CN101824400B - 一种放大增殖抗原特异性t细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使抗原特异性T细胞放大增殖的方法。该方法包括如下步骤：用免疫原A刺激T细胞，获得针对免疫原A的多肽-MHC分子复合物的免疫原A特异性T细胞；将识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因，转入所述免疫原A特异性T细胞，得到识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物和免疫原A的多肽-MHC分子复合物的双抗特异性T细胞；用免疫原A刺激增殖放大所述双抗特异性T细胞。本发明方法得到的双抗特异性T细胞，同时具有目的抗原B特异性和免疫原A特异性，用免疫原A进行诱导和扩大培养，得到大量具有目的抗原B特异性的免疫细胞，克服了以往弱免疫原性抗原无法体外诱导其特异性免疫细胞增殖的缺陷，扩增出的双抗特异性T细胞对目的抗原杀伤率高。

Description

一种放大增殖抗原特异性T细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种使抗原特异性T细胞放大增殖的方法。

背景技术

免疫治疗作为一种有效的治疗手段，近年来得到了广泛的应用。其中，细胞免疫疗法被广泛应用于肿瘤癌症的治疗中，并取的了令人惊喜的效果。但是在细胞免疫治疗实践中，存在一个重大障碍，即能够杀死异常细胞的免疫细胞难以足够数量生产。目前，免疫细胞的扩增通常是通过抗体刺激以及加入细胞因子培养实现的，如T细胞的扩增通常是用抗CD3抗体加白细胞介素-2来实现的。但这种方法只能非特异性地扩增免疫细胞，得到的有效目的细胞数量不多，不能满足需要。还有一种方法就是进行选择性扩增，即用结合目的抗原的抗原递呈细胞(如树突状细胞，B细胞等)重复刺激免疫细胞，得到大量的目的抗原特异性免疫细胞，但是这种方法比较适用于强免疫原性的抗原对特异性免疫细胞的扩增，弱免疫原性抗原很难刺激免疫细胞使之大量特异性增殖，无法满足治疗上的需要。因此，亟待需要一种有效大量扩增制备抗原特异性免疫细胞的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种增殖抗原特异性T细胞的方法。

本发明所提供的增殖抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：用免疫原A刺激T细胞，获得针对免疫原A的多肽-MHC(主要组织相容性复合物)分子复合物的免疫原A特异性T细胞；将识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因，转入所述免疫原A特异性T细胞，得到识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物和免疫原A的多肽-MHC分子复合物的双抗特异性T细胞；用免疫原A增殖放大所述双抗特异性T细胞。

所述免疫原A为病毒、细菌、7个氨基酸以上35个氨基酸以下的多肽、嵌合蛋白、或同种异体抗原；所述病毒可以是任何具有强免疫原性、能迅速而有效地激发免疫细胞免疫反应、诱导免疫细胞增殖，免疫反应机制研究得比较清楚，不对哺乳动物细胞高度致病的病毒，具体可如流感病毒、EB病毒、CMV病毒等。

所述识别目的抗原B多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子包括T细胞抗原受体(TCR)、T细胞抗原受体(TCR)样抗体、自然杀伤细胞表面与MHC分子结合的杀伤活化受体(KAR)或自然杀伤细胞表面与MHC分子结合的杀伤抑制受体(KIR)。

为了进一步增殖细胞，所述用免疫原A增殖放大所述双抗特异性T细胞的方法可以如下：将所述转入识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因的双抗特异性T细胞导入体内，用免疫原A多次免疫，在体内增殖放大双抗特异性T细胞。

所述用免疫原A增殖放大所述双抗特异性T细胞的方法还可以如下：将所述转入识别目的抗原B多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因的双抗特异性T细胞与免疫原A共培养、或将所述转入识别目的抗原B多肽-MHC复合物的免疫识别分子的编码基因的双抗特异性T细胞与结合免疫原A的饲养细胞共培养，使所述转入识别目的抗原B多肽-MHC复合物的免疫识别分子的编码基因的双抗特异性T细胞在体外培养中增殖放大。

其中，所述将识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因，转入所述免疫原A特异性T细胞可以通过病毒载体(逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒相关载体)、脂质体、阳离子聚合物、或电穿孔实现。

