养物中的NKT细胞，测量了外周血淋巴细胞(PBL)培养物中NKT细胞的扩增。PBL衍生自两个健康供体，在有5％AB血清的RPMI细胞培养基中培养。将细胞以2x106PBL/孔/2ml铺板于12-孔板。用阴性对照(溶于PBS中0.05％吐温20和1％DMSO或溶于PBS中0.05％吐温20和10％DMSO)或终浓度为10ng/ml，100ng/ml或1μg/ml的测试佐剂(αGalCer、PBS-20、PBS-25或PBS-57)处理孔。对照化合物αGalCer、PBS-20和PBS25的化学式显示如下：
所有培养物补充有重组人IL2(rhIL-2)，以在第1天得到100UI/ml的终浓度。所有细胞在37℃和5％CO2下培养10天。第7天，移除一半的培养基(1ml)用于NKT分析。CD3+群体中NKT细胞的百分比通过流式细胞仪，使用荧光标记的CD1四聚体或荧光标记抗体(抗-CD3、抗-Vβ11以及抗-NKT)进行检测。NKT群体通过流式细胞仪鉴定为Vβ11+、四聚体+和TCRαβ+群体。在每个样品中，通过从Vβ11+empty-tetramer+TCRαβ+中减去Vβ11+PBS-57-tetramer+TCRαβ+来计算NKT细胞百分比。图1显示在用PBS-57、αGalCer、PBS-25和PBS-20处理后的NKT细胞的增加。如显示的，用PBS57或αGalCer处理PBL导致NKT细胞的扩增。
在分开的实验中，测量了PBS-57相比其他候选糖脂诱导NKT细胞的体外扩增的能力。外周血淋巴细胞衍生自两个健康供体，在有5％AB的RPMI中培养。将细胞以2x106细胞每孔每2ml培养基铺板于12-孔板。一个孔接受载体(溶于PBS中0.05％吐温20和1％DMSO)作为阴性对照，测试孔接受终浓度为1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的αGalCer、PBS-25、PBS-57或PBS-83。PBS-83的结构显示如下：
所有培养物补充有rhIL-2，以在第1天得到100UI/ml的终浓度，在37℃和5％CO2条件下培养7天。第7天，通过流式细胞仪检测NKT细胞百分比。图2表示对于不同糖脂处理的条件，第7天的NKT细胞百分比。用PBS57处理导致是用αGalCer处理的细胞至少两倍的NKT细胞增加。
实施例2：在用PBS57处理的培养物中NKT细胞的扩增
在一组14个健康供体的外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)的样品上进行NKT染色。PBL分离自12个受试者，PBMC分离自2个受试者。将每个分离的细胞样品分成两份样品。来自每个供体的第一份样品用10μl抗-Vβ11FITC(Beckman Coulter)、10μl抗-TCRαβ-PC5(Beckman Coulter)和2μl PE-标记的PBS-57-CD1d-四聚体染色。来自每个供体的第二份样品用10μl Vβ11、10μl抗-TCRαβ-FITC以及2μl PE-标记的空-CD1d-四聚体染色。
为确定NKT细胞的百分比增加，将第7天的NKT细胞数量除以第0天的NKT细胞数量。如图3显示的，与PBS57孵育导致来自人志愿者PBL培养物中NKT细胞可观的增加。
实施例3：施用PBS-57的小鼠中，TCRαβ，NKT细胞群体和树突细胞成熟的分析
