CN101820898A - 互补决定区（CDRs）功能人源化 - Google Patents

Abstract

现有的免疫球蛋白人源化方法，主要着眼于框架区序列的人源化修饰。本发明提供了一种方法，其通过抗体互补决定区(CDRs)的功能人源化，降低非人CDRs抗体的潜在免疫原性。通过人CDR序列数据库的比对，鉴定出与亲本CDR具有高度序列同源性的人CDR序列。一个或多个与亲本CDR具有高度同源性的人CDR序列，被用于置换鼠源免疫球蛋白(或其人源化免疫球蛋白、或其它重组免疫球蛋白)的对应CDR。所应用的人源CDRs，将提高抗体的原有亲和力和特异性、或对原有亲和力和特异性影响最小。

Description

互补决定区(CDRs)功能人源化

优先权

本申请要求2007年5月16日提交的美国临时专利申请第60/930,371号的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及重组免疫球蛋白的构建方法。更具体而言，其涉及应用获自灵长类或者人类数据库的相应互补决定区(CDRs)序列置换亲本免疫球蛋白的CDR序列，所述亲本免疫球蛋白比如鼠免疫球蛋白。由此构建的免疫球蛋白可视为CDR-人源化的免疫球蛋白。

背景

Kohler和Milstein于1975年描述了使用细胞融合技术，用以从免疫的小鼠制备单克隆抗体，这是抗体技术发展历程中的重要里程碑。单克隆抗体具有高度特异性，结合并对疾病特异靶点发挥效应，而不影响机体正常细胞，因而较之非特异的化学药物具有较少的毒副作用。鼠抗CD3单克隆抗体OKT3是美国FDA于1986年批准的第一个治疗性抗体，用于预防器官移植排异反应。由于鼠源单克隆抗体所具有的一系列内在缺陷，如半衰期短、不能激发人体效应子功能以及人抗小鼠抗体反应(即，HAMA应答)，严重阻碍了治疗性抗体的发展步伐。

80年代至90年代期间，随着其它抗体工程技术的出现，例如啮齿动物抗体的抗体嵌合技术(参见例如：美国专利4,816,567，其通过引用并入本文)和人源化抗体技术(参见例如：美国专利5,225,539，5,585,089，5,693,762，5,693,761，其通过引用并入本文)、噬菌体展示组合文库技术(参见例如：Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)；Felici et al.，J Mol.Biol.，223：301-310(1991)；Markland et al.Gene，109：13-19(1991))、产生人抗体的huMab/Xeno鼠(参见例如：美国专利6,075,181，6,150,584；和7,041,870，其通过引用并入本文)，以及相关的抗体生产技术，终于展现出单克隆抗体的治疗前景。1997年获准上市的利妥昔(Rituximab)是首个肿瘤治疗性单克隆裸抗体，它成为开创治疗性抗体先河的标志。迄今已有超过23个治疗性抗体获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，还有数百个候选抗体正在进行临床试验阶段的评估。

首先，抗体通过与靶抗原在独特的和特异的位点结合来工作。其通过阻断靶细胞与配体的不期望的作用(参见如ReoPro(abciximab)、Remicade(Infliximab，英夫利昔单抗)和Humira(adalimumab，阿达木单抗)等)，或者通过介导免疫效应子功能来清除不需要的细胞如肿瘤细胞(参见如Rituxan(rituximab)、Herceptin(trasuzumab，赫赛汀)和Campath-1(alemtuzumab)等，从而发挥治疗功效。因为抗体的靶向特异性，其他人已将抗体用作载荷化学药物的输送载体(如Mylotarg(gemtuzumab))或放射性核素(如Zevaline(ibritumomab)，和Bexxar(tositumomab))，导向至靶细胞而发挥细胞毒性清除效应。治疗性抗体以其独有的靶向特异性、确证的临床疗效和安全性，为实现最佳的疾病诊断、治疗和其他产业化应用，开辟了无限发展空间。

治疗性抗体在临床的成功应用，得益于抗体工程技术的一系列突破，如抗体嵌合化和人源化。技术上可将大多数鼠源抗体转化为人源形式，而不显著改变亲本抗体的抗原特异性和亲和力。抗体嵌合技术(如上面所引用的美国专利4,816,567详细描述的)采用了将鼠抗体的轻链和重链可变区移植到人抗体的恒定区的方法。因此，嵌合抗体包含有1/3的鼠源序列，理论上，在反复使用时会对人体构成免疫原性。传统的抗体人源化技术(如上面所引用的美国专利5,225,539，5,585,089，5,693,762和5,693,761详细描述的)是将亲本抗体的互补决定区(CDR)序列移植到受体人框架序列，目的是减低鼠源序列百分比。所得到的人源化抗体通常将含有少于10％的鼠源序列。该抗体人源化技术并非完美无瑕。首先，鼠源抗体的CDRs将会构成主要的“外源性”(致敏原)；其次，直接将CDRs嫁接至人源框架将导致抗体特异性和亲和力丧失，虽然该丧失可通过鉴别框架中可能与抗原结合位点作用的关键残基、并将这些鼠残基重新引入回人框架予以补救。但CDRs-移植的免疫球蛋白含有7个以上的鼠源框架回复突变残基亦非罕见。传统的CDRs-移植技术的主要缺陷在于，仅仅追求达到与人抗体的“外观相似”，而非从免疫系统的全景角度去检视可实现的抗体“人化”程度。对于受体人框架背景中回复突变的鼠源残基产生新的T细胞免疫表位的可能性也未加考虑。

已开发了其他技术来产生全人化抗体，从而避免在最终的抗体结构中应用鼠源CDRs。剑桥抗体技术公司(Cambridge，UK)和Dyax公司(Cambridge，MA)已从分离自免疫的人的外周血B细胞获得抗体cDNA序列，并设计了噬菌体展示文库以鉴别具有特别的特异性的人可变区序列。简言之，将抗体可变区序列与M13噬菌体基因III或VIII结构融合(如上引用的Clackson et al.1991.Nature 352：624-628；Feliciet al.1991.J Mol Biol.222：301-310；Markland et al.1991.Gene 109：13-19中详细描述)。这些抗体可变区序列以Fab或单链Fv(scFv)结构形式表达于携带各自序列的噬菌体的外壳。使用不同水平的抗原结合条件(即严格性)，通过数轮淘选程序，选择和分离表达对感兴趣抗原特异的Fab或scFv结构的噬菌体。然后用标准测序法测定所选噬菌体的抗体可变区cDNA序列。以现有的抗体工程技术将可变区序列和同型抗体构建成完整抗体。由此方法构建的抗体可视为全人化抗体(包括CDRs)。为了改进所选抗体的免疫反应特性(抗原结合特异性和亲和力)，引入体外成熟过程，包括：不同重链和轻链的组合交联，在重链和轻链CDR3进行缺失/添加/突变(模拟V-J和V-D-J重组)、随机突变(模拟体细胞超突变)。抗肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体——Humira(adalimumab)就是如此方法构建的“全人化”抗体，已被美国FDA批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)。该技术仍存在局限性，由于所有序列都是源自成熟人B细胞的现有抗体，序列多样性有限；其次，体外成熟过程中引入的突变可能是潜在的外源性致敏原(新的T细胞表位)，从而给噬菌体文库衍生抗体的人源化带来问题。事实上，反复接受Humira治疗的患者，抗抗体反应(AAR)发生率达12％(Abbott.USA.Adalimumab Product Approval Information.2003)，所以噬菌体展示抗体的“人化”程度仍值得商榷。

由Abgenix公司和GenPharm-Mederax公司发展的人化鼠(参见美国专利6,075,181(Abgenix)；6,150,584(Abgenix)；和7,041,870(Medarex)，其通过引用并入本文)，通过基因敲除和转基因技术，携带人基因组免疫球蛋白基因序列，可能是代表了全人化抗体的最佳途径。可以用目标抗原免疫Xenomouse或HuMab鼠，抗体亲合力的成熟过程在自然的体内免疫环境中进行。尽管轻链的V-J基因片段和重链的V-D-J基因片段是100％的人源基因，但在鼠体发生的V-J和V-D-J基因连接过程中的突变/缺失/添加以及体细胞突变仍与人体有明显差异，也不能排除这些突变在人免疫监视下将成为新的T细胞免疫原表位源的可能性。事实上，类风湿性关节炎临床试验显示，由HuMab鼠制备的抗-CD20抗体(HuMax-CD20)，免疫原性和输液反应反而高于嵌合抗体Rituximab(参见：编者按Ostergaard et al.2006.First Clinical Resultof Humax-CD20 Fully Human Monoclonal IgG1 antibody Treatment in RheumatoidArthritis(RA).EULAR.Abstract P0018)。而且由于能够引入转基因鼠的免疫球蛋白小基因数量有限，抗体的多样性也不及人体自然免疫系统那么丰富。不过与其它方法的产生的抗体相比，由这些鼠产生的抗体仍是人源化程度最高的。

除了人化鼠技术，其他人源化技术大多着眼于抗体外观而非功能，构建外观相似的人化抗体已经成其最主要目标。然而从免疫系统的角度来说，它会对免疫球蛋白进行检测、监控。抗原呈递细胞(APC)会将免疫球蛋白内化、酶解成线状短肽，一些产生的短肽片段与APC细胞主要组织相容性复合物MHC-II分子结合。小部分短肽表达在细胞表面与MHC分子形成复合物，一经T细胞上的抗体特异性受体所识别，这些MHC-肽复合物便会触发一系列的效应子反应。这触发了免疫级联反应，包括T细胞激活分化为T辅助细胞。细胞因子的释放导致抗原特异的B细胞分化成为抗体特异的浆细胞。只有当那些降解的Ig短肽被免疫系统视为“自我”才能逃避免疫监视，这样的抗体才是真正意义的人化抗体。

传统的CDR移植人源化技术，不能去除重组抗体中关乎抗原结合特异性和亲合力的鼠源CDR序列，而且大多CDR移植方法中的回复突变可能引入新的T-细胞免疫原表位，从而导致CDR移植抗体成为潜在的免疫原。尽管框架重塑技术(framework-patching或框架重组技术(framework-reengineering))可以避免或减轻回复突变的需要(参见例如：美国专利7,321,026和7,338,659，其通过引用并入本文)，但鼠源CDR所固有的免疫原问题仍有待解决。

也有其它的方法尝试降低抗体人源化中鼠源CDRs的潜在免疫原性。例如，一种称为“SDR移植”的技术(参见例如Gonzales et al.2003.Minimizing immunogenicity ofthe SDR-grafted humanized antibody CC49 by genetic manipulation of the frameworkresidues.Mol Immunol.40：337-349；Gonzales et al.2004.SDR grafting of a murineantibody using multiple human germline template to minimize its immunogenicity.MolImmunol.41：863-872；Kashimiri et al.2005.SDR-grafting-a new approach to antibodyhumanization.Methods 36：25-34，其通过引用并入本文)通过鉴别并保留CDR区域中那些与特异抗原接触的关键鼠源氨基酸残基，而将其余与抗原结合无关紧要的残基直接用人免疫球蛋白CDR置换，人源框架接受移植SDR。SDR-移植依然是从外观相似的共同角度以尽量降少在最终的重组免疫球蛋白中鼠源残基的数量去解决免疫原性问题。同样，该方法也面临传统CDR-移植的问题，即，为恢复免疫特性而引入框架的回复突变本身就可能是产生新T表位的潜在致敏原。对于隐含在人源序列中的鼠源残基，人体免疫监视系统将视之为异己。