所述转入的方法具体可为1)或2)：1)将包装重组病毒的包装细胞(重组病毒中含有识别目的抗原B多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因)、所述针对免疫原A多肽-MHC分子复合物的免疫原A特异性T细胞、所述免疫原A或所述结合免疫原A的饲养细胞共培养；2)将重组病毒(含有识别目的抗原B多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因)、所述针对免疫原A多肽-MHC分子复合物的免疫原A特异性T细胞、所述免疫原A或所述结合免疫原A的饲养细胞共培养。

所述结合免疫原A的饲养细胞是按照包括如下步骤的方法制备的：先将所述免疫原A与所述饲养细胞共培养，再用丝裂霉素处理细胞得到所述结合免疫原A的饲养细胞。

本发明的原理是用免疫原A刺激T细胞，获得针对免疫原A多肽-MHC(主要组织相容性复合物)分子复合物的特异性T细胞；将能识别目的抗原B多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因，转入所述的免疫原A特异性T细胞，得到转入识别目的抗原B多肽-MHC复合物的免疫识别分子的双抗特异性T细胞；用免疫原A增殖放大上述双抗特异性T细胞。

本发明方法适合于强免疫原性或弱免疫原性抗原的特异性T细胞的增殖，更适合于弱免疫原性抗原的特异性T细胞的增殖，如免疫原性弱的肿瘤的特异性T细胞，更具体可为黑色素瘤抗原特异性T细胞。

本发明方法得到的转入识别目的抗原B多肽-MHC复合物的免疫识别分子的双抗特异性T细胞，利用其抗免疫原A的特异性，用免疫原A进行诱导，使其大量增殖，克服了以往弱免疫原性目的抗原无法体外诱导其特异性T细胞增殖的缺陷，扩增效果好，扩增出的免疫细胞对目的抗原杀伤率高；另外，本发明的增殖方法操作简单、成本低。因此，本发明的增殖方法适用于大量制备多种目的抗原特异性免疫细胞，以用于多种肿瘤等疾病的免疫输入治疗。

附图说明

图1为筛选产逆转录病毒的包装细胞系。

图2为双特异性T细胞的gp100肽或流感病毒MP肽的四聚体染色结果。

图3为双特异性T细胞的gp100肽或流感病毒MP肽的细胞内细胞因子染色结果。

图4为双特异性T细胞在体外与不同刺激物共培养后的增殖结果。

图5为双特异性T细胞在HLA-A2/Kb转基因小鼠体内增殖的结果。

图6为双特异性T细胞体外杀伤结合肿瘤抗原的靶细胞及肿瘤细胞的结果。

图7为双特异性T细胞在HLA-A2/Kb转基因小鼠体内杀伤结合肿瘤抗原的靶细胞的结果。

图8为双特异性T细胞在裸鼠体内的抑黑色素瘤实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。

Phoenix-Eco逆转录病毒包装细胞(Morgan，R.A.，et al.，High efficiencyTCR gene transfer in to primary human lymphocytes affords a vid recognitionof melanoma tumor antigen glycoprotein 100 and does not alter the recognitionof autologous melanoma antigens.J Immunol，2003.171(6)：p.3287-95)(中国科学院微生物研究所)。

PT67逆转录病毒包装细胞(Quan，S.，et al.Regulation of human hemeoxygenase in endothelial cells by using sense and antisense retroviralconstructs.PNAS，2001.98(21)：p.12203-08)(中国科学院微生物研究所)。

SupT1人淋巴细胞瘤细胞系(Morgan，R.A.，et al.，High efficiency TCR genetransfer into primary human lymphocytes affords avid recognition of melanomatumor antigen glycoprotein 100 and does not alter the recognition ofautologous melanoma antigens.J Immunol，2003.171(6)：p.3287-95)(中国科学院微生物研究所)。

APB质粒(Morgan，R.A.，et al.，High efficiency TCR gene transfer intoprimary human lymphocytes affords avid recognition of melanoma tumor antigenglycoprotein 100 and does not alter the recognition of autologous melanomaantigens.J Immunol，2003.171(6)：p.3287-95)(中国科学院微生物研究所)，APB质粒中含有抗黑色素瘤gp100 TCR蛋白的编码基因，包括片段1和片段2，片段1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，片段2的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

流感病毒为甲型流感病毒PR/8/34。(de Wit，E.，et al.，Efficientgeneration and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments.Virus Res，2004.103(1-2)：p.155-61.)(中国科学院微生物研究所)。

