CN101812429B

CN101812429B - 小鼠心肌祖细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN101812429B
Application number: CN 200910191280
Authority: CN
Inventors: 朱高慧; 陈沅; 何通川
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: CN101812429A

Abstract

本发明公开了一种小鼠心肌祖细胞及其制备方法，该心肌祖细胞表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Tbx5；其制备方法是先分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞，使其感染永生化质粒SSR#69而永生化，通过抗生素筛选法和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌细胞，再从中筛选出表达ISL1和Tbx5的心肌细胞，即得；该心肌祖细胞为可回复性永生化细胞，既能无限增殖，又无致瘤和引起病毒感染的危险，是研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损情况下增殖和分化因素的理想工具，有着良好的应用前景。

Description

小鼠心肌祖细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种祖细胞，特别涉及一种小鼠心肌祖细胞(cardiac progenitor cell，CP)，还涉及该心肌祖细胞的制备方法。

背景技术

对心脏疾病进行有效治疗以降低死亡率是当今医学的重大难题之一。心肌再生能力有限，一旦受到损伤，就会不可避免的出现功能性心肌细胞的死亡或凋亡，影响心脏的正常功能，最终导致慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)。使用传统药物疗法包括β-受体阻断剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、醛甾酮拮抗剂和利尿剂等，虽然可以从一定程度上保护心肌，延缓心脏疾病的进程，却无法使功能性心肌细胞再生，难以从根本上逆转CHF的发展进程，心梗后心力衰竭患者的死亡率仍在8～10％之间，再住院率在6～8％之间。而心脏移植术也因供体受限，加之免疫排斥等原因，很难在临床上大规模推广。

现今让心脏科医生和心力衰竭患者看到曙光的是近年来兴起的有关利用细胞移植再生修复受损心肌的研究，其在理论上具有诱人前景，而它的可行性及效果也已被某些动物实验所证实。近十余年，国内外学者在筛选细胞移植的种子细胞方面做了大量的研究工作，筛选出两类种子细胞：成体细胞和干细胞。但同时发现，用骨髓和胚胎来源的干细胞移植治疗心肌梗死尚存在不足，如直接心肌内注射移植干细胞后，由于移植成分复杂，在心肌微环境的诱导下干细胞依然表现出向心肌样细胞和肿瘤细胞等分化的多向性，并由此带来一系列的移植并发症，如微梗死、心律失常、钙化和肿瘤等，其原因可能在于心肌损伤后的心肌微环境和胚胎发育过程中的心肌微环境及相关调控基因不尽相同，这些原始状态的干细胞在成熟心肌损伤的微环境中不能被正常调控；而经血管移植干细胞后，通过细胞的归巢现象发现只有极少数的细胞停留在心脏，对心功能改善甚微。因此，我们需要动员心脏本身存在的心肌祖细胞来代偿受损心肌功能。但是如何才能有效动员呢？其动员的机制是什么呢？为了解决这一问题，并最终实现在实验动物和临床上的应用，我们必须首先得到这些心肌祖细胞，研究其特性，然后才能进一步分析影响其增殖和分化的因素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种来源于心脏组织的小鼠心肌祖细胞，为研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损情况下增殖和分化的因素提供理想的工具；目的之二在于提供所述小鼠心肌祖细胞的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、小鼠心肌祖细胞，其表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Tbx5。

进一步，所述心肌祖细胞还表达心肌细胞系早期标志物Nkx2.5；

进一步，所述心肌祖细胞还表达干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2；

进一步，所述心肌祖细胞还表达心肌祖细胞标志物Sca-1和c-kit；

进一步，所述心肌祖细胞经诱导分化后表达α-MyHC；

进一步，所述心肌祖细胞在诱导分化过程中，心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Nkx2.5和Tbx5表达呈下降趋势，心肌细胞结构蛋白标志物α-MyHC、α-actin和cTnT表达呈上升趋势，骨骼肌标志物MyoD和平滑肌标志物SM-MHC不表达；

进一步，所述心肌祖细胞为可回复性永生化细胞；

进一步，所述心肌祖细胞来源于胚胎心脏组织。

2、所述小鼠心肌祖细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞；

b、将步骤a所得心肌细胞感染永生化质粒SSR#69而永生化，通过抗生素筛选法和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌细胞；

c、从步骤b所得永生化的单克隆心肌细胞中筛选出表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Nkx2.5和Tbx5的心肌细胞，即得小鼠心肌祖细胞。

本发明的有益效果在于：小鼠与人在基因上有高达90％的同源性且两者心血管系统极为相似，本发明选用小鼠心脏及心肌细胞为研究对象，建立了一种来源于心脏组织的心肌祖细胞，该心肌祖细胞为可回复性永生化细胞，在敲除永生化基因后可以回复到永生化前的原代细胞状态，从而使细胞既能无限增殖，又无致瘤和引起病毒感染的危险，是研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损情况下增殖和分化因素的理想工具，有着良好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为体外培养心肌细胞的形态(放大200倍)；

