CN101812462B

CN101812462B - 水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN101812462B
Application number: CN2009102732412A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 方玉洁
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2029-12-16
Also published as: CN101812462A

Abstract

本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及一种GT转录因子家族基因OsGTγ-1基因在控制水稻耐盐性中的应用。通过功能分析和鉴定获得一个控制水稻耐盐性的基因OsGTγ-1，验证了该基因在水稻耐盐性抗逆遗传改良中的应用。所述的OsGTγ-1基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表SEQ NO：1中第475-1707位所示的核苷酸序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。将含OsGTγ-1基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的耐盐性得到显著提高。

Description

水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离克隆一个能够提高高盐耐受能力的水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1，并通过功能验证实现其在水稻抗逆性遗传改良中的应用。本发明利用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，分离克隆到控制水稻耐盐性的基因OsGTγ-1，一方面通过共分离检测验证该突变体与高盐敏感表型紧密连锁，另一方面通过超量表达OSGTγ-1基因提高了转基因水稻对高盐的耐受能力，证实了该基因的功能。

背景技术

植物的生长发育过程不仅取决于其遗传背景，还会受到诸多环境因素的影响。植物生长的环境并非总是适宜的，在自然界条件下，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，常常会造成各种对植物生长和生存不利的环境，致使植物受到伤害甚至死亡。对农业生产来说，各种不良环境是影响作物产量和品质的最直接、最重要的因素，也是制约许多地区农业发展的瓶颈。如何利用现代分子生物学手段研究抗逆相关基因的功能和调控机制，利用这些基因提高作物的抗逆性从而培育出具有优良抗逆性的作物品种，是植物功能基因组研究的重要内容，也是农业科学技术研究的主要目标之一。

干旱、低温和土壤盐碱化一直是制约农作物生长发育和增产增收的主要逆境因子。干旱可以导致植物细胞失水，造成细胞膨压完全丧失，甚至死亡；冻害可能造成植物细胞的机械伤害，引起细胞膜的膜脂相变而失水；盐害除渗透胁迫外，同时还伴有离子毒害，造成植物细胞内酶类的伤害、植物生长受抑制等。植物感受外界逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而调整自身的生理状态或形态来适应不利环境，维持基本的生存活动。植物感应到逆境胁迫后经过一系列的信号传导和转录调控，启动下游大量与胁迫应答相关靶基因的表达，产生一些使细胞免受胁迫伤害的物质(如LEA类蛋白、渗调蛋白、抗冻蛋白、通道蛋白等)，进而增强植物对胁迫的耐受能力(Valliyodan B，Nguyen H T.Understandingregulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants.Curr Opin Plant Biol，2006，9：189-195)。目前已经从植物中分离克隆了数十种编码与提高逆境胁迫抗性相关蛋白的基因，根据基因编码产物的功能，可将它们分成两大类：一类是编码直接保护细胞免受逆境胁迫伤害的功能蛋白的功能基因，包括：一些编码膜蛋白(如水通道蛋白、转运子)的基因；细胞质和叶绿体中的一些蛋白酶基因；编码大分子保护蛋白(如分子伴侣、LEA蛋白)的基因；编码渗透调节物质(如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等)合成酶的基因；编码毒性物质降解酶(如谷胱甘肽S转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶等)的基因。人们将与提高逆境胁迫抗性相关的功能基因进行遗传转化，使转基因植物的抗逆性有了不同程度的提高。另一类是逆境胁迫下信号传导及转录调控有关的基因，包括：抗逆相关的转录因子基因(bZIP转录因子、WRKY转录因子、MYC、MYB类及DREB类转录因子等)；感应及转导胁迫信号的蛋白激酶(MAPK、CDPK、S6K、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶等)；信号传导中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷脂酶C等)。