HLA-A2/Kb转基因小鼠(Zhou，M.，et al.，Screening and identification ofsevere acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTLepitopes.J Immunol，2006.177(4)：p.2138-45.)(中国科学院微生物研究所)。

白细胞介素-2购自Chiron B.V.，Amsterdam，The Netherlands。

共培养培养基：含10％(体积百分含量)胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、5×10^-2mM 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基。

实施例1、双特异性T细胞(抗肿瘤特异性和抗流感病毒特异性T细胞)的制备

一、表达重组病毒(含有抗黑色素瘤gp100 TCR蛋白的编码基因)的包装细胞系的制备

用APB质粒转染Phoenix-Eco细胞，产生的病毒上清感染PT67包装细胞，将感染后的各单克隆PT67病毒上清分别感染SupT1人淋巴细胞瘤细胞系，检测人CD3的表达，以未经任何感染的SupT1人淋巴细胞瘤细胞系为空白对照。该法用来筛选产生病毒滴度最高的包装细胞系。

结果如图1A所示，表明，所筛选出的该PT67包装细胞系产生病毒滴度最高(即能最大程度提高SupT1细胞表面人CD3表达)，可以作为后续实验中产毒的包装细胞系。

二、双特异性T细胞的制备

(1)流感病毒免疫小鼠：用流感病毒鼻腔免疫HLA-A2/Kb转基因小鼠。

(2)小鼠脾脏淋巴细胞的获得：免疫2-4周后取小鼠脾细胞(每个脾研磨后，2次通过200目滤网制成细胞悬液)，向细胞悬液中加入红细胞裂解液裂解红细胞，离心去除红细胞裂解碎片和血小板，收集淋巴细胞；用含10％胎牛血清的1640细胞培养基洗3遍后，用共培养培养基悬浮淋巴细胞。

(3)双特异性T细胞的获得：将步骤2)获得的淋巴细胞接种于共培养培养基中，再向其中加入步骤一筛选得到的产逆转录病毒(表达抗黑色素瘤gp100的人TCR)PT67包装细胞(PT67包装细胞与淋巴细胞的数目比为8×10⁴：1×10⁶)和流感病毒(流感病毒与T细胞的比例为2×10⁶EID50：1×10⁶个)，在37℃，5％CO₂条件下培养5天，其中，培养24-48小时后向体系中加入白细胞介素-2(白细胞介素-2在体系中的浓度为50IU/ml)，以后每隔一天加一次；获得双特异性T细胞(抗黑色素瘤特异性和抗流感病毒特异性)。

在共培养的不同时间点检测T细胞表面抗人gp100-TCR的表达。

实验设3次重复，结果如图1B和1C所示。图1B和1C结果显示用抗人TCR(α/β)-FITC(BD Biosciences，PharMingen，CA，USA.Cat.333140)检测到表面表达人gp100-TCR，表明逆转录病毒(APB)成功感染小鼠T细胞，获得双特异性T细胞(抗黑色素瘤特异性和抗流感病毒特异性)。

如需进一步扩增双特异性T细胞，则吸取悬浮细胞，去除死细胞，再加入流感病毒刺激且用丝裂霉素(80μg/ml，37℃，2h)处理的饲养细胞(同系小鼠的脾细胞)及50IU/ml的白细胞介素-2在37℃，5％CO₂条件下继续培养3-5天，得到更多的双特异性T细胞。

(4)抗流感病毒特异性T细胞的获得：用流感病毒鼻腔免疫HLA-A2/Kb转基因小鼠，2-4周后取小鼠脾脏淋巴细胞置于共培养培养基中，同时向其中加入流感病毒，流感病毒在培养体系中的浓度为2×10⁶EID50/ml，在37℃，5％CO₂条件下共培养5-10天；期间，培养24-48小时后加入50IU/ml白细胞介素-2，以后每隔一天加一次；获得抗流感病毒特异性T细胞。

图1A表示包装细胞系PT67产生的逆转录病毒感染SupT1后细胞表面人CD3的表达。Control表示没有感染逆转录病毒的SupT1，APB表示感染逆转录病毒APB的SupT1。横坐标是人CD3(人白细胞分化抗原-3)，表示相对荧光强度值，纵坐标是细胞数。