图2为永生化心肌细胞的单克隆生长情况(放大300倍)；

图3为RT-PCR检测心脏特异性基因在心脏发育过程中的表达时序(琼脂糖凝胶电泳图)；

图4为RT-PCR检测心脏特异性基因在心脏发育过程中的表达时序(目的基因相对表达量统计图)；

图5为RT-PCR筛选心肌祖细胞(琼脂糖凝胶电泳图)；1～5、5A和6～19分别为永生化心肌细胞克隆CP15-1～5、CP15-5A和CP15-6～19，H9为H9C2，P19为P19CL6；

图6为RT-PCR筛选心肌祖细胞(目的基因相对表达量统计图)；1～5、5A和6～19分别为永生化心肌细胞克隆CP15-1～5、CP15-5A和CP15-6～19；

图7为全反式维甲酸(ATRA)诱导MyHC-GLuc活性筛选心肌祖细胞；*表示P＜0.05；

图8为RT-PCR和ATRA诱导MyHC-GLuc活性筛选心肌祖细胞(灰阶图)；

图9为免疫荧光检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况(放大200倍)；

图10为Western Blot检测心肌祖细胞中SV40T的表达；

图11为心肌祖细胞生长曲线；

图12为地塞米松(Dex)诱导分化心肌祖细胞的MyHC-GLuc活性；*表示P＜0.05；

图13为心肌祖细胞的病毒感染情况；

图14为心肌祖细胞分别感染AdRFP和AdR-cre后在裸鼠体内的荧光素酶成像；

图15为心肌祖细胞分别感染AdRFP和AdR-cre后在裸鼠体内的荧光素酶成像(平均信号强度统计图)；

图16为Dex诱导心肌祖细胞分化(放大200倍)；

图17为实时定量PCR检测Dex诱导分化心肌祖细胞的心肌发育相关基因的表达；

图18为免疫荧光检测Dex诱导分化心肌祖细胞的cTnT表达。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

优选实施例中使用的主要实验材料：

(1)动物：孕15.5天的健康CD1小鼠和6～8周龄的健康免疫缺陷BALB/c裸鼠，SPF级，由美国芝加哥大学动物中心提供，喂养于严格消毒的无菌层流动物房内，环境温度维持在25℃，空气湿度为60％～70％，饲料和水经消毒后自由进食。

(2)细菌和细胞株：大肠杆菌DH10B购自美国invitrogen公司。鼠畸胎瘤细胞株P19CL6和鼠心肌细胞株H9C2购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)，鼠成肌细胞株C2C12、人胚胎肾细胞株HEK293和人结肠癌细胞株HCT116由芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室提供。

(3)质粒：永生化质粒SSR#69和质粒pAmpho由芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室提供。携带启动子基因α-MyHC(肌球蛋白重链α)和报告基因GLuc(分泌型荧光素酶)的启动子质粒MyHC-GLuc由发明人在前期工作中构建(Gao-Hui Zhu.Differentiation.2009 Jun26.PMID：19560855)，方法如下：根据基因序列数据库(GenBank)上登录的α-MyHC基因序列(登录号为NM_001091601)设计如下引物扩增α-MyHC基因第四个外显子上游5.5kb的片段，引物序列如下：F：aggggatcctgcaaggtcacacaagag(下划线部分为BamHI酶切位点)，R：ccgctcgag gtcactcaaactcttatgggggag(下划线部分为XhoI酶切位点)；以含有α-MyHC基因的质粒为模板进行PCR，PCR反应条件为：96℃预变性45秒，再92℃变性20秒、55℃退火30秒、70℃延伸45秒，共28个循环，最后70℃延伸5分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化，用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，再与经同样双酶切的质粒pBGLuc(由芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室提供)在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物电转化入感受态大肠细菌DH10B，转化产物用含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，通过菌落PCR、限制性内切酶酶切和DNA序列测定对阳性克隆进行鉴定，即得启动子质粒MyHC-GLuc。将该质粒和肌细胞分化无关对照质粒TOP-Luc分别转染C2C12细胞，用含有质量分数为2％的马血清的DMEM诱导培养基或用Dex作为诱导剂进行诱导培养，通过GLuc读数，发现该质粒具有肌肉特异性，且其活性在肌细胞分化过程中能够被有效激活，当细胞分化过程中表达α-MyHC，它就会启动报告基因GLuc的表达，因此可以通过测定细胞培养上清液中GLuc的表达量来衡量细胞中α-MyHC的表达情况，进一步来说明细胞分化的动态过程。