传统育种实践表明，想通过品种间和种间杂交等传统遗传育种手段提高作物对逆境胁迫的抗性很难奏效，利用单个功能基因来对作物的抗逆性进行改良也难以获得理想的效果。近年来发现一些逆境相关的转录因子可以调控多个逆境相关基因的表达，利用转录因子可以有效实现对植物抗逆性的改良。转录因子是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异相互作用的DNA结合蛋白，也称反式作用因子，能够通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用在mRNA转录水平上实现对基因的表达调控(Xiong等.Transcription factors in rice：a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots.Plant Mol Biol，2005，59：191-203)。实践证明，在植物体内对某些转录因子基因进行超量表达能够有效提高植物对非生物胁迫的耐受能力。例如超表达DREB1A的转基因拟南芥可表现出对干旱、高盐和冻害的抗性，而对DREB2A进行超表达能在非胁迫条件下诱导低温胁迫相关基因的表达，并能提高转基因植株对低温胁迫的耐受性(Liu等，Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separatetwo cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，1998，10：1391-1406)。Tsil(Park等，Overexpression of the tobacco Tsilgene encoding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmoticstress in tobacco.Plant Cell，2001，13：1035-1046)、番茄JERF1以及JERF3在转基因烟草中的超表达能提高烟草的耐盐性(Wang等，Ectopic overexpression of tomato JERF3 in tobacco activates downstream geneexpression and enhances salt tolerance.Plant Mol Biol，2004，55：183-192；Zhang等，The ethylene-，jasmonate-，abscisic acid-and NaCl-responsive tomato transcription factor JERF1 modulates expression of GCCbox-containing genes and salt tolerance in tobacco.Planta，2004，220：262-270)。在水稻中超量表达SNAC1基因显著提高了转基因植株的抗旱性和耐盐性(Hu等，Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103：12987-12992)。由于转录因子的超量表达能够激活多个与同类性状相关的基因的表达，因此与导入或改良个别功能基因来提高作物某种抗性的传统方法相比，对关键的转录因子进行改良或增强其调控能力，可以通过调控一个转录因子而激活多个功能基因发挥作用，为作物抗逆性分子育种提供更为有效的方法和途径。

作为一种重要的粮食作物和模式植物，水稻品质的改良和产量的提高一直是人们努力的目标。通过研究水稻中与逆境相关的转录因子从而提高水稻抗逆性是培育抗逆水稻品种的一条有效途径。在我们的前期研究中分离到一个受多种逆境诱导的基因，序列分析表明它属于植物特有的一类转录因子GT家族的成员。已有的研究表明这个家族的成员参与包括植物光应答在内的一些生理反应，并能与相应GT元件特异结合或与其它转录因子之间发生相互作用从而实现对多种不同基因的转录调控。水稻GT-2和拟南芥GT-1可在体内激活转录(Le等，Transcriptional activation by Arabidopsis GT-1 may be through interaction withTF II A-TBP-TATA complex.Plant J.1999，18：663-668；Ni等，GT-2：in vivo transcriptional activation activityand definition of novel twin DNA binding domains with reciprocal target sequence selectivity.Plant Cell.1996，8：1041-1059)，拟南芥PTL参与调节花器官的发育(Brewer等，PETAL LOSS，a trihelix transcription factor gene，regulates perianth architecture in the Arabidopsis flower.Development.2004，131：4035-4045)，但这个家族是否参与植物的逆境应答尚无报道。因此。从水稻中分离克隆该家族的基因并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于从水稻中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”同义，下同)，利用这个基因提高水稻对高盐胁迫的耐受能力，实现该基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与拟南芥中的GT-3a和GT-3b蛋白有一定的同源性，系统进化分析的结果表明该基因属于GT转录因子家族中一个新的亚家族GTγ中的成员，因此被命名为OsGTγ-1基因。

本发明涉及分离和应用一种包含OsGTγ-1基因的DNA片段，该片段赋予植物对高盐胁迫耐受性增强的能力。其中，所述的OsGTγ-1基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中第475-1707位所示的DNA序列；或

2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；或

3)1)和2)所包含的亚片段。

可以采用已经克隆的OsGTγ-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsGTγ-1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGTγ-1基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得耐盐性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。

携带有本发明OsGTγ-1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2^nd Edition)。

可使用包括本发明的OsGTγ-1基因的表达载体转化的宿主是包括水稻在内多种植物，培育耐盐的植物品种。

本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对高盐胁迫的抗性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有OsGTγ-1基因编码区的核苷酸序列。