图1B表示逆转录病毒(APB)感染且流感病毒刺激的小鼠T细胞表面人TCR(T细胞抗原受体)的表达。横坐标是人TCR，表示绿色荧光相对强度值，纵坐标是细胞数。

图1C表示逆转录病毒(APB)感染且流感病毒刺激后不同时间小鼠T细胞表面人TCR(T细胞抗原受体)的表达。横坐标是人TCR，表示绿色荧光相对强度值，纵坐标是细胞数。

实施例2、双特异性T细胞的增殖及功能

将实施例1中得到的双特异性T细胞进行如下实验。

黑色素瘤抗原gp100肽的四聚体按照文献(Estcourt，M.J.，A.J.McMichael，and T.Hanke，Altered primary CD8+T cell response to a modified virusAnkara(MVA)-vectored vaccine in the absence of CD4+T cell help.Eur JImmunol，2005.35(12)：p.3460-7)中所述方法制备。

流感病毒抗原基质蛋白MP肽的四聚体按照文献(Estcourt，M.J.，A.J.McMichael，and T.Hanke，Altered primary CD8+T cell response to a modifiedvirus Ankara(MVA)-vectored vaccine in the absence off CD4+T cell help.EurJ Immunol，2005.35(12)：p.3460-7)中所述方法制备。

FITC标记的抗小鼠CD8购自BD，PharMingen，CA，USA；

抗小鼠IFN-γ-PE购自eBioscience，产品目录号为12-7311-71；

莫能霉素购自eBioscience，产品目录号为00-4505-51；

穿透缓冲液购自eBioscience，产品目录号为00-8333。

初始T细胞：分离未进行任何免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾脏T细胞，即为初始T细胞。

一、四聚体染色及细胞内细胞因子染色

分别以双特异性T细胞、抗流感病毒特异性T细胞、初始T细胞为实验细胞进行实验，下面以双特异性T细胞为例详细叙述实验方法：

四聚体染色：将双特异性T细胞用PBS洗2遍后重悬于100μlPBS，加入MP肽四聚体(PE)或gp100肽四聚体(PE)，37℃染色20min后加入抗小鼠CD8单抗室温染色20min。PBS洗2遍后重悬于500μlPBS后上流式细胞仪计数。

细胞内细胞因子染色：将双特异性T细胞接种于共培养培养基，向不同的处理组中分别加入gp100肽(gp100肽在培养体系中的浓度为20μM)、流感病毒MP肽(流感病毒MP肽在培养体系中的浓度为20μM)刺激1-2小时，再向其中加入莫能霉素(莫能霉素在培养体系中的浓度为5μM)，在37℃、5％CO₂条件下处理4-5小时后，多聚甲醛(1％)固定后加入穿透缓冲液清洗并重悬，用抗小鼠IFN-γ-PE单抗和抗小鼠CD8单抗染色，PBS洗2遍后重悬于500μlPBS后上流式细胞仪计数。以不加肽作为对照。

实验设2次重复。

四聚体染色结果如图2所示(1表示初始T细胞，2表示抗流感病毒的特异性T细胞，3表示双特异性T细胞)。结果显示双特异性T细胞中10-15％能与MP四聚体反应，15-20％能与gp100四聚体反应，而对照的抗流感病毒特异性T细胞几乎不与gp100四聚体反应，表明双特异性T细胞既表达抗黑色素瘤抗原gp100的TCR，也表达抗流感病毒抗原MP的TCR，是双特异性的。

图2A横坐标是小鼠白细胞分化抗原-8，表示绿色荧光相对强度值；纵坐标为MP肽四聚体(PE)的红色荧光相对强度值。

图2B中横坐标是小鼠白细胞分化抗原-8，表示绿色荧光相对强度值；纵坐标为gp100肽四聚体(PE)的红色荧光相对强度值。

细胞内细胞因子染色结果如图3所示，显示双特异性T细胞中有约10％与流感病毒抗原MP肽反应能分泌γ-干扰素，约有10％与黑色素瘤抗原gp100肽反应能分泌γ-干扰素，从细胞因子分泌水平反映了双特异性T细胞是双特异性的。