(4)腺病毒：携带红色荧光蛋白(RFP)基因的重组腺病毒AdRFP和携带重组酶Cre基因的重组腺病毒AdR-cre由芝加哥大学医学中心分子肿瘤研究室提供。

(5)试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、抗生素(青霉素、氨苄青霉素、链霉素和潮霉素)、RNA提取试剂Trizol、随机六聚引物Hexamer、Superscrip逆转录酶、RNA酶抑制剂RNasin、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、DNA分子量标准、脂质体转染试剂Lipofactamine和Western Blot相关试剂购自美国invitrogen公司，胎牛血清(FBS)和超纯水购自美国Gibico公司，PCR引物由美国IDT公司合成，dNTP、Taq DNA聚合酶、二甲基亚砜(DMSO)、Realtime PCR试剂盒、Gluc检测试剂盒购自美国NEB公司，琼脂糖、溴化乙啶(EB)和聚凝胺(Polybrene)购自美国Sigma公司，胶回收纯化柱购自美国Millipore公司，细胞裂解缓冲液和质粒小量抽提试剂盒购自美国Promega公司，免疫荧光抗体购自英国Abcam公司，亲和素(Avdin)/生物素(Biotin)封闭试剂盒购自美国VECTOR公司。浓度为0.1mol/L、pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)自配：称取NaCl 9.0g、Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g和NaH₂PO₄·2H₂O0.4g，用双蒸水使完全溶解后，调节pH至7.2～7.4，再用双蒸水定容至1000ml，分装，1.05kPa高压灭菌20min，4℃保存备用。

(6)仪器：CO₂培养箱(Thermo Forma 3110型)和超净工作台购自美国Thermo FisherScientific公司，倒置显微镜和凝胶成像仪购自日本奥林巴斯公司，荧光倒置显微镜购自日本Nikon公司，PCR仪(Gene Cycler^TM)购自美国Bio-Rad公司，分光光度计、化学发光和荧光测定仪购自美国Beckman公司。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、心肌细胞的分离培养

将孕15.5天的健康CD1小鼠CO₂吸入处死后，取出小鼠胚胎心脏，置盛有25ml预冷至4℃的PBS的细胞培养皿中，切碎并反复吹打，加入2ml质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液，37℃消化5分钟，静置后转移上清液至经质量分数为1％的胶原溶液包被过夜并盛有15mlDMEM完全培养基的细胞培养皿中，剩余心脏组织再加入2ml质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液，37℃消化5分钟，静置后转移上清液至同一细胞培养皿中，在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养1小时，再将细胞培养液转移至另一经质量分数为1％的胶原溶液包被过夜的细胞培养皿中继续培养，24小时后更换新鲜的DMEM完全培养基，去除悬浮的血细胞。

体外培养心肌细胞的形态如图1所示，心肌细胞呈成纤维样形态，且细胞不断增殖，可见细胞单个或成团搏动。

2、心肌细胞永生化

将2.0μg SSR#69、1.0μg pAmpho、15μl Lipofectamine和250μl DMEM空白培养基混匀，室温下静置30分钟，制得转染混合物；将HEK293以60％的密度接种到细胞培养瓶中，用DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后，吸除培养基，用3ml DMEM空白培养基洗涤1次，加入2.5ml DMEM空白培养基，孵育5～10分钟，再加入上述转染混合物，孵育4小时后更换新鲜的DMEM完全培养基，第36小时吸出培养基，用孔径为0.2μm的滤器过滤，滤液再转移至心肌细胞培养瓶中转染心肌细胞，12小时后更换新鲜的DMEM完全培养基，24小时后加入0.1mg/ml的潮霉素溶液筛选永生化心肌细胞，筛选时间为2周。

3、永生化心肌细胞单克隆

应用无限稀释法，将筛选出的永生化心肌细胞接种到96孔板，至96孔板中1/3的孔每孔只含1个细胞时停止稀释，用含有0.1mg/ml的潮霉素的DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下继续筛选培养，待细胞生长基本达到1/3孔面积时，用胰蛋白酶消化，依次传代到24孔板、6孔板、25ml的细胞培养瓶和100mm的细胞培养皿，最后冻存备用，在冻存前均使用含有0.1mg/ml的潮霉素的DMEM完全培养基进行筛选培养，共得到20个永生化心肌细胞克隆，分别命名为CP15-1～5、CP15-5A和CP15-6～19。

永生化心肌细胞的单克隆生长情况如图2所示，接种后第3天可见单个细胞生长，第5天可见细胞分裂形成2～3个细胞，第10天时出现1个小的细胞克隆团，第15天时细胞克隆团基本达到1/3孔面积。