图1：采用MrBayes 3.0版软件(公开使用软件)依据水稻和拟南芥中GT家族成员和部分其他植物物种中已报道的GT因子蛋白序列进行系统进化分析的结果。

图2(包含图2a-图2c)：用Real-time PCR检测OsGTγ-1基因在各种逆境胁迫条件下、水稻不同组织中和在不同激素处理下的表达水平。4种非生物逆境胁迫依次是：S，高盐；D，干旱；C，低温；w，伤害。高盐、干旱、低温胁迫取样时间点为0、1、3、6小时，伤害胁迫取样时间点为0、1、10、30分钟。13个组织器官依次是：1，分蘖期的根；2，拔节期的茎；3，4叶期的叶片；4叶期的叶鞘；5，穗(0.5-1cm)；6，穗(3-5cm)；7，穗(大于10cm)；8，开花前的穗顶端分生组织；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12，发芽3星期的苗；13；3星期的黄花苗。7种激素处理依次是：A，脱落酸(ABA)；I，生长素(IAA)；G，赤霉素(GA)；K，细胞分裂素(KT)；J，茉莉酸(JA)；E，乙烯利(Eth)；S，水杨酸(SA)。喷施激素处理的浓度分别为：26.43mg/L、10mg/L、40mg/L、100mg/L、21.03mg/L、43.35mg/L、138.12mg/L，处理后按不同时间点取样，ABA、IAA、GA、KT激素处理取样时间点为0、0.5、1、3小时，JA、Eth、SA激素处理取样时间点为0、1、2、4小时。

图3：OsGTγ-1蛋白的亚细胞定位结果。OsGTγ-1：GFP融合载体和pU1391GFP空载体分别转化水稻，在激光共聚焦显微镜下对转基因植株的根进行观察。G，GFP荧光图像；PI，用碘化丙啶染色的荧光图像；M，合成图像。

图4(包含图4a-图4e)：水稻osgtγ-1突变体的鉴定。a，突变体中T-DNA插入位置示意图；b，根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。F表示在插入位点上游设计的引物，R表示在插入位点下游设计的引物，VP表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T₁代植株中，纯合突变体只有R和VP配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入F与R配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有F和R配对可以得到产物，杂合植株则R和VP配对以及F和R配对时都可以扩增得到产物。其中泳道3，4，13，15，18为T-DNA纯合；1，2，5，6，7，9，10，11，12，14，16，17为T-DNA杂合；8，9为T-DNA阴性；c，用Real-time PCR检测正常生长条件和高盐胁迫下OSGTγ-1基因在5个纯合突变体家系(M1-M5)和野生型对照家系(CK)中的表达水平；d，正常生长条件和150mM NaCl高盐胁迫下一周后5个纯合突变体家系(M1-M5)和野生型对照家系(CK)的生长情况；e，正常生长条件和150mM NaCl高盐胁迫下一周后5个纯合突变体家系(M1-M5)和野生型对照家系(CK)地上部分长度统计结果。

图5(包含图5a-图5d)：超量表达OsGTγ-1基因能够提高转基因植株的耐盐性。a，OsGTγ-1基因超量表达载体构建示意图；b，用Real-time PCR检测OsGTγ-1基因在5个独立超量表达转基因家系(O1-O5)和野生型对照家系(CK)中的表达水平；c，正常生长条件和150mMNaCl高盐胁迫下一周后5个超量表达家系(O1-O5)和野生型对照家系(CK)的生长情况；d，正常生长条件和150mM NaCl高盐胁迫下一周后5个超量表达家系(O1-O5)和野生型对照家系(CK)地上部分长度统计结果。