为测试PBS57在体内的佐剂活性，对小鼠注射测试化合物，在24小时测定细胞激活和增加。四组每组五只C57B1/6J小鼠每只静脉内施用含有载体(DMSO单独)，0.97μgαGalCer，1.3μgPBS57或0.97μgPBS83(溶于总体积100μl的PBS)的磷酸缓冲盐(PBS)。施用测试化合物后24小时，处死小鼠并通过标准方法分离血液样品及脾细胞。脾脏中NKT细胞的百分比通过流式细胞仪，使用加载了PBS-57(PBS57-四聚体)或不不加载脂质(空-四聚体)的抗-TCRαβ-FITC和PE-标记的CD1d四聚体进行估计。图4A显示了用αGalCer或PBS57处理的小鼠相比单独用PBS和载体处理的对照小鼠中TCRαβ细胞百分比增加。NKT细胞的百分比通过从TCRαβ群体中空-四聚体+细胞百分比减去PBS57-四聚体+细胞百分比而确定。图4B显示用PBS57或αGalCer处理的小鼠脾脏中NKT细胞百分比相对于对照的减少。综合而言，图4A和图4B显示的结果指出PBS57与αGalCer一样有效地增加了小鼠脾脏中TCRαβ细胞的数量。注射了αGalCer或PBS57的小鼠的NKT细胞相对于对照的丢失指出NKT细胞表面上TCR的下调表达。
树突细胞(Dendritic cells，DC)通过流式细胞仪，通过用抗-CD11c R-PE(BD Pharmingen)和抗-CD8αFITC(Beckman Coulter)染色在脾细胞中进行检测。进一步分析两个树突细胞子集——CD 11c+CD8α-和CD 11c+CD8α+群体。在用PBS57或αGalCer佐剂处理的小鼠中看到相比于对照的DC两个子集都有50％的减少。为确定施用糖脂是否诱导这两个树突细胞子集的成熟，细胞用抗-CD40生物素/Stepta APC(BD Bioscience)、抗-CD80生物素(BD Pharmingen)/Stepta APC(BD Bioscience)和抗-CD86生物素(BD Pharmingen)/Stepta APC(BD Bioscience)抗体染色并用流式细胞仪分析。图5A和5B分别显示了在CD11c+CD8α-和CD11c+CD8α+细胞二者中CD40阳性细胞的百分比。图5C和5D分别显示了在CD11c+CD8α-和CD11c+CD8α+细胞群体二者中CD80阳性细胞的百分比。图5E和5F分别显示了在CD11c+CD8α-和CD11c+CD8α+细胞二者中CD86阳性细胞的百分比。水平线代表平均值。综合而言，数据显示PBS57和αGalCer二者都实质上地增加了CD11c+CD8α-和CD11c+CD8α+群体二者中CD40+、CD80+和CD86+表达细胞的百分比。
实施例4：测试小鼠模型中PBS-57的免疫佐剂活性的操作流程
使用小鼠模型测试PBS57结合抗原在体内引发的特异性细胞毒性T细胞应答(CD8+)。C57/B1/6J CD45.2雌性小鼠第0天用总体积100μl PBS中的抗原(卵清蛋白，Ova，VII级，Sigma，圣路易斯，MO)(含有/不含佐剂)，单独佐剂或单独载体(对照)进行免疫。测试化合物为1μg PBS57，1μgαGalCer，1μg PBS83(含有/不含50μgOva)。通过从第二组C57/B1/6J CD45.2雌性小鼠分离脾细胞且用低浓度(0.6μM 37℃下10分钟)或高浓度(6μM 37℃下10分钟)CFSE(荧光染料)标记细胞而制备同基因靶标细胞。对用高浓度CFSE标记的群体预加载5μM SIINFEIU肽(Ova-特异性肽，NeoMPS，Inc，圣地亚哥，CA)，37℃下超过60分钟。对用低浓度CFSE标记的群体预加载5μl LCMV gp33-41肽(非-Ova肽，NeoMPS，Inc，圣地亚哥，CA)，37℃下超过60min。在第10天，靶标细胞两个群体等数量混合(低或高浓度CFSE的1x107个细胞，总共每100μl中2x107个细胞)，并静脉内注射入每只免疫的小鼠。第11天处死小鼠，收集脾脏细胞及眶窦的血液样品。通过流式细胞分析计算肽-冲击的靶标细胞(CFSE标记的)相对于对照群体的平均存活百分比。图6B描绘了典型的流式细胞数据，显示加载Ova-特异性肽的靶标细胞的丢失。细胞毒性活性以百分比特异性裂解表示，通过从100减去Ova-特异性靶标细胞平均存活百分比计算。图7描绘了免疫的小鼠脾脏中靶标细胞的特异性裂解的百分比。只有Ova和PBS57的组合在脾脏中产生了Ova-特异性靶标细胞的细胞毒性裂解。
实施例5：用加不同浓度αGalCer的Ova免疫后的细胞毒性应答