4、RT-PCR筛选心肌祖细胞

由于文献报道的心肌祖细胞的分离鉴定方法与标志物各有不同，因此，首先分别提取胚胎13.5天(E13.5)和18.5天(E18.5)，出生后1天(D1)、3天(D3)、7天(D7)和14天(D14)，以及出生后8周(adult)的健康CD1小鼠心脏组织总RNA，采用RT-PCR检测心脏特异性基因在心脏发育过程中的表达时序，以鉴定心肌细胞的早期和晚期标志物。

具体方法如下：取50mg冻存的心脏组织，加入1ml Trizol，充分匀浆后，加入360μl氯仿，充分震荡后，14000rpm低温离心20分钟，取上清液，加入670μl异丙醇和5μl糖原(Gly)，充分震荡后，14000rpm低温离心15分钟，弃上清液，加入600μl质量分数为70％的乙醇溶液，充分震荡后，14000rpm低温离心5分钟，弃上清液，晾干，加入50μl去内毒素的双蒸水使溶解，得心脏组织总RNA溶液，-80℃保存备用。根据GenBank上登录的小鼠心脏特异性基因的序列设计PCR引物(引物序列见表1)。RT反应方法为：将0.5μg/μl的Hexamer溶液2μl与心脏组织总RNA溶液10μl混匀，70℃反应5分钟，制得Hexamer-RNA混合物；在冰上将5×缓冲液2μl、0.1mol/L的二硫苏糖醇溶液2μl、10mmol/L的dNTPs溶液1μl、RNasin 0.2μl和双蒸水1.6μl混合，制得RT反应混合物；将Hexamer-RNA混合物、RT反应混合物和逆转录酶0.25μl混合，37℃反应60分钟，95℃反应1分钟，将RNA逆转录为cDNA，再用双蒸水稀释至总体积为100μl，-20℃保存备用。PCR反应体系为：将10×缓冲液2.0μl、10mmol/L的dNTPs溶液2.4μl、DMSO 1.2μl，330ng/μl的引物F/R溶液各0.4μl、cDNA模板(RT反应产物)10μl、Taq DNA聚合酶0.2μl和双蒸水3.5μl混合，总体积为20μl；反应条件为：95℃预变性2分钟；再92℃变性20秒、68℃退火40秒、72℃延伸30秒，共12个循环，每循环1次退火温度降低1℃；再92℃变性20秒、56℃退火40秒、72℃延伸30秒，共21～32个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像保存，Bio-Rad图像分析系统测定各DNA条带的光密度(OD)值，并将结果以GAPDH基因为内参进行校正，目的基因相对表达量＝目的基因OD值/GAPDH基因OD值。

表1小鼠心脏特异性基因的PCR引物

RT-PCR检测心脏特异性基因在心脏发育过程中的表达时序如图3～4所示，可见ISL1特异地表达在心肌细胞E13.5的早期阶段，E18.5时已经几乎检测不到；c-kit在E13.5到成体心脏的发育过程中，表达量逐渐降低，而Sca-1的表达趋势与c-kit相反，呈逐渐升高的趋势；心肌系早期表达基因Nkx2.5随心脏的发育成熟而逐渐降低，间隙连接蛋白Cx43无明显变化趋势，晚期结构蛋白α-MyHC、α-actin和cTnT则随心脏发育成熟而逐渐增加。

根据上述检测结果并结合文献报道，选取特异性较高的祖细胞标志物ISL1、心肌细胞系标志物Nkx2.5和Tbx5作为筛选心肌祖细胞的主要指标；干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2用于检测所分离的细胞是否具有干细胞自我更新的标志基因；其他的祖细胞标志物和心肌细胞系标志物用于辅助衡量细胞所处的心肌细胞发育阶段。根据上述指标，采用RT-PCR从20个永生化心肌细胞克隆中筛选心肌祖细胞，并以文献报道常用于研究心肌细胞发育的P19CL6和H9C2作为对照。RT-PCR的具体方法同上，PCR引物序列见表2。

表2心脏发育不同阶段的心肌细胞标志物基因的PCR引物

RT-PCR筛选心肌祖细胞如图5～6和图8所示，干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2在20个永生化心肌细胞克隆和P19CL6中基本上都表达，但在H9C2中不表达(图5A)；特异性心肌祖细胞标志物ISL1在CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15-13、CP15-18和P19CL6中都表达，特别是在CP15-9中高表达，非特异性心肌祖细胞标志物Sca1和c-kit也在大多数永生化心肌细胞克隆中表达，但ISL1、Sca1和c-kit在H9C2中依旧不表达(图5B)；心肌细胞系早期标志物Nkx2.5、GATA4、Tbx5、Hand2和Flk-1在CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15-13、CP15-18和P19CL6中均有不同程度的表达，其中Tbx5表达量较高且差异较明显，但H9C2中仅表达特异性相对较低的Hand2，其他标志物几乎无表达(图5C)；心肌细胞结构蛋白标志物α-MyHC、Actc1、cTnI和ANF在20个永生化心肌细胞克隆和P19CL6中表达量相对较低且无明显差异，而cTnI在H9C2中高表达(图5D)。