Gillies等认为(参见：美国专利6,992,174，其通过引用并入本文)，如果治疗性蛋白序列不含有会被宿主抗原提呈细胞视为“异己”(T表位)的线状肽段，该蛋白将被宿主免疫系统视作“自我”，用作重复治疗时可切实降低诱发不利的免疫反应的风险。据此设计的称为“肽段线展”(peptide threading)程序(计算机模拟肽段结合MHCII分子)在计算机辅助下鉴别出延伸肽段中那些可能被MHC-II提呈的“异己”序列，然后通过替换其中的一个或二个氨基酸，将其转化为免疫系统认可为“自我”序列(不会与APC的MHC-II结合)。理论上任何有治疗潜力的高免疫原性蛋白(包括鼠抗体)通过氨基酸序列中的个别突变均可转为非免疫原性蛋白(去免疫原)(参见，Adair F，2000.Immunogenicity：The last hurdle for clinically successful therapeutic antibodies.BioPharm 13：42-46；Adair et al.2002.The immunogenicity of therapeutic proteins.BioPharm Feb Issue，p30-36，其通过引用并入本文)。这项技术/方法需要对序列的必需条件有透彻的认识，知道哪些序列会被MHC提呈为“免疫原”哪些会被视为“非免疫原”，此外还需有设计精巧的肽序列分析计算机程序。

对高特异性抗体片段(Fab和Fv)与蛋白抗原偶联的晶状衍射分析，揭示出如下共性特征：1)重链和轻链都与抗原显著接触，虽然重链接触区域通常更为广泛；2)抗原结合特异性主要(如果不是全部)决定于VH和VL互补决定区(CDRs)；通常由D(多样性)基因编码的VH CDR3对抗原结合贡献尤甚；3)抗原的接触残基并非连续序列，而是相互形成一邻接表面(抗原决定簇或表位)；4)抗原和抗体的接触表面呈现高度互补；5)表面区域相互作用的夹角约600-900A；6)抗原抗体结合系经由范德华力、氢键以及程度不等的盐桥结合；7)CDR的大部分芳香族残基都参与抗原接合(参见综述：Bradford et al.1995.Structureal features of the reactions betweenantibodies and protein antigens.FASEB J.9：9-16)。

并非所有鼠抗体(或其它种属的抗体)的CDR残基都是抗原结合之必须。抗体结合位点三维构象深度分析显示，仅有20-33％的CDR残基为抗原-抗体相互作用之关键(参见Padlan EA.1994 Mol Immunol.31：169-217)。为研究体细胞突变对抗体结合亲和力和特异性的影响，Chen等(EMBO 14：278402749，1995)对2株磷酸胆碱单抗T15和D16(拥有相同VH CDR2序列)的VH CDR2引入随机突变。在所有引入的43个突变中，第17和第22突变导致抗体亲和力和特异性完全丧失；第7和第4突变减低T15和D16免疫原性；而第19和第10号突变并不改变抗体的抗原结合亲和力。D16单抗的第7号突变则提升抗体亲和力(Chen et al.Enhancement anddestruction of antibody function by somatic mutations：unequal occurrence is controlled byV gene combinatorial association.EMBO 1995，14：2784-2794)。虽然M257突变包含有发生在VH CDR2(19个残基)的4个非保守性点突变(达20％序列变化)，T15和D16的免疫特性都未改变。

抗流感病毒N9涎酸酶的单抗NC41的结合力研究显示，实际上仅5个CDRs(共6个CDRs)与涎酸酶抗原接触；轻链CDR1并不与抗原接触(Tulip et al.1991.Refinedatomic structure of N9 subtype influenza virus neuraminidase and escape mutants.J MolBiol.221：487-497)。

由此看来，人源化抗体技术仍有改进之必要，以减低人源化抗体的免疫原性。本发明解决了这一需要。

发明概要

本发明提供一种抗体重组技术，通过对亲本免疫球蛋白CDR各自进行人源化改建，较现有人源化方法进一步减低鼠源抗体免疫原性。

本领域技术人员容易理解，本发明的某一或某些部分，可用以达成某些目的，而其它部分，则用于达成其它某些目的。对于本发明的每一部分而言，每一应用目的之全部细节，可不尽相同。因此，以下所述及的目的，都应当被视为本发明任一部分的替代性描述。

因此，一方面，本发明所提供的重组免疫球蛋白，至少有一个互补决定区(CDR)的氨基酸序列是由灵长类免疫球蛋白的对应CDR的氨基酸序列替换而来。如此重组的免疫球蛋白对同一抗原的结合亲和力是亲本免疫球蛋白的50、30、20、10、5、3、或2倍。在一个实施方式中，用于替换的灵长类CDR至少有50％氨基酸序列与亲本CDR相同；在另一个实施方式中，用于替换的灵长类CDR，至少有一个对应于亲本CDR位点的相同芳香族氨基酸残基；在又一个实施方式中，用于替换的灵长类CDR，至少有一个对应于亲本CDR位点的相同荷电氨基酸残基；在还有其他的实施方式中，用于替换的灵长类CDR至少有一个对应于亲本CDR位点的相同关键氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，此残基乃维系重组免疫球蛋白对抗原的结合亲和力，是亲本免疫球蛋白对相同抗原的结合亲和力的50倍、30倍、20倍、10倍、5倍、3倍、或2倍；在优选的实施方式中，灵长类物种为人。

另一方面，本发明提供了从哺乳物种中选择CDR的方法，用以替换亲本免疫球蛋白的对应CDR，该方法包括：a)提供非人亲本免疫球蛋白的抗原结合氨基酸序列；b)确定至少一个灵长类CDR，其氨基酸序列与亲本免疫球蛋白CDR的氨基酸序列同源。

在进一步的方面，本发明提供了重组免疫球蛋白的构建方法，该方法包括如下步骤：a)提供非人亲本免疫球蛋白的抗原结合氨基酸序列，以及b)确定至少一个灵长类CDR，其氨基酸序列与亲本免疫球蛋白CDR的氨基酸序列同源(同上)。该方法进一步包括如下步骤：c)在亲本免疫球蛋白氨基酸序列中，用同源灵长类CDR替换亲本免疫球蛋白CDR；d)制备步骤c中获得的同源氨基酸的编码核酸序列；以及e)在重组细胞中表达步骤d中获得的核酸序列，获得重组免疫球蛋白。如此重组的免疫球蛋白的抗原结合亲和力是亲本免疫球蛋白对相同抗原结合亲和力的50倍、30倍、20倍、10倍、5倍、3倍、或者2倍。

根据本发明，提供了多种灵长类(例如：人)免疫球蛋白序列的数据库，并提供每一轻链和重链CDR1、CDR2、CDR3以及CDR4片段的单独的确切(有形)数据库。

一方面，本发明还提供了免疫球蛋白轻链可变区序列有形数据库，即在存储介质，例如电子、磁、光存储介质上，或者打印形式。数据库包含有某单一哺乳动物物种的轻链可变区的氨基酸序列，或者编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，数量至少是2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000个。在优选的实施方式中，物种为人。在一些实施方式中，数据库仅包含κ链序列；在其他实施方式中，数据库仅包含λ链序列；在还有其他实施方式中，数据库包含κ和λ链序列。

另一方面，本发明还提供了轻链DNA文库，所包含的DNA序列用以编码如前所述免疫球蛋白轻链可变区序列数据库的轻链可变区氨基酸序列，数量至少是2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000个。

另一方面，本发明提供了免疫球蛋白重链可变区序列有形数据库，即在存储介质，例如电子、磁、光存储介质上，或者打印形式。数据库包含有某单一哺乳动物物种的重链可变区的氨基酸序列，或者编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，数量至少是2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、或10000种。在优选的实施方式中，物种为人。在一些实施方式中，数据库仅包含γ链序列；在其他实施方式中，数据库包含其它类型重链序列，例如γ1、γ2、γ3、γ4、μ、α1、α2、δ或ε重链；在还有其他实施方式中，数据库包含上述重链类型的任何可能组合。

在进一步的方面，本发明还提供了重链DNA文库，所包含的DNA序列用以编码如前所述免疫球蛋白重链可变区序列数据库的重链可变区氨基酸序列，数量至少是2，5，10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000或10000个。

还有另一方面，此外，本发明提供了含有亲本免疫球蛋白scFv或Fab的噬菌体展示文库，其中，它的一个或多个CDR由前面提及的哺乳动物物种中选择的CDR替换，在优选的实施方式中，哺乳动物物种为人。

还有另一方面，本发明还提供了最大程度替换亲本免疫球蛋白CDRs的方法，用哺乳动物物种CDR替换亲本免疫球蛋白对应的CDRs而并不明显改变所得重组免疫球蛋白的特异性和亲和力。在一个实施方式中，该方法涉及在重链CDR3处引入突变；在另一个实施方式中，在轻链CDR3处引入突变；在还有其他实施方式中，在重链CDR3和轻链CDR3处均引入突变。

结合附图和实施例阅读下面的详细描述，本发明的上述内容和特征将更为明了。然而，需要指出的是，前文述及的发明概要以及随后的详细描述，只是本发明优选的实施方式、而非对本发明或本发明的其他替代实施方式的限制。尤其要指出，尽管本文中本发明参考一些具体实施方式进行描述，但是应该知道，这些描述是对发明的示例性说明，并不构成对发明的任何限制。正如随附的权利要求书所述，在不脱离本发明精髓和范畴的前提下，本领域技术人员可以想到对本发明作出各式各样的调整和应用。同样，对于谙熟抗体设计和文库构建的专业人员，从本发明描述的概要和一些实施实施中，可以轻易地理解本发明其他目的、特征、优势和好处。当结合具体实施例、数据、图表、以及据此所得的所有合理推论、单独或者考虑并入本文的参考文献，本发明的这些目的、特征、优势和好处变得显而易见。

附图简述

从下文发明详细描述结合附图，本发明其它特征和好处将显而易见，附图描述如下：

图1.提供免疫球蛋白RFB4的轻链可变区氨基酸序列，CDRs下划线标示。

图2.提供cRFB4L1与最大同源性人L1的氨基酸序列比对。

图3.提供抗体1F5的重链可变区V_H(图3a)和轻链可变区V_K(图3b)的DNA序列。

图4.提供抗体1F5的重链可变区V_H(图4a)和轻链可变区V_K(图4b)氨基酸序列。CDRs方框标示。

图5.提供框架重组抗体fr1F5的重链可变区V_H(图5a)和轻链可变区V_K(图5b)氨基酸序列。CDRs区域用方框标示。

图6.提供竞争性流式细胞分析的结果：鼠源1F5抗体和框架重组抗体fr1F5对FITC-偶联-fr1F5抗体的竞争比对。

图7.提供PCR引物和反应步骤的图示，经由连接体(GGGGS)₃链接VH和VK序列。

图8.提供含不同CDR人源化序列的scFv-嗜菌体以Raji细胞表面抗原提取物作为抗原的结合分析结果。

发明详述

本发明对人源化抗体构建方法进行了显著改进。尤其是，本发明提供了重组的CDR人源化抗体，其中，应用来自灵长类或人类数据库的相应CDR序列，来替换亲本免疫球蛋白(如鼠免疫球蛋白)中的CDR序列。