如实施例4中描述的，对于不同αGalCer浓度，对加载Ova-肽的靶标细胞的CD8+T细胞应答诱导的体内细胞毒性进行估计。对十一组每组三只小鼠用总100μl的单独PBS，单独50μg Ova，单独1μgαGalCer，50μg Ova加1μg、100ng、10ng、1000pg、100pg、10pg或0.1pgαGalCer进行静脉内免疫。第10天，小鼠静脉内注射CFSE-标记的靶标细胞。第11天，从每只小鼠的眶窦中收集血液样品。如上文描述的，确定平均存活百分比和细胞毒性活性。图8描绘了对于特定剂量，αGalCer每组小鼠的特异性裂解百分比。结果显示静脉内注射时，αGalCer与抗原能够产生剂量依赖的特异性细胞毒性效应。
实施例6：用加不同浓度PBS57的Ova静脉内免疫后的细胞毒性应答
如实施例4中描述的，估计用不同浓度的加载Ova-肽的CFSE-标记的靶标细胞的PBS-57刺激的CD8+T细胞应答诱导的体内细胞毒性。用总100μl的单独PBS，单独50μg Ova，50μg Ova加10μgPBS57、1μg PBS57、100ng PBS57、10ng PBS57、1ng PBS57、100pgPBS57、10pg PBS57、1pg PBS57或0.1pg PBS57对十一组每组三只小鼠进行静脉内免疫。第10天，小鼠静脉内注射靶标细胞，第11天，从眶窦中收集血液样品。如上文描述的，确定平均存活百分比和细胞毒性活性。图9显示了每种剂量的PBS57下每组免疫的小鼠血液中特异性裂解的百分比。结果显示在静脉内注射时，与Ova结合的PBS-57能够诱导剂量依赖的特异性细胞毒性效应。
实施例7：用加不同浓度Ova的PBS57静脉内免疫后的细胞毒性应答
如实施例4中描述的，估计针对不同浓度的卵清蛋白与相同浓度PBS-57的CD8+细胞的细胞毒性应答。在第0天，用总100μl PBS的50μg单独Ova，1μg单独PBS57，1μgPBS57加50μg Ova、10μg Ova、1μg Ova、100ng Ova、10ng Ova、1ng Ova、100pg Ova或10pgOva对十组每组三只小鼠进行静脉内免疫。第10天，小鼠静脉内注射靶标细胞，第11天，处死小鼠并从眶窦中收集血液样品并分离脾脏细胞。如上文描述的，计算平均存活百分比和细胞毒性活性。图10显示了用每种剂量的Ova免疫的每组免疫小鼠的特异性裂解的百分比。结果显示，对用抗原和PBS-57两者免疫接种的细胞毒性应答依赖于抗原浓度。
实施例8：用加不同浓度Ova的αGalCer肌肉内免疫后的细胞毒性应答
如实施例4中描述的，估计针对肌肉内注射不同浓度卵清蛋白与相同浓度αGalCer的CD8+细胞的细胞毒性应答。在第0天，对十四组每组三只小鼠在左后腿肌肉内注射总100μl的PBS中的400μg单独Ova，1μg单独αGalCer，或400μg Ova加1μgαGalCer、0.5μgαGalCer、0.1μgαGalCer、50ngαGalCer、10ngαGalCer、5ngαGalCer、1ngαGalCer、500pgαGalCer、100pgαGalCer、50pgαGalCer或10pgαGalCer。第10天，小鼠静脉内注射靶标CFSE染色的细胞，第11天，处死小鼠并从眶窦中收集血液样品。通过流式细胞仪监测加载SIINFEKL的靶标细胞的特异性裂解。如实施例4中描述的，计算平均存活百分比和细胞毒性活性。图11显示了每种剂量的αGalCer下，每组免疫的小鼠血液中特异性裂解的百分比。结果显示当与Ova抗原一起肌肉内注射时，αGalCer不能够产生特异性细胞毒性T细胞应答，如所看到的，广泛的αGalCer浓度(从1μg-100pg)有非常低的特异性裂解。这些浓度的αGalCer(1μg-10ng)在静脉内注射时引发细胞毒性应答，但在肌肉内施用时未引发细胞毒性应答。
实施例9：用加不同浓度Ova的PBS57肌肉内免疫后的细胞毒性应答