图6：超量表达实验所用pCB2004H载体图。

图7：亚细胞定位实验所用pU1391cGFP载体图。

具体实施方式

OsGTγ-1基因的全长cDNA是从日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中J013022H04质粒中扩增所得。OsGTγ-1是一个抗逆相关基因。主要依据有以下几个方面：(1)利用Real-time PCR方法对其进行逆境条件下的表达谱分析(图2a)，发现在胁迫处理(干旱、高盐、低温胁迫和ABA处理)的过程中，OsGTγ-1的表达量明显上升。组织表达谱分析结果(图2b)表明OsGTγ-1在不同组织中均有一定程度的表达，在叶片、叶鞘和幼穗中的表达量较高。(2)通过生物信息学方法预测该基因是水稻GT转录因子家族的成员，OsGTγ-1蛋白的亚细胞定位分析表明其定位于细胞核中(图3)。(3)该基因的T-DNA插入水稻突变体中OsGTγ-1表达受到抑制，纯合突变体对高盐胁迫的敏感性增强(图4)。(4)将其全长基因在水稻中超量表达，转基因植株对高盐胁迫的耐受能力大大增强(图5)。这些结果都表明OsGTγ-1基因是一个逆境相关调控基因，参与植物对逆境的调控。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsGTγ-1基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsGTγ-1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：对水稻GT家族进行生物信息学分析并分离克隆包含有OSGTγ-1基因区段的DNA片段

基于已报道的植物GT蛋白质序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，TIGR(The Institute for Genomic Research，http://www.tigr.org)和TAIR(TheArabidopsis Information Research，http://www.arabidopsis.org)数据库中进行BLAST搜索的结果，收集GT转录因子家族成员序列，手动除去重复序列。采用MrBayes 3.0版软件(公开使用软件)对水稻和拟南芥中GT家族成员和部分其他植物物种中已报道的GT因子蛋白序列进行系统进化分析(结果见图1)，结果发现亚家族GTγ中的成员均尚未被报道过，挑选这个亚家族中的成员OsGTγ-1作为研究对象。该基因对应日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中的cDNA克隆J013022H04(登录号为AK065397)。根据该克隆序列，设计引物OE07F(5′-GTTGGTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3′，序列特异引物外加接头KpnI位点)和OE07R(5′-GAACTGCAGTGACCGATTGCAGTTAG-3′，序列特异引物外加接头PstI)，将该克隆的序列从日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中的cDNA克隆J013022H04质粒中扩增出来。扩增产物对应本发明中SEQ ID NO：1显示序列的391-1850bp。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃40sec，55℃40sec，72℃2min，32个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入

载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因，该克隆命名为pGEM-OsGTγ-1。

本发明所涉及的序列来源于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http://www.tigr.org)，KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 5”为准。

实施例2：分析水稻内源基因OSGTγ-1的组织和逆境表达谱

以水稻品种“珍汕97”(一个中国大面积公开推广应用的水稻品种)为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及伤害处理。干早处理是将幼苗断水，高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中，低温处理是将幼苗置于4℃生长箱，在0、1、3、和6小时四个时间点取样，伤害胁迫取样时间点为0、1、10、30分钟。喷施激素处理所用的7种激素依次是：A，脱落酸(ABA)；I，吲哚乙酸(IAA)；G，赤霉素(GA3)；K，细胞分裂素(KT)；J，茉莉酸(JA)；E，乙烯利(Eth)；S，水杨酸(SA)。浓度分别为：26.43mg/L、10mg/L、40mg/L、100mg/L、21.03mg/L、43.35mg/L、138.12mg/L，处理后按不同时间点取样，ABA、IAA、GA、KT激素处理取样时间点为0、0.5、1、3小时，JA、Eth、SA激素处理取样时间点为0、1、2、4小时。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)。由于该基因本底表达较低，表达谱分析是利用Real-time PCR完成的，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将RNA样品反转录合成cDNA第一链(方法根据反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min。利用反转录酶(购自Invitrogen公司)。以上述反转录合成的cDNA为模板，利用引物H04F：5’-ATCTGGTGGTCCAACTGCTGA-3’和H04R：5’-CGGCGTTT-TTCAAGTCGAAT-3’扩增OsGTγ-1基因特异片段，以OsActin1基因作为内对照(利用引物Actin1F：5’-TGGCATCTCTAGCACATTCC-3’和Actin1R：5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’扩增OsActin1基因特异片段)进行荧光实时相对定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，45个循环。结果表明，本发明克隆的基因OsGTγ-1能被干旱、高盐、低温和ABA诱导表达，但不受伤害胁迫和其它激素处理诱导(如图2a和图2c所示)，是一个受逆境诱导的转录因子。以水稻品种“明恢63”(一个中国大面积公开推广和应用的水稻品种)为材料，提取不同生长时期的组织的RNA用Reai-time PCR检测OsGTγ-1基因的表达水平。选取的13种组织器官分别是：1，分蘖期的根；2，拔节期的茎；3，4叶期的叶片；4叶期的叶鞘；5，穗(0.5-1cm)；6，穗(3-5cm)；7，穗(大于10cm)；8，开花前的穗顶端分生组织；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12，发芽3星期的苗；13；3星期的黄花苗。结果表明：OsGTγ-1基因在所选取的组织中均有一定量的表达，但以叶片、叶鞘和幼穗中的表达量较高(如图2b所示)。