在实践或测试本发明的实施方式时，虽然可应用与在此描述的那些相似或等同的任何材料和方法，现在仍详尽描述了本发明所优选的方法、设施、和材料。由于这些因素会根据常规实验的优化状况而作出变通和调整，因此，应该理解本发明不应受限于所描述的某一具体材料组分、方法和步骤。此外，描述中所使用的术语，也仅仅是为了描述特定内容或实施方式，并不意味着对本发明范围有何限制。本发明的范围仅仅由所附的权利要求书限定。

除非另有定义，所用技术和科学术语都有相同含义，且为本领域的普通技术人员所知悉。若有歧义，以本说明书为准。

除非专门说明，本发明中所用词“一种”、“一个”和“该、所述”，意为“至少一种、一个”。

此处所述“免疫球蛋白”，是指基本上由免疫球蛋白基因编码的一条多肽或几条多肽构成的蛋白质。典型的免疫球蛋白由两条重链和两条轻链配对而成。全长免疫球蛋白重链的分子量约50kD(长约446个氨基酸)，由重链可变区基因(约116个氨基酸)和恒定区基因编码。重链恒定区的各种同种型(isotype)，如α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)δ、ε、和Mu序列，分别由对应的重链恒定区基因编码。全长免疫球蛋白轻链的分子量约25kD(长约214个氨基酸)，由轻链可变区基因(约110个氨基酸)和κ或者λ恒定区基因编码。天然存在的免疫球蛋白称之为抗体，通常是由两对相同的免疫球蛋白链所形成的四聚体分子，每对具有一条重链和一条轻链。在每对中，抗体的抗原结合是由配对轻链和重链的可变区来共同负责，而抗体的典型效应子功能则由恒定区负责。

本发明涉及人源化免疫球蛋白，本发明所述及的人源化抗体，须具备以下特征：

(1)免疫原性显著降低、更优选完全清除，因此，抗体可用于人体反复注射；

(2)对原始抗原的免疫反应性的影响最小，包括抗原结合特异性和亲和力(3倍以内)；

(3)能够介导免疫效应子功能，例如补体固定、补体介导细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性，等等。

抗体的免疫原性可使用常规技术测定，比如，典型的是在临床设施中使用合适的对象，如灵长类更优选人类进行测定。例如，目标治疗性抗体的免疫原性，可以通过在给予目标抗体后鉴定所诱发的特异性T细胞表位来分析，或者通过测定正血色素红细胞(NCE)刺激辅助T细胞反应、和/或者诱导迟发过敏样反应来分析。这些方法例如可采用Antitope公司(英国剑桥)的EpiScreen^TM技术完成自动测定。

本发明所构建的免疫球蛋白，是无免疫原性的、功能性人源化免疫球蛋白，其通常可单独临床应用，也可与其它治疗手段联合应用，以治疗易受抗体疗法影响的疾病。例如，该免疫球蛋白可用于过继性免疫、或者通过补体介导的溶解作用来清除不需要的细胞和抗原，而不会像先前的抗体治疗那样，引发免疫副作用(如过敏性休克)。可选择地，本发明的免疫球蛋白还可用于体外目的，例如用作检测特异性抗原的体外诊断工具，等等。

本发明免疫球蛋白优选以裸抗体形式用作疾病治疗目的，剂量范围可以是50-400mg/m²，给药途径可以是病灶局部、皮下、静脉内、和肌肉内注射等。以不同给药间隔多次给药可望达到理想的治疗或诊断效果，如间隔一周、每周一剂共四周。本发明免疫球蛋白可联合其它治疗手段应用，如化疗药物(如CHOP、阿霉素、5-氟脲嘧啶等)、放射治疗、放射免疫疗法、疫苗、酶、毒素/免疫毒素、或来自本发明或本发明之外的其它免疫球蛋白等。例如，如果本发明免疫球蛋白是一个特异于抗肿瘤抗体独特型的抗体，其就可用作肿瘤疫苗来刺激机体产生抗肿瘤的Ab3抗体反应。本领域所熟知的其它各种药剂、或药剂组合，也可与抗体联合应用。

本发明免疫球蛋白还可用作为各种药物组合物的构成组分。免疫球蛋白可以是裸抗体，或者与其它组分相偶联，如药物、放射性核素、毒素、细胞因子、可溶因子、激素、酶(如羧酸酯酶、核糖核酸酶)、肽、抗原(如肿瘤疫苗)、DNA、RNA、或者其它具有特异治疗功效的效应子分子，而抗体部分作为这些偶联分子的特异性靶向基或输送载体。此外，本发明免疫球蛋白或其衍生物，如抗体片段、单链Fv，双抗体等，可用作融合蛋白与其它功能部分融合，如不同发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白衍生物(例如双特异抗体)、毒素、细胞因子、可溶因子、激素、酶、肽等。本领域所熟知的其它各种药物组合，也可联合应用。

本发明的材料和方法可用于筛选对靶抗原具有结合特异性的候选抗体。前文述及，本发明所构建的是新颖的、无免疫原性的、功能性全人化抗体，具有临床治疗和/或诊断价值。因此，本发明并不局限于特异性抗原范畴。本发明适用的靶抗原的实例包括(但不限于此)：血小板表膜CD417E3糖蛋白IIb/IIIa受体(与心血管疾病相关)、肿瘤坏死因子TNF(与炎性疾病相关)、CD52(与慢性淋巴细胞白血病相关)、IL-2a(与移植排斥反应相关)、VEGF(与黄斑变性和结直肠癌相关)、EGF(与结直肠癌相关)、补体系统蛋白5(与炎性病症相关)、CD3受体(与移植排斥反应相关)、T细胞VLA受体(与多发性硬化症相关)、CD11a(与炎性疾病，如银屑病相关)、CD20、CD22、CD19、恒定链Ii(与非何杰金淋巴瘤和可能的自身免疫疾病相关)、CD33(与急性髓性白血病相关)、炎性IgE(与过敏性相关哮喘疗法相关)、呼吸道合胞病毒F蛋白(与RSV感染相关)、ErbB2(与乳腺癌相关)、CEA(与结直肠癌、乳腺癌等肿瘤相关)、Mucin(与乳腺癌、胰腺癌相关)、CD147(与肝癌相关)、β-淀粉样蛋白(与老年痴呆症相关)。

所表达免疫球蛋白的靶抗原结合能力，可通过传统技术方法来测试，例如，直接或竞争性细胞结合分析(如细胞ELISA、流式细胞分析)、ELISA测定(例如，其中，靶抗原包被ELISA标板，使用酶标仪比色方法测量抗体直接结合到包被抗原的板上)、Biacor测试(如测定抗体对特定抗原的亲和力)、等等。

本发明免疫球蛋白的临床治疗和/或诊断价值，也可通过传统技术分析和确认，例如，通过诱发靶细胞的补体介导细胞毒效应(CMC)、或抗体依赖性细胞细胞毒效应(ADCC)、或者阻断酶和功能蛋白的特异活性(如，特定白介素特异性抗体对白介素依赖的细胞系增殖效应的特异阻断)。

本发明论及的氨基酸或荷电残基是“相同的”或“保守性相似的”。“保守性相似”是指本领域认可的具有相似特性的氨基酸的保守置换过程。在保守性置换中，氨基酸残基优选突变成不同的氨基酸，而氨基酸侧链特性得以保留。所以，期望保守性置换对所得抗体活性的影响最小、或者没有影响。依照侧链特性区分不同氨基酸族，比如，疏水氨基酸族(如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)，亲水氨基酸族(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，具有下述共有功能基团或特征的侧链：脂肪族侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸)；含羟基的侧链(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)；含硫侧链(C、M)；含羧酸和酰胺的侧链(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；含碱基侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；芳香族侧链(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。此外，可提供功能相似氨基酸的保守性置换表格，为本领域技术人员所熟知。例如，以下8类氨基酸族，可以互为替换：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸、色氨酸(V)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，Creighton，Proteins 1984)

本发明基于2个基本论点：1)每一CDR区域都有序列修饰和改进的空间，而不致明显改变重组免疫球蛋白的免疫特性；2)用于替换相应的非人(如：鼠源)亲本CDR的人CDR，经人免疫监视系统视为“自我”。因此，CDR-人源化抗体较之于非CDR替换抗体，免疫原性更低。

如果有足够大容量的人免疫球蛋白V区序列数据库，就可找到与亲本免疫球蛋白CDR序列高度同源的人CDR序列。因此，以人源CDR替换亲本抗体的对应序列，不会显著改变重组抗体的免疫特性。根据Kabat数据库的分类，亲本免疫球蛋白(如：鼠抗体)重链VH的CDRs可区分为H1(CDR1)、H2(CDR2)和H3(CDR3)；轻链VL的CDRs可区分为L1(CDR1)、L2(CDR2)和L3(CDR3)；通过与人免疫球蛋白数据库的序列对比，满足以下单项、多项或全项条件的人CDR序列，将被选定用于CDR人源化：

1.与对应亲本CDR的序列同源性≥50％；

2.在与亲本CDR对应的位点，拥有相同的芳香族残基(多个)；

3.在与亲本CDR对应的位点，拥有相同的荷电残基(多个)；和/或

4.在与亲本CDR对应的关键位点，拥有相同的残基(多个)，经晶体结构和/或者计算机数据库分析确认，这些关键残基对于维系免疫球蛋白的结合位点结构和/或接触至关重要。

如果未能获得满足上述条件的人或灵长类CDR，亦可采用具备以下特征的CDR序列：

1.与对应亲本CDR的序列同源性≥50％；

2.在与亲本CDR对应的位点，至少拥有一个相同的芳香族残基；

3.在与亲本CDR对应的位点，至少拥有一个相同的荷电残基；和/或

4.在与亲本CDR对应的关键位点，至少拥有一个相同的残基，经晶体结构和/或者计算机数据库分析确认，此关键残基对于维系免疫球蛋白的结合位点结构和/或接触至关重要。

或者，亦可采用具备以下特征的人或灵长类CDR序列：

1.与对应亲本CDR的序列同源性≥50％；

2.在与亲本CDR对应的位点，拥有相同和/或者保守性相似的芳香族残基(多个)：

3.在与亲本CDR对应的位点，拥有相同和/或者保守性相似的荷电残基(多个)；和/或

4.在与亲本CDR对应的关键位点，拥有相同和/或者保守性相似的残基(多个)，经晶体结构和/或者计算机数据库分析确认，此关键残基对于维系免疫球蛋白的结合位点结构和/或接触至关重要。