图3A为双特异性T细胞的细胞内细胞因子染色结果，图3B为抗流感病毒特异性T细胞的细胞内细胞因子染色结果。1表示加流感病毒抗原MP肽反应组，2表示与加黑色素瘤抗原gp100肽反应组，3表示不加肽的对照组。横坐标代表细胞表面小鼠白细胞分化抗原-8，表示绿色荧光相对强度值；纵坐标为细胞内小鼠IFN-γ(PE)的红色荧光相对强度值。

二、双特异性T细胞在体外和小鼠体内的增殖

B16-AAD黑色素瘤细胞(Mullins，D.W.，et al.Route of Immunization withPeptide-pulsed Dendritic Cells Controls the Distribution of Memory andEffector T Cells in Lymphoid Tissues and Determines the Pattern of RegionalTumor Control.J Exp Med，2003.198(7)：p.1023-34.)(中国科学院微生物研究所)。

(一)体外培养增殖：

将双特异性T细胞用绿色荧光染料(CFSE)染色后加入不同的刺激物，同时加入白细胞介素-2(白细胞介素-2在体系中的浓度为50IU/ml)(每隔一天加一次)，用共培养培养基在37℃、5％CO₂条件下培养3天，然后上流式细胞仪观察细胞增殖状况。

不同刺激物处理分别为：

1)加入流感病毒-饲养细胞，其与双特异性T细胞的数目比例为1∶1；

流感病毒-饲养细胞的获得方法：取未经任何免疫的HLA-A2/Kb转基因小鼠的脾脏T细胞，接种于共培养培养基，向其中加入流感病毒(流感病毒在培养体系中的浓度为2×10⁶EID50/ml)刺激2h，再加入丝裂霉素(丝裂霉素在培养体系中的浓度为80μg/ml)，在37℃处理2h，用培养基洗3次，得到的细胞即为流感病毒结合的饲养细胞。

2)加入丝裂霉素处理的B16-AAD黑色素瘤细胞，其与双特异性T细胞的比例为0.5∶1；

丝裂霉素处理的B16-AAD黑色素瘤细胞的获得方法：将B16-AAD黑色素瘤细胞接种于共培养培养基，向其中加入丝裂霉素(丝裂霉素在培养体系中的浓度为200μg/ml)，在37℃处理2h，用培养基洗3次，得到丝裂霉素处理的B16-AAD黑色素瘤细胞。

3)只用共培养培养基培养双特异性T细胞，不加入任何细胞；

4)加入抗-CD3抗体，抗体浓度为200ng/ml。

实验设3次重复。

体外培养增殖结果如图4所示。双特异性T细胞与结合流感病毒的饲养细胞、抗CD3抗体共同孵育后都有明显增殖，而B16-AAD黑色素瘤细胞只能微弱刺激其增殖，表明肿瘤抗原是较弱的免疫原，不能有效刺激双特异性T细胞增殖，而流感病毒抗原是强抗原，能有力刺激双特异性T细胞增殖。

图4中，A表示双特异性T细胞，B表示抗流感病毒特异性T细胞。1表示与流感病毒-饲养细胞共培养组，2表示与B16-AAD黑色素瘤细胞共培养组，3表示只用共培养培养基培养组，4表示与抗-CD3抗体共培养组。

(二)小鼠体内的增殖：

将双特异性T细胞(3×10⁶个/只)从静脉输入小鼠体内，24小时后用流感病毒免疫小鼠(腹腔免疫一次，10^7.9 EID₅₀)。在不同时间点取小鼠脾细胞检测gp100四聚体和CD8双阳性细胞，观察T细胞被流感病毒刺激后在小鼠体内的扩增情况。实验设2次重复。

体内的增殖结果如图5所示。流感病毒免疫小鼠后，双特异性T细胞(●)在体内有明显增殖，在免疫后第7天抗肿瘤TCR表达最高，约占CD8阳性T细胞的10％，随后由于体内免疫平衡体系的作用而下降。表明流感病毒抗原能有效刺激双特异性T细胞在体内增殖。而对照的抗流感病毒特异性T细胞(○)未检测到抗肿瘤TCR的表达。

三、双特异性T细胞在体内和体外的杀伤实验

EG7细胞(Fu，H.M.，et al.Investigation of endogenous antigen processingby delivery of an intact protein into cells.J.Immunol.Methods，2008.335：p.90-97)(中国科学院微生物研究所)。

K41细胞(Fu，H.M.，et al.Investigation of endogenous antigen processingby delivery of an intact protein into cells.J.Immunol.Methods，2008.335：p.90-97)(中国科学院微生物研究所)。