实施例3：OsGTγ-1蛋白的亚细胞定位

利用水稻稳定转化体系，我们将包含预测为OsGTγ-1核定位序列的cDNA片段同报告基因GFP融合，通过玉米里的一个强启动子Ubiquitin的驱动在水稻植株中表达，对阳性转基因植株的根在激光共聚焦显微镜下进行观察的结果说明OsGTγ-1蛋白定位于细胞核内(如图3所示)。融合载体构建方法如下：OsGTγ-1部分cDNA序列(对应除去3′-末端5个氨基酸和终止密码子的编码区序列)通过引物5′-CTAGGTACCGAGCTTCTCTTTGGAATTTGTG-3′(序列特异引物外加接头KpnI位点)和5′-TAACCCGGGCTTTGGTTTGATACCCATCTC-3′(序列特异引物外加接头SmnaI位点)进行PCR扩增，产物对应本发明中SEQ ID NO：1显示序列的391-1850bp。以日本水稻全长数据库Knowledge-based OryzaMolecular biological Encyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中该基因对应的cDNA克隆J013022H04(登录号：AK065397)质粒为模板扩增获得目的片段。PCR反应体系为：质粒DNA模板0.3μl(约100ng)，10mM引物各1μl，1×rTaq聚合酶反应缓冲液(购自TaKaRa公司)，25mM MgCl₂ 5μl，10mM dNTP 1μl，rTaq聚合酶(5U/μl)(购自TaKaRa公司)0.25μl，加ddH2O至50μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃40sec，50℃40sec，72℃2min，32个循环；72℃延伸10min。通过KpnI和SmaI将OsGTγ-1的上述cDNA序列酶切纯化后连接到常用于植物蛋白亚细胞定位的载体pU1391cGFP(由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室已毕业的代明球博士改造，载体图见图7)中的GFP报告基因前面，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将以上载体(pU1391cGFP-OsGTγ-1)导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6：271-282，1994)基础上改良进行(如下述具体步骤)。

具体遗传转化步骤如下：

(1)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(2)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。

(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。

(6)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(7)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26℃。

(8)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃) 28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄) 4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

甘氨酸(Glycine) 0.2g

肌醇(Inositol) 10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃) 16.5g

硝酸钾 19.0g

磷酸二氢钾 1.7g

硫酸镁 3.7g

氯化钙 4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾 0.083g

硼酸 0.62g

硫酸锰 0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：均为1mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)愈伤组织诱导培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.5ml

脯氨酸(Proline) 0.3g

CH 0.6g

蔗糖(Sucrose) 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

2，4-D贮存液 2.0ml

脯氨酸 0.5g

CH 0.6g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

3)预培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.15g

蔗糖 5g

琼脂粉(Agarose) 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热熔解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X) 12.5ml

N6mix母液(100X) 1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.75ml

CH 0.2g

蔗糖 5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热熔解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X) 5ml

N6mix母液(100X) 0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 0.5ml

维生素贮存液(100X) 1ml

2，4-D贮存液 0.2ml

CH 0.08g

蔗糖 2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

2，4-D贮存液 0.625ml

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前熔解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X) 25ml

N6mix母液(100X) 2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X) 2.5ml

6-BA贮存液 0.5ml

KT贮存液 0.5ml

NAA贮存液 50μl

IAA贮存液 50μl

CH 0.15g

蔗糖 7.5g

琼脂粉 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前熔解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X) 100ml