如果上述条件都不能满足，亦可采用具备以下特征的人或灵长类CDR序列：

1.与对应亲本CDR的序列同源性≥50％；

2.在与亲本CDR对应的位点，至少拥有一个保守性相似的芳香族残基；

3.在与亲本CDR对应的位点，至少拥有一个保守性相似的电荷残基；和/或

4.在与亲本CDR对应的关键位点，至少拥有一个保守性相似的残基，经晶体结构和/或者计算机数据库分析确认，此关键残基对于维系免疫球蛋白的结合位点结构和/或接触至关重要。

尽管鉴定序列同源性百分比或同一性百分比的方法是本领域熟知的，CDR序列内芳香族残基和荷电残基的存在一目了然；鉴定对于维系结合位点结构或抗体-抗原接触的关键的CDR残基需要利用现存数据库、晶体结构分析和/或计算机模拟研究予以确定。

当抗原-抗体复合物的三维结构基于X-射线结晶学研究进行测定时，直接参与配体接触的组合位点的研究可以容易鉴定。如果缺乏三维结构信息，亦可通过模型拟合、与已知序列变异性的拟合或者通过与现有数据库中的抗体-配体复合物的已知晶体衍射结构比对，如PDB数据库(Padlan et al.1995 FASEB J.9：133-139)，用以鉴别对维系结合位点结构和抗原接触表面的关键的CDR残基。利用现有数据库对已知抗体-配体复合物进行结构分析，可以确定CDR特定位点的关键残基出现机率，这些残基可能折叠或部分折叠、暴露的或直接参与配体结合。可以模拟抗原和其抗体间的弥合，并以此作为基础来选择用于替换亲本CDR序列的供体CDR序列。例如，亲本抗体与抗原弥合的CDR序列，优选在本发明重组抗体中仍予保留。抗原抗体的弥合程度，可采用Winter方法量度(参见：美国专利6548640，通过引用并入本文)，比如，弥合达到200％范德华平面力。所选择的人源CDR序列最好保留有相同或保守性相似的关键位点残基，这些残基被暴露的机会更高、或者直接参与配体结合。

考虑到人源CDR序列数据库容量在不断扩增，寻找适合条件的人源序列用以替换对应鼠源CDR的几率随之增加，并能保持重组抗体免疫特性。当CDR序列是人源时，它应该已通过人体免疫系统“筛查”为“自我”。因此，，当抗原提呈细胞在内吞和降解含有该CDR序列片段的重组抗体时，与MHC-II耦合的人CDR肽段将被APC视为“自我”而提呈。本发明的方法正是利用了机体免疫系统这一高效筛选机制来提供已经通过体内系统验证为“自我”的CDR序列片段，从而无需进行繁复的晶体衍射分析，也无需为剔除潜在T表位所进行的复杂程序如肽段线展分析。根据以上条件能够选择一系列适合的人源CDR序列，按照以下策略可以用于部分甚至全部替换原始亲本非人CDRs：

1、人源CDRs依序替换亲本CDRs

通常说来，重链CDRs对抗原结合的贡献胜于轻链CDRs，在每个免疫球蛋白链内，CDRs重要性依次为CDR3＞CDR2＞CDR1。所以，在本发明一个实施方式中，非人抗体的CDRs人源化的步骤是：L1→H1→L2→H2→L3→H3。例如，从数据库挑选最适上述条件的3-10个人源L1，用以通过使用分子生物学标准技术替换对应鼠源免疫球蛋白的L1，然后表达并测试这些携带不同的人L1序列的人源化抗体的特异性和亲和力。选定具有最高抗原结合的人L1序列。可以用同样步骤选定最佳结合的人H1、L2、H2、L3、H3下序列。

在可选的实施方式中，本发明亦可从最短CDR开始(CDR3除外，对于测定免疫反应性至关重要)。因此，在多数情况下，使用该策略的CDR替换顺序为H1→L2→L1→H2→L3→H3。对CDR替换顺序的调整也在本发明范围之内。

为了方便检测不同的替换CDRs组合，可利用噬菌体展示文库和/或其他类似技术如核糖体展示技术。亦即，将包含不同人源CDRs组合的抗体可变区序列与M13噬菌体基因III或基因IV结构融合(Clackson et al.Nature.1991；352：624-628；Feliciet al.J Mol Biol.1991；222：301-310；Markland et al.Gene.1991；109：13-19)。这些抗体可变区序列以Fab或单链Fv(scFv)形式表达于携带各自序列的噬菌体的尾丝。经过几轮次不同抗原结合条件(严格性)水平的淘选，选定和分离那些表达可比拟非CDR人源化亲本抗体(也作为携带Fab或scFv结构的对照噬菌体表达)的抗原特异性与亲和力的Fab或scFv结构的噬菌体。然后可以使用标准测序方法测定所选噬菌体的抗体可变区cDNA序列。这些序列将通过使用已建立的抗体工程化技术用于按所需同型抗体构建完整的重组抗体。

2、将选定的人源CDRs组合并入单一抗体

本发明并非一定要保证鉴定出全部6个人源CDRs替换序列，可通过浩瀚的数据库任意配比组合人源CDRs的，来构建低免疫原性的免疫球蛋白。即使只有一个人源CDR成功替换鼠源CDR，也将翻译为更好的低免疫原性的免疫球蛋白。通过依序替换CDR，对可以包括到单个免疫球蛋白结构中的一组人源CDRs组合进行鉴定，并用于构建重组抗体的最终序列，这利用分子工程中的标准技术进行。包含人源CDRs的可变区序列可应用于多种抗体格式，如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体(CDR-移植抗体)、镶饰抗体(例如参见：美国专利No 6797492，其通过引用并入本文)、去免疫原抗体、或者框架重塑抗体，可以是整个IgG分子，或者是F(ab’)2、Fab’、Fab、单价或多价sFv、双特异抗体、多特异抗体或者其它融合蛋白等。由于选择用对鼠抗体进行人源化的人源性CDRs序列包含已被人体免疫系统检视为“自我”的线状肽，所得到的抗体——即便只有一个人源CDR替换，也会胜过免疫原性更高、未经CDR人源化的亲本抗体。

在单一或全部替换CDRs可能导致鼠源免疫球蛋白丧失其特异性和/或亲和力的情况下，在轻链和/或重链CDR3区引入随机突变(包括氨基酸添加或缺失)使得原有特异性和/或亲和力部分甚至完全恢复。可选地，亲本抗体CDR替换后引入CDR3随机突变，也可作为提升抗体免疫反应性的手段。应用前述噬菌体展示文库或核糖体展示文库技术以及多轮次筛选，可方便地选择出包含CDR3突变的最佳CDR-人源化抗体。

3、CDR-人源化抗体的表达

将包含人源CDRs的可变区序列与它们相应的恒定区序列在遗传上连接起来。使用标准技术，现有的各种哺乳细胞或者原核细胞表达系统都可用于表达CDR-人源化抗体。本发明的免疫球蛋白包括抗体结合片段以及其它抗体衍生物，都可利用各种重组DNA技术制备，最后在转染的细胞中进行抗体表达，最好是永生化的真核细胞，如骨髓瘤细胞或者杂交瘤细胞。本发明能够终极表达期望的CDR-人源化抗体的核酸序列，可以由多种不同的聚核苷酸(如基因组cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等)以及不同元件(如V，J，D和C区)经各种不同技术制备而成。最常用的制备方法是将恰当的合成序列与基因组序列连接，也可应用cDNA序列(参见：欧洲专利公开No.0239400；Reichmann et al.Nature.1988；332：323-327，两者通过引用并入本文)。

如前所述，DNA序列与表达控制元件可操作性连接后就可在宿主细胞内进行表达。作为宿主染色体DNA的整合体、抑或游离体，这些表达载体在宿主生物内具有可复制特征。表达载体通常含有选择性标记，如四环素或新霉素标记，以便能够检测到转化有特定DNA序列的细胞(参见如：美国专利No.4704362，通过引用并入本文)。

大肠杆菌(E.coli)特别适用作为本发明DNA序列克隆的原核生物宿主。其它适用的宿主微生物还包括，但不限于：杆菌如枯草杆菌(Bacillus subtilus)，和其他肠菌科如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、以及各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核生物宿主中，也可以制备表达载体，其典型地将包含有宿主相容性表达控制序列(例如复制起点)。此外，还包含数量不等的各种已知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或源自λ噬菌体的启动子系统。启动子任选地与操纵子序列一道来控制表达，启动子还包含有核糖体结合位点序列等类似物，用于起始和完成转录和翻译。其它微生物如酵母也可用于表达，酵母菌是优选的宿主，合适的表达载体包含控制序列如启动子，包括3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶以及复制起始和终止序列所需类似元件等。

除微生物之外，本发明也可应用哺乳动物组织细胞培养来表达和制备本发明的重组多肽(参见：Winnacker，“From Genes to Clones”，VCH Pulishers，N.Y.，(1987)，通过引用并入本文)。事实上，真核生物细胞实际上是优选的，原因在于已经发展了一系列可分泌完整免疫球蛋白的宿主细胞，包括：CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞，优选地骨髓瘤细胞系等、以及转化的B细胞或杂交瘤细胞系。这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，比如复制起点、启动子、增强子(Queen et al.Immunol Rev.1986；89：49-68，通过引用并入本文)以及必需的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接结点、多聚腺苷化位点、和转录终止序列。优选的表达控制序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、巨细胞病毒、牛乳头状囊瘤病毒的启动子等。

根据宿主细胞的类型，可以采用本领域已知的不同的方法，将包含特定DNA片段(如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转化到宿主细胞。例如，原核生物细胞宿主通常采用氯化钙转染，其它细胞宿主可采用磷酸钙处理或电穿孔转染(通常参见：Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press.2001，通过引用并入本文)。

一经表达，本发明的完整抗体、抗体二聚体、单个轻链和重链、或者其它免疫球蛋白形式，可通过本领域的标准分离技术予以纯化，如硫酸铵沉淀、亲和层析、柱层析、凝胶电泳等(通常参见：R.Scopes.“Protein Purification：Principles and Practice”.Springer-Verlag，N.Y.(2002)，通过引用并入本文)。经充分纯化的免疫球蛋白的纯度优选至少达到90-95％同质性，药用抗体纯度优选达到98-99％或更高同质性。

在下文中，通过参考示例性实施方式本发明将予以详细地描述。具体而言，以抗CD22抗体RFB4和抗CD20抗体1F5为例，描述如何应用本发明进行CDR人源化改建。然而，由于不同重链和轻链CDRs的人源化组合方式多种多样，所列实例只是用于示例性说明本发明的各个发明，而非旨在限制本发明的范围。因此，与本文描述的实施方式相似或等同的实施方式可以用于实践或测试本发明。