如实施例4中描述的，分析针对肌肉内注射PBS57的CD8+细胞的细胞毒性应答。在第0天，对十四组每组三只小鼠在左后腿肌肉内注射总100μl PBS中的单独PBS，400μg单独Ova、1μg单独PBS57或400μg Ova加1μg PBS57、0.5μg PBS57、0.1μg PBS57、50ng PBS57、10ng PBS57、5ng PBS57、1ng PBS57、500pg PBS57、100pg PBS57、50pg PBS57或10pg PBS57。第10天，小鼠静脉内注射靶标CFSE标记的细胞，第11天，从眶窦中收集血液样品。如实施例4中描述的，计算平均存活百分比和细胞毒性活性。图12显示了用PBS57和Ova肌肉内免疫的小鼠的剂量曲线的特异性裂解。结果显示PBS-57在静脉内以及肌肉内注射时都能引发特异性细胞毒性应答，不像αGalCer只能在静脉注射时诱出细胞毒性应答。
实施例10：用加PBS57或αGalCer的Ova肌肉内或静脉内免疫后的细胞毒性应答比较
如实施例4中描述的，估计静脉内及肌肉内施用时对Ova加PBS57或Ova加αGalCer的细胞毒性应答。在第0天，对八组小鼠的注射如下：
1)以50μl PBS中的400μg Ova进行IM注射3只小鼠；
2)以50μl PBS中的400μg Ova进行IV注射3只小鼠；
3)以50μl PBS中的400μg Ova和1μgαGalCer进行IM注射6只小鼠；
4)以50μl PBS中的400μg Ova和1μgαGalCer进行IV注射3只小鼠；
5)以50μl PBS中的400μg Ova和1μgαGalCer进行IM注射6只小鼠；
6)以50μl PBS中的400μg Ova和1μgαGalCer进行IV注射3只小鼠；
7)以50μl PBS中的400μg Ova和1μg PBS57进行IM注射6只小鼠；以及
8)以50μl PBS中的400μg Ova和1μg PBS57进行IV注射3只小鼠。
第10天，用CFSE标记的靶标细胞注射小鼠。在第11天，处死小鼠并收集血液样品。如实施例4中描述的，确定平均存活百分比和细胞毒性活性。图13比较了使用不同施用途径的特异性裂解百分比。这些结果证实了αGalCer在肌肉内注射时没有诱导细胞毒性应答，而PBS57不管何种施用途径都引起细胞毒性应答。
实施例11：PBS57增强了在体内对破伤风类毒素的抗体应答
为确定添加PBS57至破伤风类毒素免疫是否导致增强的免疫应答，一组六只小鼠在第0和第15天用10μg破伤风类毒素(TT)或10μg破伤风类毒素与1μg PBS57的组合进行肌肉内免疫。在第0、15和30天所取的血液样品中，由标准方法确定IgG滴度。由破伤风类毒素特异性ELISA确定抗体滴度。如图14中看到的，PBS57增强了对TT的抗体应答。
实施例12：比较用Ova单独或与PBS57组合进行肌肉内免疫后的CD8+T细胞应答
使用小鼠模型测试由PBS57与抗体组合所引发的体内特异性T细胞应答(CD8+)。C57/B1/6J CD45.2雌性小鼠在第0和14天用总100μlPBS载体中的抗原(卵清蛋白，Ova，VII级，Sigma，圣路易斯，MO)(含或不含佐剂)、单独佐剂或单独载体(对照)进行肌肉内免疫。测试佐剂为1μgPBS57(含或不含50μgOva)。每组包括至少三只小鼠。在第21天从每只小鼠收集血液，在阻断Fc受体后用H2Kb-SIINFEKL五聚体对分离的细胞进行五聚体染色。进行FACS分析，分析中只包括CD8+细胞(将CD19+细胞排除在分析之外以排除任何B细胞)。图15描绘了典型的流式细胞数据，显示了用PBS57和Ova肌肉内注射后相比于单独Ova，Ova-特异性CD8+T细胞的增加。结果以血液中H2Kb-SITNFEKL特异性CD8+T细胞的平均+/-标准偏差的形式报告。
实施例13：比较用Ova单独或者与PBS57或αGalCer组合进行皮下免疫后的CD8+T细胞应答