5、ATRA诱导MyHC-GLuc活性筛选心肌祖细胞

肌球蛋白(MyHC)是肌肉收缩单位的重要结构组成部分，其中α-MyHC的存在和表达有组织特异性，因此，α-MyHC的存在对肌肉细胞分化过程有重要提示意义。

将2μg MyHC-GLuc、15μl Lipofactamine和500μl DMEM空白培养基混匀，室温下放置10～30分钟，制得转染混合物；分别将处于指数生长期的20个永生化心肌细胞克隆以60～80％的密度接种到细胞培养瓶中，用DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后，吸除培养基，用3.0ml DMEM空白培养基洗涤1次，加入2.5ml DMEM完全培养基，孵育10分钟，再加入上述转染混合物，孵育4小时后更换为DMEM完全培养基，12小时后加入终浓度为0.5μmol/L的ATRA溶液诱导分化，激活MyHC-GLuc活性，分别于诱导后第3、6、12和18天吸取20μl细胞培养上清液，用GLuc检测试剂盒检测GLuc的表达量，按照试剂盒说明书操作。

ATRA诱导MyHC-GLuc活性筛选心肌祖细胞如图7～8所示(图7只列出了经RT-PCR检测为ISL1/Tbx5双阳性克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15-13和CP15-18以及3个ISL1/Tbx5双阴性克隆CP15-2、CP15-3和CP15-19的数据)，可见ATRA能够有效地诱导ISL1/Tbx5双阳性克隆的MyHC-GLuc活性，特别是在第18天时(p＜0.05)。

6、免疫荧光检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况

为了进一步验证RT-PCR结果，采用免疫荧光法检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15-13和CP15-18中的表达情况，同时以2个ISL1/Tbx5双阴性克隆CP15-12和CP15-17作为对照。

具体方法如下：将处于指数生长期的永生化心肌细胞克隆以60～80％的密度接种到培养腔室玻片系统中，用DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后，吸除培养基，取腔室玻片，用PBS洗涤1次，冷丙酮固定10分钟，室温下干燥10分钟，PBS洗涤1次，用体积分数为5％与二抗同属源的血清封闭20分钟，PBS洗涤1次，加入抗ISL1单克隆抗体或抗c-kit单克隆抗体(稀释度为1∶200)，同时设一抗对照组(加入同种IgG亚型的单克隆抗体)，室温下孵育60分钟或4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，再加入DyLight 594(绿色荧光)标记的相应二抗(稀释度为1∶200)，室温下孵育30分钟，PBS洗涤3次，封片，置荧光显微镜下观察。

免疫荧光检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况如图9所示，ISL1在CP15-9中表达最强而在CP15-13中表达较弱，一抗对照组几乎没有表达，对照组表达较弱(图9A)；c-kit除了在一抗对照组中几乎没有表达外，在其余各组中均有表达，尤其在CP15-9和CP15-13中表达较强(图9B)；与RT-PCR结果一致。

综合上述RT-PCR结果、ATRA诱导MyHC-GLuc活性结果和免疫荧光结果，筛选出4个具有心肌祖细胞特性的克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18。

7、Western Blot检测心肌祖细胞的可复性

SSR#69结构中含有SV40T永生化基因，并且在SV40T基因前后分别加入了重组酶Cre的作用靶点LoxP，当有Cre存在时，SV40T基因可以被Cre作用于2个LoxP位点而切除，从而使永生化细胞回复到正常生长状态。

将CP15-9和CP15-10分别感染AdR-Cre，48小时后收集细胞裂解总蛋白，用Western Blot检测SV40T的表达，观察心肌祖细胞的可复性。具体方法如下：将总蛋白与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，水浴煮沸10分钟，上样进行SDS-PAGE，电泳结束后，将蛋白质电转移至PVDF膜上，用质量分数为1％的脱脂奶粉溶液室温下封闭1～2小时，再加入抗SV40T单克隆抗体(用含有质量分数为1％的脱脂奶粉的TBST进行稀释，稀释度为1∶500)，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，显色，凝胶成像仪成像保存，并将结果以β-actin为内参进行校正。

Western Blot检测心肌祖细胞中SV40T的表达如图10所示，可见Cre能够有效去除SV40T基因，减少其在心肌祖细胞中的表达，从而使心肌祖细胞恢复到永生化前的状态。