实施例1

RFB4是一个公众已知的靶向人CD22抗原的抗体，其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列已公布(Mansfield et al.Recombinant RFB4 Immunotoxins ExhibitPotent Cytotoxic Activity for CD22-Bearing Cells and Tumors.Blood.1997；80：2020-2028)。以RFB4嵌合抗体(cRFB4)为实例(Yang et al.Construction andcharacterization of recombinant anti-B lymphoma chimeric antibody.Chinese J NewDrugs.2006；15(3)：186-192)，对其VK区的CDR1施行人源化改建，以此说明本发明CDR人源化概念。VK区氨基酸序列如图1所示，将cRFB4VK的CDR1与源自Kabat数据库的人L1进行序列比对(Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.US Department of Health and Human Services)，显示有2个人L1序列与cRFB4L1高度同源，它们分别来自WALKER’CL和VKI-ChrI’CL(图2)，与cRFB4L1同源性比例分别超过90％和80％。就人WALKER’CL的L1序列而言，除了第28号(参照Kabat数据库编号)的天冬氨酸(负电荷)转换为丝氨酸(中性)，至少保留有一个带电残基(第24号精氨酸)和一个芳香族残基(第32号酪氨酸)，从而满足人源CDR选择的基本条件。虽然VKI-Chrl’CL的L1序列同源性达80％，然而第32号位酪氨酸(芳香族残基)转为天冬酰胺(中性)，第28号位天冬氨酸转为丝氨酸，似乎并不理想。由于CDR1序列的这些延伸线段都是人源性，可以认为业已通过人体免疫系统检视，在MHC提呈时没有免疫原性。

1、引物设计：cRFB4人源化L1的制备

用寡核苷酸合成技术来合成PCR引物(Molecular Informatrix Laboratory)，以重叠PCR制备编码cRFB4VK的DNA序列，其中分别以WALKER’CL和VKI-Chrl’CL的L1替换其L1。携带WALKER’CL的L1序列的cRFB4VK命名为03CDR-S，携带VKI-Chrl’CL的L1序列的cRFB4VK命名为03CDR-GN。PCR寡核苷酸引物罗列于下：

引物1(5’-GAACTCTAGACACAGGACCTCACC-3’)

引物S1(5’-GTTCAGATAATTGCTAATGCTCTGACTTGC-3’)

引物S2(5’-AGCATTAGCAATTATCTGAACTGGTATC-3’)和

引物2(5’-TGCGGGATCCAACTGAGGAAG-3’)

引物GN1(5’-GTTCAGATTATTGCTAATACCCTGACTTGC-3’)

引物GN2(5’-GGTATTAGCAATAATCTGAACTGGTATC-3’)

构建03CDR-S：

cRFB4VK可变区序列携带有WALKER’CL人L1序列，分为两半合成，VK序列的N-端部分命名为N-03CDR-S，VK序列的C-端部分命名为C-03CDR-S。

引物1和引物S用于N-03CDR-S的PCR扩增，而引物S2和引物2用于C-03CDR-S的PCR扩增。简言之：PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbag，CA)，1.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega，MD，WI)，0.04U/μl PlatinumTag聚合酶(Invitrogen)，50ng cRFB4VK DNA模板，0.2μM引物1和引物S(用于N-03CDR-S)，或0.2uM引物S2和引物2(用于C-03CDR-S)。反应物置于94℃下预变性3分钟，采用25孔铝盘

personal PCR反应仪(Eppendorf，Westbury，NY)进行25次延伸循环(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后于72℃后延伸步骤10分钟。

应用重叠PCR，将N-03CDR-S和C-03CDR-S的PCR反应产物连接成为人源L1的VK序列03CDR-S。简言之，将N-03CDR-S和C-03CDR-S的PCR反应产物各0.5μl与0.2μM引物1和引物2混合，反应体积50μl，反应条件与上相似。混合物置于94℃下预变性3分钟，采用相同PCR反应仪(Eppendorf，Westbury，NY)进行25次延伸循环(94℃变性45秒，53℃退火45秒，72℃延伸45秒)，72℃后延伸10分钟，之后PCR产物存于4℃备用。

构建03CDR-GN：

携带有VKI-CHrl’CLVK人L1序列的VK可变区序列，分为两半合成，VK序列的N-端部分命名为N-03CDR-GN，VK序列的C-端部分命名为C-03CDR-GN。

引物1和引物GN1用于N-03CDR-GN的PCR扩增，引物GN2和引物2用于C-03CDR-GN的PCR扩增。简言之：PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen，Carlsbag，CA)，1.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega，MD，WI)，0.04U/μl Platinum Tag聚合酶(Invitrogen)，50ng cRFB4VK DNA模板，0.2μM引物1和引物GN1(用于N-03CDR-GN)，或0.2μM引物GN2和引物2(用于C-03CDR-GN)。反应物置于94℃下预变性3分钟，采用25孔铝盘

personal PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后于72℃后延伸步骤10分钟。

应用重叠PCR，将N-03CDR-GN和C-03CDR-GN的PCR反应产物连接成为人源L1的VK序列03CDR-GN。简言之，将N-03CDR-GN和C-03CDR-GN的PCR反应产物各0.5μl与0.2μM引物1和引物2混合，反应体积50μl，反应条件与上相似。混合物置于94℃下预变性3分钟，采用相同PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环(94℃变性45秒，53℃退火45秒，72℃延伸45秒)，72℃后延伸10分钟，之后PCR产物存于4℃备用。

2、cRFB4CDR-人源化抗体的表达

将重叠PCR制备的CDR-人源化VK产物进行纯化(QIAquick PCR PurificationKit，Qiagen)，使用分子生物学标准技术将纯化的PCR产物亚克隆至轻链表达载体pEκ对应的限制位点(Yang et al.Construction and characterization of recombinant anti-Blymphoma chimeric antibody.Chinese J New Drugs.2006；15(3)：186-192)。应用电穿孔转染将携带不同CDR-人源化cRFB4VK的轻链表达载体pEκ与携带cRFB4VH的重链表达载体pEγ，共转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(Yang et al.Chinese J New Drugs.2006；15(3)：186-192)。pEκ携带有潮霉素选择标记，用于根据潮霉素表达选择转染细胞。用ELISA法筛选完全抗体表达量最大的克隆，并检测纯化的抗体与CD22抗原的结合力。

3、cRFB4CDR-人源化抗体的结合亲和力比较

采用流式细胞术分析cRFB4CDR-人源化抗体的亲和力。取Raji细胞5×10⁵，分别与1μg纯化抗体cRFB4或者1μg cRFB4CDR-人源化抗体温育，终体积100μl PBS含1％FBS和0.01％(w/v)叠氮钠(PBS-FA)，4℃温育30分钟，然后用PBS洗涤细胞3次除去未结合抗体。羊抗人IgG1Fc-FITC荧光抗体，Fc片段特异性抗体(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)用PBS-FA稀释20倍，将100μl荧光抗体和Raji细胞混合、4℃温育30分钟，分析抗体与Raji细胞的结合水平。用PBS洗涤混合物3次，用FACSCAN荧光活化的细胞分选仪(Beckton Dickinson，Bedford，MA)测定荧光强度。

应用竞争结合分析进一步比较CDR-人源化前后的抗体亲和力，将定量的(由贮存液稀释10倍)鼠源RFB4-FITC荧光抗体(Ancell Corpration，Bayport，MN)与各种浓度的cRFB4或CDR-人源化cRFB4混合，将混合物加入到Raji细胞，终体积100μlPBS-FA，4℃温育30分钟。PBS洗涤3次后，通过流式细胞仪FACSCAN(BecktonDickinson，Bedford，MA)测定Raji细胞与FITC-RFB4结合的荧光强度。

实施例2

1F5是另一个公开的靶向人CD20抗原的抗体，其重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列业已公布(Shan et al.Charaterization of scFv-Ig constructs generated fromthe anti-CD20 mAb 1F5using linker peptides of varying lengths.J Immunol.1999；162：6589-95)。有两种途径获得1F5可变区序列：以公开的序列数据进行寡核苷基因合成，或者直接从1F5杂交瘤获得，如下所述。

1、简言之，1F5杂交瘤源自美国菌种典藏中心(ATCC#HB-9645；lot#221900)。应用Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen)从3×10⁷个杂交瘤细胞中抽提分离出RNA，然后用cDNA Cycle Kit(Invitrogen)制备cDNA，所用引物CH1B(5’ACAGTC ACT GAG CTG G3’)和Ck3BH1(5’GCC GGA TCC TCA CTG GAT GGT GGGAAG ATG GAT ACA 3’)分别特异于小鼠IgG CH1恒定区和κ恒定区。cDNA第一链经由RACE和PCR扩增。PCR后将DNA片段克隆至TA克隆载体(Invitrogen)，双脱氧链末端终止法测序。1F5重链和轻链可变区基因的DNA序列以及氨基酸序列分别如图3和图4所示。

2、应用框架重组(framework-reengineering)技术对1F5进行功能人源化根据称为框架重组的技术对1F5进行功能人源化，其中，各种人源性免疫球蛋白的框架片段(FR1，FR2，FR3，FR4)可任意配比组合构成可容纳鼠源CDRs的最佳支撑平台。1F5框架重组抗体的设计及构建参见Lei等(美国临时专利申请第60/878,030号，和国际专利申请第PCT/IB07/004379号，其内容通过引用并入本文)。1F5框架重组抗体的VH  序列是由LS2’CL(FR1)-CDR1-NEWM(FR2)-CDR2-783C’CL(FR3)-CDR3-4G12’CL(FR4)构成(图5A)；VK序列是由BJ19(FR1)-CDR1-MOT(FR2)-CDR2-WES(FR3)-CDR3-NIG-58(FR4)构成(图5B)；按照设计序列，应用寡核苷基因合成以及PCR将1F5框架重组抗体的VH和VK组合起来。结果显示，1F5框架重组抗体的免疫反应性与亲本鼠源抗体相当(图6)。

3、尽管1F5抗体使用功能人源化方法成功地重组，框架重组抗体的CDRs仍然为鼠源性，仍可构成潜在免疫原。使用本发明方法可进一步降低鼠源CDRs的免疫原性，做法如下：

a.1F5重链CDR1具有最短序列(SYNMH)，并作为首先实施人源化改建的CDR；

b.1F5轻链CDR2序列长度其次(ATSNLAS)，并作为第二个人源化改建的CDR。

以H1和L2为实例说明CDR人源化，同理对其它轻重链的CDRs进行人源化改建。

4、1F5的H1人源化

将鼠源1F5抗体的H1的DNA编码序列输入NCBI IgBlast数据库进行检索比对，发现具有高度核苷酸同源性的人Ig序列共9个。利用Expert Protein Analysis System(ExPASy)之Proteiomics and sequence analysis tools(cn.expasy.org/tools)，将这些高度同源性的核苷酸序列翻译为氨基酸序列。进而利用ClustalW软件(Pole BioInformatique Lyonnais(pbil.univ-lyonl.fr/))，通过簇区分析对全部翻译序列进行比对。同源性人H1和鼠源1F5抗体H1的比对结果显示如下：

AF376954        NYNMH

AC110080        KYNMH

AY429737        GYNMH

AJ407992        GYNMH

AF087418        GSNMH

Test1x0         SYNMH

AF376951        SYNMH

DQ926652        SYYMH

AC148025        SYNLH

AP001241        SFNMQ

                ：：

Prim.cons.      SYNMH

同源性人H1与1F5的H1多比对

由比对的序列显而易见，编码AF376951(Homo Sapiens，Clone MEI免疫球蛋白重链可变区)的人源H1与1F5的H1序列完全相同。基于本发明原理，1F5抗体的重链H1默认为人源H1，无需对H1序列作进一步的人源化修饰，或者可选地，1F5的H1无需作进一步的修饰而被人源化。