(一)体外杀伤：

将HLA-A2/Kb转基因小鼠的脾细胞用CFSE(10μM)染色，然后分别用黑色素瘤抗原gp100肽(10μM，37℃，30min)、流感病毒抗原MP肽(10μM，37℃，30min)、流感病毒(2EID₅₀/cell，37℃，120min)刺激后，以不同的效靶比与效应细胞(双特异性T细胞)混合，37℃、4h后用PI(碘化丙锭，10μg/ml，Sigma-Aldrich，81845)染色，上流式细胞仪检测，计算杀伤率。实验设3次重复。

体外杀伤结果如图6所示，A表示双特异性T细胞体外杀伤结合特异抗原的靶细胞，B表示双特异性T细胞体外杀伤肿瘤细胞。

图6A中1表示靶细胞为结合gp100肽的同系小鼠脾细胞，2表示靶细胞为结合MP肽的同系小鼠脾细胞，3表示靶细胞为结合流感病毒的同系小鼠脾细胞，4表示靶细胞为未经任何刺激的同系小鼠脾细胞。●表示效应细胞为双特异性T细胞，○表示效应细胞为未经抗原刺激的同系小鼠脾细胞(对照)。

图6B中●表示杀伤B16-AAD黑色素瘤细胞的结果，○表示杀伤EG7细胞的结果，■表示杀伤K41细胞的结果。

结果表明双特异性T细胞显著杀伤结合gp100肽、MP肽或流感病毒的同系小鼠脾细胞，而不杀伤未结合的小鼠脾细胞(图6A)。并且，双特异性T细胞可以显著杀伤B16-AAD黑色素瘤细胞((图6B●)，而不杀伤对照肿瘤靶细胞((图6B○、■)。

(二)体内杀伤：

将1×10⁷双特异性T细胞从静脉输入HLA-A2/Kb转基因小鼠体内，24小时后用流感病毒(腹腔免疫一次，10^7.9 EID₅₀)免疫小鼠。7天后从静脉输入靶细胞，4小时后取小鼠脾细胞上流式细胞仪选PKH26阳性的细胞观察杀伤状况。靶细胞制备如下：将HLA-A2/Kb转基因小鼠的脾细胞分别用PKH26(4μM)和CFSE(2μM，或0.2μM)染色，然后CFSE高染(2μM)的靶细胞群结合gp100或流感病毒；同时CFSE低染(0.2μM)的靶细胞群不加刺激物作为对照。将CFSE高染和低染的靶细胞群以1∶1的比例混合后(2.5×10⁶个/群)静脉输入实验小鼠作为靶细胞。实验设3次重复。

体内杀伤结果如图7所示。1为实验对照组，表示小鼠注射PBS后7d进行体内杀伤实验的结果；2是实验组，表示小鼠注射双特异性T细胞(2A，2B)，或流感特异性T细胞(2C)，24小时后用流感病毒免疫，7d后进行体内杀伤实验的结果。

A，C表示杀伤结合gp100肿瘤抗原的靶细胞，B表示杀伤结合流感病毒的靶细胞。

结果表明，双特异性T细胞体内杀伤结合gp100肿瘤抗原的靶细胞(图7A)，平均杀伤率达到65％；杀伤结合流感病毒的靶细胞(图B)，平均杀伤率达到48.5％。而对照流感病毒特异性T细胞不能杀伤结合gp100肿瘤抗原的靶细胞(图7C)。

四、双特异性T细胞在裸鼠体内的抑瘤实验

Balb/c nu/nu裸鼠购自北京大学医学部实验动物研究中心。

用8×10⁴B16-AAD鼠黑色素瘤细胞接种于Balb/c nu/nu裸鼠皮下，24小时后静脉注射1×10⁶双特异性T细胞，同时以抗流感病毒特异性T细胞作为对照。再24小时后腹腔免疫流感病毒(10^7.9 EID₅₀，以后每7-10天免疫一次)刺激T细胞增殖。观察裸鼠体内肿瘤生长状况。肿瘤体积(立方厘米)＝肿瘤长径(厘米)×[肿瘤短径(厘米)]²/2。