8、永生化基因对心肌祖细胞增殖和分化的影响

将CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分别感染AdRFP和AdR-Cre，于感染后第1、2、3、4、5和6天进行细胞计数，观察SV40T基因的存在对心肌祖细胞增殖的影响。心肌祖细胞生长曲线如图11所示，可见Ad-RFP组和AdR-Cre组的生长趋势一致，但Ad-Cre组的细胞增殖较慢，表明SV40T基因的存在可以提高心肌祖细胞的增殖能力。

将CP15-9转染MyHC-GLuc后，再分别感染Ad-RFP和AdR-Cre，用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，激活MyHC-GLuc活性，于诱导后第3、6、9和12天吸取20μl细胞培养上清液，用GLuc检测试剂盒检测GLuc的表达量，按照试剂盒说明书操作，观察SV40T基因的存在对心肌祖细胞分化的影响。在MyHC-GLuc活性检测时，为了均衡Ad-RFP组与AdR-Cre组的细胞量，应用细胞裂解总蛋白量来标准化GLuc读数。Dex诱导分化心肌祖细胞的MyHC-GLuc活性如图12所示，相对于空白对照组，Dex可以有效诱导分化心肌祖细胞的MyHC-GLuc活性(p＜0.05)，且空白对照组和Dex诱导组中AdR-Cre对MyHC-GLuc活性的影响不大，表明SV40T基因的存在对心肌祖细胞分化的影响较小。

9、心肌祖细胞的致瘤性检测

将质粒pSEB-Luc与pAmpho共转染HEK293，在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养，36小时后开始收集病毒液，每12小时收集1次，共收集3次，每ml病毒液加入6μl2mg/ml的聚凝胺后，分4次感染CP15-9或CP15-10，每次作用4～8小时，每次之间用新鲜的DMEM完全培养基培养8～12小时，最后1次感染后加入2.0μg/ml的灭菌素筛选1周，形成稳定表达荧光素酶的细胞株CP15-9*或CP15-10*，再传代冻存备用；用DMEM完全培养基培养CP15-9*或CP15-10*，待细胞贴壁生长至80％融合时分别感染Ad-RFP和AdR-Cre，12小时后更换新鲜的DMEM完全培养基，第48小时置荧光显微镜下观察，细胞感染率基本在60～80％左右(如图13所示)，用胰蛋白酶消化，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清液，细胞沉淀用含有磷脂酰丝氨酸的PBS洗涤后，重悬于50μl PBS中，置冰上保存备用；将1×10⁶个经上述处理的细胞移植到裸鼠皮下，于移植后第1、3和7天进行荧光素酶成像，并进行信号强度分析。

心肌祖细胞分别感染Ad-RFP和AdR-Cre后在裸鼠体内的荧光素酶成像如图14～15所示，可见移植后随时间延长，Ad-RFP组和AdR-Cre组的荧光素酶信号逐渐减弱并最终消失，AdR-Cre组的信号消失较早，移植的心肌祖细胞在裸鼠体内未形成肿瘤。

10、Dex诱导心肌祖细胞的分化

将CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第14天时置明视野显微镜下观察细胞形态改变，如图16所示，CP15-5A、CP15-9和CP15-10在Dex诱导分化14天后，细胞形态变得宽大，细胞之间排列规则紧密，而CP15-18细胞形态拉长，成束状排列。

11、实时定量PCR检测Dex诱导分化心肌祖细胞的心肌发育相关基因的表达

将CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第7天和第11天时提取细胞总RNA，通过RT得到cDNA，再进行心肌发育相关基因的实时定量PCR检测(引物序列见表3)，并将结果以GAPDH为内参进行校正。

表3心肌发育相关基因的PCR引物

实时定量PCR检测Dex诱导分化心肌祖细胞的心肌发育相关基因的表达如图16所示，总体看来，与空白对照组(未加入Dex)相比，CP15-9和CP15-10在Dex诱导分化过程中，早期基因ISL1、Nkx2.5和Tbx5表达呈下降趋势，晚期基因α-MyHC、α-actin和cTnT表达呈上升趋势，骨骼肌标志基因MyoD和平滑肌标志基因SM-MHC几乎不表达；而在CP15-5A和CP15-18中，无固定变化趋势。

12、免疫荧光检测Dex诱导分化心肌祖细胞的cTnT表达

将CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第14天时固定细胞，采用免疫荧光法检测心肌细胞结构蛋白cTnT的表达。结果如图18所示，可见与空白对照组(未加入Dex)相比，cTnT在Dex诱导分化心肌祖细胞中的表达较强，其中又以CP15-9和CP15-10的表达相对较强，且有形态改变。