尽管如此，为了进一步说明本发明原理和筛选条件，应用经IgBlast检索得来的另外2个人H1序列以及原H1序列，对框架重组1F5抗体的H1进行人源化改建。

31    32    33    34    35

S     Y     N     M     H(AF376951)

S     Y     Y     M     H(DQ926652)

S     Y     N     L     H(AC148025)

S     Y     N     M     H(1F5)

1F5的H1序列带有含芳香基的酪氨酸(Y)和碱性组氨酸(H)。在选择对1F5H1人源化合适的人源H1时，所有的人源H1序列在对应的位置都要有Y和H。由于AF376951的H1序列与1F5的一致，所以毫无疑问的选择它进行H1的人源化。重链CDR的序列分析表明，31号残基(Kabat数据库编号：H1的第一个残基)直接参与了31个复合物中13个复合物的配体结合；发现32号残基与配体有8处相互作用，其中只有3处涉及主链原子；34号残基没有直接参与31个复合物的任何一个的配体连接。由此在1F5的H1中，31号残基(S)可能对维持免疫球蛋白结合位点的结构和相互联系至关重要，而34号残基可能对配体的结合并不重要。因此，选择人源的H1进行CDR人源化时，应着力于维持31号位残基的稳定性，而可对34号位残基进行修饰。

鉴于上述思路，DQ926652的H1序列中天冬酰胺(N)——酸性氨基酸的酰胺衍生物——由带有芳香基的酪氨酸(Y)替换，能导致所得抗原结合位点接触和构象的明显改变。然而，由于二者之间80％的同源性且保留了32号位的酪氨酸、35号位的组氨酸及重要的31号位丝氨酸(经根据X-线晶体信息的计算机数据库分析确认)，这种修饰被认为是可行的。数据库分析表明保留AC148025的H1序列中31号位的丝氨酸很重要。尽管使用大小相似的脂肪族亮氨酸(L)替换了含硫的蛋氨酸(M)，但多数情况下34号位对配体结合的影响并不大。上述转化是细微的，并且基于80％序列同源性的标准以及芳香基和荷电结构的保留，H1序列被选择作为1F5的H1人源化的候选序列。

5、1F5的L2人源化

将鼠源1F5抗体的L2的DNA编码序列输入NCBI IgBlast数据库进行检索比对，发现具有高度核苷酸同源性的人Ig序列共5个。利用Expert Protein Analysis System(ExPASy)之Proteiomics and sequence analysis tools(cn.expasyorg/tools)，将这些高度同源的核苷酸序列翻译为氨基酸序列。进而利用ClustalW软件(PoleBioInformatique Lyonnais(pbil.univ-lyonl.fr/))，通过簇区分析对全部翻译序列进行序列比对。同源性人H1和鼠源1F5抗体H1的对比结果显示如下：

AC034151    TTSSLAR

AC128677    TTSSLAR

AC002060    SKSILAS

AC016745    TTSNMAD

Test2x0A    ATSNLAS

AC103563    ATPNLDC

            ：..：

Prim.cons.  TTSNLA2

同源性人L2与对应的1F5的多比对

在此序列比对的基础上，使用前述的选择标准，只有2个序列被选择用于进行L2的人源化，它们是：SKSILAS(人染色体22q11.2，BAC克隆免疫球蛋白轻链142e2，完整序列；登录号：AC002060)和TTSNMAD(人，BAC克隆RP11-480C16，完整序列；登录号：AC016745)。

检索Kabat库(Kabat et al.1991.具有免疫学重要性的蛋白数据库.第5版.美国卫生和人类服务部)后发现另一人轻链序列也可用来进行CDR人源化。它是：人κ轻链亚群I来自GAL(I)的AASNLQS。

50    51    52    53     54     55     56

T     T     S     N      M      A      D(AC016745)

S     K     S     I      L      A      S(AC002060)

A     A     S     N      L      Q      S(GAL(I))

A     T     S     N      L      A      S(1F5)

1F5的L2序列并不含有芳香基或带电基团。AC016745与1F5的VK CDR2有大约57％的同源性。其L2序列中，50号(Kabat编号)位的丙氨酸转换为含羟基的苏氨酸、54号位的亮氨酸转换为含硫的蛋氨酸都稍显保守，T含有羟基而M含有硫。最大的变化是56号位丝氨酸转换为天冬氨酸，因为在生理条件下天冬氨酸带负电荷。因此，AC016745的L2序列应该是最适合进行人源化的序列。AC002060的L2序列与1F5有71％的同源性。51号位苏氨酸(含羟基)转化为赖基酸(碱性)、53号位天冬酰胺(酰胺衍生物)转换为异亮氨酸(脂肪族类)都是明显的变化，都可能影响到所得免疫球蛋白的免疫反应性。GAL(I)的L2序列与1F5也有约71％的同源性。51号位苏氨酸(含羟基)到丙氨酸(脂肪族类)的转换尚属轻微，然55号位丙氨酸(脂肪族类)到谷氨酰胺(酰胺衍生物)的转换就比较重大。由于这些变化发生在L2序列不同的位点，对CDR人源化后免疫球蛋白最终反应性的影响尚未经实验证实。不过既然这些片段都是人源的，那么它们应该能够通过人免疫系统的检视，不被MHC提呈系统视为异己。

6、用于框架重塑1F5的各种CDR人源化VH和VK序列的构建：

VH：为了对框架重组后1F5的H1进行人源化，选择出3个同源性程度最高的人H1序列，分别是AF376951(人，克隆MEI免疫球蛋白重链可变区)(SYNMH)、DQ926652(SYYMH)和AC148025(SYNLH)。

1F5的原始H1序列同AF376951中的完全一样，因此默认为人源化的HI，不需要做进一步的修饰。

为了检测修饰后H1序列的基本特点，使用符合上述选择标准的2个最同源的人源H1构建H1人源化的免疫球蛋白。

V1来自DQ926652的CDR人源化H1序列

V2来自AC148025的CDR人源化H1序列

它们的构建使用如下引物完成：

5’NH-LG：

GTG CAA CTG CAG GCT TCC GGG GCT GAG GTA AAT AAG CCT GGG GCCTCA GTG AAG

3’NH-LG-v1：

TAC CCA GTG CAT ATA GTA ACT GGT AAA TGT

3’NH-LG-v2：

TAC CCA GTG CAA ATT GTA ACT GGT AAA TGT

5’CH-LG-v1：

AGT TAC TAT ATG CAC TGG GTA CGG CAG CCT

5’CH-LG-v1：

AGT TAC AAT TTG CAC TGG GTA CGG CAG CCT

3’CH-LG

GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GCT AAA GTA GTCTAC GTA

将V1分为两半合成，再经重叠PCR的方法和使用引物5’NH-LG，3’NH-LG-v1，5’CH-LG-v1和3’CH-LG连接。简言之：PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen)，1.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega)，0.04U/μl PlatinumTag聚合酶(Invitrogen)，50ng框架重组1F5的VH DNA模板，0.2μM引物5’NH-LG和3’NH-LG-v1(N末端)，或0.2μM引物5’CH-LG-v1和3’CH-LG(C末端)。反应物置于94℃下预变性3分钟，采用携带25孔铝盘的

personal PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后于72℃后延伸步骤10分钟。

应用重叠PCR，将V1的N-末端和C-末端的两部分反应产物连接成为人源化VH序列。简言之，将N-末端和C-末端的两部分PCR反应产物各0.5μl与0.2μM 5’NH-LG和3’CH-LG混合。反应体积50μl，反应条件与上相似。混合物置于94℃下预变性3分钟，采用相同PCR反应仪(Eppendorf，Westbury，NY)进行25次延伸循环(94℃变性45秒，53℃退火45秒，72℃延伸45秒)，72℃延长的温育10分钟后，PCR产物存于4℃备用。

V2的构建基本上与V1的构建步骤一样，只是所有涉及核苷酸引物5’CH-LG-v1和3’NH-LG-v1的步骤都分别由5’CH-LG-v2和3’NH-LG-v2替换。

VK：为了对框架重组后1F5的L2进行人源化，选择出3个同源性程度最高的人L2序列，分别是AC002060(SKSILAS)、AC016745(TTSNMAD)和GAL(I)(AASNLQS)。

V3来自AC002060的CDR人源化L2序列

V4来自AC016745的CDR人源化L2序列

V5来自GAL(I)的CDR人源化L2序列

它们的构建使用如下引物完成：

5’NK-LG：

GAT ATT CAG CTG ACA CAG TCT CCA TCA AGT CTT TCT GCA TCT GTG

3’NK-LG-v3：

GGA AGC CAG GAT GGA CTT GGA ATA AAT TAC

3’NK-LG-v4：

ATC AGC CAT GTT GGA TGT GGT ATA AAT TAC

3’NK-LG-v5：

GGA CTG CAG GTT GGA GGC GGC ATA AAT TAC

5’CK-LG-v3：

TAT TCC AAG TCC ATC CTG GCT TCC GGA GTC CCT

5’CK-LG-v4：

ACC ACATCC AAC ATG GCT GAT GGA GTC CCT

5’CK-LG-v5：

GCC GCC TCC AAC CTG CAH TCC GGA GTC CCT

3’CK-LG：

CCG TTT GAT CAC CAG CTT GGT CCC AGC ACC GAA CGT GAG CGG

将V3分为两半合成，再经重叠PCR的方法和使用引物5’NK-LG，3’NK-LG-v3，5’CK-LG-v3和3’CK-LG连接。简言之：PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen)，1.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega)，0.04U/μl PlatinumTag聚合酶(Invitrogen)，50ng框架重组1F5的VK DNA模板，0.2μM引物5’NK-LG和3’NK-LG-v3(N末端)，或0.2μM引物5’CK-LG-v3和3’CK-LG(C末端)。反应物置于94℃下预变性3分钟，采用携带25孔铝盘的

personal PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后于72℃延长的温育10分钟。

应用重叠PCR，将V3的N-末端和C-末端的两部分反应产物连接成为人源VK序列。简言之，将N-末端和C-末端的两部分PCR反应产物各0.5μl与0.2Mm 5’NK-LG和3’CK-LG混合，反应体积50μl，反应条件与上相似。将混合物置于94℃下预变性3分钟，采用相同PCR反应仪(Eppendorf，Westbury，NY)进行25次延伸循环(94℃变性45秒，53℃退火45秒，72℃延伸45秒)，72℃温育10分钟后，PCR产物存于4℃备用。

V4和V5的构建基本上与V3的构建步骤一样，只是所有涉及核苷酸引物5’CK-LG-v3和3’NK-LG-v3的步骤都分别由5’CK-LG-v4和3’NK-LG-v4或5’CK-LG-v5和3’NK-LG-v5替换。