结果如图8所示。双特异性T细胞(图8■，n＝10)能显著抑制黑色素瘤细胞在裸鼠体内的增殖，肿瘤体积与对照组(未注射T细胞●(n＝7)，注射抗流感病毒特异性T细胞○(n＝7))相比均有显著性差异(p＜0.05)。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种放大增殖抗原特异性T细胞的方法

<130>CGGNARC92133

<160>2

<210>1

<211>1149

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<220>

<223>

<400>1

atggtgaaga tccggcaatt tttgttggct attttgtggc ttcagctaag ctgtgtaagt    60

gccgccaaaa atgaagtgga gcagagtcct cagaacctga ctgcccagga aggagaattt    120

atcacaatca actgcagtta ctcggtagga ataagtgcct tacactggct gcaacagcat    180

ccaggaggag gcattgtttc cttgtttatg ctgagctcag ggaagaagaa gcatggaaga    240

ttaattgcca caataaacat acaggaaaag cacagctccc tgcacatcac agcctcccat    300

cccagagact ctgccgtcta catctgtgct gcctcattaa ttcagggagc ccagaagctg    360

gtatttggcc aaggaaccag gctgactatc aacccaaata tccagaaccc tgaccctgcc    420

gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt    480

gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact    540

gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa    600

tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc    660

cccagcccag aaagttcctg tgatgtcaag ctggtcgaga aaagctttga aacagatacg    720

aacctaaact ttcaaaacct gtcagtgatt gggttccgaa tcctcctcct gaaagtggcc    780

gggtttaatc tgctcatgac gctgcggctg tggtccagct gagacctgca agattgtaag    840

acagcctgtg ctccctcgct ccttcctctg cattgcccct cttctccctc tccaaacaga    900

gggaactctc ccacccccaa ggaggtgaaa gctgctacca cctctgtgcc cccccggcaa    960

tgccaccaac tggatcctac ccgaatttat gattaagatt gctgagagct gccaaacact    1020

gctgctaccc cctctgttcc cttattgctg cttgtcactg cctgacaatt cacgggcgga    1080

ggcataccta cgagctaagt gggattcctc tcaggggctg tcaggaattc ccaccggtgg    1140

gtctaaggt                                                            1149

<210>2

<211>1163

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<220>

<223>

<400>2

gccatggact cctggacctt ctgctgtgtg tccctttgca tcctggtagc gaagcataca    60

gatgctggag ttatccagtc accccgccat gaggtgacag agatgggaca agaagtgact    120

ctgagatgta aaccaatttc aggccacaac tcccttttct ggtacagaca gaccatgatg    180

cggggactgg agttgctcat ttactttaac aacaacgttc cgatagatga ttcagggatg    240

cccgaggatc gattctcagc taagatgcct aatgcatcat tctccactct gaagatccag    300

ccctcagaac ccagggactc agctgtgtac ttctgtgcca gcagccccgg gggcaatgag    360

cagttcttcg ggccagggac acggctcacc gtgctagagg acctgaaaaa cgtgttccca    420

cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca    480

ctggtatgcc tggccacagg cttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat    540

gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc    600

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aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag    720

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gtagacagtt ctggccggct cag                                            1163

Claims (3)

1.一种增殖抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：将识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子的编码基因，转入针对免疫原A的多肽-MHC分子复合物的特异性T细胞，得到识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物和免疫原A的多肽-MHC分子复合物的双抗特异性T细胞；用免疫原A刺激增殖放大所述双抗特异性T细胞；

所述免疫原A为病毒、细菌或7个氨基酸以上35个氨基酸以下的多肽；

所述识别目的抗原B的多肽-MHC分子复合物的免疫识别分子包括T细胞抗原受体、T细胞抗原受体样抗体、自然杀伤细胞表面与MHC分子结合的杀伤活化受体或自然杀伤细胞表面与MHC分子结合的杀伤抑制受体；

所述用免疫原A刺激增殖放大所述双抗特异性T细胞的方法为如下体外细胞培养方法：将所述双抗特异性T细胞与所述免疫原A共培养、或将所述双抗特异性T细胞与结合所述免疫原A的饲养细胞共培养，使所述双抗特异性T细胞在体外培养中增殖放大。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述针对免疫原A的多肽-MHC分子复合物的特异性T细胞是通过用所述免疫原A刺激T细胞得到的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述转入是通过病毒载体、脂质体、阳离子聚合物，或电穿孔实现的；所述病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。

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