总的来说，优选实施例是先分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞，使其感染永生化质粒SSR#69而永生化，通过抗生素筛选和无限稀释法获得永生化的单克隆心肌细胞，再根据心肌细胞发育过程中基因表达时序和ATRA诱导MyHC-GLuc活性，以及免疫荧光法验证，筛选出4个具有心肌祖细胞特性的克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18，在进一步的实时定量PCR和免疫荧光筛选过程中，发现CP15-9和CP15-10在Dex诱导分化过程中，早期基因ISL1、Nkx2.5和Tbx5表达逐渐降低，晚期基因α-MyHC、α-actin和cTnT表达明显升高，而骨骼肌和平滑肌基因几乎不表达，为较优克隆。研究结果还显示，优选实施例筛选出的4个心肌祖细胞单克隆为可回复性永生化细胞，在敲除永生化基因后可以回复到永生化前的原代细胞状态，从而使细胞既能无限增殖，又无致瘤和引起病毒感染的危险，是研究影响心肌祖细胞在成体心肌细胞受损情况下增殖和分化因素的理想工具，有着良好的应用前景。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>重庆医科大学附属儿童医院

<120>小鼠心肌祖细胞及其制备方法

<160>40

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ISL1基因的PCR引物F

<400>1

aaggacaaga aacgcagcat 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ISL1基因的PCR引物R

<400>2

ccatcatgtc tctccggact 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sca-1基因的PCR引物F

<400>3

cctggagccc tctagtgatg 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sca-1基因的PCR引物R

<400>4

gagcagcaat ccacaacaaa 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>c-kit基因的PCR引物F

<400>5

gggctagcca gagacatcag 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>c-kit基因的PCR引物R

<400>6

aggagaagag ctcccagagg 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Nkx2.5基因的PCR引物F

<400>7

gagcctggta gggaaagagc 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Nkx2.5基因的PCR引物R

<400>8

ggtgggtgtg aaatctgagg 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cx43基因的PCR引物F

<400>9

cctcaacatg gcatttcctt 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cx43基因的PCR引物R

<400>10

tccacaccta gagggtcagg 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>α-MyHC基因的PCR引物F

<400>11

gaggaccagg ccaatgagta 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>α-MyHC基因的PCR引物R

<400>12

gctgggtgta ggagagcttg 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>α-actin基因的PCR引物F

<400>13

ctgacagagg caccactgaa 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>α-actin基因的PCR引物R

<400>14

catctccaga gtccagcaca 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cTnT基因的PCR引物F

<400>15

ctgagacaga ggaggccaac 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cTnT基因的PCR引物R

<400>16

accaagttgg gcatgaagag 20

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct3/4基因的PCR引物F

<400>17

ctgggcgttc tctttgga 18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct3/4基因的PCR引物R

<400>18

ggcttcctcc acccactt 18

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Nanog基因的PCR引物F

<400>19

aagtacctca gcctccagca 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Nanog基因的PCR引物R

<400>20

gtgctgagcc cttctgaatc 20

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox2基因的PCR引物F

<400>21

ccggggagat acatgctg 18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox2基因的PCR引物R

<400>22

gaacccgact gggaacct 18

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GATA4基因的PCR引物F

<400>23

tctcccagga acatcaaacc 20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GATA4基因的PCR引物R

<400>24

gtgtgaaggg gtgaaaagga 20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Tbx5基因的PCR引物F

<400>25

cgctgtgact tcgtaccaga 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Tbx5基因的PCR引物R

<400>26

actttgcatc cgagacatcc 20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hand2基因的PCR引物F

<400>27

ctacttccac ggctggctta 20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hand2基因的PCR引物R

<400>28

ccataatggg agtggtccag 20

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Flk-1基因的PCR引物F

<400>29

ggcggtggtg acagtatctt 20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Flk-1基因的PCR引物R

<400>30

gtcactgaca gaggcgatga 20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Actc1基因的PCR引物F

<400>31

ccctggattt tgagaacgag 20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Actc1基因的PCR引物R

<400>32

gagtctctgg acagcggaag 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cTnI基因的PCR引物F

<400>33

ctgcaggaga tgattgacga 20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>cTnI基因的PCR引物R

<400>34

tgtagccatc agcgtttttg 20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ANF基因的PCR引物F

<400>35

gggggtagga ttgacaggat 20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ANF基因的PCR引物R

<400>36

ggatcttttg cgatctgctc 20

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MyoD基因的PCR引物F

<400>37

tggcagcgag cactacag 18

<210>38

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MyoD基因的PCR引物R

<400>38

gcggtgtcgt agccattc 18

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SM-MHC基因的PCR引物F

<400>39

gcagaaggct cagaccaaag 20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SM-MHC基因的PCR引物R