7、各种CDR人源化抗CD20抗体的scFv-噬菌体抗体的表达

含不同版本人源化CDR的免疫球蛋白VH、VL序列，通过重叠PCR的方法随机连接，形成抗体的单链可变片段(scFv)。

VH、VL序列经由序列为(GGGGS)₃的肽连接体连接起来(其序列和大小可变)。见图7。

不同版本CDR人源化的VH和VK序列首先使用PCR的方法分别采用5’SfiNH-LG、3’CH-连接体-LG、5’NK-连接体-LG和3’Not1CK-LG进行扩增。它们的序列如下：

5’SfiNH-LG(Sfi1限制位点，加下划线)

GAT CGG CCC AGC CGG GCC GTG CAA CTG CAG GCT TCC

3’CH-连接体-LG(部分连接酶序列为斜体)

GAC GGT GAC CGT GGT GCC GGA GAC GGT GAC CGT GGT

5’NK-连接体-LG(部分连接酶序列为斜体)

GAG CTC ACT CAG TCT CCA GAT ATT CAG CTG ACA CAG

3’Not1CK-LG(Not1限制位点，加下划线)

CGG CGC ACC TGC GGC CGC CCG TTT GAT CAC CAG CTT

不同版本CDR人源化的VH序列采用PCR进行扩增，采用引物对5’SfiNH-LG和3’CH-linker-LG引入Sfi1克隆位点和部分连接体序列，不同版本CDR人源化的VK序列也采用PCR进行扩增，采用引物对5’NK-连接体-LG和3’Not 1-CK-LG引入Not 1克隆位点和部分体序列。

PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen)，1.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega)，0.04U/μl Platinum Tag聚合酶(Invitrogen)，50ng不同版本CDR人源化VH或VK的PCR产物，0.2μM相应的引物。反应物置于94℃下预变性3分钟，采用携带25孔铝盘的personal PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)，然后于72℃后延伸10分钟，5μl每个含部分连接体序列的VH和VL的PCR产物与独特的克隆位点一起用作重叠PCR的模版。

重叠PCR反应体积50μl，含1×PCR缓冲液(Invitrogen)，2.5mM MgCl₂(Invitrogen)，0.2mM dNTP(Promega)，0.04U/μl Pl atinum Tag聚合酶(Invitrogen)，5μl不同版本CDR人源化VH或VK的PCR产物，0.2μM侧翼引物(5’SfiNH-LG和3’Not 1-CK-LG)，0.02μM的scFv连接体核苷酸(GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCCTCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCGGAC ATC GAG  CTC ACT CAG TCT CCA GAG CTC ACT CAG TCT CCA)，它编码(GGGGS)₃这一连接体序列。上述混合物置于94℃下预变性3分钟，采用携带25孔铝盘的

personal PCR反应仪(Eppendorf)进行25次延伸循环，每一循环由94℃变性60秒，50℃退火60秒，72℃延伸60秒组成，然后于72℃后延伸10分钟，之后PCR产物(scFv)存于4℃备用。

经过重叠PCR之后，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiangen)纯化单链可变区片段(scFv)。纯化的PCR产物经由Sfi I酶解，50μl反应溶液含1×NE缓冲液2(NewEngland Biolabs)，补充0.01％BSA(1×NEB-BSA，New England Biolabs)，5U的SfiI限制内切酶和1ug纯化的scFv。反应混合物37℃温育过夜，酶解产物经QIAquickNucleotide Removal Kit(Qiagen)纯化回收，然后经由NotI酶解，50μl的反应溶液含1×NE缓冲液3(New England Biolab)，补充0.01％BSA(1×NEB-BSA，New EnglandBiolabs)，5U的Not I限制内切酶，及经Sfi I-7水解后纯化的scFv的DNA。反应混合物37℃温育过夜。Sfi I/Not I水解后的scFv DNA经由凝胶纯化(QIAquick GelExtraction Kit；Qiagen)，以备随后亚克隆。

噬菌粒载体pCANTAB 5E(Amersham)经Sfi I和Not I双解线化，将酶解scFv片段亚克隆至载体相应位点。然后在1×T4连接缓冲液(Invitrogen)中进行连接，载体与插入分子摩尔比例为1∶3，DNA总浓度＜100ng。

由连接的DNA构建成scFv噬菌体库(scFv-pCANTAB 5E)。理论上，不同形式的CDR-人源化VH和VK可以任意组合来构建scFv文库。为了方便说明，个别构建含有各式VH和VL组合的scFv文库。这些噬菌体包含的组合有：VH(原始):VL(原始)；VH:VL(式3)；VH:VL(式4)；VH:VL(式5)；VH(式1):VL(原始)；VH(式1):VL(式3)；VH(式1):VL(式4)；VH(式1):VL(式5)；VH(式2):VL(式3)；VH(式2):VL(式4)；VH(式2):VL(式5)。用电穿孔法将scFv-噬菌体DNA导入大肠杆菌TG1(Stratagene)。简言之，将2μl scFv-pCANTAB 5E与20μl感受态细胞TG1(Stratagene)混合，置于无菌电穿孔管(0.1-cm-gap，BioRad)。样品经1次脉冲电击(2000V，25μF，200Ω)后，加入1ml SOC培养基以悬浮细胞，然后将细胞移至无菌14-ml Falcon聚丙烯圆底离心管(BD Biosciences)，37℃摇床(250rpm)温育1小时。

合并全部转化培养，系列稀释(1×，10^-1×，10^-2×和10^-3×)后涂布于SOBAG平板(SOBG培养基含1.5％Bacto-arga(BD Bioscience)和100μg/ml氨苄青霉素(Sigma，St.Louis，MO)，30℃温育过夜，测算转化效率(文库容量)。

剩余培养4℃离心(4000rpm)5分钟，用含100μg/ml氨苄青霉素和5mM MgCl₂的10ml SOBG培养液悬浮沉淀细胞，冰育15分钟，偶尔轻摇。分光光度计600nm吸光值测算细胞数量(10⁸细胞/ml的OD₆₀₀值为0.4)。

悬浮细胞中加入M13KO7辅助噬菌体(Amersham)，感染复数比3∶1，M13KO7辅助噬菌体感染：37℃静置温育30分钟，然后摇床(200rpm)温育30分钟。感染培养液4℃离心(4000rpm)10分钟，沉淀细胞以10ml 2X-YT培养液悬浮，培养液含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素。悬浮细胞经系列稀释(1×，10^-1×，10^-2×和10^-3×)后涂布于SOBAG-K平板(SOBG培养基，含0.5％Bacto-arga，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素)，37℃温育过夜(＞20小时)，测算噬菌体援救率。剩余悬浮细胞用2X-YT培养液(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)补足至50ml，37℃摇床(250rpm)温育过夜，用于重组scFv-噬菌体制备。

8、含不同VH和VL组合的scFv噬菌体抗体，对Raji细胞表面抗原的亲和力比较培养上清中的scFv-噬菌体用计算公式定量：

为避免在OD₂₆₉和OD₃₂₀吸光度干扰，在吸光度测定前先用PEG/NaCl沉淀来纯化噬菌体。

用Raji细胞膜蛋白作为抗原进行ELISA结合分析。如下制备Raji细胞膜蛋白抗原：通过离心沉淀1×10⁷Raji细胞，将细胞沉淀物重悬浮于0.5ml PBS，冰浴超声粉碎细胞悬浮液，离心去除细胞碎片。使用BCA分析测定含Raji细胞膜抗原的上清液的蛋白浓度。ELISA板包被Raji细胞膜抗原，加入100ul含等量不同scFv-噬菌体构建物的上清液，ELISA板37℃温育1小时。用PBS洗ELISA板3次，加入M13噬菌体特异性HRP偶联鼠抗体(Amersham)，测定ELISA板孔中的抗原特异性噬菌体结合量(见图8)。

9、CD20抗原特异性scFv噬菌体展示文库的淘选

CDR-人源化抗CD20scFv-噬菌体抗体文库构建完毕，收集scFv-噬菌体转化的所有培养物并扩增。导入淘选步骤以鉴定CD20特异性scFv-噬菌体。简言之，将scFv-噬菌体培养上清移至预冷的50ml离心管内，每25ml上清中加入5ml PEG/NaCl溶液(20％聚乙二醇，M.W.8000(Sigma)，2.5MNaCl(Sigma))。冰育1.5小时后，4℃离心(10,000g)30分钟，收集重组噬菌体沉淀，用2ml 2X-YT培养液(含1％BSA)重新悬浮噬菌体沉淀。为确定scFv-噬菌体效价，取2μl重悬浮噬菌体用200μl 2X-YT培养液连续稀释(10^-2×，10^-4×，10^-6×，10^-8×和10^-10×)。从每一滴度稀释液中取出2μl，加入到200μl对数生长期大肠杆菌TG1，37℃温育30分钟(不摇振)，以备scFv-噬菌体感染。

对数期TG1的制备如下：将100μl TG1接种入10ml含5mM MgCl₂的2X-YT培养液，培养过夜。接种物经37℃摇床(250rpm)温育，直至OD₆₀₀吸光值达到0.4-0.5。细菌培养液用冰预冷20分钟备用。重组噬菌体感染后，将100μl感染的TG1细胞涂布于SOBAG板(SOBG培养基含1.5％Bacto-arga和100μg/ml氨苄青霉素)，30℃温育过夜。

向剩余的重组噬菌体浓集物中加入2倍容积的scFv-噬菌体封闭缓冲液(含1×PBS，0.2％TrionX-100(Sigma)，0.01％NaN₃(Riedel-de Haen)，0.1％BSA(Sigma)，10％脱脂奶(Nestle))，室温下预封闭30分钟。24孔培养板(Corning)预先包被CD20抗原(Abnova GmbH，Heidelberg，Germany.H00000931-P01/MS4A 1RecombinantProtein P01)，然后每孔加入0.5ml封闭液稀释的重组噬菌体。

提前1天准备筛选用的预封闭培养板，将CD20抗原溶于碳酸盐包被缓冲液，pH9.6，(15mM Na₂CO₃(Sigma)，35mM NaHCO₃(Sigma))，抗原终浓度10μg/ml，每孔加入1ml含抗原的碳酸盐包被缓冲液。4℃轻微摇振温育过夜，每孔用3ml pH8.0的硼酸缓冲液(26mM的Na₂B₄O₇(BDH)，100mM的H₃BO₃(Sigma)，0.1％BSA(Sigma)，100mM的NaCl(Sigma)，3mM的KCl(Sigma)，0.5％吐温-20(USB))洗涤3次。再用2.5ml相同缓冲液37℃下封闭2小时，淘选前用3ml硼酸缓冲液洗涤3次。

淘选是在室温下轻微摇振温育2小时进行的。去除未结合的scFv-噬菌体之后，以1×PBS用力震荡洗涤培养板孔5次，每次30秒。再用2.5ml含0.1％Tween-20(USB)的PBS洗涤孔10次。洗涤完毕，用100μl 0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.2)经10分钟温育将板孔上结合的scFv-噬菌体洗脱下来，并立即用10μl的1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中和。

合并洗脱的scFv-噬菌体，用于再感染50ml含2％葡萄糖和5mM MgCl₂的对数期TG1。再感染条件：37℃下静止温育30分钟，然后摇振(200rpm)温育30分钟。将100μl再感染TG1培养物作系列稀释(1×，10^-1×，10^-2×和10^-3×)，涂布SOBAG板，30℃温育过夜，测算文库效价。