N6mix母液(100X) 10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X) 10ml

6-BA贮存液 2ml

KT贮存液 2ml

NAA贮存液 0.2ml

IAA贮存液 0.2ml

CH 1g

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X) 50ml

MSmix母液(100X) 5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X) 5ml

蔗糖 30g

Phytagel 3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基

LB(pH 7.0)1L

Tryptone 10g

Yeast extracts 5g

NaCl 10g

琼脂粉 15g

加蒸馏水定容至1000ml，封口灭菌。使用前熔解培养基，加入相应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

实施例4：鉴定OSGTγ-1水稻T-DNA插入突变体

为研究OsGTγ-1的功能，用该基因的基因组序列(包含其启动子区1000bp)在华中农业大学室作物遗传改良国家重点实验室的水稻突变体数据库(http://rmd.ncpgr.cn/，一个向国内外公开开放的公共数据库，数据库所涉及的水稻突变体材料公众可以向持有人中国湖北省武汉市的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室免费索取)中进行BLAST检索，发现了一个水稻T-DNA插入突变体(03Z11BT07)。本发明所涉及的序列来源于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http://www.tigr.org)，KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 5”为准。

根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物F和R，及T-DNA上设计一条引物VP，如图4a，F表示在插入位点上游设计的引物，R表示在插入位点下游设计的引物，VP表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T₁代植株中，T-DNA纯合植株只有R和VP配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入F与R配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有F和R配对可以得到产物，杂合植株则R和VP配对以及F和R配对时都可以扩增得到产物。根据插入位点设计的引物序列为F(引物)：5′-GGCACGTCATGGTTGGTAC-3′，R(引物)：5′-AACAAAAGCGGCGGTAATG-3′，VP(引物)：5′-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3′。PCR反应体系为：水稻突变体小样DNA模板0.5μl(约50ng)，10mM引物各0.2μl，1×rTaq聚合酶反应缓冲液，25mM MgCl₂ 2μl，10mM dNTP 0.2μl，rTaq聚合酶(5U/μl)0.1μl，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃3min；94℃40sec，55℃40sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR结果如图4b所示，其中泳道3，4，13，15，18为T-DNA纯合；1，2，5，6，7，9，10，11，12，14，16，17为T-DNA杂合；8，9为T-DNA阴性。结果表明T-DNA(左边界)插入在OsGTγ-1基因的启动子区(离转录起始位点约500bp)。

选取5个已鉴定基因型的纯合突变体家系和野生型家系进行高盐胁迫实验。利用Real-time PCR的方法检测正常条件下和高盐胁迫条件下纯合突变体家系和野生型家系中OSGTγ-1基因的表达量，结果表明OSGTγ-1基因在纯合突变体中的表达均受到抑制(如图4c所示)。高盐胁迫实验具体步骤如下：将纯合突变体家系和野生型家系种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞处理10min，无菌水清洗5次)，在MS培养基上发芽，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子分别转移到含有0mmol/L和150mmol/L的NaCl的MS培养基上，在光照培养室生长7-8天后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不少于15棵植株，实验设置3次重复。结果表明：纯合突变体植株在正常条件下的生长与对照没有明显差异，但纯合突变体植株在高盐胁迫处理条件下的生长显著(t测验P＜0.05)劣于对照，说明抑制OSGTγ-1基因的表达会使植株对高盐胁迫的敏感性增强(见图4)。该实验设置的3次生物学重复结果一致，说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T₂代。将T₁代收获的种子播种得到T₂代纯合，杂合和野生型种子。同样进行上述胁迫实验，结果一致。

实施例5：OSGTγ-1基因超量表达载体的构建、转化及转基因植株耐盐性型鉴定

为了更好地阐明OSGTγ-1基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，由转基因植株的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建方法如下：首先通过查找日本水稻全长数据库Knowledge-based Oryza Molecularbiological Encyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J013022H04(登录号：AK065397)，并购买其全长cDNA。以该全长cDNA为模板，用引物OE07F(5′-GTTGGTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3′，序列特异引物外加接头KpnI位点)和OE07R(5′-GAACTGCAGTGACCGATTGCAGTTAG-3′，序列特异引物外外加接头PstI)扩增出包含OSGTγ-1全长的DNA片段。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃40sec，50℃40sec，72℃2min，32个循环；72℃延伸10min。将该扩增片段亚克隆到