<400>40

tatccagaat gcccaggaag 20

Claims

1.小鼠心肌祖细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、分离培养胚胎15.5天的小鼠心肌细胞；

c、根据心肌细胞发育过程中基因表达时序和ATRA诱导MyHC-GLuc活性，以及免疫荧光法验证，筛选出具有心肌祖细胞特性的克隆，其表达心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Tbx5，还表达心肌细胞系早期标志物Nkx2.5，干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2，以及心肌祖细胞标志物Sca-1和c-kit，并经诱导分化后表达α-MyHC；在进一步的实时定量PCR和免疫荧光筛选过程中，选取在Dex诱导分化过程中心肌祖细胞标志物ISL1及心肌细胞系早期标志物Nkx2.5和Tbx5表达呈下降趋势，心肌细胞结构蛋白标志物α-MyHC、α-actin和cTnT表达呈上升趋势，骨骼肌标志物MyoD和平滑肌标志物SM-MHC几乎不表达的克隆为较优克隆；具体方法如下：

RT-PCR筛选心肌祖细胞：选取祖细胞标志物ISL1、心肌细胞系标志物Nkx2.5和Tbx5作为筛选心肌祖细胞的主要指标，干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox2用于检测所分离的细胞是否具有干细胞自我更新的标志基因，其他的祖细胞标志物和心肌细胞系标志物Sca1、c-kit、GATA4、Hand2、Flk-1、α-MyHC、α-actin、cTnI和ANF用于辅助衡量细胞所处的心肌细胞发育阶段，根据上述指标，采用RT-PCR从步骤b所得永生化的单克隆心肌细胞中筛选心肌祖细胞，并以常用于研究心肌细胞发育的P19CL6和H9C2作为对照；所述ISL1、Sca1、c-kit、Nkx2.5、α-MyHC、Oct3/4、Nanog、Sox2、GATA4、Tbx5、Hand2、Flk-1、α-actin、cTnI和ANF的PCR引物序列分别如SEQ ID No.1～2、SEQ ID No.3～4、SEQ ID No.5～6、SEQ IDNo.7～8、SEQ ID No.11～12、SEQ ID No.17～18、SEQ ID No.19～20、SEQ ID No.21～22、SEQ IDNo.23～24、SEQ ID No.25～26、SEQ ID No.27～28、SEQ ID No.29～30、SEQ ID No.31～32、SEQID No.33～34和SEQ ID No.35～36所示；

ATRA诱导MyHC-GLuc活性筛选心肌祖细胞：将2μg MyHC-GLuc、15μl Lipofactamine和500μl DMEM空白培养基混匀，室温下放置10～30分钟，制得转染混合物；分别将处于指数生长期的步骤b所得永生化的单克隆心肌细胞以60～80％的密度接种到细胞培养瓶中，用DMEM完全培养基在37℃、体积分数为5％的CO₂和饱和湿度的条件下培养，待细胞贴壁后，吸除培养基，用3.0ml DMEM空白培养基洗涤1次，加入2.5ml DMEM完全培养基，孵育10分钟，再加入上述转染混合物，孵育4小时后更换为DMEM完全培养基，12小时后加入终浓度为0.5μmol/L的ATRA溶液诱导分化，激活MyHC-GLuc活性，分别于诱导后第3、6、12和18天吸取20μl细胞培养上清液，用GLuc检测试剂盒检测GLuc的表达量，按照试剂盒说明书操作；

免疫荧光检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况：进一步验证RT-PCR结果，采用免疫荧光法检测ISL1和c-kit在ISL1/Tbx5双阳性克隆中的表达情况，同时以2个ISL1/Tbx5双阴性克隆作为对照；

实时定量PCR检测Dex诱导分化心肌祖细胞的心肌发育相关基因的表达：将筛选出的具有心肌祖细胞特性的克隆分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第7天和第11天时提取细胞总RNA，通过RT得到cDNA，再进行心肌发育相关基因ISL1、Nkx2.5、α-MyHC、α-actin、cTnT、Tbx5、MyoD和SM-MHC的实时定量PCR检测，并将结果以GAPDH为内参进行校正；所述ISL1、Nkx2.5、α-MyHC、α-actin、cTnT、Tbx5、MyoD和SM-MHC的PCR引物序列分别如SEQ ID No.1～2、SEQ ID No.7～8、SEQ ID No.11～12、SEQ IDNo.13～14、SEQ IDNo.15～16、SEQ ID No.25～26、SEQ ID No.37～38和SEQ ID No.39～40所示；

免疫荧光检测Dex诱导分化心肌祖细胞的cTnT表达：将筛选出的具有心肌祖细胞特性的克隆分别用0.5μmol/L的Dex溶液诱导分化，第14天时固定细胞，采用免疫荧光法检测心肌细胞结构蛋白cTnT的表达。