向剩余的再感染培养液中加入终浓度5×10⁹pfu/ml的M13KO7辅助噬菌体和100μg/ml氨苄青霉素进行噬菌体援救。超感染在37℃静止温育30分钟，然后摇振(200rpm)温育30分钟。援救培养物冰育10分钟，4℃离心(4000rpm)10分钟，将援救细胞沉淀物重新悬浮于50ml含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2X-YT培养液中。将100μl援救培养物作系列稀释(1×，10^-1×，10^-2×和10^-3×)，涂布SOBAG-K板，37℃温育过夜(＞20小时)，测算第二轮筛选文库的效价。剩余的援救培养液在37℃下摇床(250rpm)温育过夜，产生的重组噬菌体以备下一轮淘选。淘选过程重复2次，每次淘选都使用10倍系列稀释的包被抗原。

二轮淘选之后，用50ml含2％葡萄糖和5mM MgCl₂的对数期TG1培养物再感染第2轮洗脱物。混合物于37℃静止温育和摇振(200rpm)温育，将100μl再感染培养物作系列稀释(1×，10^-1×，10^-2×和10^-3×)，涂布SOBAG板，测算效价。剩余的再感染培养液经4℃离心(4000rpm)10分钟，收集沉淀细胞并重悬浮于8ml含20％甘油(Sigma)的2X-YT培养液，分瓶于-70℃储存。

应用噬菌体-ELISA法对每一单克隆的重组噬菌体的抗原特异性进行分析，以第2轮筛选的单克隆TG1接种1ml含2％葡萄糖，5mM的MgCl₂和100μg/ml氨苄青霉素的2X-YT培养液，37℃摇振(250rpm)温育4-5小时，按100μl培养液制备甘油菌，-70℃储存。

向剩余培养液中加入2×10⁸pfu/ml的M13KO7辅助噬菌体，援救培养置于37℃静止温育和200rpm摇振温育来辅助感染。培养液经4℃离心(4000rpm)10分钟后，沉淀细胞悬浮于2.5ml含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2X-YT培养液，培养液置于37℃摇振(250rpm)温育过夜以制备重组噬菌体，4℃离心(4000rpm)15分钟。收集含上清液的scFv-噬菌体，4℃储存，用于噬菌体-ELISA检测。

用96孔ELISA板进行噬菌体-ELISA检测，板孔用50μl碳酸盐抗原溶液包被，该碳酸盐缓冲液pH9.6，含50μg CD20抗原。4℃温育过夜，所有孔用200μl pH8.0的硼酸盐缓冲液洗涤3次，再用200μl同样的缓冲液于37℃下封闭1小时。封闭之后，用200μl的硼酸盐缓冲液洗涤3次，孔井中加入100μl含scFv-噬菌体的上清，37℃温育1小时。

温育后用200μl pH8.0的硼酸盐洗涤缓冲液洗涤板孔5次，加入100μl经硼酸缓冲液稀释5000倍的酶标抗M13鼠抗体(HRP/抗-M13小鼠Ab，Amersham)，37℃温育1小时，之后用200μl硼酸盐缓冲液洗涤3次，然后加入100μl邻苯二胺(OPD，Sigma)底物溶液显色。

底物溶液如下配制：将10mg OPD溶于10ml pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液(24mM柠檬酸(Sigma)，51mM Na₂HPO₄(Sigma))，加入8μl 30％H₂O₂(BDH)。室温显色1小时后，加入100μl 40％H₂SO₄(Sigma)终止显色。呈色强度用Sunrise酶标仪(Tecan)于吸光度450nm测定。将ELISA读数大于1.5倍均值的样本视为潜力噬菌体而筛选出来，用对照抗原(BSA)和核苷酸序列测定进一步对候选噬菌体进行噬菌体-ELISA测试分析。

经过几轮淘选，重组抗体中其人源CDR影响抗原反应性的被筛选掉，而保留免疫反应性的重组抗体会被分离出来并用于进一步的分析。

10、阳性噬菌体文库的先导物转化为功能性抗体

对CD20抗原阳性的scFv-噬菌体的scFv进行DNA测序。用序列特异引物在恰当的克隆位点掺入，将选定的scFv-噬菌体VH和VL序列进行PCR扩增。然后将VH和VL序列亚克隆至它们对应的阶段载体，具体描述见Orlandi et al(1989.Cloningimmunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction.PNAS3833-3837)。重链和轻链可变区分别亚克隆至最终表达载体，如Orlandi等所述(1989)，最终表达载体与pSV-gpt和pSV-hyg相似，含人IgG和人κ序列。

为表达功能人化抗体，用电穿孔法使用Co et al.所述条件(参见：Co et al.1992.Chimeric and humanized antibodies with specificity for the cd33 antigen.J Immunol.148：1149-1154)将重链和轻链表达载体转染至Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，选择潮霉素表达细胞。通过ELISA检测选择具有最大完整抗体表达量的克隆。测定纯化的抗体对CD20抗原的结合力。简言之，向三份CD20抗原包被后的ELISA板孔内加入不同浓度的纯化抗体(从0.01-10μg/ml)，板在室温温育1小时。用缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)将未结合抗体洗脱出来。将辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG，Fc片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)加入板孔(体积100μl，抗体母液稀释×10⁴)，随后温育1小时，再洗涤板3遍。接着，板孔内加入反应溶液(体积100μl，含167μg邻苯二胺(OPD；Sigma，St.Louis，MO)和0.025％辣根过氧化物酶)，避光条件下显色30分钟。向每孔加入50μl的4N盐酸溶液中止显色，之后自动酶标仪测定OD490nm吸光值。

11、不同CDR人源化的抗CD20抗体的亲和力比较

在竞争性流式细胞分析中，经常使用Raji Burkit淋巴瘤细胞将带有不同人源CDRs且经证明保留免疫活性的抗体与亲本抗体(框架重组的1F5)进行结合力的比较。简言之，终体积100μl的PBS反应溶液中，混合有1μg鼠1F5、不同浓度的CDR人源化抗体和亲本框架重组抗体，补充1％的FCS和0.01％叠氮钠(PBS-FA)。混合物于4℃温育30分钟，用PBS洗涤3次以洗脱掉未结合的抗体。接着加入20倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，Fc片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，反应终体积100μl，4℃温育30分钟，最终目的是在不同浓度竞争物(均含人Fc段)存在的前提下，对鼠1F5与Raji细胞的结合力进行评价。混合物使用PBS缓冲液洗涤3次，以FACSCAN荧光激活的细胞分选仪(Becton Bickinson，Bedford，MA)测量荧光强度。

产业应用

本发明所构建的功能人源化免疫球蛋白，使抗体免疫原性和构建方法得以显著改善。发明所涉及的抗体产品和构建步骤，对于开发疾病诊断用抗体和治疗性抗体，拥有广阔的应用价值。

本发明所提及的所有专利和公开出版物，通过引用以其整体并入本文。对于这些参考文献的引述，不应被解读为承认本发明晚于这些引述的参考文献的公开内容。

尽管本发明参考具体的实施方式进行了详细的描述，应该明白前文所述本质上是示例性的和解释性的描述，用以说明本发明和其优选的具体实施方式。本领域技术人员通过常规实验，就能轻易找到本发明的各种变通和调整用途，但并不脱离本发明的精髓和范围。由权利要求书可见，本发明的其它优势和特征是明显的，这些权利要求的范围将由合理的等同物来判定，本领域技术人员对此易于理解。因此，本发明并不受前文描述的限制，而是由所附的权利要求和其等同值来限定。

Claims (16)

1.重组免疫球蛋白，其亲本免疫球蛋白对靶抗原具有亲和力，其中所述亲本免疫球蛋白的至少一个互补决定区(CDR)的氨基酸序列经由灵长类免疫球蛋白对应CDR的氨基酸序列替换，其中所述重组免疫球蛋白与所述靶抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白与所述靶抗原的结合亲和力的约50倍以内。

2.权利要求1所述的重组免疫球蛋白，其中所述灵长类CDR具有与所述被替换亲本CDR的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的带电荷氨基酸残基；或者，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR相同的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

3.权利要求2所述的重组免疫球蛋白，其中所述灵长类CDR具有与所述被替换亲本CDR的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的带电荷氨基酸残基；以及，在对应的位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR相同的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

4.权利要求1所述的重组免疫球蛋白，其中在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的带电荷氨基酸残基；或者，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR保守地相似的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

5.权利要求4中的重组免疫球蛋白，其中在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的带电荷氨基酸残基；以及，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR保守地相似的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

6.权利要求1-5中的任一项所述重组免疫球蛋白，其中所述重组免疫球蛋白与所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白的约10倍以内。

7.权利要求6所述的重组免疫球蛋白，其中所述重组免疫球蛋白与所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白的约3倍以内。

8.权利要求7所述的重组免疫球蛋白，其中所述亲本免疫球蛋白重链CDR3的氨基酸序列被替换。

9.权利要求7所述的重组免疫球蛋白，其中所述亲本免疫球蛋白轻链CDR3的氨基酸序列被替换。

10.权利要求7所述的重组免疫球蛋白，其中所述亲本免疫球蛋白轻链、重链CDR3的氨基酸序列均被替换。

11.权利要求1所述的重组免疫球蛋白，其中所述灵长类为人。

12.一种构建重组免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供与靶抗原结合的非人亲本免疫球蛋白的氨基酸序列；

b.至少鉴定出一个灵长类CDR，其氨基酸序列与所述亲本免疫球蛋白的CDR的氨基酸序列同源；

c.用所述灵长类CDR氨基酸序列替换所述亲本免疫球蛋白CDR的氨基酸序列；

d.制备编码步骤c中获得的氨基酸序列的核酸序例；

e.在重组细胞中表达由步骤d中获得的所述核酸序列以获得免疫球蛋白，其中所获得的所述重组免疫球蛋白，与所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白的约50倍以内。

13.权利要求12所述的方法，经步骤b鉴定的灵长类CDR具有与所述被替换亲本CDR的氨基酸序列至少50％相同的氨基酸序列；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个相同的带电荷氨基酸残基；或者，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR相同的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

14.权利要求13所述的方法，其中在所述亲本CDR的对应位点，在步骤b中鉴定的所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的带电荷氨基酸残基；或者，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR保守地相似的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

15.权利要求12所述的方法，其中在所述亲本CDR的对应位点，在步骤b中鉴定的所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的带电荷氨基酸残基；或者，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR保守地相似的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

16.权利要求15所述的方法，其中在所述亲本CDR的对应位点，在步骤b中鉴定的所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的芳香族氨基酸残基；在所述亲本CDR的对应位点所述灵长类CDR含有至少一个保守地相似的带电荷氨基酸残基；以及，在对应位点所述灵长类CDR含有至少一个与所述亲本CDR保守地相似的氨基酸残基，经晶体结构和/或计算机分析确认，该位点残基的作用是维持所述重组免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力是所述亲本免疫球蛋白对所述抗原的结合亲和力的约50倍以内。

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