使用小鼠模型测试相比于αGalCer，PBS57与抗原结合所引发的体内特异性T细胞应答(CD8+)。C57/B1/6J CD45.2雌性小鼠在第0和14天用总100μl PBS载体中的抗原(卵清蛋白，Ova，VII级，Sigma，圣路易斯，MO)(含或不含佐剂)，单独佐剂或单独载体(对照)进行皮下免疫。测试佐剂为1μgPBS57或αGalCer(含或不含50μgOva)。每组包括至少三只小鼠。在第21天从每只小鼠收集血液，在阻断Fc受体后用H2Kb-SIINFEKL五聚体对分离的细胞进行五聚体染色。进行FACS分析，分析中只包括CD8+细胞(将CD19+细胞排除在分析之外以排除任何B细胞)。图16描绘了典型的流式细胞数据，显示了用PBS57和Ova肌肉内注射后相比于单独Ova或相比于Ova加αGalCer的免疫，Ova-特异性CD8+T细胞的增加。结果以血液中H2Kb-SIINFEKL特异性CD8+T细胞的平均+/-标准偏差的形式报告。
本发明的组合物和方法已经以示例性实施方式的形式描述，对本领域技术人员明显的是可以在本文描述的方法的步骤或步骤的顺序上以及对组合物和方法进行变动而不偏离本发明的思想、精神和范围。更具体地，明显的是化学和生理上都相关的特定的试剂可以替代本文描述的试剂，而达到相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和改动似乎都在本发明的精神，范围和概念之内。另外，所有本文列出或描述的专利和出版物以其全部通过引用而并入。
本说明书和附加权利要求中使用的，单数形式的“一”、“一个”和“这个”包括复数指代，除非内容里清楚地指明另外的意思。因此，例如，指示含有“一种多聚核苷酸”组合物包括两种或多种多聚核苷酸的混合物。还应该注意，术语“或者”通常以其包含“和/或”的意义使用，除非内容里清楚地指明另外的意思。所有本说明书中引用的出版物、专利和专利申请表明了本发明所涉及的本领域普通技术水平。本文所有出版物、专利和专利申请清楚地通过引用并入，其程度与每个单个出版物或专利申请具体分别通过引用指出的相同。在本公开和所并入的专利、出版物和参考文献有冲突的情况下，本公开应当控制。
还要特别理解的是本文列举的任何数值包括所有从较低值到较高值的值，即，列举的最低值和最高值之间所有可能的数值组合应考虑为在本申请中清楚陈述。

Claims (17)

1.在受试者中，增强疫苗的免疫原性的方法，包括将PBS-57和疫苗共施用于受试者，其中免疫原性相对于对照被增强。
2.权利要求1的方法，其中免疫原性相对于对照被增强了至少50％。
3.权利要求1的方法，其中免疫原性相对于对照被增强了至少75％。
4.权利要求1的方法，其中免疫原性相对于对照被增强了至少100％。
5.权利要求1的方法，其中免疫原性相对于对照被增强了至少150％。
6.权利要求1的方法，其中疫苗为肌肉内施用。
7.权利要求1的方法，其中疫苗为皮下施用。
8.在受试者中，刺激对抗原的体液免疫应答的方法，包括将PBS-57和抗原施用于受试者。
9.权利要求8的方法，其中体液免疫应答包括产生IgG抗体。
10.权利要求8的方法，其中体液免疫应答包括产生IgA抗体。
11.在受试者中，激活CD4+T淋巴细胞的方法，包括将PBS-57和抗原施用于受试者。
12.权利要求11的方法，其中CD4+T淋巴细胞的激活包括Th1免疫应答的增加。
13.权利要求11的方法，其中CD4+T淋巴细胞的激活包括Th2免疫应答的增加。
14.权利要求11的方法，其中CD4+T淋巴细胞的激活包括Th1和Th2免疫应答的增加。
15.在受试者中，激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括将PBS-57和抗原施用于受试者。
16.权利要求15的方法，其中疫苗为肌肉内施用。
17.权利要求15的方法，其中疫苗为皮下施用。
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