载体(购于Promega公司)上，筛选阳性克隆并进行测序验证，再用引物ALLF(5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CACTAT AGG G)和ALLR(5’-GGG GAC CAC TIT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TATAG)从带有该片段的

载体上扩增出一条可供重组到pCB2004H载体上的片段，PCR条件同上。按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行重组反应后转化大肠杆菌DH10β(大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。pCB2004H是已公开发表的用于超量表达载体构建的载体(Hou等，A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cellviability and stress tolerance，Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：6410-6415)(载体图见图6)。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将上述超量表达载体(pCB2004H-OSGTγ-1)导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移栽，得到转基因植株。具体遗传转化步骤同实施例3中所述。

本实施例利用Real-time PCR的方法鉴定T₀代转基因植株中OSGTγ-1基因的表达量，选取了5个OSGTγ-1超量表达T₂家系(如图5b所示)进行高盐胁迫实验。具体步骤如下：将超量表达转基因家系和野生型家系种子去壳消毒(75％酒精处理3min，0.15％氯化汞处理10min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，野生型对照家系晚一天播于不含潮霉素的MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子分别转移到含有0mmol/L和150mmol/L的NaCl的MS培养基上，在光照培养室生长7-8天后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不少于15棵植株，实验设置3次重复。结果表明：在正常条件下OSGTγ-1超量表达转基因植株的生长与对照没有明显差异，但在高盐胁迫处理下生长要显著(t测验P＜0.01)优于对照(图5)，说明本发明的OsGTγ-1基因的表达可以缓解高盐胁迫造成的植株生长受阻，增强转基因植物对高盐胁迫的耐受性(如图5)。

序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐盐性中的应用

<130>

<141>2009-12-15

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1998

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1998)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(475)..(1707)

<223>

<400>1

gattcttcct ttctctgtgt ttgtttgttt ccagttgcca ctaaccagcc agagccccgg 60

gggggagaag agcgagagag gaggagaaat cttgcagcaa tccctcgctt agattcgcca 120

ttaccgccgc ttttgttccc accaagatta ccaccccctc ctcctcctgt gctcgagcgc 180

tcgcatcgca tttcaggctg cttcttgatt ctgcgaggag gttgaaatct ctcgtgattg 240

caacagctgc catccgttcg ttccggtgga gtgcacccct tcatcaccaa ggaggagaaa 300

aagctgtaat cttcggccgt ttctgccttt ctgcagcaaa cggttgaaga aaagccgcgt 360

cttttgggcg gatttcgcgg aggccgcttg aggtttttag gcgtggttcg tgtgagcttc 420

tctttggaat ttgtggggga aagagtgagg gagggaggga gctcagtggg agag atg 477

Met

1

gag ggg aat ttg ccg ccg aga gga gcc ctt gtc cat ggc cat ggc ggc 525

Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly Gly

5 10 15

ggc gtc ggc gcc ttc gat ctg gag gcg acg atg cag ccg ccg ccg ccg 573

Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro Pro

20 25 30

ttc cac ttc gcc cag gat ccg cac ctc cac cac cac cag ggc atg gtc 621

Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met Val

35 40 45

ccc gtc cgc ggg aac ccg atg ctg gat ttg ggc aat gtg gtc aag acc 669

Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys Thr

50 55 60 65

tcg ccg agc gac gag gag gac gtg gat gac ggc cac cac cat ggt ggc 717

Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly Gly

70 75 80

ggc ggc ggc agc ggt aag gag gcc tcc cag tgg cac cgg gtg aag tgg 765

Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys Trp

85 90 95

atc agt ggc atg gtc aag ctg ctg gtg tcc gcc gtg gcc tac atc gac 813

Ile Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr Ile Asp

100 105 110

gag gac gtc gac atg gac tac ggc acg ggc agc gcc gcg agg agg aag 861

Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg Lys

115 120 125

cac gcc atg ctg aag agg aag ggg aag tgg agg ctc gtc tcc gcg gcg 909

His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala Ala

130 135 140 145

atg acc gag agg ggc ttc ccg gtg tcg ccg cag cag tgc gag gac aag 957

Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp Lys

150 155 160

ttc aac gat ctc aac aag agg tac aag agg atg acc gag atc ctt ggc 1005

Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu Ile Leu Gly

165 170 175

cgg gga acg gcg tgc cag gtc gtc gag cac ccc gag ctt ctt gag ggg 1053

Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu Gly

180 185 190

atg cgg ctc tcg gga aag ctc aaa gag gag gct agg aag cac ctg aac 1101

Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu Asn

195 200 205

tca aag cat ctg cac tat gag gag atg tgc tcg tac cat aac agg aac 1149

Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg Asn

210 215 220 225

aaa atg tgt ctg ttt gat gat ccc gcc ctt cag aag tca ttg cgt ttg 1197

Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg Leu

230 235 240

gcg ctt agg agt gga gag gag cgt gca aag aag aac ccg ttt ggg tat 1245

Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly Tyr

245 250 255

gat gat gag gat ttt tct gac gat gac gac gaa gat gaa gaa ttc gat 1293

Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe Asp

260 265 270

gat ctg gag gtc agc gct gaa gat cat cac cat gga att cat ggt gcc 1341

Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly Ile His Gly Ala

275 280 285

aag agg ctg aag cat gat cag gag gag acg cat ttt ggg tct aat ctg 1389

Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn Leu

290 295 300 305

tca gaa gtt gct gtt att gac atg aac aaa atg ctc tct gag gga tct 1437

Ser Glu Val Ala Val Ile Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly Ser

310 315 320

ggt ggt cca act gct gaa aag agt ccc tct acc cct ggt atg cgt gat 1485

Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg Asp

325 330 335

att cga ctt gaa aaa cgc cgc ctg aag atc aaa gct cag atg ctg aaa 1533

Ile Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys Ile Lys Ala Gln Met Leu Lys

340 345 350

att gag cag aag cat ttc aag tgg ctg agg ttc agc aag gag aag gac 1581

Ile Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys Asp

355 360 365

agg gaa ttg gag aag atg aga ctg gag aat gaa aag atg aaa ctg gag 1629

Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu Glu

370 375 380 385

aat gag cgg ttg gaa ttg gag ctg aag ctt aaa gaa ata gag atg ggt 1677

Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu Ile Glu Met Gly

390 395 400

atc aaa cca aag aag att ttt agt gat tga agccttggaa tgatagaact 1727

Ile Lys Pro Lys Lys Ile Phe Ser Asp

405 410

agaaatggtt agagttgctg gtgatccttt tgtcttttgc aggagcttgc agatttaggg 1787

tcttatatat acattgatct gtgcccctgt ttgaatttta ccttagctaa ctgcaatcgg 1847

tcaagtgaat ggctattcca gttgttaagt gtttaaactt ggtactagtt ggcctttcaa 1907

atgataaatg tttaagccgt ccttgtacat gcctgctgtt aactttctgc agttgtttgt 1967

gtgttgctat tgacctctga gtcttttttt t 1998

<210>2

<211>410

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly

1 5 10 15

Gly Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro

20 25 30

Pro Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met

35 40 45

Val Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys

50 55 60

Thr Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys

85 90 95

Trp Ile Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr Ile

100 105 110

Asp Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg

115 120 125

Lys His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala

130 135 140

Ala Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp

145 150 155 160

Lys Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu Ile Leu

165 170 175

Gly Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu

180 185 190

Gly Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu

195 200 205

Asn Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg

210 215 220

Asn Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg

225 230 235 240

Leu Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly

245 250 255

Tyr Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe

260 265 270

Asp Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly Ile His Gly

275 280 285

Ala Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn

290 295 300

Leu Ser Glu Val Ala Val Ile Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly

305 310 315 320

Ser Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg

325 330 335

Asp Ile Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys Ile Lys Ala Gln Met Leu

340 345 350

Lys Ile Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys

355 360 365

Asp Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu

370 375 380

Glu Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu Ile Glu Met

385 390 395 400

Gly Ile Lys Pro Lys Lys Ile Phe Ser Asp

405 410

Claims

1.一种能够提高盐胁迫耐受能力的OsGTγ-1基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1中第475-1707位所示。